INMUNOMICOLOGIAINMUNOMICOLOGIA

20152015

INFECCIONES POR INHALACION DE ESPORASINFECCIONES POR INHALACION DE ESPORAS

Histoplasmosis

Blastomicosis

Paracoccidioidomicosis

Coccidioidomicosis

Aspergilosis

Zygomycosis

Cryptococosis

RESPUESTA INMUNOLOGICA DEL RESPUESTA INMUNOLOGICA DEL HUESPEDHUESPED

MEDIACION CELULAR MEDIACION POR ANTICUERPOSMEDIACION CELULAR MEDIACION POR ANTICUERPOS

IDRAGLUTINACION

HEMAGLUTINACION

INMUNOPRECIPITACION

RIA,

ELISA, ETC.

INMUNODIAGNOSTICO DE HONGOS PATOGENOSINMUNODIAGNOSTICO DE HONGOS PATOGENOS

INVESTIGACION DE ANTIGENOSINVESTIGACION DE ANTIGENOSAntigeno Polisacárido capsular : Cryptococcus neoformans:Exoantígenos de C. albicans puede diferenciar C. tropicalisDetección de los serotipos A y B de Candida albicans.Antígenos liberados en cultivo: Extractos de medios de cultivo

INVESTIGACION DE ANTICUERPOSINVESTIGACION DE ANTICUERPOSTécnicas de IDD,

•B. dermatitidis, •P. brasiliensis, •H. capsulatum, •C. immitis, •Candida •Aspergillus, etc.

• Se han desarrollado diversos métodos alternativos al cultivo que pueden proporcionar al clínico información rápida y fiable ante la sospecha de una micosis invasora.

• Entre estos métodos destacan:– Detección de antígenos, – Deteccion de anticuerpos y – Deteccion de componentes fúngicos no antigénicos.

• Algunas de estas técnicas serológicas ya se han convertido en• herramientas básicas en el laboratorio de Microbiología Clínica

actual, como:– Detección del antígeno capsular de Cryptococcus neoformans – Detección de galactomanano en pacientes con aspergilosis invasora.

DETECCION DE ANTIGENODETECCION DE ANTIGENO

• Criptococosis• La detección de antígeno capsular en líquidos orgánicos y

especialmente en LCR ante la sospecha de meningitis criptocócica. • Ello se debe en gran parte a la rapidez, sencillez técnica y

especificidad de la prueba.• Permite el diagnóstico, en 10-15 min, de aproximadamente el 99%

de las meningitis criptocócicas y el 67% de las criptococosis diseminadas.

• El aislamiento de C. neoformans puede requerir varios días.• Se utilizan dos tipos de técnicas, una cualitativa y otra cuantitativa. • La técnica cualitativa se emplea para diagnosticar nuevos casos de

criptococosis o para confirmar reinfección especialmente en el sida.

Antigeno cryptococo…….Antigeno cryptococo…….• La técnica consiste en la detección de antígeno capsular

criptocócico mediante anticuerpos monoespecíficos dirigidos frente a él y unidos a partículas de látex. La aglutinación de las partículas de látex tras la reacción antígeno-anticuerpo se detecta a simple vista..

• La técnica cuantitativa se emplea habitualmente para el seguimiento• de la evolución de pacientes ya diagnosticados mediante el título de

antígeno capsular presente en la muestra clínica, que generalmente es suero o LCR.

• Es útil para conocer la eficacia del tratamiento antifúngico aplicado.

CRYPTOCOCOSIS LATEXCRYPTOCOCOSIS LATEX• FUNDAMENTO• Consiste en la precipitación de particulas de latex sensibilizadas

con anticuerpo anti-polisacarido capsular de C. neoformans en muestras de LCR, suero y orina.

• Esta prueba posee una sensibilidad del 99% para LCR de pacientes con criptococosis meníngea.

• El limite de detección es de 3.2 ng/ml a 12.5 ng/ml .• Una reaccion negativa no descarta infección.• La prueba tiene valor diagnostico y pronostico, un aumento

progresivo de titulo es de mal pronostico. • Cuando la terapia es inadecuada se observa aumento o

mantenimiento de los titulos sobre muestras consecutivas.• Para evitar falsos negativos se tratan los especimenes clínicos con

pronasa (DE) previa a la prueba, esta enzima cuya funcion es separar los complejos inmunes circulantes y destruir el factor reumatoideo, elimina los falsos positivos y aumentar la sensibilidad de la prueba.

