Clase 4 2015 Transformacion Fondo Blanco

-

Transformación Genética de Especies Vegetales

Dra. Marisa LOPEZ BILBAO

[email protected]

Instituto de Biotecnología, INTA

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

AGROBIOTECNOLOGIA CURSO 2015

- Para transformar una especie vegetal

Analizar las plantas obtenidas (presencia,

estabilidad y nivel de expresión del transgén)

Ensayos de transformación

Sistema de cultivo de tejidos

Eficiente y reproducible,

Descendencia fértil

Método de selección

(Sin escapes)

Vector de Transformación (gen de

interés, gen de selección, promotor,

otras secuencias regulatorias)

Entrega: Cepa de Agrobacterium

o Gen Gun (otros métodos

menos usados)

Mercedes R

- • Sistemas de transferencia de ADN basados

en vectores biológicos

- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens

y Agrobacterium rhizogenes

- Sistemas basados en virus vegetales

• Sistemas de transferencia directa de ADN

- Transferencia por biobalística

- Transferencia mediada por cationes divalentes

y/o electroporación

- Transferencia por microinyección

Sistemas de transferencia genética en plantas

Entrega: Cepa de

Agrobacterium o

Gen Gun (otros

métodos menos

usados)

-

Tumor de tallo provocado

por Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.

Procesos celulares Etapas de infección

Agrobacterium se une a

la célula húesped Reconocimiento célula - célula

Procesamiento del ADN

Empaquetamiento del ADN

Transporte intercelular

Importación al núcleo

Integración del ADN y expresión de los genes

BI

Hebra T

Formación del complejo T

inmaduro, compuesto por

VirD2 y la hebra T

Formación del pilus para el

transporte del complejo T dentro de la célula húesped

Importación de la hebra T al

núcleo de la célula húesped

Integración de la hebra T y la

formación del tumor

Formación del complejo T

maduro, compuesto por

VirD2 y la hebra T cubierta

por VirE2

BD

Procesos celulares involucrados

en las etapas de interacción entre

la bacteria y la planta

Biología de Agrobacterium tumefaciens

-

Mapa genético del plásmido

Ti de octopina

Biología de Agrobacterium tumefaciens

-

Mapa genético del

plásmido Ti de

octopina

Estructura de la

región T de un

plásmido Ti de

octopina

-

Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.

2

Mecanismos moleculares implicados en la transformación por Agrobacterium tumefaciens

-

Agrobacterium

tumefaciens posee

un sistema

regulatorio de dos

componentes para

reconocer las

células vegetales

susceptibles

-

Una única molécula

de proteína VirD2 se

halla unida

covalentemente al

extremo 5’ del DNA.

