“COMPARACIÓN DE LA TOXICIDAD ENTRE 3 DILUYENTES

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Villa de Álvarez, Col., junio de 2013

“COMPARACIÓN DE LA TOXICIDAD ENTRE 3 DILUYENTES

USADOS EN EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA,

ALIMENTOS Y SUPERFICIES COMO CONTROL DE CALIDAD”

Nombre de las Residentes

Abigail Michel Martínez

No. Control: 12460893

Francisca Treviño Medina

No. Control: 12460391

Nombre del Asesor Interno

Dra. Argelia Juárez Alcaraz

Nombre del Asesor Externo

QFB. Juan Andrés Zavaleta Carmona

Nombre de la Carrera

Ingeniería Bioquímica

INFORME TÉCNICO DE RESIDENCIA PROFESIONAL QUE PRESENTA:

Villa de Álvarez, Col., a Enero de 2018

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AGRADECIMIENTOS DE ABIGAIL MICHEL MARTINEZ.

Le agradezco a Dios por enseñarme en todo momento el camino del bien y haberme dado salud y

fuerza, además de su infinita bondad y amor para poder lograr mis objetivos.

A mis padres Juan y Liliana, por ayudarme en todo momento brindándome sus consejos, sus

valores, esfuerzo, comprensión, sacrificio, por haber depositado su confianza y fé en mi formación

profesional, haciéndome una persona de bien y por lo más grande y maravilloso que me han dado, la

vida. Por su motivación y por ser ejemplos de perseverancia, constancia, responsabilidad y respeto,

que tanto los caracterizan y que me han infundado siempre, y por el valor mostrado para salir adelante

haciendo posible la realización de sus anhelos y los míos, con eterno agradecimiento y amor por todo

lo que me han dado.

Gracias a mis familiares que siempre me brindaron alguna palabra de aliento en mi

educación, tanto académica, como en la vida. A mis hermanos Juan y Alberto, por ser parte

importante de mi vida.

A todos y cada uno de mis compañeros y amigos que en algún momento de mi carrera

profesional logramos compartir buenos y malos momentos, tanto dentro, como fuera del Tecnológico

de Colima.

Al Tecnológico de Colima por haberme proporcionado los conocimientos necesarios para

lograr mi formación como profesionista.

A la Dra. Argelia Juárez Alcaraz por brindarme su orientación, ayuda y sobre todo compartir

sus conocimientos que me transmitieron la capacidad y criterio necesario para lograr concluir con éxito

mi Residencia profesional.

Al QFB. Juan Andrés Zavaleta Carmona por su dirección, paciencia, entrega, valiosos

consejos y conocimientos que me permitieron terminar mi Residencia Profesional, inculcando en mi

un sentido de responsabilidad, seriedad y rigor académico para obtener una formación completa.

Al Laboratorio Estatal de Salud Pública, por brindarme la confianza, apoyo y sobre todo la

oportunidad de desarrollar la Residencia Profesional dentro de sus instalaciones, permitiéndome

reafirmar y adquirir nuevos conocimientos que me ayudaran a formarme profesionalmente.

5

AGRADECIMIENTOS DE FRANCISCA TREVIÑO MEDINA.

Les agradezco a todas las personas que directa o indirectamente fueron parte de mi proceso de

aprendizaje a lo largo de mi carrera, lo cual me ayudo a culminar con mi Residencia Profesional.

Y en especial a Dios por haberme guiado a lo largo de mi proyecto y por brindarme una vida

llena de aprendizajes.

Gracias a mis tutores de vida, María y Armando por el apoyo brindado en todo momento, por

los valores y la responsabilidad que me han inculcado y por haberme dado la oportunidad de construir

una educación en el transcurso de mi vida, lo cual me llevo a adquirir las habilidades necesarias para

poder culminar con éxito la Residencia Profesional.

A mis hermanos, Alicia, Ricardo, José Cruz, Rubén, Ambrosio, Adán y María luisa, por

apoyarme en todo momento buenos o malos y por estar para mi incondicionalmente, por ser un gran

apoyo a lo largo de mi carrera.

Por ser la mejor amiga y estar presente en el transcurso de toda mi carrera, por el apoyo, la

paciencia, sabiduría y porque nunca faltaron las palabras de aliento, Gracias Marleny González

Rosas.

A mis amigas que se volvieron parte de mí familia Alicia, Mirna, Maritza y Cyntia por estar

siempre presente, por escucharme y aconsejarme siempre que lo necesité.

Le agradezco el tiempo, la confianza y el apoyo dedicado, a la Dra. Argelia Juárez Alcaraz,

por haber compartido conmigo sus habilidades y sus conocimientos, los cuales fueron de gran

beneficio e impacto para mi aprendizaje.

Gracias QFB. Juan Andrés Zavaleta Carmona por creer y confiar en mí y por haberme

brindado la oportunidad de poder desarrollar la Residencia profesional bajo su mando.

Al Laboratorio Estatal de Salud Pública, gracias por todo el apoyo y aprendizaje que me

brindaron dentro de la empresa. Por habernos dado la oportunidad de crecer como profesionista y

aprender cosas nuevas.

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Tabla de Contenido

Introducción ....................................................................................................................................... 12

Justificación ....................................................................................................................................... 13

Objetivo General ................................................................................................................................ 14

Objetivos específicos ......................................................................................................................... 14

Hipótesis de trabajo ........................................................................................................................... 15

Hipótesis nula .................................................................................................................................... 15

Caracterización del área .................................................................................................................... 15

Función del Control de Calidad de Medio de Cultivos ....................................................................... 16

Fundamentos teóricos ....................................................................................................................... 17

Materiales .......................................................................................................................................... 27

Equipos .............................................................................................................................................. 28

EPP .................................................................................................................................................... 28

Reactivos ........................................................................................................................................... 29

Metodología ....................................................................................................................................... 30

Resultados de la identificación de E. coli ........................................................................................... 47

Resultados ......................................................................................................................................... 56

Análisis de Resultados. ...................................................................................................................... 75

Conclusiones ..................................................................................................................................... 80

Discusión ........................................................................................................................................... 81

Recomendaciones ............................................................................................................................. 81

Glosario ............................................................................................................................................. 82

Bibliografía ......................................................................................................................................... 83

7

Tabla de Figuras.

Fig. 1. Escherichia coli ATTC 25922 en ACE, vista en el seno .......................................................... 20

Fig. 2. Agar Nutritivo. ......................................................................................................................... 21

Fig. 3. Agar Base Sangre (ABS). ....................................................................................................... 22

Fig. 4. Agar Soya Tripticasa. .............................................................................................................. 23

Fig. 5. Prueba de Citocromo Oxidasa (E. coli). .................................................................................. 24

Fig. 6. Prueba IMVIC. ........................................................................................................................ 25

Fig. 7. Sistema de identificación bacteriana API. ............................................................................... 26

Fig. 8. MicroScan WalkAway 96 Plus. ............................................................................................... 27

Fig. 9. Pellet liofilizado de .................................................................................................................. 30

Fig. 10. Macerado del Pellet en tubo. ................................................................................................ 30

Fig. 11. Inoculación de microorganismos ........................................................................................... 31

Fig. 12. Escala colorimétrica de tiras reactivas. ................................................................................. 31

Fig. 13. Suspensión de microorganismos .......................................................................................... 32

Fig. 14. Frotis cubierto con colorante violeta...................................................................................... 33

Fig. 15. Frotis cubierto con Yodo-Lugol. ............................................................................................ 33

Fig. 16. Enjuague con agua destilada. ............................................................................................... 33

Fig. 17. Cultivos primarios (AN, AST, ABS). ...................................................................................... 34

Fig. 18. Tres tipos de Agares selectivos ............................................................................................ 34

Fig. 19. Pruebas bioquímicas (IMVIC). .............................................................................................. 35

Fig. 20. Suspensión de colonia aislada .............................................................................................. 36

Fig. 21. Llenado de los tubos con la suspensión de E. coli. ............................................................... 36

Fig. 22. Aplicación de la parafina ....................................................................................................... 37

Fig. 23. Llenado de cámara de incubación. ....................................................................................... 37

Fig. 24. Tira API colocada en cámara húmeda .................................................................................. 37

Fig. 25. Suspensión bacteriana en placa selectiva. ........................................................................... 39

Fig. 26. Varillas de inoculación. ......................................................................................................... 39

Fig. 27. Prompt inoculado. ................................................................................................................. 40

Fig. 28. Suspensión de bacterias ....................................................................................................... 41

Fig. 29. Inoculo desplazado hacia la .................................................................................................. 41

Fig. 30. Inoculo rehidratando panel. ................................................................................................... 42

8

Fig. 31. Panel dentro del WalkAway. ................................................................................................. 42

