CROMATINA

Estructura y función

Cromatina: estructura y función

• Primera clase- "Cromosomas" virales,

bacterianos y eucariotas- Cromatina:

Niveles de compactado:Nucleosoma,Fibras,

Cromosomas en interfase y mitosis

• Segunda clase- Procesos celulares en

el contexto de la cromatina:

ReplicaciónRegulación de la

expresión génica

En eucariotas, procariotas y virus:

ADN asociado a proteínas

Organismo Dimensiones ARN/ADN Longitud

VTM 0.008x 0.3 µm

ARN (simple) 2µm=6.4kb

Fago T4 0.065x0.1 µm ADN (doble) 55 µm=170 kb

E. coli 1.7x0.65 µm 1 ADN doble 1.3 mm = 4.2 x103 kb

H. sapiens (nucleo)

6µm diam. 46 cromosomas

ADN doble

1.8 m = 6 x106 kb

* EL ADN CABE DENTRO DE LA CÉLULA

* ADN PROTEGIDO DE LESIONES; MÁS ESTABLE

* ADN ORGANIZADO CONTROL DE LAS DIFERENTES FUNCIONES CELULARES (expresión génica, replicación, recombinación, separación de cromosomas en la división celular,...)

ADN de ØX174 Cromosomas eucarióticos en mitosis

Bacteria lisada – ADN “compacto”

EUCARIOTAS, PROCARIOTAS, VIRUS – ADN CONDENSADO POR ASOCIACIÓN CON PROTEÍNAS

EN VIRUS: ADN o ARN condensado dentro de las partículas virales por interacciones inespecíficas con proteínas de la cápside

VMT: ARN en hélice dentro de la cápside

CROMOSOMA PROCARIÓTICO

Lisis: fibras en forma de bucles unidas a la envoltura rota de la célula

LISIS

E.coli

•Cromosomas circulares

•Cromosomas lineales

•Ambos (ej. Agrobacterium tumefaciens)

CROMOSOMA PROCARIÓTICO

HLP1.

• Dominios en bucles de 40 kb aprox. de ADN superenrrollado; asociado a proteínas básicas

• No se sabe cómo se mantienen unidos en su base

• Cada dominio es independiente de los otros

PROTEÍNAS BÁSICAS DETECTADAS EN BACTERIAS

Proteína ComposiciónContenido por

célulasSemejanza con

eucariontes

HUDímero

subunidades a y b de 9.000 d.

40.000 dímeros Histona H2A

H

Dímero subunidades idénticas de

28.000 d.

30.000 dímero Histona H2B

IHF

Subunidad a de 10.500 d.

Subunidad b de 9.500 d.

Desconocido Desconocida

H1Subunidad de

15.000 d.10.000 copias Desconocida

HLP1Monómero de

15.000 d.20.000 copias Desconocida

PSububnidad de

3.000 d.Desconocido Protaminas

CROMOSOMA EUCARIÓTICO - CROMATINADIFERENTES NIVELES DE

COMPACTADO

6 veces compactado

40 veces compactado

> 1000 veces compactado

> 10000 veces compactado

CROMATINA - NUCLEOSOMAS

FIBRA DE 30 nm

FIBRA DE 10 nm

« collar de perlas »

Suspension de nucleos a baja fuerza ionica: lisis y liberación de fibras de cromatina de 30 nm

Nucleasa microcóccica

fuerza iónica

205

405

805605

Digestión suave con nucleasa microcóccica: se obtienen múltiplos de una determinada unidad de longitud: Repetición nucleosomal

Tratamiento más drástico con nucleasa

microcóccica:

3) Se liberan mononucleosomas

4) Se liberan nucleosomas recortados

5) Se liberan cores de histonas

PARTÍCULA NUCLEOSÓMICA CENTRAL

- 146 pb de ADN enrollados alrededor de la PARTÍCULA NUCLEOSÓMICA CENTRAL o CORE de histonas (2 vueltas)

-Tetrámero de H3 y H4

-2 dímeros de H2A y H2B

6 nm

OCTÁMERO

NUCLEOSOMA

-146 pb ADN enrollados en el core

-ADN ligador de largo variable

- Histona H1

Especie Repetición nucleosomal

Longitud del ligador

S. cerevisiae 160-165 13-18

Erizo de mar (espermatozoide)

260 110

D. melanogaster 180 33

Humano 185-200 38-53

EN PROMEDIO

EN LA CROMATINA HAY OTRAS PROTEINAS:

HMGs, protaminas, y todas las enzimas necesarias para la duplicación, transcripción,

etc. del ADN.

