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Cristalografía de rayos X (RXs) de macromoléculas Como utilizar la física para conocer la biología It's a miracle that curiosity survives formal education A. Einstein
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Cristalografía de rayos X (RXs) de macromoléculas
Como utilizar la física para conocer la biología
It's a miracle that curiosity survives formal educationA. Einstein
La radiación electromagenética interactúa con la materia
La longitud de onda de los RXs es del orden de la distancia entre átomos: 1,5Å
La cristalografía utiliza una computadora para reconstruir la imagen del objeto
Los rayos de luz visible son difractados por el objeto y enfocados por un lente
Los RXs no pueden ser enfocados por lentes
La difracción de los RXs por una sola molécula es muy débil
Por tanto...
…medimos la dirección e intensidad de los rayos difractados y utilizamos una computadora para reconstruir la imagen
…utilizamos cristales de proteína para incrementar la señal
¿Qué son los cristales?
Son un arreglo ordenado tridimensional de objetos
Cristal!!!!
¿Qué son los cristales?
Los cristales son arreglos de moléculas ordenados por traslación
Los cristales de macromoléculas se mantiene unidos por fuerzas iónicas débiles entre las
distintas moléculas
Contienen aproximadamente un 40% de solvente
¿Cuándo se comenzaron a producir cristales?
Los primeros intentos fueron a mediados del siglo XIX
La búsqueda sistemática de condiciones de cristalizción comenzó hacia la década del 50'
Los kits de cristalización fueron pensados en los 80' pero no se comercializaron hasta los 90'
Se introdujo la robótica hacia fines del 90'
Las técnicas en nanoescala comenzaron en el siglo XXI
Historia
1853 Hemoglobin Lehman, CG. Lehrbuch der physiologische Chemie.
Leipzig
1926 Urease Sumner, JB. J Biol Chem. 69: 435
1930 Pepsin & other proteolytic enzymes Northrop,
JH, Kunitz, M, Herriot RM. Crystalline Enzymes. Columbia University Press, NY (review)
1934 Pepsin Diffraction Bernal JD & Crowfoot, D. Nature, 133:794
1935 Tobacco Mosaic Virus Stanley, WM. Science. 81: 644
¿Cómo se crecen los cristales?
Bajo condiciones de laboratorio controladas
A diferencia de las sales inorgánicas que se producen por fusión
Inclusive las móleculas orgánicas pequeñas se cristalizan con cambios de temperatura
Con las proteínas se evitan este tipo de técnicas
Creciendo cristales
Conmpuestos inorgánicos – enfriando una solución saturada
Compuestos polares orgánicos – lo mismo o precipitando desde una solución acuosa con solventes orgánicos
Proteínas – Lo anterio es mortal!!!
1. Disolviendo en un buffer y precipitando
2. Controlando la evaporación
Diversos tipos de cristales de proteínas
Los cristales no son perfectos
Mosaicidad
La estructura cristalina es similar a la de solución
Retienen actividad enzimática
Estructuras resueltas por RMN son similares a las de rayos X
Diferentes formas de cristalización producen la misma estructura
Puede haber diferencias significativas en loops y aminoácidos de superficie
¿Cómo se producen cristales 3D?
En general involucra la creación de orden tridimensional
En la práctica con macromoléculas significa la creación de condiciones tales que las fuerzas intermoleculares son ejercidas de la misma manera sobre cada macromoléculas
Estas fuerzas son:
Polares
Mediadas por moléculas de agua
Débiles
¿Cómo se producen cristales?
Respuesta rápida: disminuímos gradualmente la solubilidad de la proteína de manera que produce una precipitación ordenada (cristalización) más que una precipitación desordenada (amorfa)
Conozca su proteína
Presencia de cisteínas libres
¿Une sustratos o ligandos? ¿Están presentes en la preparación?
Sensibilidad a proteasas
Unión de metales
Estabilidad y/o actividad a diferentes pHs y temperaturas
Modificaciones post-traduccionales
Preparación de proteína
Purificación de fuentes naturales
Expresión recombinante con fusiones para facilitar la purificación
Sistemas de expresión: E. coli, levadura Baculovirus, células de mamíferos, etc.
Preparación de proteína
Estrategia de purificación:
1) Optimización de la expresión
2) Preparación del extracto libre de células
3) Fraccionamiento con sulfato de amonio o PEG
4) Cromatografía de afinidad
5) Cromatografía de intercambio iónico
6) Cromatografía de exclusión molecular
Variables de cristalización
Precipitante PEG Sales (Sulfato de amonio, LiCl, NaCl, etc) Alcoholes (isopropanol, MPD)
pH
Concentración de proteína
Temperatura
Aditivos
Sustratos o cofactores
¿Cómo se crecen cristales?
Robot de cristalización
Diagrama de fase para cristalización
Ejemplo. Cristalización de lisozima
Kits de cristalización
Soluciones con las condiciones que funcionaron antes.