Fig. 32. Frascos estériles rotulados. .................................................................................................. 43

Fig. 33. Diluyentes de pruebas. ......................................................................................................... 43

Fig. 34. Cultivo de E. coli con caldo BHI. ........................................................................................... 44

Fig. 35. Pipeteo de 1 ml del ............................................................................................................... 44

Fig. 36. Preparación de diluciones ..................................................................................................... 44

Fig. 37. Descarga de 0.1 mililitros ...................................................................................................... 45

Fig. 38. Ensayo de T0 en AST y ABRV. ............................................................................................ 45

Fig. 39. Estriado de cajas de ABRV. .................................................................................................. 46

Fig. 40. Estriado de cajas de AST. ..................................................................................................... 46

Fig. 41. Crecimiento en placas primarias AN, ABS y AST. ................................................................ 47

Fig. 42. Tira reactiva de Citocromo Oxidasa negativa. ...................................................................... 47

Fig. 43. Frotis de E. coli ATCC a partir de los .................................................................................... 48

Fig. 44. Vista en microscopio a 100x. ................................................................................................ 48

Fig. 45. Prueba Citrato negativa. ....................................................................................................... 50

Fig. 46. Prueba MIO ........................................................................................................................... 50

Fig. 47. Prueba MR. ........................................................................................................................... 51

Fig. 48. Prueba VP. ............................................................................................................................ 51

Fig. 49. Código de identificación E. coli 25922. ................................................................................. 54

Fig. 50. Pruebas API inoculadas. ....................................................................................................... 55

Fig. 51. Reacciones bioquímicas de la prueba API inoculada. .......................................................... 55

Fig. 52. Informe global del estado del panel analizado. ..................................................................... 56

Fig. 53. Distribución de E. coli 25922 en Agar Soya Tripticasa. ......................................................... 58

Fig. 54. Medias de Porcentaje de Toxicidad de los tres diluyentes con 95% (s agrupada). ............... 77

Fig. 55.Grafico de Cuartiles de Porcentaje de Toxicidad. .................................................................. 78

Fig. 56. Grafica de Probabilidad normal (Residuos). ......................................................................... 79

9

Índice de Tablas.

Tabla 1: Composición Solución reguladora de Fosfatos. ................................................................... 18

Tabla 2: Composición Diluyente 9. .................................................................................................... 19

Tabla 3: Composición Solución Salina ............................................................................................... 19

Tabla 4: Composición Agar Nutritivo (AN). ........................................................................................ 21

Tabla 5: Composición Agar Base Sangre (ABS). ............................................................................... 22

Tabla 6: Composición Agar Soya Tripticasa (AST). ........................................................................... 23

Tabla 7: Bioquímica IMVIC. ............................................................................................................... 35

Tabla 8: Pruebas que requieren adición de reactivos externos ......................................................... 38

Tabla 9: Resultado prueba Citocromo Oxidasa. ................................................................................ 47

Tabla 10: Resultado pruebas bioquímica MIO. .................................................................................. 49

Tabla 11: Resultado prueba bioquímica MR (Voges-Proskauer). ...................................................... 49

Tabla 12: Resultado prueba bioquímica VP (Voges-Proskauer). ....................................................... 49

Tabla 13: Resultado prueba bioquímica Citrato de Simmons. ........................................................... 50

Tabla 14: Resultados Prueba API. ..................................................................................................... 52

Tabla 15: Solución tampón de fosfatos (L:16-4) (e1). ........................................................................ 57

Tabla 16: Diluyente 9 (L:16-2) (e1). ................................................................................................... 57

Tabla 17: Solución Salina fisiológica al 0.85% (L:39-4) (e1). ............................................................. 57

Tabla 18: % de Toxicidad del diluyente (rango ± 30%) (e1). ............................................................. 58

Tabla 19: Solución tampón de fosfatos(L:16-4) (e1). ......................................................................... 59


Tabla 21: Solución salina fisiológica al 0.85% (L:39-4) (e1). .............................................................. 59



Tabla 24: Solución Salina fisiológica al 0.85% (L;39-4) (e2). ............................................................. 60


Tabla 26: Solución Tampón de fosfatos (L:16-4) (e2). ....................................................................... 62




10













Tabla 42: Solución salina fisiológica al 0.85%. (L:39-4) (e4). ............................................................. 68







Tabla 49: Solución salina fisiológica al 0.85%. (L:39-4) (e5). ............................................................. 71








Tabla 57. Resumen Estadístico para Porcentaje de Toxicidad de los tres diluyentes. ...................... 75

Tabla 58. Sesgo estandarizado de los diluyentes. ............................................................................. 75

Tabla 59. Curtosis Estandarizada de los diluyentes. ......................................................................... 75

Tabla 60. Diferenciación significativa mediante el Valor-P. ................................................................ 76

11

Tabla 61. Medias para Porcentaje de Toxicidad con intervalos de confianza del 95%. ..................... 76

Tabla 62.Pruebas de Múltiple Rangos para Porcentaje de Toxicidad mediante ................................ 77

Tabla 63. Tabla de diferencia significativa entre los diluyentes. ........................................................ 77

12

Introducción

Un diluyente es un medio formulado para separar microorganismos de un cultivo sólido a una fase

liquida o para reducir su concentración por dilución ya sea primaria o decimal, sin que este medio

promueva la multiplicación o reducción de la concentración original de microorganismos durante el

tiempo de contacto con el diluyente, es decir, debe de preservar a los microorganismos en condiciones

óptimas para ser recuperados en un agar de prueba. Esta propiedad que debe de tener los diluyentes

es fundamental en la preparación de diluciones para los exámenes microbiológicos cualitativos de

alimentos, pero principalmente cuantitativos ya que de esta característica depende la precisión en los

resultados de nuestro método y por tanto la certeza y confiabilidad de los mismos.

En microbiología de alimentos se utilizan varios diluyentes entre los que se encuentran la Solución

reguladora de fosfatos, solución salina fisiológica y diluyente 9, sin embargo, estas formulaciones

presentan variaciones en la eficiencia en la preservación de la concentración original de la carga

bacteriana, de tal manera que este trabajo, pretende determinar cuál de los tres medios nos brinda la

mejor opción para la dilución de muestras sin la variación significativa en la concentración. Para tal fin

utilizaremos el método de Toxicidad de diluyente de la ISO 11133:2014, el cual nos permitirá

determinar el % en el incremento o disminución de la concentración inicial de un microorganismo de

prueba ATCC, en un tiempo determinado de contacto con cada diluyente.

13

Justificación

Los Medios de Cultivos empleados en los procesos analíticos del LESP Colima son evaluados

por el Área de Control de Calidad de Medios como medida rutinaria para asegurar que este insumo

de gran importancia en el acondicionamiento y dilución de las muestras de agua, alimento y superficies

cumpla con las especificaciones requeridas por el Método analítico vigente. La mayoría de estos se

fabrican en el LESP a partir de polvos deshidratados o por ingredientes. Sin embargo, existen

diferencias en el desempeño entre las diferentes formulaciones, por tal motivo, es necesario establecer

cuál de los medios usados para la dilución de muestras, es el que presenta un resultado favorable con

base al criterio de evaluación para la prueba de “toxicidad del diluyente”.

14

Objetivo General

Evaluar mediante la prueba de Control de Calidad de medios ISO 11133:2014 Método 9, la

Toxicidad de 3 medios diluyentes utilizados en el acondicionamiento, preparación y dilución de

muestras de agua, alimentos y superficies, para realizar una comparación entre ellos y establecer cuál

es el más adecuado para los fines mencionados.

Objetivos específicos

• Manejar y conservar el microorganismo de prueba (Cepas ATCC).

• Preparar medios de cultivo AST y ABRV

• Medir el pH y determinar las pruebas físicas de los medios de cultivo implicados en la prueba.

• Realizar pruebas de Toxicidad de Diluyente en diferentes lotes de Diluyentes a base de:

o Peptona de gelatina (Diluyente 9 o 99).

o Solución tampón de fosfatos.

o Solución salina fisiológica 0.85% de NaCl.

o Implementación del Agar de Soya Tripticasa como referencia de la prueba.

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Hipótesis de trabajo

La solución salina fisiológica al 0.85% es el mejor medio para mantener sin variación

significativa la viabilidad y la concentración de bacterias logarítmicamente en los métodos de prueba

de control de calidad para alimentos, aguas y superficies, por lo que se prevé que, una vez realizada

la estadística en base a la toxicidad, sea la que presente una toxicidad nula.

Hipótesis nula

El experimento realizado con el método de toxicidad de diluyente como prueba de control de

calidad de medios de cultivo demuestra que no existe diferencia significativa en la variación de

concentración original de bacterias cuando se usa solución salina fisiológica al 0.85%, solución tampón

de fosfatos o solución de peptona de gelatina.