CRYPTOCOCOSIS LATEX….CRYPTOCOCOSIS LATEX….• LECTURA DE RESULTADOS• La lectura es visual y se debe realizarse de la siguiente

manera:• Negativo: suspensión granular muy fina con ausencia

de aglutinación• Positivo +: suspensión con escasos grumos contra un

fondo homogeneo lechoso.• Positivo ++: suspensión con escasos a moderados

grumos contra un fondo moderamente homogeneo.• Positivo +++: suspensión con moderados a abundantes

grumos contra un fondo claro.• Positivo ++++: suspensión con abundantes grumos

contra un fondo totalmente claro

CRYPTOCOCOSIS CRYPTOCOCOSIS LATEX LATEX

TITULACIONTITULACION criptococos criptococos

• Cuando la prueba es positiva + o mas, se debe realizar titulaciones para el seguimiento de tratamientos.

• Las diluciones recomendadas son: – positivo ++ se recomienda comenzar al 1:2; – positivo es +++ o ++++ se suguiere comenzar en 1:100

• Posteriormente para muestras seriadas del mismo paciente se debe utilizar el mismo esquema de dilucion.

• El seguimiento se debe realizar hasta la negativizacion de la aglutinación.

• Cuando se realiza titulaciones para seguimiento de tratamientos es conveniente realizarlas con el mismo equipo para evita variaciones.

Falso positivoFalso positivoLa sensibilidad varía entre el 93% y el 100% con un 93-98% de especificidad. Puede haber falsos positivos:•Presencia de factor reumatoide•Pacientes con lupus •Pacientes con sarcoidosis,•Arrastre medio de cultivo de agar chocolate, •Asas de platino o desinfectantes. •Infección sistémica por Trichosporon ashaii

Desaparecen los falsos positivos al tratar el suero con pronasa o2-mercaptoetanol.

CANDIDOSISCANDIDOSISDETECCION DE ANTIGENOSDETECCION DE ANTIGENOS CIRCULANTES CIRCULANTES

La Candidosis diseminada representa una de las causas de infección más importantes en lo que concierne a mortalidad y morbilidad en el paciente inmunocompetente e inmunocomprometido.Los métodos habituales de diagnóstico (hemocultivo) son negativos en las candidosis profundas.Los métodos serológicos no diferencian entre la colonización y la invasión.

Aglutinación con particulas de látex sensibilizadas:Acs. monoclonales anti mananosAcs. policlonales anti glucoproteínas

DETECCION DE ANTIGENO de DETECCION DE ANTIGENO de CandidaCandida

• Candidiasis• La detección de antígeno en pacientes con candidiasis invasora nos

ha permitido solucionar el problema diagnóstico que presenta esta micosis.

• La detección de manano parece ser más sensible y especifica. • Platelia Candida Ag (Bio-Rad)• Es un ELISA que detecta manano en suero utilizando el anticuerpo

monoclonal EBCA1. • Este anticuerpo reconoce residuos ß-1,5 del manano de C. albicans,

C. tropicalis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. parapsilosis y C. pseudotropicalis pero no de C. krusei.

• El límite de detección de la prueba es 0,25 ng/ml de suero. • .

DETECCION DE ANTIGENO de DETECCION DE ANTIGENO de AspergillusAspergillus

• Aspergilosis• La detección de galactomanano mediante un ELISA permite el

diagnóstico de la aspergilosis invasora.• Especificidad del 89,6% y sensibilidad del 87,5%. • Esta prueba en algunos estudios se ha demostrado que es positiva

antes de que aparezca la sintomatología clínica.• Platelia Aspergillus EIA (Bio-Rad)• La prueba es un ELISA que detecta galactomanano en suero

utilizando el anticuerpo monoclonal EBA-2, que reconoce el galactomanano de A. fumigatus, A. flavus y A. niger.

• El límite de detección de la prueba es 1 ng/ml de suero

DETECCION DE ANTIGENO de DETECCION DE ANTIGENO de AspergillusAspergillus

• Actualmente, se considera un resultado positivo cuando el paciente presenta dos muestras consecutivas con un índice ³0,5.

• La detección de galactomanano puede verse disminuída en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica y Síndrome de Job

• El Platelia Aspergillus EIA no ha sido evaluado en profundidad en plasma, orina, BAL y LCR.

