COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS DE BIURET Y ULTRAVIOLETA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ALBÚMINA EN CLARA DE HUEVO.

Universidad de la Amazonia, Facultad de Ciencias Básicas, programa de Química.

RESUMEN

Se determinó el porcentaje de proteína en clara de huevo con el objetivo de comparar entre el método Biuret y ultravioleta. Para los dos métodos se cuantifico en un espectrofotómetro pero a diferentes longitudes de onda a 540 nm con el método Biuret y a 290nm para el método ultravioleta. El análisis estadístico arrojo como resultado que el método más preciso para determinar el porcentaje (p/v) de proteína en clara de huevo fue el método ultravioleta con una desviación estándar 6,40 y con coeficiente de variabilidad 59,53%. El método mas exacto es el método de Biuret por presentar un % de error de 16,20 a comparación del método UV que presento un error de 76,76%.

PALABRAS CLAVES: Método de Biuret, Método UV, Proteína Albumina, Precisión, Exactitud

INTRODUCCIÓN

Los principales métodos empleados para la determinación de proteínas totales son los siguientes:

Método del BiuretEn solución alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando un color purpureo que se cuantifica espectrofotométricamente (540nm). Como solución estándar se utiliza una solución de albumina.

Proteína + Cu+2 Complejo Cu-Proteína (púrpura)

El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.

Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O). (Fernandez, al). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

El método de Lowry: (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer A= e.l.cEste método consta de dos etapas:1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.(Badui, 1999).2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Método de Bradford se emplea un colorante hidrofóbico cuyas disolucionesacuosas en presencia de acidoFosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos como el metanol. Su principal ventaja es que resulta más rápido y fácil de emplear que otros métodos alternativos, y más sensible que la medida de absorbancia a 280 nm.

Método kjendhal

El método se basa en la destrucción de la materia orgánica con ácido sulfúrico concentrado,formándose sulfato de amonio que en exceso de hidróxido de sodio libera amoníaco, el quese destila recibiéndolo en:

a) Ácido sulfúrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de ácido es valorado conhidróxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o, b) Ácido bórico formándose borato de amonio el que se valora con ácido clorhídrico.

Las proteínas se clasifican según la solubilidad de la siguiente forma:

Albuminas: solubles en agua y en solución salinaGlobulinas: poco solubles en agua, solubles en solución salinaProlaminas: solubles en etanol 60-70%; insolubles en etanol absoluto y aguaGlutelinas: insolubles en agua y soluciones salinas, solubles en ácidos y bases diluidos.Escleroproteinas: insolubles en agua y soluciones salinas.

La curva de calibrado es un método de química analítica empleado para medir la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar (la concentración). Para ello, se efectúan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una función matemática que relacione ambas; después, se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene la concentración de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva de calibración, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración del analito.

El propósito de esta práctica es el de comparar dos métodos de análisis de albúmina de la clara de huevo de gallina; el método de Biuret y el método por espectroscopia ultravioleta.

METODOLOGIA

Muestra: Clara de huevo de gallina.

Materiales: espectrofotómetro para Biuret: Spectronic 20D, y espectrofotómetro para UV GENESYS 5; dos celdas de plástico de 1mL (Spectronic 20D), dos celdas de cuarzo de 1ml (Spectronic 20D), dos balones aforados de 50mL, dos beaker de vidrio de 100 ml, tubos de ensayo, frasco lavador, vidrio de reloj, vortex.

Reactivos: NaCl al 0.9% (50 ml), albumina sérica bovina, reactivo de biuret.

Procedimiento para el Método de Biuret

Se preparó una solución patrón de albúmina de 2,15mg/mL. Volumen final 50mL

Se realizó las 7 mezclas indicadas a continuación en la tabla 1.

Tabla 1. Volúmenes adicionados de cada sustancia para obtener las Soluciones de trabajo para la curva de calibración. El volumen final para cada tubo fue de

6mL

Muestra/tubo B1 1 2 3 4 5 6 7Patrón de albúmina

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.0

Muestra 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 1.5Agua destilada 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 1.0 0.5

Biuret 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0B1: Blanco

Se agitó en el vortex por 30 segundos aproximadamente, y luego se dejó en reposo durante 20 minutos a temperatura ambiente. Por último se leyó la absorbancia a 540nm

Preparación de la muestra

Se pesó 0.5 ml de clara de huevo y se llevó a 50mL de solución con Cloruro de sodio (NaCl) al 0.9%p/v.

Procedimiento para el Método de Ultravioleta (UV)

Se trabajó con la solución patrón de albúmina de 2,15mg/mL, preparada para el método de Biuret.

Se tubo realizó las soluciones con cada una de las mezclas indicadas en la siguiente tabla:

Tabla 2.Volúmenes adicionados para preparar las Soluciones de trabajo para la curva de calibración.