Caracterización del área

Este proyecto se realizó en el laboratorio de Control de Calidad de Medios de Cultivo

perteneciente al Departamento de Control Sanitario del Laboratorio Estatal de Salud Pública-

COESPRIS en donde se cuenta con una colección de cepas ATCC (American Type Culture

Collection), usadas como microorganismos de prueba para el Control de Calidad. El microorganismo

de prueba Escherichia coli ATCC 25922 usado en este proyecto, pertenece a dicha colección.

Como asesor externo el Q.F.B. Juan Andrés Zavaleta Carmona, responsable del Laboratorio

mencionado y en la cual se realizará las pruebas de toxicidad de diluyente.

16

Función del Control de Calidad de Medio de Cultivos

En el laboratorio de Microbiología el principal objetivo es mantener, desarrollar, detectar y

cuantificar una gran variedad de microorganismos. Los medios de cultivos son usados en diferentes

técnicas, así como, diversas fórmulas y presentaciones de medios de cultivo, diseñados para el

desarrollo específico o propósito determinado. Muchos procedimientos de prueba dependen de la

capacidad de los medios de cultivo, así como su reproducibilidad en los resultados. Los requerimientos

para los medios pueden ser específicos dependiendo de qué tipo de muestra y que organismos

quieren ser detectados. De tal manera, que los medios de cultivo deben cumplir con criterios de

desempeño, así como prerrequisitos, para un trabajo microbiológico confiable. Existen diferentes

pruebas para demostrar el desempeño de un medio de cultivo.

Estos criterios son la parte esencial de los procedimientos del control de calidad que permiten

un monitoreo efectivo de los medios de cultivos en sus diferentes fases.

El estándar internacional que define los términos relativos a la seguridad de calidad de medios

de cultivos es la ISO 11133:2014. Estos requerimientos son aplicables a todas las categorías de

medios de cultivos de pruebas que serán usados en laboratorios de análisis microbiológicos.

17

Fundamentos teóricos

Toxicidad de diluyente (ISO, 2014).

La prueba de toxicidad de diluyente es una evaluación microbiológica de desempeño de un

medio de cultivo, que sirve para diluir o transportar una muestra, la cual es representativa de un lote

o de un producto terminado.

Método ISO 11133:2014, 9.2.1.2 para evaluación de diluyentes.

El procedimiento consiste en realizar una suspensión de 1ɥL del microorganismo de prueba

en 10 ml de caldo BHI, para generar concentración inicial de ≈ 104 UFC/ml, se homogeniza la

suspensión y se diluye en el volumen necesario para obtener un aproximado de 100 UFC/Placa sobre

la superficie de un agar no selectivo (medio de referencia, AST). Este procedimiento nos generara a

t0.

Esta dilución se dejará por 45 min a temperatura ambiente, tomando como la preparación

inicial el momento en el que se termina de inocular la caja Petri establecida como t0.

Transcurrido los 45 min, homogenizar la suspensión y transferir el mismo volumen inoculado

en t0. Sobre el agar de referencia. Esta caja de Petri se rotulará como t45.

Incubar a 36°C +/- 1 por 24 horas.

Lectura e interpretación de resultados

Después de la incubación contar el número de colonia en las cajas de Petri marcadas como

t0 Y t45.

El número de microorganismos en t45 después de la incubación del diluyente debe estar en +/-

30% del conteo inicial (t0).

18

Medios utilizados (Formulación).

Solución Reguladora de Fosfatos (Sanitarios, 2011).

También es conocida como Buffer o Tampón de Fosfatos y generalmente es utilizada como medio de

transporte y diluyente para muestras obtenidas en hisopados de superficies vivas e inertes. Su característica

principal es mantener el equilibrio osmótico y pH fisiológico de las unidades obtenidas en el muestreo. Tiene la

característica de no contener ninguna proteína.

Tabla 1: Composición Solución reguladora de Fosfatos.

Fosfato monopotásico 34.0 g

Agua destilada pH final 7.2 ±

0.2

1 litro

Preparación:

Disolver el fosfato en 500 ml de agua destilada y ajustar el pH a 7.2 con solución de hidróxido

de sodio 1 N, llevar a un litro de agua destilada. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C ± 1°C.

Para diluciones:

Añadir 1.25 ml de solución concentrada de reguladora de fosfatos a un litro de agua destilada

y ajustar el pH A 7.2, distribuir en frascos de dilución en volúmenes de 97 ml. Esterilizar durante 15

minutos a 121°C ± 1°C.

19

Diluyente 9 (Sanitarios, 2011).

Es un medio usado ampliamente en el acondicionamiento de muestras alimenticias,

principalmente para la dilución de las mismas, además de contener sales para mantener el equilibrio

osmótico, contiene proteína. Generalmente se utiliza en tubos con 9 ml.

Tabla 2: Composición Diluyente 9.

Peptona 1.0 g

Cloruro de sodio 8.5 g

Agua destilada pH final 7.2 ± 0.2 1 litro

Preparación:

Suspender 9.5 g del polvo en 1 litro de agua y ajustar el pH a 7.0 con hidróxido de sodio 1 N.

Mezclar y dejarlo en reposo 10 minutos para que se hidraten bien las partículas y Esterilizar durante

15 minutos a 121°C ± 1°C.

Solución Salina Fisiológica 0.85% (Sanitarios, 2011).

Este medio, es el más simple de todos los diluyentes ya que solo consta de Cloruro de Sodio

a un pH ligeramente ácido. Normalmente es utilizado para rehidratar presentaciones liofilizadas o en

polvo de reactivos microbiológicos como cepas ATCC. También es utilizado en la dilución de muestras

microbiológicas, aunque con menos frecuencia que la solución de Fosfatos y el Diluyente 9.

Tabla 3: Composición Solución Salina Fisiológica 0.85%.

Cloruro de Sodio 8.5 g

Agua destilada 1 litro

Preparación:

Disolver 8.5 g de NaCl en el agua, diluir a un litro, Esterilizar durante 15 minutos a 121°C ±

1°C, enfriar y guardar a la temperatura de laboratorio.

20

Microorganismo de prueba

Para realizar las pruebas de evaluación y desempeño de cualquier medio de cultivo es

necesario de microorganismos de prueba los cuales son obtenidos directamente de una colección de

cultivo (ATCC). El microorganismo de prueba puede ser un control positivo, negativo o ambos.

Control positivo es un microorganismos o grupo de microrganismos que deben de ser

detectados o cuantificados. Control negativo consiste en un microorganismo que debe de ser inhibido

por el medio y por condiciones de incubación. Si no es inhibido totalmente no debe de mostrar las

características esperadas del control positivo.

Escherichia coli

E. coli se caracteriza por ser un bacilo corto no esporulados, Gram negativo, motil, se mueve

por medio de flagelos periticos (Fig.1). Fermenta la lactosa, glucosa y sacarosa. Además de ser

anaerobio facultativo que crece a un pH óptimo de (6.0-7.0). E. coli es capaz de crecer en medios

selectivos como MC, EMB.

Fig. 1. Escherichia coli ATTC 25922 en ACE, vista en el seno del agar y superficial.

21

Agares usados en aislamiento e identificación de E. coli 25922

Agar Nutritivo (AN) (Sanitarios, 2011).

Tabla 4: Composición Agar Nutritivo (AN).

Extracto de carne 3 g

Peptona 5 g

Agar 15 g*

Agua destilada pH 6.8 ±

0.2

1 litro

* La cantidad de agar puede variar de acuerdo a la marca.

Preparación:

Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada (Fig.2). Dejar reposar de 5 a 10 min.

Esterilizar a 121°C por 15 min. Si se usa como base para el agar sangre, adicionar 8 g de NaCl para

evitar la hemolisis de las células.

Cepas de control: E. coli.

Fig. 2. Agar Nutritivo.

22

Agar Base Sangre (ABS) (Sanitarios, 2011).

Tabla 5: Composición Agar Base Sangre (ABS).

Proteasa peptona 15 g

Digerido de hígado 2.5 g

Extracto de levadura 5 g

NaCl 5 g

Agar 12 g

Agua destilada pH 7.4 ±

0.2

950 ml

Preparación:

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada con agitación constante y calentamiento.

Esterilizar a 121°C por 15 min. Enfriar a 45-50°C. Distribuir asépticamente en cajas de Petri.

Para el medio de agar sangre enfriar a 48°C y adicionar 50 ml de sangre desfibrinada de

carnero estéril, a 950 ml de medio base. Distribuir asépticamente en cajas de Petri (Fig.3).

Fig. 3. Agar Base Sangre (ABS).

23

Agar Soya Tripticasa (AST) (Sanitarios, 2011).