Se requieren

600 moléculas

de VirE2 para

recubrir los 20

Kbp del ADN-T

VirB2

Ensamblaje de las proteínas de Agrobacterium

involucradas en el transporte del complejo T

Procesamiento de la hebra T y formación

del complejo T maduro

-

La integración

del ADN-T al genoma

de la célula vegetal

involucra

el apareamiento

no homólogo entre

éste y el ADN

cromosómico

(1) y (3): digestión de las cadenas desplazadas de ADN

de la planta por endonucleasas. (2): digestión del

extremo no apareado

del ADN-T por exo- o endonucleasas. (4) y (5): cortes

en la cadena desapareada del ADN de la planta

-

Protocolos de transformación mediante Agrobacterium tumefaciens

Transformación estable

Transformación transiente No se hereda y se usa para estudios en

el laboratorio de función, especificidad,

nivel de expresión, etc

Se obtienen plantas y su descendencia

portadoras del transgén

-

Kan

50 mg/L

Enraizamiento

Invernáculo

Regeneración

Re1

Re2

Re3

Re4

RA

Desinfección

Germinación

Agroinfección

&

Co-cultivo


Transformación

girasol

Transformación

tabaco Explanto inicial plantas maduras

en macetas

Explanto inicial semillas

en germinación

-

Transformación lechuga Explanto inicial cotiledones expandidos y verdes

-

Transformación

estable por floral dip

en Arabidopsis


-

Agroinfiltración en Nicotiana benthamiana

Bombardeo en hojas de cebolla

Evaluación

sobre el

explanto

inicial a los ¾

días de la

agroinfección

«estable» de

girasol

Tumor de raíces producido por

Agrobacterium

rhizogenes en discos de remolacha

Cultivo de raíces de tabaco transformadas

por Agrobacterium rhizogenes

Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus

No se necesita marcador de selección porque se ve

directamente la raíz

-

Protocolos de transformación mediante Agrobacterium rhizogenes

Genetic transformation of

Calibrachoa excellens via

Agrobacterium rhizogenes:

Changing morphological

traits

-


El uso de Agrobacterias implica el agregado de antibióticos para eliminar la

bacteria del medio de cultivo de plantas

Los más utilizados son cefotaxina, carbenicilina, timentina, augmentina.

La evaluación de estos antibióticos se realiza casi al mismo tiempo que la

puesta a punto del protocolo de cultivo de tejidos

-

Sistemas de transferencia directa de ADN

• Ventajas

- Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos

vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal

- No requieren eliminar las células del organismo vector de los tejidos o plantas

transgénicas

- Requieren construcciones más simples y pequeñas

- Son apropiados para estudios de expresión transitoria

• Desventajas

- Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén y del

vector en varios sitios del genoma de las células transformadas

- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de re-arreglos en los transgenes

- Bombardeo de

micropartículas

1984. Sandford et al.,

describen la técnica de

bombardeo de

micropartículas para la

transferencia directa de

ADN (Universidad de

Cornell, EEUU).

Modelo comercial actual

Medidor de presión de helio

Tubo de aceleración de gas

Interruptores de control

Medidor de vacío

Portador del discode ruptura

Portador del macroproyectil

Ensamblaje del propulsorde microproyectiles

Cámara de bombardeo

Controles del flujode aire y de vacío

Células blanco

Soporte del blanco

Válvula de medición de helio

Modelo comercial actual




Medidor de vacío






Células blanco

Soporte del blanco





Medidor de vacío






Células blanco

Soporte del blanco


Acelerador de micropartículas PDS 1000/He

por descarga de helio a alta presión

Soporte del tejido blanco

- • Parámetros físicos y químicos que influyen en la transferencia del

ADN

- Método de aceleración de las micropartículas

- Naturaleza química y física, densidad y volumen de micropartículas

- Naturaleza, preparación, adherencia y concentración del ADN - Vacío y distancias de bombardeo - Diámetro de apertura de la placa de retención - Número de bombardeos

• Parámetros relacionados con la construcción genética utilizada

- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y genes marcadores

de selección

• Parámetros relacionados con el tejido o células blanco

La transformación

por biobalística

depende de

factores físicos,

químicos

y biológicos

- - Transferencia de genes a células,

tejidos y órganos vegetales

- Transferencia de genes a

microorganismos y organelas

(cloroplastos)

- Estudio de expresión transitoria

- Análisis de promotores y de

delección de genes

- Estudio de mecanismos de

expresión. y regulación de genes

- Transferencia de ARN viral

-

Transformación

genética de plantas in

vivo usando una

pistola génica Helios

-

A B C

D E F

P

M

A y B: callos de maíz. C: brotes

primordiales de maíz. D y E: callos y

brotes de soja. F: ápice de una plántula

de algodón de 4 días (M: meristema

apical y P: primordio foliar).

Plantas transgénicas obtenidas por bombardeo de micropartículas

Tipos de explantos

DC

A B

Transformación de Festuca arundinacea

a partir de suspensiones celulares

A: suspensión de células de Festuca arundinacea sobre papel de filtro

antes del bombardeo. B: selección de células transformadas en medio

de selección conteniendo higromicina. C y D: plántulas transgénicas

de Festuca arundinacea regeneradas a partir de callos resistentes.

