Clase005 Manchas Bioquímica Forense

BIOQUÍMICA FORENSE

Análisis de manchas

Estudio de manchas.

Por mancha se entiende toda modificación de color, toda suciedad o toda adición de una materia extraña, visible o no, en la superficie del cuerpo humano, ropa, instrumentos u objetos cualquiera, determinadas por depósito de un producto líquido, blando y algunas veces sólido.

El estudio de las manchas puede establecer relaciones de la intervención o participación de una persona o cosa en un hecho delictivo

Analizaremos manchas de sangre y semen.

Investigaciones analíticas de manchas de sangre

Diagnóstico genérico: demostrar la naturaleza sanguínea de la mancha

Diagnóstico específico: especie animal a la que corresponde la mancha.

Diagnóstico individual: demostrado que la sangre es humana, determinar a que individuo pertenece.

Diagnóstico genérico

A menudo el aspecto de una mancha es muy demostrativo que está formada por sangre; otras veces su apariencia es menos clara. Tanto en un caso como en el otro, la prueba de convicción debe ser confirmada en su naturaleza para que tenga valor.

Las técnicas analíticas adquieren su mayor importancia cuando las manchas son pequeñas, invisibles o inaparentes o para excluir como sangre una mancha que lo aparece por su forma y aspecto

Diagnóstico genérico

Habitualmente se emplean dos tipos de pruebas: pruebas de orientación , que a su falta de especificidad oponen una gran sensibilidad, y pruebas de certeza , absolutamente específicas.

Es aconsejable comenzar por las últimas y, si hubiese material suficiente, emplear las primeras para ratificar los resultados.

Pruebas de certeza

Se basan en poner de manifiesto algún elemento característico de la sangre, bien sus elementos figurados o bien la hemoglobina .

Sobre la base de estos elementos y de acuerdo con la metodología utilizada, se pueden dividir en técnicas microscópicas, microquímicas o cristalográficas, espectroscópicas y cromatográficas.

1. Técnicas microscópicas

Fundamento: ponen de manifiesto los elementos figurados de la sangre.

Ventajas: si el examen es directo, no modifica la prueba de convicción en absoluto. Cuando el diagnóstico es positivo puede adelantar datos referentes a la especie.

Técnicas microscópicas

Investigación directa: se utiliza un microscopio especial en que la iluminación se hace por reflexión. Da mejores resultados cuando la sangre ha formado una costra delgada (ejemplo arma blanca). Los hematíes se observan como pilas de monedas apiladas y puede apreciarse si presentan o no núcleos. La prueba sólo tiene valor si es positiva.


Investigación de los elementos después de una preparación: A menudo los elementos figurados de la sangre se rompen en la mancha y hacen imposible la investigación directa. No obstante existen métodos para aislar y teñir los glóbulos rojos y blancos.


Para ello se eluye la mancha con suero isotónico o suero sanguíneo. Se realiza un frotis (extendido en un portaobjetos) y se tiñe con May-Grunwald-Giemsa.

2. Técnicas microquímicas o cristalográficas

Fundamento: se basan en la existencia de ciertos derivados de la hemoglobina que tienen tendencia a cristalizar. Los más importantes son las sales halogenadas de la hematina y el hemocromógeno.

Las sales halogenadas de de hematina (descrito en 1853), el fundamento de esta reacción consiste en tratar la hemoglobina en caliente con un ácido orgánico, con lo cual la hemoglobina se desdobla en heme y globina, a la vez se oxida el hierro del heme. En presencia de una sal halogenada de Cl, Br o I, se forman cristales de clorhidrato, bromhidrato o yodhidrato de hematina, respectivamente. Los cristales son alargados y pardos oscuros.

2. Técnicas microquímicas o cristalográficas

El hemocromógeno, a su vez, es un compuesto nitrogenado de la hematina, después de una reducción. Se utiliza sosa al 10 %, piridina, una solución saturada de glucosa y agua destilada, no es necesario calentar. Los cristales son de color naranja y tiene forma arborescentes.

La sangre vieja no da reacción positiva a cristales de hematina, pero si a la formación de hemocromógeno.