Tabla 6: Composición Agar Soya Tripticasa (AST).

Tripticasa peptona 15 g

Fitona peptona 5 g

NaCl 5 g

Agar 15 g

Agua destilada pH 7.3 ± 0.2 1 litro

Preparación:

Suspender los ingredientes en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar de 5 a 10 minutos.

Calentar con agitación constante para disolver el agar. Hervir por 1 min. Distribuir en tubos, cajas o

matraces. Esterilizar a 121°C por 15 min.

Cepa de control: E. coli.

Fig. 4. Agar Soya Tripticasa.

24

Pruebas de caracterización del microorganismo de prueba (E. coli ATCC 25922).

Prueba Citocromo Oxidasa.

Determina la presencia de la enzima citocromo oxidasa cuando reacciona con el dicloruro N,

N- dimetil-1,4-fenildiamonio en presencia de oxigeno molecular, formando la molécula de

condensación azul de indofenol, está reacción se emplea para clasificar e identificar bacterias.

El procedimiento consiste en impregnar el papel de la tira reactiva con biomasa de E. coli. Se

observa si en el transcurso de un minuto la zona impregnada vira a un color azul-violeta en este caso

la prueba se considera como positiva (Fig.5).

Fig. 5. Prueba de Citocromo Oxidasa (E. coli).

25

Prueba IMVIC (Indol – Movilidad - Voges Proskauer – Citrato)

Es una serie de pruebas diseñadas para diferenciar entre los Entéricos (Familia

Enterobacteriaceae). (Faddin, 1990) y se compone de 4 pruebas bioquímicas (Fig.6).

• Indol.

• Rojo de metilo.

• Voges-Proskauer.

• Citrato.

Fig. 6. Prueba IMVIC.

El resultado de este se expresa mediante símbolos de positivo o negativo (+ ó -, K o A) según

el resultado de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del método.

Sistema de identificación bacteriana API (Rodriguez, 2005).

La prueba API es un sistema de identificación para bacterias de la familia Enterobacteriaceae

y otras bacterias Gram (-). Consta de 21 test bioquímicos (Fig.7) estandarizados y miniaturizados y

una base de datos. Cada tira de API contiene 20 pocillos con distintos sustratos deshidratados

(Appelbaum P. C., 1980).

Los pocillos se inoculan con una suspensión de microorganismos en agua o solución salina,

que rehidratan los medios, se incuban a 37°C por 24 hrs, y por efecto del metabolismo bacteriano se

producen los cambios de color espontáneos o bien por la adición de reactivos.

26

Fig. 7. Sistema de identificación bacteriana API.

Partes de un pocillo

27

Sistema microbiológico automatizado para identificación bacteriana.

Para uso diagnostico in vitro.

El instrumento automatizado WalkAway para la identificación bacteriana, utiliza dos sistemas

ópticos controlados por el ordenador para la detección del crecimiento bacteriano en los pocillos de

los paneles. Para la Concentración Mínima Inhibidora (CIM), la intensidad de la luz transmitida a través

de cada pocillo es inversamente proporcional a la concentración de bacterias en dicho pocillo. Además,

bajo el sistema fluorométrico, la intensidad de la fluorescencia en cada pocillo es proporcional a la

concentración de bacterias en ese pocillo. Los pocillos seleccionados también contienen sustratos

químicos que experimentan cambios de color o fluorescencia en presencia de determinadas bacterias.

El WalkAway-96 plus, tiene una capacidad de 96 paneles MicroScan con 96 pocillos cada uno

de cualquier tipo compatible con el entorno de la incubadora; hasta ocho torres de paneles con 12

paneles cada una.

Fig. 8. MicroScan WalkAway 96 Plus.

28

Materiales

9 frascos de vidrio, capacidad 250 ml.

48 cajas Petri 15x90 mm.

10 asa bacteriológica de 1 L.



10 pipetas graduadas, clase A de 2 ml.



20 puntillas estériles para pipeta automática, Marca Spinreact, 100 a 1000 L.

10 tubos de ensaye con tapón de rosca de baquelita (16x150 mm).

5 tubos de ensaye con tapón de rosca de baquelita (13x100 mm).

10 porta objetos.

Equipos

Incubadora.

Cuenta colonias.

Baño maría.

Refrigerador.

Potenciómetro.

Vortex.

Mechero Bunsen.

Auxiliar de pipeteo.

Micro pipeta automática.

EPP

Guantes de látex.

Cubre bocas.

Lentes de seguridad.

Bata.

Zapato cerrado.

29

Reactivos

3 frascos de Agar bilis rojo violeta de 300 ml.

4 frascos de Agar soya Tripticasa de 300 ml.

2 frascos Agar cuenta estándar de 300 ml.

Placa de agar nutritivo.

Placa de agar de eosina y azul de metileno.

Placa de agar Mc Conkey.

Placa de agar sangre.

Citrato de Simmons en tubo de 4 ml.

Agar TSI en tubo de 4 ml.

Agar base sangre.

Agar SIM en tubo de 4 ml.

Caldo MR-VP, 2 tubos con 3 ml.

Tiras reactivas de Citocromo oxidasa.

Reactivo de Elrich modificación de Kovacs.

Hidróxido de potasio al 40%.

Solución de alfa naftol al 0.5%.

Solución de rojo de metilo al 0.2%.

Solución salina fisiológica al 0.85%.

Solución peptona de gelatina.

Solución amortiguadora de fosfatos.

Equipo de colorantes para tinción de Gram.

Caldo nutritivo.

Nota: Todo el material fue esterilizado en una autoclave a 121°C, durante 15 min a una presión de 15

libras.

30

Metodología

1. Reconstitución de Microorganismo de Prueba.

Se coloca un Pellet liofilizado de E. coli ATCC 25922 como el que se muestra en la Fig.9, en

un tubo con 0.5 ml de caldo BHI, se deja macerar dentro del caldo por 15 min a temperatura ambiente

(Fig.10).

Pasar a un cultivo primario o de granulación en agares no-selectivos de enriquecimiento (AN,

AST Y ABS), con un asa bacteriológica calibrada de 30 L, la cual se descarga en la superficie del

agar para generar biomasa, por estría cruzada e incubándola a 35°C 1°C por 24 2 horas.

Fig. 9. Pellet liofilizado de E. coli ATCC 25922.

Fig. 10. Macerado del Pellet en tubo.

31

1.1 Pruebas de Control de Calidad para el microorganismo de prueba

1.1.1 Prueba de citocromo oxidasa

Procedimiento

1. Con un asa de inoculación se toma del medio de cultivo (AN, AST, ABS) una colonia aislada.

2. Aplicar la colonia sobre la zona de las tiras reactivas marca Merck y frotar con el asa de

inoculación (Fig.11).

3. Aproximadamente de 20 a 60 segundos comparar con la escala colorimétrica (Fig.12).

4. Si el microorganismo cumple con el resultado esperado en esta prueba proceder a realizar la

Tinción Gram, para identificar la estructura bacteriana correspondiente a la cepa utilizada y

verificar pureza.

Fig. 11. Inoculación de microorganismos en tiras reactivas.

Fig. 12. Escala colorimétrica de tiras reactivas.

32

1.1.2 Tinción Gram

Manejo de la muestra

1. Agregar una gota de solución salina fisiológica al 0.85% en un portaobjetos previamente

desengrasado.

2. Realizar una suspensión de la muestra sobre el portaobjetos (Fig.13).

3. Fijar la muestra.

Procedimiento

1. Colocar la placa en una gradilla de tinción.

2. Cubrir el frotis con colorante de violeta de genciana y esperar un minuto (Fig.14).

3. Escurrir el colorante de violeta de genciana y enjuagar con agua destilada (Fig.15).

4. Cubrir con solución Yodo Lugol y esperar un minuto (Fig.16).

5. Lavar con solución acetona – alcohol, dejar actuar de 5-15 segundos.

6. Enjuagar para remover restos de colorante.

7. Cubrir el frotis con safranina y esperar un minuto.

8. Enjuagar y secar en medio ambiente y después observar al microscopio.

Fig. 13. Suspensión de microorganismos en SSF 0.85%.

33

Fig. 14. Frotis cubierto con colorante violeta de genciana.

Fig. 15. Frotis cubierto con Yodo-Lugol.

Fig. 16. Enjuague con agua destilada.

34

1.1.3 Reconocimiento de la morfología colonial correspondiente de E. coli ATCC 25922

en agares selectivos y específicos.

Procedimiento

1. Sembrar por estría cruzada a partir de los cultivos primarios (AN, AST, ABS) que se muestran

en la Fig.17, por lo menos en 3 agares selectivos (MC, ABRV y EAM) que se muestran en la

Fig.18 y diferenciales para identificar que la morfología colonial corresponda a las de E. coli

ATCC 25922.

