Coliformes Totales Fecales y E Coli - NMPx

INTI – Mendoza Curso práctico Microbiología de Aguas - 2013

Número Más Probable- Coliformes y E. coli en aguas Página 1 de 9

Investigación de coliformes totales, coliformes termotolerantes y Escherichia coli.

Método de tubos múltiples Número Más Probable

ISO 9308:2

SMWW

1.Principio

El método se basa en la inoculación de porciones de muestras en una serie de tubos con medio de cultivo líquido que contienen lactosa. Luego de incubarlos por 24h (48h) a 35-37°, los tubos que presentan turbidez y producción de gas se subcultivan en un medios líquidos confirmatorios, incubando a 35-37°C 48h para coliformes totales (BL BG) y a 44°C 24h para coliformes termotolerantes (EC) . Para confirmar E coli, se subcultivan los tubos positivos para coliformes termotolerantes para evidenciar la producción de indol.

Se calcula el Número Más Probable (NMP) de coliformes totales, coliformes termotolerantes (fecales) y presuntivo E coli por 100ml de muestras, utilizando tablas estadísticas considerando tubos.

2- Material y equipo

• Tubos de ensayo de 16x 160 mm

• Gradillas

• Pipetas estériles de 10 y 1 mL o micropipetas

• Estufa o baño de incubación (35 o37°C y 44-44.5°C)

• Medios de cultivos prueba presuntiva:

� Caldo Lauril Triptosa Sulfato ( contiene lactosa)

• Medio de cultivo prueba confirmatoria para coliformes totales:

� Caldo Bilis Verde Brillante Lactosa (BGBL o BRILA)

• Medio de cultivo prueba confirmatoria coliformes termotolerantes

� Caldo EC

• Medio de cultivo prueba confirmatoria E coli

� Agua de Triptona



3- Procedimiento

Se realizará en las siguientes etapas: 1. Prueba presuntiva

Se incuba porciones de muestra en Caldo Lauril Sulfato luego de incubarse a 35-37°C durante 24(48h), los tubos que presentan gas y turbidez se consideran positivos y pasan a la etapa confirmatoria

2- Confirmación

- Para Coliformes totales: se evidencian ciertas características que las diferencian de otras Enterobacteriaceae como, por ejemplo, su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas y desarrollarse en presencia de sales biliares a 35-37°C durante 24h (48h).

- Para coliformes termotolerantes: se evidencian ciertas características que diferencian los coliformes termotolerantes de otras Enterobacteriaceae como, por ejemplo, su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 44-44,5 °C durante 24h.

3- Producción de indol

La especie Escherichia coli se diferencia de otros coliformes termotolerantes por su capacidad de producción de indol

4- Estimación del NMP para cada grupo según tablas NMP

3.1 -. Prueba Presuntiva

Se preparan en una gradilla tres series de tres tubos con Caldo LTS.

La primera serie con 10 ml medio con doble concentración y las otras llevan el medio con simple concentración.



Sembrar tubos de Caldo LTS

En 1° serie de tubos doble concentración se vierte 10 ml de muestra sin diluir. En 2° serie, tubos simple concentración, se vierte 1 mL de la muestra sin diluir. En 3° serie, tubos simple concentración, se vierte 1 mL de la dilución 10-1 de la muestra.

Los tubos llevan campana de Durham para observar la producción de gas.

Incubar las tres series a 35 o 37 ± 1ºC, haciendo lecturas a las 24 (48 horas)



Lectura de la Prueba Presuntiva

La reacción es positiva cuando se evidencia la fermentación de la lactosa.

El gas en la campana de Durham indica fermentación de la lactosa con formación de gas a la temperatura de incubación.

Seleccionar los tubos positivos fermentación + gas y desechar los otros.

3.2 Confirmación para coliformes totales

La confirmación es positiva cuando se comprueba el crecimiento en presencia de sales biliares y la fermentación de la lactosa a 35 o 37°C

Se utilizan únicamente los tubos positivos (fermentación y gas) en Caldo LTS seleccionados en la prueba presuntiva.

En condiciones estériles y se toma la muestra del tubo positivo (LTS), con ansa en anillo.