• La prueba puede dar positiva con hongos del género Penicillium, Alternaria y Paecylomyces.

• Alimentos como los cereales, pollo, pastas y productos lácteos pueden contener galactomanano que puede ser adsorbido en niños y pacientes con alteraciones en la barrera intestinal.

• Resultados falsos positivos en pacientes tratados con: piperacilina-tazobactam y amoxicilina-clavulánico

(REACCIONES SEROLOGICAS)(REACCIONES SEROLOGICAS)

AglutinaciónFijación de ComplementoInmunoprecipitación en gel:

InmunoelectroforesisInmunodobledifusión

InmunofluorescenciaInmunoenzimática (ELISA)Radioinmunología

DETECCION DE ANTICUERPOSDETECCION DE ANTICUERPOS

• Dificultad de preparación de antígenos estandarizados

• Débil título de anticuerpos en el curso de las micosis

• Utilización generalmente para micosis profundas

• Reacciones cruzadas• En cryptocosis no tiene utilidad• Candidosis: actualmente detectan anticuerpos contra el manano, la

enolasa y los antígenos del micelio.• Aspergilosis: La detección de anticuerpos específicos en suero es,

una prueba complementaria clásica para confirmar el diagnóstico de aspergiloma pulmonar y de la aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA). Las técnicas empleadas son: la inmunodifusión doble (IDD) y contrainmunoelectroforesis (CIE)

Inconvenientes de la InmunodifusionInconvenientes de la Inmunodifusion Es lenta, precisa de una incubación de hasta 3 días, aunque a las 24 h ya se pueden observar arcos de precipitación.Puede producir reacciones cruzadas entre distintas especies de Aspergillus y se extienden a otras especies de hongos e incluso algunas bacterias.Esta técnica no distingue el tipo de anticuerpo específico presente en el suero (IgG, IgM o IgE).Tiene una sensibilidad baja, Debido a éste problema esta técnica no es de utilidad en aspergilosis invasoras.El factor reumatoide y la proteína C-reactiva presentes en el suero pueden causar falsas precipitinas.

DIAGNOSTICO INMUNOLOGICODIAGNOSTICO INMUNOLOGICO

DE LAS MICOSIS PROFUNDASDE LAS MICOSIS PROFUNDAS

DETECCION DE LA SENSIBILIDAD CUTANEADETECCION DE LA SENSIBILIDAD CUTANEA

Antígeno : Histoplasmina (filtrado del cultivo miceliano)Reacción positiva:

Infección en evolución ( infiltración pulmonar, lesiones cutáneas) o crónica ( calcificación pulmonar, esplénica )

Reacción negativa: no excluye infección (comienzo, diseminación, anergia).

Induce la formación de anticuerposPresencia de reacciones cruzadas con otras micosisUso epidemiológico. Sin valor diagnóstico

Antigeno de histoplasmaAntigeno de histoplasma

• Las pruebas pueden aplicarse a muestras tales como: suero, plasma, liquido peritoneal o LCR de pacientes con enfermedad respiratoria, hepatoesplenomegalia, signos de infección sistémica extrapulmonar o con compromiso meníngeo, en pacientes que vivieron o trabajaron en zonas endémicas de Histoplasma capsulatum

InmunodifusionInmunodifusion

Reacción de identidad: Reacción de identidad: Fusión completa de los anticuerpos del paciente con los antígenos del hongo. Fusión de los extremos de las bandas precipitantes del suero de referencia y del suero del paciente.

CONSTITUYE UNA PRUEBA POSITIVAPONE EN EVIDENCIA QUE EL PACIENTE POSEE

ANTICUERPOS ESPECÍFICOS PARA EL ANTÍGENO DE UN HONGO EN PARTICULAR. .

Suero Problema

Suero Control

NO SE INTERPRETA COMO POSITIVA Realizar otras pruebas complementarias como la IEF, FC,

ELISA, etc.

Reacción de identidad parcial: Reacción de identidad parcial: Anticuerpos del paciente reaccionan en forma incompleta con el antígeno de referencia. Esto ocurre por la existencia de fracciones antigénicas comunes a varios hongos que reaccionan parcialmente con los anticuerpos del suero del paciente (histoplasmosis-paracoccidioidomicosis).

