DIAGNOSTICO Vol. 50(1) Enero - Marzo 2011 . Trasplante de tejidos - Células madre e'stem") . Arias-Stella, J.

(Comentari~s Médico~0"-"o ."""

Un nuevo camino para el trasplante de tejidosSobre las células madre (#stem#) pluripotentes inducidas

Javier Arias-Stella1

La disponibilidad de óvulos fertilizados, desechados enlas Clínicas de Fertilización en el mundo, estimuló a losinvestigadores a intentar el cultivo de células embrionariashumanas (11.

El embrión, en el estadio de blastocisto, es una bolsaque tiene una envoltura o capa de células externas y una zonainterna engrosada denominada la masa de células internas ICM("internal cell mass"). La envoltura es la que, producida laimplantación, da lugar a la placenta. La "masa celularinterna", 1CM, es la que forma el feto (1).

Hace ya algún tiempo que experimentos realizados enanimales menores demostraron que al colocar el blastocisto enun petri o placa de cultivo de células, la envoltura o capa celularexterna se colapsa y eventualmente desaparece quedando solola "masa de células internas". Estas células pueden, conmedios apropiados, cultivarse indefinidamente en ellaborato-rio. Con algunas variantes de procedimiento estos mismosexperimentos se realizaron en primates, y en 1998 James A.Thomson y col., de la Universidad de Wisconsin, lo lograron,igualmente, con las células del blastocisto humano. Desdeentonces se pueden cultivar células derivadas de la blástulahumana. Estas son las llamadas células madre ("stem'')embrionarias humanas (11.

Las células madre tienen variable potencial: solamenteel cigoto y los descendientes de las primeras dos divisiones sontotipotentes, capaces de formar embrión y placenta (21.Después de alrededor de cuatro días, luego de la fertilización,estas células comienzan a especializarse, proceso que se llamadiferenciación.

Llámese células madre embrionarias o ES ("embrionicstem ") a las derivadas de la ICM (3).

Las células ICM (en los primeros 5 - 6 días después dela formación del cigoto) son pluripotentes, esto es, capaces dediferenciarse en cualquiera de las células que forman las trescapas germinales (2).

Avanzado el proceso de diferenciación, 15 - 16 días, lascélulas embrionarias se hacen multipotentes, esto es, solopueden formar algunas de las células de la misma hoja germinalde donde provienen (2).

El procesodediferenciación esnormalmenteunidirec-cional. Producido el nacimiento del nuevo ser los órganos estánconstituidos por células diferenciadas o adultas. Sin embargo,la mayoría de los tejidos en los órganos tienen una reserva decélulas madre ("stem '') multipotentes, capaces de producir unlimitado rango de células diferenciadas, que sirve parareemplazar a las células que se dañan o mueren. Por ejemplo, enel intestino delgado, las células madre pueden producir cuatrolíneas de linaje propio (células de Paneth, células "globet" oproductoras de moco, células columnares absorbentes y célulasenteroendocrinas) (2).

Tener en el Laboratorio por tiempo indefinido, semanaso meses, cultivos de "células embrionarias pluripotenteshumanas" constituye un asunto que ha originado granexpectativa por la trascendencia que puede tener para el futurode la medicina (4"5).

Las células embrionarias e indiferenciadas conestímulos específicos apropiados, factores de crecimiento,transcriptores y otras moléculas del lenguaje intercelular -quecada vez se descubren y definen con mayor precisión- puedendiferenciarse en tejidos específicos.

En la medida en que se reconozcan mejor los factoresque determinan la diferenciación celular específica, se estará encondiciones de producir células y tejidos para usarlos en laterapia médica. La idea es poder reemplazar las célulasdañadas, en distintos órganos, por células normales. Por eso esque se habla de "ingeniería de tejidos y órganos". y se hancomenzado a patentar procedimientos de formación de célulaso tejidos para corregir condiciones patológicas en diver~osórganos.