-

Transferencia de ADN mediada por electroporación y/o

métodos químicos

Electroporación de protoplastos

Pulsador de

electroporación

Cubetas de

electroporación

- A B

C D

E F

Cultivo y regeneración de

protoplastos de tabaco

-

Línea celular embriogénica

usada como fuente

de protoplastos

Protoplasto fluorescente

a las 24 h de la electroporación

Protoplastos luego de

la electroporación

Callos embriogénicos de 4

semanas derivados de protoplastos

Callos embriogénicos GFP positivos a los 6

meses de la transformaciónPlanta regenerada a partir de

callos en selección positiva

Línea celular embriogénica

usada como fuente

de protoplastos

Protoplasto fluorescente

a las 24 h de la electroporación

Protoplastos luego de

la electroporación

Callos embriogénicos de 4

semanas derivados de protoplastos







Aislamiento y electroporación de protoplastos de Citrus sinensis

(naranjo dulce) con el gen gfp

-

Expresión estable de genes transferidos a protoplastos de plantas por métodos

químicos y/o electroporación

npt II / kanamicinaPlantasMétodos químicosPetunia hybrida

npt II / kanamicinaCallosMétodos químicosBrassica campestris

npt II / kanamicinaCallosMétodos químicosTriticum monococcum

hpt / higromicinaPlantas fértilesElectroporaciónOryza sativa (Japonica)

dhfr / metotrexatoCallosElectroporaciónPanicum maximum

npt II / kanamicinaCallosElectroporación Brassica napus

hpt / higromicinaPlantas fértilesMétodos químicosArabidopsis thaliana

npt II / kanamicina

hpt / higromicina

als / clorosulfuron

Plantas fértilesElectroporaciónSolanum tuberosum

hpt / higromicinaPlantasMétodos químicos / ElectroporaciónDactylis glomerata

Zea mays

Festuca arundinacea

Oryza sativa (Indica)

Lolium multiflorum

Nicotiana tabacum

Especie

npt II / kanamicina

pat / fosfinotricina

Plantas fértilesMétodos químicos

hpt / higromicina


hpt / higromicina

npt II / kanamicina

npt II / kanamicina

Gen marcador de

selección / agente de

selección

Plantas fértiles

Plantas fértiles

Callos

Plantas fértiles

Tipo de

transgénico

Métodos químicos

Métodos químicos

Métodos químicos

Métodos químicos

Técnica de transformación

npt II / kanamicinaPlantasMétodos químicosPetunia hybrida

npt II / kanamicinaCallosMétodos químicosBrassica campestris

npt II / kanamicinaCallosMétodos químicosTriticum monococcum

hpt / higromicinaPlantas fértilesElectroporaciónOryza sativa (Japonica)

dhfr / metotrexatoCallosElectroporaciónPanicum maximum

npt II / kanamicinaCallosElectroporación Brassica napus

hpt / higromicinaPlantas fértilesMétodos químicosArabidopsis thaliana

npt II / kanamicina

hpt / higromicina

als / clorosulfuron

Plantas fértilesElectroporaciónSolanum tuberosum

hpt / higromicinaPlantasMétodos químicos / ElectroporaciónDactylis glomerata

Zea mays

Festuca arundinacea

Oryza sativa (Indica)

Lolium multiflorum

Nicotiana tabacum

Especie

npt II / kanamicina


Plantas fértilesMétodos químicos

hpt / higromicina


hpt / higromicina

npt II / kanamicina

npt II / kanamicina

Gen marcador de

selección / agente de

selección

Plantas fértiles

Plantas fértiles

Callos

Plantas fértiles

Tipo de

transgénico

Métodos químicos

Métodos químicos

Métodos químicos

Métodos químicos

Técnica de transformación









(Sin escapes)






menos usados)

-

La capacidad de Agrobacterium

tumefaciens de introducir ADN

en el genoma de la planta permitió

desarrollar vectores plasmídicos

basados en el plásmido Ti

-

Mapa de restricción

de los plásmidos

pBIN19; pPZP111;

pMON10098;

pGreen0029.