Muestra/tubo B1 1 2 3 4 5 6 7mL

Patrón de albúmina

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.0

muestra 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 1.0NaCl 0.9% 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 2.0 2.0

B1: Blanco

Se agitó en el vortex por aproximadamente 30 segundos y se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 290nm.

Preparación de la muestra

Se trabajó con la misma muestra utilizada en el Método de Biuret.

RESULTADOS

Método de Biuret

Tabla 3. Valores de Transmitancia a una longitud de onda de 540nm.

Ensayo (540nm)N°

experimentoA B C D

1 91,6 94,6 83,6 97,12 84 98,2 86,2 953 83,2 91,6 89,2 97,24 79,2 88 83,2 89,25 74,2 87 81,2 856 89 92 83,8 93,27 83 77,4 88,6 80,6

Tabla 4. Valores de Absorbancia a una longitud de onda de 540nm

Ensayo (540nm)N°

experimentoA B C D

1 0,038 0,024 0,077 0,0122 0,076 0,008 0,064 0,0223 0,080 0,038 0,049 0,0124 0,101 0,056 0,079 0,0495 0,129 0,060 0,090 0,0706 0,051 0,036 0,076 0,0307 0,081 0,111 0,052 0,093

Muestra de cálculos

Para determinar los valores de Absorbancia de cada experimento en cada uno se los ensayos, expresados en la tabla 4, se tiene en cuenta la siguiente ecuación:

A = 2 – Log T

A: Absorbancia.

T: Valor de Transmitancia

La Absorbancia para el caso del ensayo D, experimento 2:

A = 2 – Log 95 A = 0,022

Ensayo (540nm)[Albúmina]

mg/mLA B C D

0,072 0,038 0,024 0,077 0,0120,143 0,076 0,008 0,064 0,0220,215 0,080 0,038 0,049 0,0120,287 0,101 0,056 0,079 0,0490,358 0,129 0,060 0,090 0,070

Tabla 5. Datos para la curva de calibración.

Muestra de cálculos

Para calcular la concentración de albúmina expresada en la tabla 5, se tuvo en cuenta la ecuación 2 y los volúmenes expresados en la Tabla 1.

C1V 1=C2V 2 (Ecuación 2)

Donde:

C1 es la concentración inicial de albúmina (2,15mg/mL).

V1 es el volumen de patrón de albúmina adicionado a cada tubo.

C2 es la concentración que se quiere determinar.

V2 es el volumen final de cada solución o experimento (6mL).

Para el caso de la primera concentración de albúmina expresada en la columna 1.

C2=C1V 1

V 2

=(2,15mg /mL)(0,2mL)

6mL=0,072mg /mL

Tabla 6. Datos de las variables de las curvas de calibración para cada ensayo.

Ensayo (540nm)Curva de

CalibraciónA B C D

A 0,0227 0,0011 0,0595 -0,0099B 0,2889 0,1678 0,0573 0,1997r 0,9745 0,8716 0,4124 0,8820

R2 0,9496 0,7597 0,1701 0,7779

Para hallar el valor de cada una de las variables observadas en la columna 1 de la tabla 6, se empleó una calculadora CASIO fx-82ES y se llevó a cabo por el método de correlación lineal.

Tabla 7. Ecuaciones de las rectas

Ensayo Ecuación de la Recta ( Y= mx + b )A A = 0,2889[Albúmina] + 0,0227B A =0,1678[Albúmina] + 0,011C A =0,0573[Albúmina] + 0,0595D A =0,1997[Albúmina] – 0,0099

.

La pendiente es positiva, por lo tanto, a medida que aumenta la [Albúmina] aumenta la absorbancia.

Se elimina el ensayo C teniendo en cuenta el criterio de aceptación en el que se expresa la siguiente condición: R2˃˃˃ 0,7500. (El R2 se puede observar en la tabla 6, fila 6); y dicho ensayo tiene un R2de 0,1701.

Tabla 8. Ecuaciones de las rectas aceptadas.

Ensayo Ecuación de la Recta ( Y= mx + b )A A = 0,2889 [Albúmina] + 0,0227B A =0,1678 [Albúmina] + 0,011D A =0,1997 [Albúmina] – 0,0099

Cuantificación de proteína soluble en solución salina en clara de huevo, Tabla 4 experimento 6, ensayo A (Absorbancia = 0,051).

La muestra se manejó de la siguiente manera: 0,5 mL de clara de huevo se llevó a 50mL de extracto, de ahí se tomó 1mL y se llevó a 6mL de extracto.