Se utilizan para elegir las condiciones iniciales. Soluciones de aditivos Hamptom Jena Bioscience Emerald Qiagen
Optimización
Mover las condiciones de cristalización Concentración y tipo de precipitante Concentración de proteína Tipo de buffer y pH Aditivos
La idea es muestrear el espacio de cristalización
Factores que afectan la cristalización
Físicos: Temperatura, presión, viscosidad, vibración, superficie.
Químicos: pH, precipitante, fuerza iónica, metales.
Bioquímicos: pureza, ligandos, modificaciones post-traduccionales, proteolisis.
Ingeniería: proteínas de fusión, diferentes construcciones, mutantes
Estructura sin cristales
XFEL: X ray free electron laser
Desafíos en estructura de móleculas individuales
●Sincronización de proteína hidratadas. No tienen que tener mucha agua.
●Reconstitución de la imagen 3D proveniente de imágenes 2D tomadas al azar.
●Muy poca cantidad de fotones detectados en cada pulso.●Recolección dentro de los 20 fs luego de la llegada del
pulso. Después de que la mólecula es iluminada pero antes que se degrade.
Cristales y celda unidad
La celda unidad
Por convención y sencillez los ejes de coordenadas siguen la dirección de los bordes de la celda unidad
Sistemas cristalinos
Triclínico: no simetría
Monoclínico: un eje de simetría 2
Ortorómbico: tres ejes de simetría 2 perpendiculares
Trigonal: un eje de simetría 3
Tetragonal: un eje de simetría 4
Hexagonal: un eje de simetría 6
Cubico: 4 ejes de simetría 3
Experimento de difracción
Sincrotrón
Magnetos
Cabina de medición
Anillo de electrones acelerado
Montado de cristales para colectar datos
Experimento de difracción
Imagen de difracción
Ley de Bragg
Bragg demostró que un conjunto de planos paralelos produce una difracción solo si:
2 dhkl sen = n
Detectamos la difracción sólo cuando hay interferencia positiva entre R1 y R2
La intesidad del rayo difractado depende de cuantos átomos hay en el conjunto de planos
Ley de Bragg
Difracción constructiva. Produce imagen de difracción
Ley de Bragg
Difracción destructiva. No produce imagen de difracción
Imagen de difracción
Indices de Miller
Tres letras (hkl) que identifican un conjunto particular de planos equivalente y paralelos
Cada letra se asocia con un eje.
H con X
K con Y
L con Z
Los indices de Miller pueden ser negativos
Los conjuntos de planos que tienen índices de signos opuestos son idénticos
Colectando datos de difracción
W. L. Bragg demostró que el ángulo que un rayo difractado emerge de un cristal puede ser calculado tratando la difracción como si la reflexión fuera de un conjunto de planos de átomos paralelos y equivalentes.
Los planos más obvios son las caras de la celda unidad
Este modelo asume que cada difracción es una reflexión de un conjunto de planos
Esta manera de interpretar la difracción es útil para geometría de la colecta de datos. La estructura se resuelve interpretando que cada átomo es un difractor independiente
Otra forma de interpretar la difracciónComo proveniente de un objeto
?
Entendiendo el fenómeno de difracción
Difracción en 3D
Matemática de la cristalografíaFunciones de onda
f(x) = F cos 2 (hx + )
f(x) = F sen 2 (hx + )
variablesamplitud frecuencia
Series de Fourier
f0 =1
f1 = cos 2 (x)
f2 = (-1/3) cos 2 (3x)
f3 = (1/5) cos 2 (5x)
Cada rayo difractado impactado en el film
produce una reflexión que puede ser descripta como
la suma de las contribuciones de todos
los elementos que producen dispersión en la
celda unidad
Reflexión
Factores de estructura: una serie de Fourier de cada reflección
Ecuación de factores de estructura: una suma de Fourier que describe un rayo difractado
La suma computada de la serie de Fourier de la reflexión hkl es llamada el factor de estructura Fhkl
Fhkl = fA + fB + …+ fA´ + fB´ + … + fF´
Si la difracción del átomo A es representada por fA
Todos los átomos contribuyen a cada reflección en el patrón de difracción
Densidad electrónica a partir de los factores de estructura
Se puede dividir la celda unidad en pequeños volumenes y calcular los factores de estructura con la densidad electrónica de estos volumenes utilizando una serie de Fourier
Fhkl = f(1) + f(2)+ … + f(m) + … + f(n)
Cada reflección es descripta por una ecuación similar por lo tanto tenemos muchas ecuaciones que describen las refelcciones en términos de la densidad electrónica
¿Existe alguna manera de resolver dichas ecuaciones para la función (x,y,z) en función de la reflecciones obtenidas?