NOTA: Se usará como referencia el certificado de calidad de la cepa utilizada.

Incubar de 24 a 48 horas los cultivos inoculados de 35 1 °C.

Fig. 17. Cultivos primarios (AN, AST, ABS).

Fig. 18. Tres tipos de Agares selectivos diferentes (MC, ABRV, EAM).

1.2 Morfología colonial, morfología bacteriana y pruebas bioquímicas (IMVIC)

(Fig.19).

a) Indol.

b) Rojo metilo.

c) Voges Proskauer.

d) Prueba de Citrato.

35

Tabla 7: Bioquímica IMVIC.

MIO: Movilidad - Indol – Ornitina. Rojo de metilo.

Cultivar E. Coli 25922 en caldo de

peptona.

Para la lectura agregar 2 gotas del

reactivo de Kovacs al cultivo (Para

prueba del Indol).

Se inocula en medio RM-VP.

Incubación a 48 horas a 37°C.

Agregar 3 gotas de rojo de metilo.

Voges Proskauer Citrato

Se inocula 2 medios de RM-VP.

Agregar 2-3 gotas de KOH al 40% y

2-3 gotas de alfa-naftol (dejar

reposar de 10 a 15 minutos).

Estriar en agar citrato de Simmons

(Contiene Azul de bromotimol

como indicador).

Incubación de 24 a 48 horas a 37°C (antes de agregar reactivos).

Fig. 19. Pruebas bioquímicas (IMVIC).

36

Sistema De Identificación Miniaturizado Multiprueba (API).

▪ Preparación de la suspensión bacteriana.

Tomar una colonia aislada de E. coli y re suspenderla homogéneamente en 5 mL de solución

salina (0.85% de NaCl) como se muestra en las Fig.20.

Fig. 20. Suspensión de colonia aislada de E. Coli en solución salina (0.85% NaCl).

▪ Siembra de la galería API.

▪ Cada pocillo tiene un tubo y una cúpula (parte aerobia).

• Llenar con la suspensión preparada de bacterias los tubos (Fig.21), no la cúpula, de todos los

pocillos, excepto para los pocillos CIT, VP, GEL (Brooks K. A., 1974).

Fig. 21. Llenado de los tubos con la suspensión de E. coli.

▪ Sellar la interface aire-líquido con parafina liquida los pocillos (Fig.22), ADH, LDC, ODC, URE,

H2S para generar una reacción anaerobia en el tubo.

37

Fig. 22. Aplicación de la parafina para obtener anaerobiosis.

▪ Poner agua en los alveolos de la cámara para proporcionar una atmosfera húmeda durante la

incubación como se muestra en las Fig.23 y 24 (Castillo C. B., 1984).

▪ Poner la galería en la cámara húmeda e incubar a 37±1°C por 18 a 24 horas.

Fig. 23. Llenado de cámara de incubación.

Fig. 24. Tira API colocada en cámara húmeda para incubación.

38

▪ A continuación, se describen las pruebas a las cuales se les adicionaran reactivos para la

interpretación de resultados (Hayek L., 1984).

Tabla 8: Pruebas que requieren adición de reactivos externos

Triptosa

Desaminasa

Voges Proskauer

Indol

Oxidasa

Reducción de

nitratos

Añadir una

gota de FeCl3

(10%).

Añadir una gota de

reactivo 1 (kOH al

40%) y una gota de

reactivo 2

(C2H5OH), dejar

reposar entre 5 y

10 minutos.

Añadir una

gota de

reactivo de

Kovacs.

Añadir una gota del

reactivo

(tetrafenilendiamina)

recién preparado.

Sobre el tubo

de glucosa,

añadir 1 gota

NIT 1 y 2 gotas

de NIT 2, Dejar

reposar de 2 a

5 minutos.

39


Sistema de inoculación

• Preparación de la suspensión bacteriana a partir de una placa de cultivo (selectiva) reciente

no superior a las 24 horas (Fig.25).

Fig. 25. Suspensión bacteriana en placa selectiva.

1. Preparar el material necesario para la suspensión (Botella de inoculación Prompt,

varilla de inoculación (Fig. 26), bandeja estándar, tapa de transferencia, pie de

RENOK, RENOK).

Fig. 26. Varillas de inoculación.

40

2. Mantener la punta de la varilla perpendicular a la superficie del agar y toque con ella

3 colonias aisladas cuyo tamaño sea al menos tan grande como la punta de la varilla.

No perfore el agar. No raspe ni arrastre el extremo de la varilla por las colonias.

3. Sujetar la varilla por el tapón con una mano y sujete la anilla con la otra, y tire con

firmeza para romper la unión entre la anilla y el vástago de la varilla. No retuerza ni

doble la anilla. Mantenga el extremo de la varilla apuntando al suelo, alejada de usted

y del resto de las personas.

4. Tirar de la anilla lentamente hacia abajo, separándola del vástago de la varilla y

después procede a desecharse.

5. Sujetando la varilla de inoculación con una mano, tomar una botella de inoculación

Prompt.

6. Doblar el cierre de la botella hacia un lado hasta que este se parta.

7. Introduzca la varilla de inoculación dentro de la botella y presione hacia abajo con un

movimiento giratorio para asegurarse de que quede bien cerrado.

8. Agitar bien la botella durante 8 a 10 minutos para que las bacterias se desprendan

del extremo de la varilla. Si no se desprenden deje reposar la solución durante 5

minutos y de nuevo agite (Fig. 27).

Fig. 27. Prompt inoculado.

41

• Colocación de la suspensión en el inoculador

1. Sacar la varilla de inoculación de la botella y deséchela.

2. Verter la suspensión en la bandeja estándar, apretando suavemente la botella (Fig.

28).

Fig. 28. Suspensión de bacterias en bandeja estándar.

3. Con ayuda del RENOK, tomar la tapa de transferencia.

4. Colocarla sobre la bandeja estándar, levante la palanca del RENOK, para generar el

vacío provocando que el inoculo se desplace a la tapa de transferencia del inoculador

(Fig. 29).

Fig. 29. Inoculo desplazado hacia la tapa de transferencia del inoculador.

42

5. Colocar la tapa de transferencia que contiene el inoculo, sobre el panel MicroScan a

utilizar y soltar la palanca. El inoculo se dispensa rehidratando el panel al mismo

tiempo que lo inocula con el microorganismo que se va a analizar (Fig. 30).

Fig. 30. Inoculo rehidratando panel.

6. Finalmente se coloca la tapa de los paneles.

Procesamiento de los paneles en el instrumento WalkAway.

• Antes de procesar un panel se debe hacer lo siguiente:

1. Transmitir la petición del panel desde el Sistema de Información del laboratorio (LIS)

a LabPro o introduzca la selección directamente en LabPro.

2. Colocar una etiqueta de código de barras al panel.

3. Cargar el panel en el Instrumento WalkAway, colocándolo de manera que el código

de barras quede hacia el fondo del equipo (Fig. 31).

Fig. 31. Panel dentro del WalkAway.

• El instrumento incuba los paneles a 35°C durante 2 a 42 horas, dependiendo del panel a

utilizar. NOTA: El panel para E. coli, es Neg Urine Combo 55.

43

1. Preparación y Acondicionamiento de material de prueba.

En frascos estériles (Fig.32), se acondicionan 99 ml de las soluciones a probar (Solución salina

fisiológica al 0.85%, Diluyente 9 y Solución de Fosfatos que se muestran en la Fig.33), para hacer las

diluciones de 10-2, 10-4 y 10-6.

Se identifican las cajas de Petri (15x90 mm) y se procede a vaciar el agar de referencia (AST)

en condiciones de esterilidad, para su posterior siembra por la Técnica de Distribución en Superficie.

Fig. 32. Frascos estériles rotulados.

Fig. 33. Diluyentes de pruebas.

Una vez preparado el material, se procede a tomar una colonia del Agar Soya Tripticasa y se

agrega a un caldo BHI, de donde se toma un mililitro para hacer las diluciones posteriores (Fig.34, 35

y 36).

44

Fig. 34. Cultivo de E. coli con caldo BHI.

Fig. 35. Pipeteo de 1 ml del caldo BHI inoculado.

Fig. 36. Preparación de diluciones con el cultivo de microorganismos.

45

Una vez realizadas las diluciones, a partir de la dilución 10-6 se realiza la descarga de 0.1

mililitro en las cajas del T0 de los diferentes diluyentes (SSF0.85%, S.PO4 y diluyente 9), así como en

los agares AST Y ABRV (Fig.37 y 38).

Fig. 37. Descarga de 0.1 mililitros en cajas con Agar AST.

Fig. 38. Ensayo de T0 en AST y ABRV.