A = 0,2889 [Albúmina] + 0,0227 (Ecuación 3)

0,051 = 0,2889 [Albúmina] + 0,0227 [Albúmina] = 0,0980mg/mL

Ahora, teniendo en cuenta la ecuación 2, se determina la concentración de albúmina en los 6mL de extracto:

C1=C2V 2

V 1

=(0,0980mg /mL)(6mL)

1mL=0,588mg /mL

La anterior es la concentración de albúmina en los 6mL de extracto, ahora con la misma ecuación y teniendo en cuenta el factor de dilución, se determina la [Albúmina] (mg/mL) en los 50mL.

C1=C2V 2

V 1

=(0,588mg /mL)(50mL)

1mL=29,4mg /mL

Para determinar la cantidad de albúmina expresada en %p/v y teniendo en cuenta los cálculos anteriores se puede hacer una regla de tres así:

29,4mg de Albúmina 0,5mL de Clara de Huevo

X mg de Albúmina 100mL de Clara de Huevo

X = 5880mg de Albúmina/100mL de Clara de Huevo.

Al expresar esta cantidad en g/mL (%p/v) queda:

5,880g de Albúmina (proteína soluble)/100mL de Clara de Huevo.

Cuantificación de proteína soluble en solución salina en clara de huevo, Tabla 4 experimento 7, ensayo A (Absorbancia = 0,081).

La muestra se manejó de la siguiente manera: 0,5mL de clara de huevo se llevó a 50mL de extracto, de ahí se tomó 1,5mL y se llevó a 6mL de extracto.

Teniendo en cuenta la ecuación 3 se determina la concentración de albúmina en la solución.

0,081 = 0,2889 [Albúmina] + 0,0227 [Albúmina] = 0,2018mg/mL

Por medio de la ecuación 2 se determina la [Albúmina] en los 6mL de extracto:

C1=C2V 2

V 1

=(0,2018mg /mL)(6mL)

1mL=1,2108mg /mL

La concentración de albúmina en los 50mL se halla:

C1=C2V 2

V 1

=(1,2108mg /mL)(50mL)

1mL=60,54mg /mL

Para expresar el valor en %p/v:

60,54mg de Albúmina 0,5mL de Clara de Huevo

X mg de Albúmina 100mL de Clara de Huevo

X = 12108mg de Albúmina/100mL de Clara de Huevo.

Al expresar esta cantidad en g/mL queda:

12,108g de Albúmina (proteína soluble)/100mL de Clara de Huevo.

Tabla 9. %p/v expresada en mg de Albúmina /100mL de Clara de Huevo.

Ensayo (540nm)Tubo A B C D

6 5,88 12,48 11,06 11,99

7 12,11 26,2 4,06 20,61

Método de Ultravioleta

Tabla 10. Valores de Absorbancia a una longitud de onda de 290nm.

Ensayo (290nm)N°

experimentoA B C D

1 0,002 0,021 0,000 0,0842 0,049 0,073 0,016 0,1323 0,080 0,083 0,048 0,1744 0,116 0,136 0,105 0,2655 0,156 0,177 0,150 0,2626 0,142 0,139 0,248 0,1767 0,151 0,125 0,121 0,195

Tabla 11. Datos para la curva de calibración

Ensayo (290nm)[Albúmina]

mg/mLA B C D

0,143 0,002 0,021 0,000 0,0840,287 0,049 0,073 0,016 0,1320,430 0,080 0,083 0,048 0,1740,573 0,116 0,136 0,105 0,2650,717 0,156 0,177 0,150 0,262

Tabla 12. Ecuaciones de las rectas, y Coeficiente de correlación lineal

Ensayo Ecuación de la Recta ( Y= mx + b )

R2

A A = 0,261[Albúmina] - 0,032 0,99B A = 0,262 [Albúmina] - 0,014 0,97C A =0,271 [Albúmina] - 0,053 0,96D A =0,341 [Albúmina] + 0,037 0,94

.

Cuantificación de proteína soluble en solución salina en clara de huevo, Tabla 9 experimento 6, ensayo D (Absorbancia = 0,176).

A =0,341 [Albúmina] + 0,037 (Ecuación 4)

0,176 =0,341 [Albúmina] + 0,037 [Albúmina] = 0,4076mg/mL

Teniendo en cuenta la ecuación 2, se determina la concentración de albúmina en los 3mL de extracto:

C1=C2V 2

V 1

=(0,4076mg /mL)(3mL)

1mL=1,2228mg /mL

La anterior es la concentración de albúmina en los 3mL de extracto, ahora se determina la [Albúmina] en los 50mL.

C1=C2V 2

V 1

=(1,2228mg /mL)(50mL)

1mL=61,14mg /mL

Para determinar la cantidad de albúmina expresada en %p/v y teniendo en cuenta los cálculos anteriores se tiene:

61,14mg de Albúmina 0,5mL de Clara de Huevo

X mg de Albúmina 100mL de Clara de Huevo

X = 12228mg de Albúmina/100mL de Clara de Huevo.