3. Técnicas Espectroscópicas

Fundamento: obtener el espectro de absorción de la hemoglobina o alguno de sus derivados, como prueba de la naturaleza sanguínea de la mancha. La hemoglobina tiene dos bandas de absorción en la zona del visible, cuyos máximos se encuentran a 577 y 540.5 nm, respectivamente. Además, de la banda de Soret típica de los derivados porfirínicos , próximo al UV, para la hemoglobina a 412 nm. Esta última banda es mucho más intensa, unas veinte veces mayor que las otras.

Técnica: se prepara una solución de la mancha en agua destilada.

4. Técnicas Cromatográficas

Fundamento: aprovechan la propiedad fisico-química de la hemoglobina, que le confiere una movilidad cromatográfica concreta cuando se desarrolla en un solvente adecuado.

Técnica: Cromatografía en placa fina, mezcla metanol-ácido acético-agua (90:3:7). Se seca y se pulveriza con una solución de agua oxigenada, la hemoglobina y la hematina aparecen de color azul. Si se observa a la luz UV aparece una flourescencia roja que corresponde a la hematoporfirina. Obviamente se deben correr en paralelo estándares de hemoglobina y hematina. El Rf de la hemoglobina es de 0.70.

Pruebas de Orientación

Pruebas de orientación

Son extraordinariamente sensibles, por lo que permiten demostrar trazas de sangre a diluciones de 1:200.000. Carecen en cambio de especificidad.

Podemos nombrar:

1. Peroxidasas

2. Luminol

Peroxidasas

Fundamento: se basan en la presencia en la sangre de peroxidasas, enzimas capaces de descomponer el peróxido desprendiendo oxígeno. El oxígeno se para oxidar una base, la base oxidada cambia de color.


Reacción de la peroxidasa:

H2O2 + Sangre (peroxidasa) H2O + O2

Base + + O2 Base coloreada Principales bases utilizadas:

Reactivo de Adler: bencidina azul

Reactivo de Van Deen: tintura de guayaco azul

Reactivo de Kastle-Meyer: fenolftaleína rojo

Reactivo de Kohn-O Kelly: ortoluidina verde azul


Valor de la prueba: la prueba tiene valor cuando es negativa, sirviendo entonces para ratificar la negatividad de las pruebas de certeza; su gran sensibilidad permite excluir que la negatividad de las pruebas de certeza se deba a la escasez de material sanguíneo en la muestra de la mancha sospechosa.

Es importante destacar que un resultado positivo, en cambio, no autoriza a establecer la naturaleza sanguínea de la mancha, ya que vegetales, semen o heces dan resultados positivos al poseer catalasas y peroxidasas.

Luminol

El luminol es un compuesto orgánico que, cuando se oxida emite luz (quimioluminiscencia).

En esta reacción una pequeña cantidad de luminol (3-aminoftalhidrazida) se disuelve en una solución básica acuosa, que contiene además una pequeña cantidad de sulfato de cobre. Al agregar esta solución a otra donde exista un agente oxidante, la reacción que se produce es la siguiente:

Luminol

Luminol

En una solución acuosa la oxidación de luminol es catalizada por la presencia de un ión metálico, como hierro o cobre.

Por esta razón la solución de luminol puede ser usada para detectar sangre, ya que puede ser catalizada por el hierro de la hemoglobina.

Luminol en escena del crimen

Luminol

Con frecuencia, las ropas manchadas con sangre durante un acto violento son lavadas para eliminar los vestigios.

El análisis de DNA mediante PCR ha dotado a la criminalística de la posibilidad de estudiar indicios mínimos que, con otros métodos, sería imposible analizar.

El luminol tiene una alta sensibilidad para encontrar manchas de sangre invisibles.

Además, en condiciones experimentales no produce interferencias en la posterior extracción y amplificación del DNA.

Luminol (Verdú y cols, Cuadernos de Medicina Forense, 2002)

Diagnóstico específico


El segundo punto que el perito debe resolver es si la sangres es humana o no. En los últimos años ha habido un gran número de aportes en este campo, sobre todo a nivel de perfeccionamiento técnico.

Glóbulos rojos: en los mamíferos son redondos y carecen de núcleo. En las aves, reptiles y batracios son elípticos y poseen núcleo.


Glóbulos blancos: tienen la ventaja que se conservan mejor en la mancha, y los eosinófilos proporciona más datos al variar su granulación de especie en especie.