HISTONAS DEL CENTRALES o del CORE

- Proteínas pequeñas (11- 15 Kda)- Muy conservadas - RELEVANCIA- Alta carga + (ricas en Lys y Arg)- Dominio “pliegue histónico” - 3 hélices-α separadas por asas cortas no estructuradas- Colas N-terminales ¡¡IMPORTANTES!!

Histona Nº residuos PmContenido en moles % de

ModificaciónLys Arg

H1 213 21.000 27,7 1,4 Fosforilación

H2A 129 13.900 10,9 9,3Fosforilación,

acetilación

H2B 125 13.774 15,2 6,1Fosforilación,

acetilación

H3 135 15.273 9,6 13,3Acetilación, metilación

fosforilación

H4 102 11.236 10,8 13,7Acetilación, metilación

fosforilación

2) Se forman heterodímeros H3-H4

3) Se forma tetrámero H3 - H4

4) Unión al ADN

5) Dos dímeros H2A-H2B son reclutados

¿Cómo se arma un nucleosoma?: Las histonas se asocian de manera ORDENADA para formar un nucleosoma

-Tetrámero se une a 60 pb centrales de los 146

-Dímeros H2A-H2B a 30 pb a cada lado de esos 60 pb

-Hélice N-ter de cada H3 contactan 13 pb en cada extremo del ADN

ESTRUCTURA ATÓMICA DEL NUCLEOSOMA A ALTA RESOLUCIÓN

EJE DIÁDICO

INTERACCIONES ADN-histonas

- 14 sitios de contacto diferentes, uno por cada vez que el surco menor del ADN está frente al octámero de histonas

- 142 puentes de hidrógeno (entre a.a. y O del enlace fosfodiéster cerca del surco menor)

- enlaces por cargas + de histonas y – del ADN

(INTERACCIONES INESPECÍFICAS)

Colas N-terminales de histonas del core dirigen el enroscado del ADN en sentido levógiro:

¿Cómo se disponen los nucleosomas en la fibra de 10 nm?

2 factores favorecen la ubicación de un nucleosoma:

• Facilidad para que se curve la doble hélice: secuencias ricas en AT en surco menor

• Presencia de proteínas no histonas unidas al ADN con gran afinidad

- Longitud variable en el genoma

- Posicionamiento dinámico

Fibra de 30 nm:

Una vez que se forman los nucleosomas, la fibra de 10 nm se condensa en el siguiente nivel de compactado

2 modelos para la fibra de 30 nm:

SOLENOIDEZIGZAG

ADN ligador

ADN ligador

INTERVIENEN:

- H1

- Colas N-terminales de las histonas del core

Histona H1 o ligadora- Proteína pequeña; un poco más grande que las del core

- Secuencia menos conservada

- Estructura típica

¿Dónde se ubica en el nucleosoma?

Modelos:

Protección de 20 pb adicionales de ADN de digestión con nucleasa

microcóccica

Al aumentar la concentración salina en presencia de histona H1 se forma una fibra de 30 nm:

Las colas N-terminales de las histonas intervienen en la formación de la fibra de 30 nm

Recordar : Las colas de las histonas son blanco de modificaciones

post-traduccionales

Compactado en la fibra de 30 nm, un cromosoma humano aún mediría 0.1 cm = 10 veces más

grande que el núcleo celular!!

Niveles de mayor compactado (?) que varían en el ciclo celular en respuesta a señales del ciclo celular

Cromatina saliendo de un núcleo lisado

en interfase Cromosoma mitótico

CROMATINA EN INTERFASE

* La cromatina es una estructura fluida y dinámica en la que se deben

"exponer" las secuencias de ADN para que se den los diferentes procesos celulares.