Abreviaturas:

BI: borde izquierdo; ori:

origen de replicación;

BD: borde derecho

Vectores basados en el plásmidos T

-

Tomado de: Hellens and Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000.

Si ColE1 pVS1 BI Cloranfenicol Si 9 8909 pPZP111

Si

No

Si

No

No

No

Si

LacZ

Kanamicina

Tetraciclina

Gentamicina

Ampicilina

Tetraciclina

Ampicilina ,

estreptomicina y

espectinomicina

Kanamicina

Selección

bacteriana

BI

BI

BI

BD

BD

BD

BD

Marcador

de

selección

en:

pSa

pRK2

pRi

pRK2

pRK2

pRi

pRK2

Agrobacterium

Origen de replicación

pUC

pRK2

ColE1

ColE1

ColE1

ColE1

pRK2

E. coli

Si 6 9200 pPCV001

Si 7 13200 pGA482

Si 2 17500 pC22

Si 9 11777 pBIN19

Si 4 25700 pJJ1881

Si 5 14440 pCGN1547

No 18 4632 pGreen0029

Mobilización

Sitios

únicos de

restricción

en ADN - T

Tamaño

(kb) Vector

Si ColE1 pVS1 BI Cloranfenicol Si 9 8909 pPZP111

Si

No

Si

No

No

No

Si

LacZ

Kanamicina

Tetraciclina

Gentamicina

Ampicilina

Tetraciclina

Ampicilina ,

estreptomicina y

espectinomicina

Kanamicina

Selección

bacteriana

BI

BI

BI

BD

BD

BD

BD

Marcador

de

selección

en:

pSa

pRK2

pRi

pRK2

pRK2

pRi

pRK2

Agrobacterium

Origen de replicación

pUC

pRK2

ColE1

ColE1

ColE1

ColE1

pRK2

E. coli

Si 6 9200 pPCV001

Si 7 13200 pGA482

Si 2 17500 pC22

Si 9 11777 pBIN19

Si 4 25700 pJJ1881

Si 5 14440 pCGN1547

No 18 4632 pGreen0029

Movilización

Sitios

únicos de

restricción

en ADN - T

Tamaño

(kb) Vector

diseño de vectores binarios

GATEWAY vectors for

Agrobacterium-mediated plant

transformation Mansour Karimi, Dirk Inzé and Ann

Depicker

TRENDS in Plant Science Vol.7 No.5 May

2002

-

Genes Reporteros

Permiten ver la expresión del transgen (reportero)

GUS Gen de la β glucuronidasa

GFP (green fluorescent protein) No es destructiva

Otras proteínas fluorescentes

-

Genes reporteros

-glucuronidasa

Proteína de fluorescencia

verde

Cloranfenicol

acetiltransferasa

Luciferasa

Luciferasa

Abreviatura

gus/uidA

GFP

Cat

Luc

luxA, luxB

Origen

E. coli

Aequorea victoria

E. Coli

Photinus pyralis

Vibrio harveyi

Detección

Fluorométrico (cuantitativo)

o histoquímico (in situ),

no radiactivo

Fluorescencia,

no destructiva

Ensayo radiactivo

sensitivo, semi cuantitativo

Luminiscencia

Luminiscencia

Genes reporteros

-glucuronidasa

Proteína de fluorescencia

verde

Cloranfenicol

acetiltransferasa

Luciferasa

Luciferasa

Abreviatura

gus/uidA

GFP

Cat

Luc

luxA, luxB

Origen

E. coli

Aequorea victoria

E. Coli

Photinus pyralis

Vibrio harveyi

Detección

Fluorométrico (cuantitativo)