Suero: concretamente las proteínas del suero debido a sus propiedades antigénicas. Se utilizan anticuerpos polivalentes frente a un suero humano total o monovalente, es decir, frente a una sola fracción antigénica, el más usando es antihemoglobina humana y anti-IgG.

Diagnóstico individual

Actualmente se realiza con técnicas de biología molecular.

Manchas de semen

Análisis de semen

El semen o líquido espermático se puede presentar al investigador en tres formas distintas: como mancha, impregnando un tejido, como fluido, mezclado con otros fluidos corporales (secreción vaginal), o como semen o líquido espermático, cuando se obtiene del sujeto para una investigación de esterilidad.

En el campo del derecho penal esta relacionado con delitos sexuales (agresión o abuso sexual)

Análisis de semen

Entre las huellas que puede resultar de la comisión de un delito sexual figuran las manchas de semen sobre las ropas, en el propio sujeto o la víctima, constituyendo una prueba de enorme importancia.

Análisis de semen

Características del semen: El semen recién emitido es un líquido, cremoso, opalescente, que tiende a amarillo verdoso cuando pasa el tiempo y olor típico. Consta de dos elementos distintos: las células o espermatozoides y el plasma seminal. El plasma seminal sirve como soporte, vehículo, medio nutricio y de estabilización para los espermios.

Análisis de semen

Semen: volumen eyaculado normal es de 2 a 4 ml. Espermatozoides: eyaculación normal aproximadamente

100 millones de espermios/ml. Líquido seminal: Contiene fructosa, ribosa, inositol,

sorbitol, aminoácidos libres, amina (espermina, colina y etanolamina), ergoteína, albúmina, dos a tres alfa globulinas, dos beta globulinas, y una gamma globulina, fibrinolisina, aminooxidasa, fosfatasa ácida, fosfatasa alcalina, 5-nucleotidasa, lecitinas y ácidos grasos (Prostanglandinas), Zinc y calcio.

Análisis de semen

El tiempo post-coito que se pueden encontrar espermatozoides en la vagina varía de unos autores a otros: 14 hasta 85 horas. De todos modos, cuanto más precozmente se proceda, mayores posibilidades de éxito habrá.

Cavidad rectal se pueden encontrar espermatozoides hasta 24 horas después.

En la boca hasta 8 horas.

Análisis de semen

Cuando el semen se encuentra en forma de mancha, su forma varía según el soporte:

1. Piel: cuando se deseca adquiere una forma de una fina película,como de pegamento. Estas manchas deben buscarse en la víctima como en el agresor en las zonas del pubis, cara interna de muslo y labios mayores.

2. Pelos: los pelos impregnados tienen un aspecto como engomado.

3. En tejidos absorbentes: forma manchas típicas con una característica de tiesura, como si el tejido estuviera almidonado. Si la mancha es reciente tiene un olor típico.

Análisis de semen

Las prendas sospechosas deben ser examinadas a la luz UV de Wood (luz UV de 320 a 400nm). Las manchas de semen dan una fluorescencia blanca amarillenta, que va ganado amarillo con el tiempo. El examen de fluorescencia permite diferenciarlas de otros productos como orina (fluorescencia celeste), pus, moco o secreción vaginal.

La fluorescencia de Wood no es específica para el semen, ya que puede estar ausente si la mancha ha sido tratada con detergente.

Análisis de semen: Investigaciones analíticas

El examen se orienta a la búsqueda de espermatozoides y de espermina y colina. Se añaden a la investigación la determinación de fosfatasa y métodos inmunológicos.

Investigación de espermios: Se ha denominado la prueba de certeza, siendo la prueba reina del diagnóstico. Ya que si se encuentra un espermatozoide o su cabeza, queda identificada en su naturaleza.


Técnica: maceración de la mancha o destrucción del soporte con ácido sulfúrico al 80% (destruye tejido y no espermios). Tinción (hematoxilia-eosina, azul de metileno-fucsina) de los espermatozoides y observación microscópica.


Investigación de espermina y colina: El hecho de no descubrir un espermatozoide completo no debe llevar a concluir que la mancha no es semen. La investigación de los espermios en una mancha puede ser negativa por varias razones:

1. Deshidratación de los espermios en la mancha los que los hace frágiles y se rompen.

2. Difícil elución desde los tejidos.

3. Difusión de los espermios de la mancha no es uniforme.

4. Sujeto azoospérmico.

Análisis de semen: Investigaciones analíticas.