* Estructura de cromosomas en interfase: cromosomas plumosos, cromosomas politénicos

* 2 «formas» de cromatina en interfase: EUCROMATINA y HETEROCROMATINA

CROMOSOMAS “ESPECIALES” EN INTERFASECROMOSOMAS PLUMOSOS («lampbrush»)

Cromosomas apareados en premeiosis en oocitos inmaduros de anfibios – CROMOSOMAS GIGANTES

BUCLES: genes que se expresan

EJE: cromatina condensada (ANDAMIAJE

CROMOSÓMICO)

CROMOSOMAS POLITENICOS

Cromosomas de larvas de insectos; múltiples ciclos de síntesis de ADN sin división celular

Los cromosomas homólogos se mantienen unidos, paralelos

D. melanogaster

BANDA

INTERBANDA

-5000 bandas e interbandas

-3 a 30 kb = 0.005 a 0.0005 µm

- Interbandas: 5 % genoma

- Bandas: > condensación cromatina y/o > contenido de proteínas

- Patrón reconocible

-Genes en interbandas se expresan más

CROMOSOMAS POLITENICOSECDISONA

CAMBIOS EN LA EXPRESION GENICA

APARICIÓN DE «PUFFS»: la cromatina se descomprime y

hay transcripción

MAS ADELANTE VEREMOS LOS MECANISMOS IMPLICADOS EN ESTA «APERTURA» DE LA CROMATINA

Tiempo

ANILLOS DE BALBIANI (Chironomus tentans):

LO QUE OCURRE EN CROMOSOMAS PLUMOSOS Y POLITENICOS EN CUANTO A PODRIA SER LO QUE OCURRE EN TODOS LOS CROMOSOMAS EN INTERFASE

EUCROMATINA Y HETEROCROMATINA

En la cromatina se distinguen zonas más y menos densas

EUCROMATINA

Estructura menos condensada, compuesta mayormente de fibra de 30 nm

HETEROCROMATINA

- Forma altamente condensada

- Incluye proteínas adicionales

- Genes no expresados (silenciados) en la mayoría de los casos; repetidos (tandems) de secuencias cortas

- Mantenimiento de telómeros y centrómeros de cromosomas

TELÓMERO

-Secuencias cortas repetidas

Ej. 5´TTAGGG 3’ (humano)

- Gran parte monocatenario (3’) formando una estructura especial, resistente a nucleasas

Estructura especial de la cromatina:

- Desacetilada

- Asociada a proteínas especiales

CENTRÓMERO

- Resistencia en la mitosis; unión a huso durante la mitosis a través del cinetocoro

- Diferente largo en los diferentes organismos

Ej. levadura: 125 pb

humano: varios miles de Kb

- Secuencias repetidas no características- satélites α

-Histonas desacetiladas, metiladas

Histonas especiales ej CENP-A, variante de H3

(N-terminal con extensión; unión a cinetocoro?)

-Docenas de proteínas asociadas

CROMOSOMAS EN MITOSIS

- Nivel máximo de compactado; los cromosomas se observan como cuerpos bien definidos

- Asociados a diferentes complejos de proteínas. si se extraen las histonas, se observa en microscopio electrónico bucles de ADN unidos a un andamiaje nuclear (40-90 kb = 10-30 nm)

Proteínas de andamiaje nuclear:

- topoisomerasa II en base de los lazos : control en replicacion y transcripción?

- SMCs “Structural maintenance of chromosomes”

SMCs

- COHESINAS

- CONDENSINAS (+ ATP : formación de bucles)

Formación de complejos en forma de anillos

ORGANIZACIÓN DE LOS CROMOSOMAS:

BANDEADO DE PROTEÍNAS G

Bandas G: bajo contenido de GC

Bandas R: alto contenido de GC –genes + transcriptos

Organización mantenida en la evolución:: IMPORTANTE

La cromatina es una estructura dinámica:porciones de ésta se descompactan para que tengan lugar los distintos procesos celulares

- Replicación

- Regulación de la expresión génica

REPLICACIÓN En el sitio de replicación la fibra de 30 nm se desorganiza.Inmediatamente después de la replicación el ADN se asocia a nucleosomas.

Nuevos nucleosomas : 2 posibilidades

2) los nucleosomas viejos se desarman y sus histonas + nuevas histonas forman nuevos nucleosomas

3) Los cores “viejos” se mantienen

Experimento: Sobrecruzamiento de histonas

Células crecen en presencia de a. a. PESADOS

• Replicación en presencia de a.a. livianos:: histonas nuevas son livianas

• Se forman octámeros

• Purificación de nucleosomas y fraccionamiento en gradiente de densidad

nucleosoma parentalhistonas sintetizadas de novo (livianas)

A) Se conservan los octámeros

B) Se forman octámeros nuevos (mezcla de histonas)

A) dos densidadesB) gradiente de densidades

B) parece ser la correcta

In vivo el ensamblaje de los nucleosomas no es un proceso espontáneo.