Al expresar esta cantidad en g/mL (%p/v) queda:

12,228g de Albúmina (proteína soluble)/100mL de Clara de Huevo.

Cuantificación de proteína soluble en solución salina en clara de huevo, Tabla 9 experimento 7, ensayo D ( Absorbancia = 0,195).

Con la ecuación 4, se halla el valor de [Albúmina] en dicho experimento:

0,195 =0,341 [Albúmina] + 0,037 [Albúmina] = 0,4633mg/mL

Concentración de albúmina en los 3mL de extracto:

C1=C2V 2

V 1

=(0,4633mg /mL)(3mL)

1mL=1,3899mg /mL

[Albúmina] en los 50mL de extracto:

C1=C2V 2

V 1

=(1,3899mg /mL)(50mL)

1mL=69,4950mg /mL

69,4950mg de Albúmina 0,5mL de Clara de Huevo

X mg de Albúmina 100mL de Clara de Huevo

X = 13899mg de Albúmina/100mL de Clara de Huevo.

Al expresar esta cantidad en g/mL (%p/v) queda:

13,899g de Albúmina (proteína soluble)/100mL de Clara de Huevo.

Tabla 9. %p/v expresada en mg de Albúmina /100mL de Clara de Huevo

Ensayo (290nm)Tubo A B C D

6 19,97 17,52 33,11 12,237 21,03 15,92 19,0 13,90

Tabla 10. Datos estadísticos obtenidos en las pruebas Biuret y UV

BIURET UVPROMEDIO 12,55 19,09

DESVIACION ESTANDAR 7,47 6,40COEFICIENTE DE

VARIACION59,58% 33,54%

Tabla 11. Análisis estadístico de los dos métodos para la determinación de la precisión y exactitud de los métodos.

Parámetro Biuret Ultravioleta%p/v Media ±desviación

estándar12,55± 7,471

a 19,09± 6,40a

Coef. De variación 59,58% 33,54%% de error 16,20% 76,76%

1. Diferente letra minúscula a la derecha de la media ± d. estándar indica que hay diferencias significativas entre los dos métodos.DISCUSION DE RESULTADOS

Para la comparación de estos dos métodos, biuret y ultravioleta fue necesario de una gran precisión a la hora de adicionar los volúmenes al tubo de ensayo expresados en la tabla1, la forma de pipetear es un factor importante a la hora de realizar estos tipos de análisis y comparaciones, ya que al medir mal los volúmenes de cada reactivo la determinación de albumina tendría valores erróneos.

Para cada uno de los ensayos realizado por los dos métodos los resultados de las pendientes fueron positivas, es decir a medida que la concentración de albumina aumenta la absorbancia aumenta también. Según la tabla 4 en el ensayo C no se sigue la relación anterior.

Para los análisis estadísticos y determinación del porcentaje (%) de albumina en la clara de huevo fue necesario fijar un criterio de aceptación de los ensayos.

Este criterio se determinó teniendo en cuenta el R2 de cada ensayo, R2>>>> 0,7500 (ver tabla 7); por lo tanto el ensayo C se descartó (tabla 8).

Para cada método se le realizo el análisis estadístico (media, desviación estándar muestral, coeficiente de variación y porcentaje de error) tabla No 10; el método de biuret tiene una desviación estándar mayor (7,47) que el método UV (6,40), igualmente los datos están más dispersos biuret que en UV por el coeficiente de variación.

Se realizó un análisis estadístico en el cual se llevó a cabo el test student en donde se determinó que no hay diferencias significativas (P˂ 0,05) entre los métodos sobre el contenido de albumina en la clara de huevo.

Según el análisis estadístico el método con mayor precisión es el UV porque es el que menor desviación y coeficiente de variación; la precisión está en términos de repetibilidad, es decir las muestras y los análisis se realizaron el mismo día. El método de biuret fue el método que menor % de error tuvo, por lo tanto es el más exacto.

CONCLUSIONES

Entre los dos métodos no hay diferencias significativas ya que con la prueba test student (p<0,05) lo confirma.

El método de ultravioleta es el más preciso por presentar una desviación estándar de 6,40 y un coeficiente de variación de 33,54%, estos son menores que los del método de Biuret para la cuantificación de proteína (Albumina) en la clara de huevo.

El método de Biuret es el más exacto ya que presenta un % de error de 16,20% a comparación que el método de UV que tiene un error de 76,76%.

BIBLIOGRAFIA

Análisis químico cuantitativo; Daniel C. Harris Métodos para la cuantificación de proteínas. Fernandez Emilio, Galvan

Aurora. Departamento de bioquímica y biología molecular. Campus Universitario de Rabanales.

Badui S. Química De Los Alimentos. 3ed. 5reimpresión Editorial Alambra Mexicana. México (1999)648pp.

Nota 4.7/5.0