Sin embargo, los cultivos de células madre embriona-rias humanas no escapan al problema básico derivado de laindividualidad biológica genética.

Cada línea de células madre tiene la especificidadgenética del embrión de donde provino, de tal manera queestarán siempre expuestas a las reacciones inmunológicas delorganismo receptor. En otras palabras, los pacientes tratadoscon estas células tendrían que, como los pacientes detrasplantes de órganos, someterse a terapias inmunosupresivas./

¡ProfesorEmérito de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH). Instituto de Patología yBiologia Molecular Arias-Stella.

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La única forma de evitar estas reacciones inmunoló-

gicas esque las células embrionarias madre reemplazantes seanderivadas del propio paciente en que se quiere reemplazaralgún tejido enfermo y esto solo puede obtenerse a través de laclonación terapéutica o clonación de investigación (6.7).

Solo así se garantizaria un trasplante o reemplazotisular sin la limitación del rechazo inmunológico.

Como hemos mencionado en otro lugar, la clonaciónterapéutica o clonación de investigación, se consigue por latécnica de "transferencia nuclear de células somáticas oclonaje", que consiste en extraer el material genético nuclear,de una célula adulta e introducirlo en un huevo al que se le haextraído el núcleo, "ovum vacío ". De este nuevo híbrido sedesarrollará un embrión y deéstese obtienen las células madrepluripotentes. Se logra así revertir el reloj del desarrollo celulary retrotraerlo a la condición decélula embrionaria, proceso quese ha denominado "reprogramación celular". Una célulaadulta se ha reprogramado, en el laboratorio, a célula embrio-naria (7).

Lograda la técnica de transferencia nuclear de célulassomáticas o clonaje, hubo grandes esperanzas de poder, a partirde esas células pluripotentes humanas, reemplazar tejidosdañados y tener armas para curar enfermedades.

Laboratorios como Advance Cell Technology e investi-gadores como Gerarld Schatten de la Universidad de Pittsburg(8.9),y luego Hwang, Moon y col. (10)de la Universidad de Seúl enCorea del sur, comunicaron sucesivos estudios donde sealternaron resultados alentadores con fracasos.

Pronto, sin embargo, se fue aprendiendo que conseguirla diferenciación específica de las líneas cultivadas de célulasembrionarias, si bien se obtenía con algún éxito en animalesmenores, no resultaba igualmente feliz en el caso de las célulasmadre embrionarias humanas obtenidas por clonaje.

Los experimentos en múltiples laboratorios, académi-cos y privados, que se han desarrollado, sobretodo en EstadosUnidos e Inglaterra, con el objeto de inducir la diferenciaciónespecífica en los cultivos de células madre embrionariashumanas, no han resultado, hasta ahora, del todo felices. Se hanreportado éxitos parciales pero a la larga se ha concluido quetodavía no se obtienen células diferenciadas específicas avoluntad y confiables (11).

Así las cosas, vino el experimento de Shinya Yamanakay sus colaboradores, de la Universidad de Kyoto, Japón, enagosto del 2006. Ellos le dieron la vuelta al problema dereprogramación celular utilizando una tecnología nueva paratransformar células adultas en células pluripotentes sin lanecesidad de usar huevos o embriones (12).

Lo primero que hicieron fue identificar un cóctel de dosdocenas de genes diferentes que están activos en las célulaspluripotentes pero silentes en las células adultas. Cuando estosgene s, usando retrovirus como vehículos, fueron introducidos

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en células de la piel del pericote, ellos fueron capaces dereprogramar a las células de la piel en células pluripotentes. Aestas células les dieron el nombre de iPSCs ("inducedpluripotent stem cells") (12.,5).