Y se inocula en un tubo con Caldo Bilis Lactosa Verde Brillante Esto se repite con todos los tubos positivos de la prueba presuntiva.

Incubar todos los tubos inoculados a 37°C durante 18-24 h



La turbidez indica crecimiento en presencia de sales biliares.

El gas en la campana de Durham indica fermentación de la lactosa con formación de gas a 35 o 37°C (en presencia de sales biliares)

Anotar la combinación de tubos confirmados para Coliformes Totales

Ej,

Calcular por Tabla el NMP de coliformes totales /100ml de muestra=

Medio Tubos 10 ml Tubos 1ml Tubos 0,1 ml (10-1)

LTS + + + + + + Caldo Bilis Verde Brilante

- + + - + -

Combinación 2 1 0

3-3- Confirmación para coliformes termotolerantes

La confirmación es positiva cuando se comprueba el crecimiento en presencia de sales biliares y la fermentación de la lactosa a 44 o 44.5°C

Se utilizan únicamente los tubos positivos (fermentación y gas) en Caldo LTS seleccionados en la prueba presuntiva.

En condiciones estériles y se toma la muestra del tubo positivo (LTS), con ansa en anillo.



Y se inocula en un tubo con Caldo EC Esto se repite con todos los tubos positivos de la prueba presuntiva.

Incubar todos los tubos inoculados a 44.5°C durante 18-24 h

La turbidez indica crecimiento en presencia de sales biliares.

El gas en la campana de Durham indica fermentación de la lactosa con formación de gas a 44,5 ºC (presencia de sales biliares)

Anotar la combinación de tubos confirmados para Coliformes termotolerantes

Ej,

Calcular por Tabla el NMP de coliformes totales / 100ml de muestra


LTS + + + + + + EC - - + - + -

Combinación 1 1 0

Todos los tubos confirmados como positivos (turbidez + gas) de organismos coliformes termotolerantes en cada dilución se utilizan para el aislamiento de Escherichia coli en agar EMB o Levine y comprobación bioquímica de la producción de indol.



3.4 Escherichia coli

Para la investigación de E. coli se parte de los tubos confirmados como positivos (crecimiento y formación de gas en caldo E.C. a 44,5ºC) en el medio E.C.

Siembra en agua triptona (TW) a partir de los tubos positivos de EC Incubar en estufa o en baño maria a 44-44,5 ºC durante 24h

Simultáneamente se siembra en agar Levine (EMB) para aislamiento de las colonias y observar la morfología y coloración típica de Escherichia coli

Incubar a 44,5 ºC con las placas invertidas durante 24 h

Observar el brillo metálico de las colonias de Escherichia coli en agar EMB



Características de las colonias de E. coli sobre agar EMB o Levine:

2-3 mm de diámetro, planas o ligeramente cóncavas, centros azul oscuros o casi negros, que ocupan las 3/4- partes de la colonia. Con luz reflejada, se observa un brillo metálico verdoso; a veces, este brillo metálico no se manifiesta.

Otras colonias se descartan como pertenecientes a Escherichia col: incoloras o trasparentes (como las producidas por Proteus y Salmonella)

rosas o marrones con centro azul oscuro ( como las producidas por Klebsiella y Enterobacter). El brillo metálico verdoso con luz reflejada nunca la presentan las especies de estos generos

Realizar la prueba de indol en los tubos de agua triptona (TW) Añadir 0,5 mL (aprox, 3 gotas) del reactivo de Kovacs a cada tubo.



La reacción positiva se manifiesta por la formación de un anillo rojo en la superficie del medio. La reacción negativa muestra anillo amarillento. Escherichia coli al desaminar e hidrolizar el triptófano del medio, produce indol que se pone de manifiesto al añadir el reactivo de Kovacs

Con aquellos casos en que se comprueba la presencia de Escherichia coli por la producción de indol y el crecimiento característico sobre agar EMB, se hace la lectura en la tabla del NMP para obtener el número de E. coli por mililitro de muestra.

Anotar la combinación de tubos confirmados para Escherichia coli

Ej,

Calcular por Tabla el NMP de Escherichia coli / 100ml de muestra


LTS + + + + + + EC - - + - + -

Agar EMB + - Indol + -

Combinación 1 0 0

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