Reacción de no identidad: Reacción de no identidad: Las bandas de precipitación se entrecruzan. La muestra del paciente presenta anticuerpos que pueden reaccionar con uno de los múltiples componentes no específicos del antígeno de referencia.

CONSTITUYE UNA PRUEBA CONSTITUYE UNA PRUEBA NEGATIVANEGATIVA

INMUNODOBLE DIFUSION HCINMUNODOBLE DIFUSION HC TITULACIONTITULACION

M : M : La banda M se encuentra cerca del hoyo del antígeno Histoplasmosis aguda o cronicaHistoplasmosis aguda o cronica.. de una infección pasada o de una prueba cutánea reciente.

H : H : la banda H cerca del hoyo del suero control positivo. Histoplasmosis activa y progresiva. Histoplasmosis activa y progresiva. Puede persistir de uno a dos añosPuede persistir de uno a dos años

DETECCION DE COMPONENTES NO ANTIGENICOSDETECCION DE COMPONENTES NO ANTIGENICOS

• Actualmente se basa en la detección de D-arabinitol,DNA y (1®3)-ß-D-glucano.

• El D-arabinitol es un metabolito producido por C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis y C. kefyr que puede detectarse mediante cromatografía gas-líquido o mediante una técnica enzimática

• comercializada en Japón. • Niveles elevados de D-arabinitol se han detectado en pacientes con• candidiasis invasora y su monitorización se ha mostrado útil en el

seguimiento de estos pacientes.• La técnica presenta falsos positivos en pacientes con insuficiencia

renal o en tratamiento con esteroides y suele ser necesario ajustar las concentraciones de D-arabinitol con respecto a las de creatinina o L-arabinitol. El D-arabinitol también puede detectarse en orina.

DETECCION DE COMPONENTES NO ANTIGENICOSDETECCION DE COMPONENTES NO ANTIGENICOS

• La detección de (1®3)-ß-D-glucano en plasma es otra posibilidad diagnóstica en las micosis producidas por – Candida, – Aspergillus y – Pneumocystis,

• El ser humano carece de glucanasas para digerir (1®3)-ß-D-glucano y por tanto su eliminación es lenta.

• Existen varias pruebas comercializadas para la detección (1®3)-ß-D-glucano, siendo el Fungitell la más recientemente comercializada. Las pruebas para detectar (1®3)-ß-D-glucano pueden presentar falsos positivos en pacientes sometidos a hemodiálisis con aparatos que tengan membranas de acetato de celulosa, o en tratamiento con albúmina, inmunoglobulinas, algunos agentes anticancerosos y

• sulfamidas

REACCION DE AMPLIFICACION ENZIMATICAREACCION DE AMPLIFICACION ENZIMATICA(PCR(PCR))

DIAGNOSTICO FUTURODIAGNOSTICO FUTURO

Sondas quimioluminiscentes marcadas con Ester de Acridina: H. capsulatum, B. dermatitides, C. immitis, C. neoformans.

(100% de especificidad y ± 96% de sensibilidad).

Identificación rápida (2 h.) vs 3 días para la investigación de exoantígenos de un cultivo miceliano de 7 a 10 días de desarrollo.

INMUNODIAGNOSTICO DEINMUNODIAGNOSTICO DEHONGOS PATOGENOSHONGOS PATOGENOS

SONDAS NUCLEICASSONDAS NUCLEICAS

Hibridación de ADN:

Identificación rápida, sensible y específica del material genético detectado con sondas de ADN marcado. Ventajas: Detección e identificación simultánea, directamente de la muestra clínica o de colonias aisladas con ayuda de la amplificación enzimática, de sondas nucléicas

CANDIDOSISCANDIDOSIS

SONDAS NUCLEICASSONDAS NUCLEICAS

Han sido desarrolladas para:•Tipiaje del ADN del género, especies de Candida.•Identificación de factores de virulencia C. albicans.•Estudio de la morfogénesis C. albicans.•Modo de acción de antifúngicos.

CRIPTOCOCOSISCRIPTOCOCOSISSONDAS NUCLEICASSONDAS NUCLEICAS

Permite identificar los 4 serotipos de C. neoformans ( Sonda Accu Probe Soc. Gen-Probe), con

100% de sensibilidad y especificidad

Identificación muy rápida (1 h)

42 cepas aisladas de enfermos fueron identificadas

52 otras especies de levaduras no respondieron