Dado que, en los últimos años los investigadores, comohemos antes subrayado, han estado embarcados en la tarea delograr manejar células embrionarias para conseguir sudiferenciación en células específicas que pudieran serutilizadas en la medicina, enfrentando problemas éticos ypolíticos, la noticia del experimento de Yamanaka fue tomadacon un poco de escepticismo. Sin embargo, pronto se comprobóque la nueva técnica era válida y hoy cientos decientíficos estántrabajando en todo el mundo para investigar el potencial de las"induced pluripotent stem cells" (iPSCs) siguiendo elprocedimiento del grupo japonés, con la meta de saber si estascélulas pueden servir para tratar enfermedades humanas quehasta hoy desafian curación, tales como: diabetes tipo 1,enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson.

Sucesivos experimentos fueron demostrando, al grupode investigadores japoneses, que no eran indispensables ungran número de genes para inducir la formación de iPSCs, yeventualmente comunicaron que con solo cuatro genes, Oct4,Sox2, Klfy c-Myc, ello era posible (16-18).

La figura 1, tomada de la comunicación de KonradHochedlinger, profesor asociado de la Universidad de Harvard,en Scientific American, de Mayo 2010 (11),da una idea de cómolos cuatro genes se insertan usando la cadena genómica de unretrovirus inyectada en las células de la piel de pericotes. Elvirus incorporó los genes en el ADN del pericote, y estos genescomenzaron a reprogramar las células de la piel en célulasmadre pluripotentes inducidas (iPSCs).

El gen Oct4, también llamado POU5Fl, se localiza enel cromo soma 6 y está constituido por 114,317 bases. Codificael factor de transcripción de la familia PO U: POU5F 1,proteínaque está críticamente involucrada en la capacidad de autore-novación e indiferenciación de las células madre embrionarias.

El gen Sox2 se localiza en el cromo soma 3 y estáconstituido por 2,503 bases. Codifica la proteína SRY-BOX2,también conocida como Sox2, que es un factor de transcripcióncuya función es esencial en el mantenimiento de la renovaciónde las células madre no diferenciadas.

El gen Myc se localiza en el cromosoma 8 y contiene5,359 bases. Este gen codifica una fosfoproteína nuclearmultifuncional que juega un rol importante en el ciclo celular,apoptosis y transformación celular. Se trata de un factor detranscripción que regula varios genes específicos. Su mutación,sobreexpresión, rearreglo y translocación se ha asociado conuna variedad de tumores hematopoyéticos, leucemias ylinfomas, incluyendo el "Linfoma de Burkitt".

El gen Klf4 se localiza en el cromosoma 9 y contiene4,621 bases. Codifica una proteína que constituye un factor detranscripción con acciones activadoras y represoras.

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Gen"Reprogramadores

Sox2 ~c-Myc~Oct4 ~Klf4~

\

UPCH. B

~Célula de

piel de pericoteI

J

.,.J'"""'t-. -J"""'~

:\ U' -:; ...":'J\-~,~l'"# .;.,..r

DNA

-,

-

¡PSCs

Figura 1.Ligeramentemodificado de Hochedlinger, K, Scientific American, May 201O.Se muestra de manera esquemática cómo Yamanka inserta sus cuatro genes, normalmente activos en embriones, en un retrovirusmodificado que luego es inyectado en la célula de la piel del pericote. El virus se inserta en el ADN del pericote y los genes inician lareprogramación de lascélulas de la piel convirtiéndolas en células pluripotentes inducidas (iPSCs).

Estos estudios se han realizado con cultivos celulares decélulas adultas fibroblásticas y de la piel de pericotes y de sereshumanos.

Como ya hemos señalado, el estudio del grupo japonésse ha repetido en múltiples laboratorios y, actualmente, se hanreprogramado células adultas en el pericote, en el hombre, en larata y en el mono, especies con las que se está trabajando lasiPSCs, intensamente (11,19,201.