Transcurridos 45 minutos, se realiza el mismo procedimiento, pero solo en Agar Soya

Tripticasa. Una vez realizado el paso anterior, se dejar secar las muestras y posteriormente procede

a realizar el estriado como se muestra en las Fig.39 y 40; e incubar a 371°C por 24 horas.

46

Fig. 39. Estriado de cajas de ABRV.

Fig. 40. Estriado de cajas de AST.

47

Resultados de la identificación de E. coli.

Aislamiento de E. Coli 25922.

Se obtuvo un aislamiento e identificación de E. Coli en los agares AN, ABS Y AST como se

muestra en la Fig.41. Sin embargo, se utilizó el AST como agar de referencia para llevar a cabo las

pruebas de toxicidad de diluyente.

Fig. 41. Crecimiento en placas primarias AN, ABS y AST.

Prueba de citocromo oxidasa

Tabla 9: Resultado prueba Citocromo Oxidasa.

Medio de cultivo Resultado

Agar Nutritivo Negativo

Agar Soya Tripticasa Negativo

Agar Base Sangre Negativa

Fig. 42. Tira reactiva de Citocromo Oxidasa negativa.

48

Tinción de Gram

E. Coli se caracteriza por poseer bacilos Gram negativos debido a que contiene una capa de

petidoglucano mucho más delgada que otros microorganismos, es por ello que no retiene el color

violeta cristal y por esto las células se tiñen con safranina y por ende observamos el color rojo.

Fig. 43. Frotis de E. coli ATCC a partir de los cultivos primarios (AN, ABS, AST).

Fig. 44. Vista en microscopio a 100x.

49

Pruebas bioquímicas (IMVIC)

Tabla 10: Resultado pruebas bioquímica MIO.

MIO Resultado Fundamento

Movilidad Positivo Presencia de turbidez más allá de la línea de siembra.

Indol Positivo Color rojo, al agregar el reactivo de Kovacs.

Ornitina Negativo Color amarillo.

Tabla 11: Resultado prueba bioquímica MR (Voges-Proskauer).

Rojo de metilo (MR) Resultado Fundamento

Lactosa Positivo A/A Coloración roja.

Sacarosa Positivo A/A

Glucosa Positivo A/A

Ac. Sulfhídrico Negativo Vira de color negro en el fondo.

Producción de gas Positivo A/A Separación del medio de cultivo.

A/A= Ácido – Ácido

Tabla 12: Resultado prueba bioquímica VP (Voges-Proskauer).

Prueba Resultado Fundamento

Voges Proskauer (VP) Negativo Color amarillo

50

Tabla 13: Resultado prueba bioquímica Citrato de Simmons.

Prueba Resultado Fundamento

Citrato de Simmons Negativo No hay cambio en la coloración

(verde).

Fig. 45. Prueba Citrato negativa.

Fig. 46. Prueba MIO (M+, I+, O-).

51

Fig. 47. Prueba MR.

Fig. 48. Prueba VP.

52

Sistema de identificación bacteriana API

Tabla 14: Resultados Prueba API.

Prueba Nombre Resultado

ONPG Ortonitrofenol-B-

galactósido

Positivo

ADH Arginina Deshidrolasa Positivo

LDC Lisina Descarboxilasa Positivo

ODC Ornitina Descarboxilasa Positivo

CIT Citrato Sódico Negativo

H2S Tiosulfato Sódico Negativo

URE Urea Negativo

TDA Triptófano Desaminasa Negativo

IND Indol Positivo

VP Piruvato sódico Negativo

GEL Gelatina de Kohn Negativo

GLU Glucosa Positivo

MAN Manitol Positivo

INO Inositol Negativo

SOR Sorbitol Positivo

RHA Ramnosa Positivo

SAC Sacarosa Negativo

53

MEL Melibiosa Positivo

AMY Amigdalina Negativo

ARA Arabinosa Positivo

Fuente: 20 100/20 160, Sistema de identificación de entero bacterias

y otros bacilos Gram negativos no fastidiosos. Biomérieux.

54

Perfil numérico e identificación

Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un patrón numérico de 7 cifras (Fig.49).

Los pocillos están separados en grupos de 3, en total tenemos 7 grupos de 3 tubos. A cada pocillo se

le da un valor de 0, 1, 2 o 4.

• Si la reacción es negativa el valor es 0.

• Si la reacción es positiva el valor es: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el segundo,

4 si es el tercero.

• Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un código de 7 cifras.

• Este código se compara con la tabla de identificación del género y especie de la marca

comercial, para obtener el resultado de la bacteria a prueba.

Fig. 49. Código de identificación E. coli 25922.

El valor obtenido, fue la cifra de 5144552, la cual corresponde al microorganismo Escherichia coli

ATCC 25992.

55

Fig. 50. Pruebas API inoculadas.

Fig. 51. Reacciones bioquímicas de la prueba API inoculada.

56


El resultado obtenido directamente del instrumento WalkAway fue de 99.9% de probabilidad de

que el microorganismo analizado fue E. coli (Fig. 52).

Fig. 52. Informe global del estado del panel analizado.

57

Resultados

El ensayo 1 (e1) se realizó en agar Soya Tripticasa de lote 39-4, en dos tiempos, T0 y T45,

utilizando la técnica de extensión en superficie e incubándolo a 35±1°C durante 24 horas.

Tabla 15: Solución tampón de fosfatos (L:16-4) (e1).

Agar Soya Tripticasa (AST)

Ensayo 1 Lectura 1 Lectura 2 Lectura 3

N° de repeticiones T0 T45 T0 T45 T0 T45

1 68 92 48 100 62 97

2 35 77 70 97 48 96

3 68 73 63 70 66 76

4 101 89 93 88 83 94

5 97 110 129 115 104 116

Promedio 73.8 88.2 80.6 94 72.6 95.8

Tabla 16: Diluyente 9 (L:16-2) (e1).




1 62 138 64 130 68 123

2 89 112 83 135 86 115

3 94 110 109 105 83 95

4 93 58 69 65 84 59

5 69 92 89 97 74 83

Promedio 81.4 102 82.8 106.4 79 95

Tabla 17: Solución Salina fisiológica al 0.85% (L:39-4) (e1).



N° de repeticiones

T0 T45 T0 T45 T0 T45

1 35 82 35 75 34 71

2 35 49 35 64 36 57

3 33 91 33 95 35 78

4 58 59 58 68 54 49

5 68 102 64 97 66 98

Promedio 45.8 76.6 45 79.8 45 70.6

58

Cálculo de prueba de toxicidad

% 𝑻𝒐𝒙𝒊𝒄𝒊𝒅𝒂𝒅 = 𝑻𝟒𝟓 − 𝑻𝟎

𝑻𝟎𝒙 𝟏𝟎𝟎

Tabla 18: % de Toxicidad del diluyente (rango ± 30%) (e1).

Diluyentes S. PO4 Diluyente 9 SSF 0.85%

Promedio T0 75.667 81.067 45.267

Promedio T45 92.667 101.13 75.667

%T 22.467 24.753 67.158

Fig. 53. Distribución de E. coli 25922 en Agar Soya Tripticasa.

59

Agar de referencia (Agar Bilis Rojo Violeta)

Se desarrolló un ensayo al T0 con ABRV de lote 23-4, para comparar la toxicidad del agar con

respecto a sus componentes inhibidores, obteniéndose los siguientes resultados en el ensayo 1.

Tabla 19: Solución tampón de fosfatos(L:16-4) (e1).

Agar Bilis Rojo violeta (ABRV)


N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 83 84 79

2 8 8 8

3 5 5 5

4 0 0 0

5 0 0 0

Promedio 19.2 19.4 18.4



Ensayo 1 Lectura 1 Lectura 2 Lectura

3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 38 43 38

2 38 43 40

3 46 50 48

4 54 53 49

5 53 52 54

Promedio 45.8 48.2 45.8

Tabla 21: Solución salina fisiológica al 0.85% (L:39-4) (e1).



N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 0 0 0

2 6 6 6

3 5 6 5

4 2 2 2

5 0 0 0

Promedio 2.6 2.8 2.6

60

Ensayo 2


Agar Soya Tripticasa (AST) (L:39-4)



1 98 98 95 101 101 103

2 97 93 95 99 99 100

3 95 120 90 119 97 130

4 127 128 117 115 126 133

5 111 106 116 120 120 121

Promedio 105.6 109 102.6 110.8 108.6 117.4





1 124 112 104 107 112 117

2 114 128 110 110 134 126

3 116 129 114 122 124 121

4 98 169 91 163 94 178

5 101 101 82 105 105 114

Promedio 110.6 127.8 100.2 121.4 113.8 131.2

Tabla 24: Solución Salina fisiológica al 0.85% (L;39-4) (e2).