Se requieren chaperonas histónicas (ej. CAF-I, RCAF)

POSICIONAMIENTO DE NUCLEOSOMAS:

A veces es un estorbo, a veces una ventaja: depende de dónde queden los sitios de unión de factores transcripcionales

Si quedan escondidos, la cromatina deberá ser modificada para que los factores de transcripción puedan actuar.

CROMATINA Y TRANSCRIPCIÓN

POSICIONAMIENTO DE LOS NUCLEOSOMASPOSICIONAMIENTO EXTRÍNSECO:

El primer nucleosoma se posiciona en un determinado lugar, por secuencia o por proteína unida al ADN. El resto determinado por el primero

200 pb

PROMOTORES “PREPOSICIONADOS”

- Sitios de unión de factores de transcripción expuestos sobre el nucleosoma o en ADN ligador

- Genes constitutivos suelen ser de este tipo

Ej.: Promotor del gen hsp26 de D. melanogaster (respuesta al shock térmico)

GAGA GAGAHSE HSE TATA

pol II

pol II

(A)

(B)

HSTFTFIID

transcripción

interacción

- Modificaciones de la estructura de la cromatina asociados a transcripción se han observado in vitro e in vivo

- Esas modificaciones, ¿son necesarias para la transcripción o son consecuencia de la misma?

Se ha demostrado que en algunos promotores el “remodelado” de la cromatina puede tener lugar aún en ausencia de transcripción

¿Qué pasa si los sitios de unión de factores de transcripción en un promotor NO están accesibles?

EJEMPLO: Promotor de PHO5 de S. cerevisiae

TATAPHO2

PHO4

carencia de fosfato

TATAPHO2

PHO2

pol IITBP

-1-2

a b

transcripción

PERO....

¿Cómo se remodela la cromatina?

1) COMPLEJOS REMODELADORES DE LA CROMATINA ATP-dependientes

2) MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS HISTONAS

A)

TATA

TATA

TBP

SWI/SNF

SWI/SNF

TATA

transcripción

TBP

TATA

TBPSWI/SNF

TATA

SWI/SNF

B)

TBP

transcripción

Swi-Snf

MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS HISTONAS DEL CORE

-Lisinas y Serinas de histonas del core sufren acetilación, metilación, fosforilación, ubiquitinación....

- Mutaciones causan alteraciones de la expresión:

Ej. H4: *dominio R (aa 17 a 29) : implicado en represión

*dominio A (aa 1 a 16) : implicado en activación

-Modo de acción:

1) modificación de la interacción con ADN (carga)

2) Lugares de unión para proteínas

“Código de histonas”

SWI/SNF

DESACETILACIÓN DE HISTONAS

- Grandes complejos proteicos

- Reclutados a determinados promotores por represores específicos

1) Ume6 se una a promotor; interacción con Sin3

2) Sin3 es parte de complejo con RPD3 (HDAC)

COMPLEJOS DE ACCIÓN REPRESIVA - SILENCIAMIENTO

Complejos de proteínas que establecen estructuras muy organizadas de la cromatina (de tipo de heterocromatina)

Ej. telómeros de S. cerevisiae

• Rap1 se une a telómeros

• Rap1 recluta Sirs

•Interacción con histonas hipoacetiladas

• Sirs se agregan

Las figuras de esta presentación han sido extraídas de:

- Lewin, B. 2004. Genes VIII. Pearson Prentice-Hall.

-Watson, J.D. et al. 2004. Molecular Biology of the Gene. 5ª ed. Pearson Benjamin-Cummings.

-Lodish, H. et al. 1999. Molecular Cell Biology. 4a ed. W.H. Freeman & Co.

- Alberts, B. et. al. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4a ed. Garland Publishers

-Travers, A. (1999) “The location of linker histone in the nucleosome”;

TIBS 24: 4.

- Thoma, F.; Koller. T.H. and Klug A. (1979) “Involvement of the histone H1 in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin”.

J. Cell. Biol. 83; 403