Es interesante que algunos investigadores, figura 2, hanlogrado reprogramar células usando un virus que no se integrapennanentemente en elADN celular, consiguiendo igualmentela producción de células iPSCs, y que han reportado lainducción de células pluripotentes (iPSCs) usando solamentetres o dos de los genes reprogramadores y aún con solo lasproteínas de transcripción de los genes reprogramadores, figura3 (18,201.

El descubrimiento de las iPSCs ha sido acogido congran interés por que evita los problemas que trae la técnica dereprogramar células adultas usando la cIonación. No se necesi-tan "ovums", ni embriones y, por lo tanto, no traen problemasmorales ni éticos. Sin embargo, estas nuevas células no dejan detener sus problemas propios. Los controles de calidad yseguridad son delicados y todavía están por establecerse demanera definitiva. Todavía está por aclararse qué son, enrealidad, estas células y sus capacidades.

Aunque, al microscopio, las colonias de iPSCs puedenlucir como las células madre embrionarias, mostrando inclusomarcadores moleculares asociados a las células pluripotentes,la prueba inequívoca de su pluripotencia viene dada por testsfuncionales. ¿Pueden estas células hacer todo lo que pordefinición hacen las células pluripotentes? Aún en las coloniasde células embrionarias se pueden encontrar algunas célulasincapaces, que no son pluripotentes como las verdaderascélulas madre embrionarias, y por ello los científicos handesarrollado algunos tests de rutina para calibrar la pluripo-tencia (11l.

Estas pruebas estrictas para calificar la pluripotencia son: .

a. La habilidad de las células madre de producir unavariedad de células de diferente tipo en una placa decultivo cuando son estimuladas con factores específicosde diferenciación.

b. La habilidad de las células madre de producir unteratoma (un tumor que contiene células de todos loslinajes embrionarios) cuando son inyectadas debajo de lapiel a un pericote. Y

c. La capacidad, cuando son inyectadas en un embrióninicial de un pericote, de incorporarse al crecimientoembrionario y contribuir al desarrollo de los tejidos dedistinto linaje, incluyendo células genninales, en elpericote recién nacido resultante.

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virusno integrado

FiguSe esquematiza cómo otros investigadores, reproduciendo el trabajo de Yamanka con células deperícote y humanas, han utilizado virus que no se integran permanentemente al ADN celular,logrando, igualmente, la producción de iPSCs.

Genes Reprogramadores

~~~

~~

~

.. ., IPSCs J

Protelnas Reprogramadoras

FiguraSe esquematiza cómo otros investigadores, han logrado los mismos resultados que en los experimentos deYamanaka utilizando solamente tres o dos de los cuatro genes y también usando solo las proteínas codificadas porlos cuatro genes reprogramadores.

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Mientras que las células madre embrionarias general-mente pasan todas estas pruebas estrictas, algunas de las célulasiPSCs obtenidas, no lo hacen.

Un examen cuidadoso de las células que fallan, harevelado que los virus usados para introducir los 4 factores dereprogramación de los genes en las células de la piel, no hansilenciado algunos de sus propios genes, dando como resultadocélulas que no tienen, auténticamente, la calidad de pluripo-tentes.

Como los científicos, por razones éticas, no puedenrealizar estas pruebas estrictas de pluripotencia en humanos (nose pueden inyectar iPSCs en embriones humanos tempranaspara ver si se incorporan al desarrollo). Es absolutamente

crítico asegurarse que las iPSCs humanas llenan los otroscriterios de pluripotencia.

Ahora los estudios están dirigidos a centrarse en lascélulas iPSCs que son capaces de pasar estas pruebas estrictasde pluripotencia y buscar puntualizar los elementos quedistinguen a las células buenas (pluripotentes) de las célulasmalas (no pluripotentes). Así como evitar los factores técnicosque pueden conducir a resultados no favorables y dominar losprocedimientos para la diferenciación celular (21-24).

Mientras tanto debemos considerar que las célulasmadre ("stem '') embrionarias continúan siendo losstandard de oro de las células pluripotentes (25).

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