1 91 86 87 83 88 90

2 102 88 99 91 114 91

3 104 91 92 85 104 95

4 69 89 64 80 74 76

5 80 85 85 83 86 88

Promedio 89.2 87.8 85.4 84.4 93.2 88

61



Promedio T0 105.6 108.2 89.267

Promedio T45 112.4 126.8 86.733

%T 6.4394 17.19 -2.838

62


Tabla 26: Solución Tampón de fosfatos (L:16-4) (e2).

Agar Bilis Rojo violeta (ABRV) (L:23-4)


N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 5 5 5

2 9 13 9

3 18 17 22

4 4 4 4

5 0 0 0

Promedio 7.2 7.8 8




N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 5 5 5

2 9 13 9

3 18 17 22

4 4 4 4

5 0 0 0

Promedio 7.2 7.8 8




N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 83 83 89

2 88 87 88

3 97 92 91

4 69 68 68

5 1 1 0

Promedio 67.6 66.2 67.2

63

Ensayo 3





1 119 144 122 148 126 152

2 137 112 131 109 142 114

3 115 93 109 104 118 90

4 130 117 134 93 130 115

5 101 101 102 106 102 107

Promedio 120.4 113.4 119.6 112 123.6 115.6





1 114 107 109 109 120 100

2 126 109 129 92 132 105

3 151 87 149 88 155 82

4 117 120 111 134 120 149

5 133 152 146 144 138 144

Promedio 128.2 115 128.8 113.4 133 116





1 43 24 44 24 56 23

2 75 90 75 87 72 92

3 98 92 100 87 99 94

4 117 73 109 75 114 76

5 98 103 96 98 94 104

Promedio 86.2 76.4 84.8 74.2 87 77.8

64



Promedio T0 121.2 130 86

Promedio T45 113.67 114.8 76.133

%T -6.216 -11.69 -11.47

65





3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 128 129 126

2 83 83 87

3 133 138 131

4 102 99 107

5 113 108 115

Promedio 111.8 111.4 113.2




3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 122 113 119

2 108 110 119

3 114 119 119

4 104 107 105

5 79 77 86

Promedio 105.4 105.2 109.6




3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 89 82 82

2 96 116 109

3 113 116 117

4 120 113 112

5 88 87 85

Promedio 101.2 102.8 101

66

Ensayo 4





1 31 62 30 61 31 61

2 127 72 126 77 130 67

3 98 101 91 98 94 102

4 122 97 120 98 125 99

5 112 65 113 60 115 61

Promedio 98 79.4 96 78.8 99 78





1 115 33 111 35 117 35

2 87 63 85 63 90 67

3 121 76 113 77 116 79

4 99 82 103 81 103 80

5 111 101 114 92 116 95

Promedio 106.6 71 105.2 69.6 108.4 71.2





1 68 76 70 75 65 79

2 103 104 103 104 107 102

3 102 105 95 106 99 107

4 107 73 107 72 111 75

5 102 97 104 96 107 99

Promedio 96.4 91 95.8 90.6 97.8 92.4

67



Promedio T0 97.667 106.73 96.667

Promedio T45 78.733 70.6 91.333

%T -19.39 -33.85 -5.517

68





3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 77 76 80

2 90 90 93

3 67 67 65

4 59 58 69

5 47 47 47

Promedio 68 67.6 70.8




3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 103 107 109

2 85 86 87

3 83 85 86

4 84 80 85

5 82 82 87

Promedio 87.4 88 90.8

Tabla 42: Solución salina fisiológica al 0.85%. (L:39-4) (e4).



3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 92 94 93

2 158 145 148

3 105 105 103

4 92 91 96

5 70 69 73

Promedio 103.6 100.8 102.6

69

Ensayo 5





1 99 78 100 77 99 85

2 113 137 112 132 113 133

3 80 111 80 119 79 118

4 107 137 112 143 111 145

5 118 92 118 91 119 94

Promedio 103.4 111 104.4 112.4 104.2 115





1 60 77 64 68 62 72

2 111 41 102 40 107 43

3 56 39 58 42 60 42

4 78 69 79 72 76 76

5 96 78 90 77 94 73

Promedio 80.2 60.8 78.6 59.8 79.8 61.2





1 49 34 48 34 51 35

2 78 86 78 84 80 84

3 73 80 71 79 74 82

4 61 115 60 111 60 112

5 23 87 22 89 23 91

Promedio 56.8 80.4 55.8 79.4 57.6 80.8

70



Promedio T0 104 79.533 56.733

Promedio T45 112.8 60.6 80.2

%T 8.4615 -23.81 41.363

71





3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 128 130 127

2 107 98 104

3 105 109 107

4 119 114 119

5 92 92 93

Promedio 110.2 108.6 110




3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 70 72 74

2 102 105 107

3 81 81 76

4 101 104 99

5 81 83 81

Promedio 87 89 87.4

Tabla 49: Solución salina fisiológica al 0.85%. (L:39-4) (e5).



3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 75 75 76

2 70 70 69

3 52 52 53

4 53 54 54

5 68 66 64

Promedio 63.6 63.4 63.2

72

Ensayo 6





1 102 39 95 39 97 40

2 51 100 56 107 55 105

3 64 92 64 93 63 91

4 48 42 47 43 50 42

5 19 20 19 21 19 20

Promedio 56.8 58.6 56.2 60.6 56.8 59.6





1 144 112 140 117 142 113

2 169 137 173 134 173 132

3 107 98 104 98 101 101

4 82 54 86 55 88 57

5 98 77 102 76 105 79

Promedio 120 95.6 121 96 121.8 96.4





1 127 131 122 133 124 132

2 81 44 82 45 83 44

3 58 54 58 55 59 58

4 18 34 18 35 19 37

5 27 33 27 33 26 33

Promedio 62.2 59.2 61.4 60.2 62.2 60.8

73



Promedio T0 56.6 120.93 62..933

Promedio T45 59.6 96 60.067

%T 5.3004 -20.62 -3.014

74





3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 68 68 68

2 88 89 91

3 96 94 96

4 88 87 89

5 73 73 74

Promedio 82.6 82.2 83.6




3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 98 99 100

2 133 132 135

3 108 111 110

4 101 99 99

5 98 99 100

Promedio 107.6 108 108.8




3

N° de repeticiones

T0 T0 T0

1 72 73 72

2 63 62 64

3 53 51 51

4 42 43 44

5 18 18 17

Promedio 49.6 49.4 49.6

75

Análisis de Resultados.

Para el análisis estadístico se utilizó el programa Statgraphics Centurión XVl Versión 161.03,

a través de un análisis de prueba de medias (ANOVA Simple), para la interpretación de los resultados

mediante el método estadístico de la diferencia significativa mínima (LSD) de Fisher, este

procedimiento ejecutó un análisis de varianza de un factor con el fin de comparar los valores medios

de Porcentaje de toxicidad para los tres diferentes niveles (diluyentes).

La prueba-F determina las diferencias significativas entre las medias mediante las Pruebas de

Rangos Múltiples.

Tabla 57. Resumen Estadístico para Porcentaje de Toxicidad de los tres diluyentes.

TOXICIDAD DE DILUYENTE

Recuento Promedio Desviación Estándar Coeficiente de Variación

Diluyente 9 6 -8.0045 23.6574 -295.551%

Solución tampón de fosfatos

6 2.84372 14.2268 500.29%

Solución Salina Fisiológica 0.85%

6 14.2803 32.1766 225.321%

Total 18 3.03985 24.8255 816.67%

Tabla 58. Sesgo estandarizado de los diluyentes.


Mínimo Máximo Rango Sesgo Estandarizado

Diluyente 9 -33.85 24.753 58.603 0.631532


-19.39 22.467 41.857 -0.410436


-11.47 67.158 78.628 1.19492

Total -33.85 67.158 101.008 1.78532

Tabla 59. Curtosis Estandarizada de los diluyentes.

TOXICIDAD DE DILUYENTE Curtosis Estandarizada

Diluyente 9 -0.791343

Solución tampón de fosfatos 0.297421

Solución Salina Fisiológica 0.85% -0.145687

Total 1.17337

76

La tabla muestra el análisis de varianza de la toxicidad para cada uno de los diluyentes

mediante la comparación de medias usando la suma de cuadrados y los grados de libertad, utilizando

un nivel de confianza del 95%.

Tabla 60. Diferenciación significativa mediante el Valor-P.

Fuente Suma de Cuadrados

°GL Cuadrado Medio

Razón-F Valor-P

Entre grupos 1490.19 2 745.094 1.24 0.3164

Intra grupos 8987.03 15 599.135

Total (Corr.) 10477.2 17

Descompone la varianza del porcentaje de toxicidad en dos componentes: un componente

entre-grupos y un componente intra-grupos. La razón-F es igual a 1.24, es el cociente estimado entre

grupos y el estimado intra-grupos. Puesto que el valor-P de la razón-F es mayor que 0.05, por lo que

no existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de los porcentajes de toxicidad

de los diluyentes.