1. Técnicas electroforéticas: Electroforesis sobre papel en tampón piridina/ácido acético/agua pH 3.9, a 350 V por 1 hora y 50 min. Se seca y se pulveriza con reactivo de Dragendorff. La colina aparece de color rojo y la espermina color calabaza.

2. Técnicas enzimáticas: Investigación de fosfatasa ácida prostática (tiene la misma significancia que la determinación de peroxidasa en sangre). Se utilizan kits comerciales.

Análisis de Pelos

Análisis de Pelos

El pelo tiene una gran importancia como evidencia. Pero, su utilidad como indicio ofrece notas contrapuestas, ya que si bien tiene una gran resistencia a la destrucción, dada su estructura y composición, por otro lado puede pasar inadvertido por su pequeñez, y por su poco peso puede ser transportado a otro lugar por diversos agentes.

Análisis de Pelos

Estructura del pelo: el pelo es un anexo dela piel y presenta pelo libre propiamente tal y su raíz.

El pelo propiamente tal tiene tres capas concéntricas que desde afuera hacia adentro son: cutícula, corteza y médula.

El diagnóstico más importante es el de diferenciar pelo de animales de ser humano.

Si se tiene la raíz del pelo se puede realizar análisis de ADN.

Examen de prendas

Tipos de manchas

Estudio de manchas: examen de la ropa.

Examen de la ropa: la importancia y trascendencia que desde el punto de vista criminálistico tiene el examen de la vestimenta, fundamentalmente por la gran cantidad de vestigios que los vestidos puedan contener.

En los bolsillos se puede encontrar peinetas con restos de pelo de la víctima.


En la ropa se pueden encontrar manchas biológicas de sangre, semen u orina, así como otros vestigios biológicos (pelos, caspa).

Para el estudio se utilizan tres tipos de iluminación: la de incandencia o luz ordinaria, la luz de tungsteno, rica en radiaciones rojas, que da muy buenos resultados en manchas de sangre y, finalmente la luz UV, que pone de manifiesto las sustancias con propiedades fluorescentes y es muy útil para manchas de semen, orina, pinturas y aceites.


También hay que pesquizar destrucción de partes de las ropas. Relacionar como un puzzle trozos de prendas encontrados en el sitio del suceso.

Finalmente describir totalmente cada una de las prendas (tamaño, forma, color, tipo de tela, etc.)

Estudio de manchas:

Aunque el número de manchas puede ser muy elevado, en esta sección de curso nos ocuparemos de dos tipos de manchas: las de sangre y semen.

Manchas de sangre:

La sangre es el vestigio más importante y el más frecuente. Cuando se encuentre debe ser estudiado cuidadosamente en cada uno de sus aspectos.

El aspecto de las manchas varía con la antigüedad y el soporte en que recae.

1. En los tejidos absorbentes y claros las manchas presentan un color rojo oscuro, que con el tiempo tiende a ennegrecerse más. Si las manchas han sido lavadas con agua, el color se hace rosa y el pigmento difunde al tejido, de manera irregular, con lugares más densos que otros.

Manchas de sangre:

2. En los tejidos oscuros las manchas se visualizan mal, por lo que se hace necesario emplear el reactivo de luminol para hacerlas visibles. Este reactivo contiene 3-aminoftalhidracida, el cual hace la mancha fluorescente sin alterarla químicamente.

3. Cuando la mancha se asienta sobre un soporte no absorbente, se forman costras con aspecto de escamas brillantes o agujas. Si la sangre es reciente, las escamas son rojas, aunque el color depende del grosor de la costra (menor espesor más roja). A medida que el tiempo transcurre las costras se hacen más oscuras.

Mecanismo de producción de las manchas de sangre

Se pueden distinguir los siguientes mecanismos: Proyección: tiene lugar cuando la sangre sale

proyectada con cierta fuerza viva, bien describiendo una curva parabólica o bien en caída libre.

Escurrimiento: la sangre babea y, por concentración de cierta cantidad, al ir cayendo por acción de la gravedad, forma charcos, etc.


Contacto: cualquier objeto ensangrentado al contacto con un sustrato deja una impresión, como huellas de manos, pies, etc.

Impregnación: se trata de un mecanismo común a los anteriores, con los que se asocia; consiste en la imbibición de un sustrato por el líquido. Si el tejido es absorbente, la sangre lo empapa y difunde por él dando origen a manchas uniformes, circulares y de bordes netos.