La transformada de Fourier
La transformada de Fouriery
la transformada inversa de Fourier
El problema de las fases: el patito de Kevin Cowtan
El problema de las fases
El problema de las fases
Se resuelve basicamente por tres métodos 1) derivados de átomos pesados (reemplazo isomorfo), 2) dispersión anómala y 3) reemplazo molecular
Derivados de átomos pesados consiste en adicionar metales pesados a los cristales para obtener derivados que producen una leve diferencia en las intensidades de reflexiones. A partir de esa diferencia se calcula la posición de los átomos pesados y las fases de la proteína se obtienen computando varios derivados.
En dispersión anómala se toma ventaja de que los átomos pesados son capaces de absorber rayos X a una determinada long de onda. El resultado es que no se cumple la ley de Friedel de reflexiones simétricas.
En reemplazo molecular el concepto es que proteínas similares tendrán fases aproximadamente similares de manera que podemos tomar prestadas las fases de una proteína de estructura conocida y utilizarlas con las intesidades calculadas.
Reemplazo Isomorfo
Se agregan átomos pesados que incrementan el número total de electrones pero no cambian el grupo de espacio o el tamaño de la celda. Eso modifica las intensidades sin cambiar el patrón de difracción
Reemplazo isomorfo
Reemplazo Isomorfo
Una vez obtenido la posición de los átomos pesados se puede calcular Fh entonces se tienen dos posibles fases para cada Fp
Se suman varios reemplazos para ganar precisión
Dispersión anómala
La idea es que uno o más átomos con número atómico grande pierden cierta cantidad de energía del raxo X en forma de scattering. Depende de la longitud de onda
Pares de Friedel
Las reflexiones con inversión de índices de Miller tienen la misma intensidad pero dirección opuesta
Dispersión anómala
No se cumple la ley de Friedel
Pregunta: cómo se verán las imágenes de difracción?
Dispersión anómala
Reemplazo molecular
Consiste en tomar la fases prestadas de un modelo resuelto que sea similar a la estructura a determinar
Para obtener la fases se usan dos funciones:
Función de rotación
Función de traslación
Permiten ubicar el modelo en la celda de la estructura incognita para luego combinar las intensidades experimentales con las fases del modelo
Densidad electrónica a partir de las reflexiones obtenidas
¿Están todos los parámetros que necesitamos en los datos obtenidos en las Imágenes de difracción?
La intensidad de cada punto es la amplitud del factor de estructura
La frecuencia es la posición hkl de cada punto
f(x) = F cos 2 (hx + )
La fase se pierde y debe obtenerse de otra manera
Mapas de densidad electrónica
Son utilizados como punto inicial para modelar las moléculas
Mapas de densidad e importancia de la resolucion
Refinamiento
A los mapas iniciales se realiza un ciclo de refinamiento y modificaciones que consisten en ajustar los datos iniciales al modelo.
Las intensidades no se modifican
Se cambian las fases
El ajuste se sigue por los indicadores R y Rfree
Ciclo de refinamiento
Validación
Se chequea la estereoquímica que sea compatible con lo conocido
Presencia de aguas estructurales. Muchas pueden indicar sobrerefinamiento
Estructura-Función
Analizar el sitio activo de las enzimas para conocer los mecanismo catalíticos
Conocer cuales son los sitios de reconocimiento de la unión proteína-proteína. Anticuerpos.
Estudios de plegamiento de proteínas.
Estudios de canales de membrana.
Mioglobina
Kendrew et al determinaron la estructura de la mioglobina en 1958.Fue la primer estructura a 2A En 1962 John Kendrew y Max Perutz obtuvieron el Nobel por esta estructuraEs uno de los pilares de la biología molecularPermitió comprender las bases estructurales de los mecanismos de unión y liberación de oxígeno
La subunidad grande (50S) del ribosoma
El ribosoma consiste de dos subunidades, las cuales se unen formando un surco donde se ubica el ARN mensajero. La subunidad grande está compuesta por dos hebras de ARN y varias proteínas que estabilizan las estructura. La estructura indica que el ARN, y no la proteína, es el que cataliza la formación de los enlaces peptídicos en la síntesis de proteínas. Apoyando la teoría que sostiene que el ARN antecede a las proteínas en la evolución.
La estructura de aprox 100.000 átomos fue resuelta a 2.4A en el año 2000 por Tom Steitz de la Univ de Yale
Modelos y moléculas
La imagen muestra modelos, no moléculas
No se muestran la estructura e interacciones sino que están dibujadas.
Las moléculas están en estado cristalino, no en solución
Los modelos corresponden a un promedio de entre 1013 y 1015 proteínas presentes en el cristal
Además las estructuras están promediadas en el tiempo que dura el experimento de cristalografía.
![Magnetismo y óptica...Magnetismo y óptica Parte II: Óptica (Tiempo aproximado: 27 horas) 4. Difracción. [Abr18-Abr22] (3 horas). a. Introducción a la difracción. Difracción](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/5ff02a844a3a097e462eec9d/magnetismo-y-ptica-magnetismo-y-ptica-parte-ii-ptica-tiempo-aproximado.jpg)