Tabla 61. Medias para Porcentaje de Toxicidad con intervalos de confianza del 95%.

Error Est.

Nivel Casos Media (s agrupada) Límite Inferior Límite Superior

Diluyente 9 6 -8.0045 9.99279 -29.3037 13.2947


6 2.84372 9.99279 -18.4555 24.1429


6 14.2803 9.99279 -7.01885 35.5795

Total 18 3.03985

La tabla muestra la media del porcentaje de toxicidad para cada diluyente, también muestra

el error estándar de cada media, el cual es una medida de variabilidad de su muestreo. El error

estándar es el resultado de dividir la desviación estándar mancomunada entre el número de

observaciones en cada diluyente. Se interpreta un intervalo alrededor de cada media y en las Pruebas

de Rangos Múltiples, estos se usan para determinar cuáles medias son significativamente diferentes

de otras.

77

Tabla 62.Pruebas de Múltiple Rangos para Porcentaje de Toxicidad mediante el método: 95% Student-Newman-Keuls.

Nivel Casos Media Grupos Homogéneos

D9 6 -8.0045 X

SPO4 6 2.84372 X

SSF 6 14.2803 X

Se ha identificado un grupo homogéneo, la alineación de la X’s en la columna de la tabla

anterior, muestra que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los diluyentes, en la

prueba de múltiples rangos empleadas para diferenciación entre media.

Tabla 63. Tabla de diferencia significativa entre los diluyentes.

Contraste Sig. Diferencia

D9 - SPO4 -10.8482

D9 – SSF -22.2848

SPO4 – SSF -11.4366

* indica una diferencia significativa.

No hay diferencias estadísticamente significativas entre cualquier par de medias, con un nivel

de 95% de confianza. El método empleado para discriminar entre las medias es el procedimiento de

comparación múltiple de Student-Newman-Keuls.

Fig. 54. Medias de Porcentaje de Toxicidad de los tres diluyentes con 95% (s agrupada).

D9 SPO4 SSF

Medias y 95.0% (s agrupada)


-30

-10

10

30

50

PO

RC

EN

TA

JE

DE

TO

XIC

IDA

D

78

La Fig. 54 muestra la relación entre el porcentaje de toxicidad y los diluyentes, utilizando un

nivel de confianza del 95%.

Fig. 55.Grafico de Cuartiles de Porcentaje de Toxicidad.

La norma ISO 11133:2014 establece un porcentaje de toxicidad aceptable de ±30%, en la

figura se muestra que la solución tampón de fosfatos es el único diluyente que mantiene una tendencia

dentro del rango establecido (Fig. 55). Los resultados de los ensayos realizados mostraron que 2 de

6 porcentajes de toxicidad de la solución salina fisiológica 0.85% se encuentran fuera de los limites,

mientras que el diluyente 9 muestra solo 1, por lo que estadísticamente la solución tampón de fosfatos

tiene un resultado de toxicidad estable y dentro del rango permitido por la norma, por lo anterior este

medio sería el de elección con respecto a solución salina fisiológica 0.85% y diluyente 9.

Gráfico de Cuantiles

-40 -20 0 20 40 60 80

PORCENTAJE DE TOXICIDAD

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

pro

po

rció

n

TOXICIDAD DE DILUYENTED9SPO4SSF

79

Fig. 56. Grafica de Probabilidad normal (Residuos).

La Fig. 56 representa la relación entre los residuos contra un porcentaje acumulado,

mostrando una distribución lineal con apego a la recta, sin embargo, hay puntos que no siguen la

misma tendencia. En la figura se observa los porcentajes de toxicidad de la solución salina fisiológica

al 0.85%, siendo estos los únicos que no siguen un patrón lineal. Haciendo énfasis en que los 3

diluyentes no muestran diferencias significativas con respecto a los residuos.

Análisis estadístico

De acuerdo al análisis estadístico anterior, se determina que no existe diferencia significativa

entre los 3 diluyentes en consideración con los limites 30% de toxicidad, pero sin embargo es posible

observar que la solución tampón de fosfatos presenta una menor variación con respecto a su toxicidad,

manteniéndose más cercano al 0, siendo este el valor estándar para mantener la concentración

original de las células.

Gráfica de Probabilidad Normal

-26 -6 14 34 54

RESIDUOS

0.1

1

5

20

50

80

95

99

99.9

po

rce

nta

je a

cu

mu

lad

o

80

Conclusiones

Como resultado de la investigación documental y durante la práctica en el laboratorio, se logró

determinar que la solución salina fisiológica 0.85% no es el mejor medio para mantener sin variación

la concentración logarítmica de bacterias, de acuerdo a los porcentajes de toxicidad de diluyente que

mostro el análisis estadístico.

La hipótesis de trabajo fue planteada de acuerdo a la formulación de los diluyentes. En dicha

hipótesis se estableció basado en datos empíricos y debido a que la solución salina fisiológica 0.85%

no contiene ningún tipo de nutriente, pero si la concentración de sales adecuadas para mantener la

osmosis apropiada que era la que arrojaba resultados más confiables, sin embargo después de haber

realizado la prueba de toxicidad de diluyente con las 30 repeticiones, se determinó que esta solución

imparte una tendencia a incrementar la concentración original de unidades de prueba, incluso

rebasando los límites establecidos por la norma (±30%).

Se observó que es importante considerar la variación de pH en el caso de la solución salina

fisiológica 0.85%, con el fin de incrementar su eficiencia como diluyente.

La solución tampón de fosfatos, es el más viable para mantener la concentración de bacterias

original, tomando como referencia el T0 y T45, por el método de diferencia significativa mínima (LSD),

con un 95% de confianza. La estadística permite hacer comparaciones entre diluyentes.

El diluyente 9 presenta similitudes con la solución tampón de fosfatos, sin embargo, el

diluyente 9 es propenso a sufrir contaminación en el momento de la inoculación del microorganismo

de prueba, ya que es el único que contiene un componente proteínico a comparación de los otros dos

diluyentes en los que su formulación solo es constituida por sales minerales.

81

Discusión

Un diluyente no debe aumentar o disminuir considerablemente la concentración original de

bacterias de una muestra, por lo que la Solución Salina Fisiológica al 0.85% fue más viable como

diluyente de las suspensiones de E. coli. Sin embargo, finalmente los ensayos determinaron que la

solución tampón de fosfatos fue la mejor (14.28, 2.84% Toxicidad respectivamente), no obstante, la

solución salina fisiológica 0.85% fue menos susceptible a contaminarse por el medio ambiente.

La fórmula del diluyente 9 incluye peptona, que puede actúa como principal fuente de

nitrógeno en cultivos bacterianos. Concediendo esta característica adicional sobre los otros dos

diluyentes, podría ser que permitiera el incremento de la población bacteriana durante los 45 minutos.

También podría permitir el desarrollo de la contaminación ambiental, en el lapso de tiempo que se

requiere para la inoculación, alterando la concentración original de la población bacteriana.

La solución tampón de fosfatos, puede mantener una respuesta celular de la población dentro

de los límites establecidos, de acuerdo a las unidades de prueba con una variación menor de

concentración original. También, mantiene la presión osmótica y el pH adecuado para el crecimiento

de E. coli.

Recomendaciones

Se recomienda el uso de solución tampón de fosfatos como principal diluyente, en segundo

lugar, la solución salina fisiológica al 0.85% y como última opción el diluyente 9, para análisis

microbiológico de aguas, alimentos y superficies,

82

Conclusión del ABRV (Medio de cultivo de prueba)

La ISO 11133:2014 establece el uso del Agar Soya Tripticasa como medio de referencia para

recuperación y aislamiento de bacterias Gram negativas aerobias, por lo que para el microorganismo

de prueba E. coli, se utilizó dicho agar. Sin embargo, fuentes bibliográficas indican que el Agar Bilis

Rojo Violeta permite llevar a cabo la detección e identificación presuntiva del microorganismo, sin

embargo, como dato alternativo se obtuvo una toxicidad inherente en la formulación del Agar Bilis Rojo

Violeta, ya que, el conteo en el tiempo 0 en este agar resulto mucho menor a los conteos en tiempo 0

del Agar Soya Tripticasa. También se determinó una sumatoria de toxicidades cuando se utiliza el

diluyente 9 en el Agar Bilis Rojo Violeta, obteniendo en algunos casos la mortalidad total de la

concentración de unidades de prueba.

83

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85

PROYECTO APROBADO POR:

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