Un mecanismo mixto, entre el contacto y la impregnación, es el origen de las manchas en limpiadura. Cuando se enjuga una hoja de arma blanca, o un palo, en un trapo absorbente, se producen unas manchas típicas, de forma rectangular, con soluciones de continuidad y trazos transversales más densos, y la intensidad del color decrece progresivamente.

Importancia médico-legal de los mecanismos de producción de las manchas de proyección

Manchas de Proyección:

1. Altura: si la altura es pequeña, la mancha tiene la forma de un disco redondeado; a mayor altura, el diámetro es mayor y el contorno es irregular, apareciendo dentellones y gotas satélites, que se forman al estallar aquella y romperse la tensión superficial de la sangre.


Una relación estricta entre altura y característica de la mancha no pueden establecerse, aunque existen trabajos experimentales al respecto, teniendo en cuenta las características físico-qcas de la sangre (viscosidad) influyen poco, en cambio si influye la cantidad de sangre. Sumado al hecho que una gota normal contiene: 0.0495 a 0.0516 ml de sangre (límite de confianza de 95%).


Una gota que cae de unos 8 cm de altura produce una mancha perfectamente regular, de color rojo oscuro y de unos 9 mm de diámetro.

Si la altura de caída es 30 cm produce una mancha de 13 mm de diámetro, de periferia festoneada, con salientes de longitud de 0.5mm.

Si aumenta la altura la gota principal no suele pasar de 16 mm, pero las agujas salientes aparecen en mayor número, adquiriendo forma estrellada, si el plano es horizontal.


2. Naturaleza del soporte: El tamaño y las características del contorno están condicionados muy directamente con las condiciones del soporte, tanto su superficie como su naturaleza intrínseca.

Superficies duras y lisas, no absorbentes: se formarán gotas más circulares.

Superficies rugosas o que tengan junturas: manchas irregulares con gotículas satélites. Cuando la superficie es absorbente, predomina el mecanismo de imbibición o impregnación y desaparecen las gotas satélites


Si la gota es proyectada oblicuamente, incide sobre el plano en un ángulo agudo, con lo que la mancha se alarga en el sentido de la dirección. Según este ángulo de incidencia, la velocidad de proyección y la cantidad de sangre, la superficie de la mancha se alargará más o menos, dibujando, en los casos más extremos, una gota satélite en la punta, lo que

asemeja a un signo de exclamación (¡).


Cuando se encuentren centenares de pequeñas gotas a gran distancia entre sí y en ausencia de otras de mayor tamaño, debe pensarse en un mecanismo de proyección a alta velocidad, como un disparo a boca de jarro.

Pequeñas gotas alargadas en forma de signos de exclamación, de dirección opuesta o múltiple, sugiere un arma ensangrentada manejada violentamente; para conocer el lugar de procedencia basta trazar el eje de todas las gotas y ver el lugar donde convergen: ahí debe situarse la fuente de proyección.


Unas manchas de proyección que dejan en la pared un espacio “mudo”, o hueco sin manchar, pueden indicar el lugar que ocupaba el agresor y que interceptó la sangre.

Las manchas de proyección sobre los objetos son fácilmente transportables, que llevan implícita la posibilidad que hayan sido cambiadas de sitio, por lo que deberán valorarse con suma prudencia.

Importancia médico-legal de los mecanismos de producción de las manchas de escurrimiento

Manchas de escurrimiento: Su mayor interés radica en que permiten reconstruir los cambios de posición que haya experimentado el cadáver.

1. El reguero sigue siempre en su dirección la influencia de la gravedad; regueros opuestos, por lo tanto, indicarán cambios de posición.

2. Igualmente el reguero puede reconstruir la supervivencia de la víctima, señalando el recorrido que hizo luego de la agresión.

Importancia médico-legal de los mecanismos de producción de las manchas de contacto e impregnación

Tienen extraordinario interés cuando dibujan huellas de manos o pies, así como cuando han sido producidas para limpiar un arma blanca.

1. Las dimensiones de las manchas de la ropa empapada pueden dar una idea del tiempo que estuvieron en contacto con la sangre.

2. La existencia de coágulos de sangre en la mancha indica sobrevivencia de la víctima.

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