o histoquímico (in situ),

no radiactivo

Fluorescencia,

no destructiva

Ensayo radiactivo

sensitivo, semi cuantitativo

Luminiscencia

Luminiscencia

Genes reporteros utilizados en transformación de plantas

-

Promotores constitutivos vs tejido específico

Ejemplo de utilización del gen reportero uid A

-

Promotores

• Promotores constitutivos

• todos los tejidos

• independiente de factores ambientales

• activos entre especies y reinos

• Promotores inducibles

– expresión dependiente de factores externos

– factores abióticos (luz, temperatura, heridas)

– factores bióticos (ataque patógenos)

• Promotores tejido o desarrollo específico

– expresión restringida en tiempo y/o espacio

– desde órganos completos durante todo el desarrollo hasta pocas células en

corto tiempo

– órgano especifico (semillas)

-

Esqueleto del vector

Bordes Izquierdo y Derecho

Gene de selección en bacterias (en E coli y en Agrobacterium)

Genes Reporteros o Genes de Interés

Promotores

Terminadores

Secuencias Enhancer









(Sin escapes)






menos usados)

- Genes Marcadores ó

de Selección Diferenciar células

transformadas de las

no transformadas

Selección negativa vs Selección Positiva

Kanamicina,

Higromicina,

Gentamicina,

Antibióticos

Glufosinato de

amonio

Glifosato

Herbicidas

Manosa y

otros

azúcares

Genes de selección

manosa-6P

fructosa-6P

manosa–6P

isomerasa

-

MetotrexatoPlásmido R67Dihidrofolato reductasadhfr

Bleomicina, fleomicinaTn5 y Streptoalloteichus

hindustanus

Resistencia a bleomicinaBle

Kanamicina, G418,

paromomicina, neomicina

Tn5Neomicina fosfotransferasanptII

EstreptomicinaTn5Estreptomicina

fosfotransferasa

SPT

Higromicina BE. coliHigromicina fosfotransferasaaphIV

CloranfenicolFago p1CmCloranfenicol acetil

transferasa

cat

GlifosatoPetunia hybrida5-enolpiruvilshikimato-3-

fosfato sintasa

EPSP

Fosfinotricina, bialofosStreptomices

hygroscopicus

Fosfinotricin acetil

transferasa

bar

GentamicinaSerratia marcescens;

Klebsiella pneumoniae

Gentamicin-3-N-

acetiltransferasa

aacC3, aacC4

SelecciónFuenteProducto genéticoGen de selección

MetotrexatoPlásmido R67Dihidrofolato reductasadhfr

Bleomicina, fleomicinaTn5 y Streptoalloteichus

hindustanus

Resistencia a bleomicinaBle

Kanamicina, G418,

paromomicina, neomicina

Tn5Neomicina fosfotransferasanptII

EstreptomicinaTn5Estreptomicina

fosfotransferasa

SPT

Higromicina BE. coliHigromicina fosfotransferasaaphIV

CloranfenicolFago p1CmCloranfenicol acetil

transferasa

cat

GlifosatoPetunia hybrida5-enolpiruvilshikimato-3-

fosfato sintasa

EPSP

Fosfinotricina, bialofosStreptomices

hygroscopicus

Fosfinotricin acetil

transferasa

bar

GentamicinaSerratia marcescens;

Klebsiella pneumoniae

Gentamicin-3-N-

acetiltransferasa

aacC3, aacC4

SelecciónFuenteProducto genéticoGen de selección

Ejemplos de genes de selección

-

Ya tenemos todos los elementos necesarios, por lo

que podemos armar un vector de transformación









(Sin escapes)






menos usados)

- Diseño experimental para los ensayos en semillas de lechuga

Después de los ensayos de transformación, sigue Análisis T1, T2……

-

14 líneas T1 PrHaAP10

Ensayos fluorométricos

Ensayos histoquímicos

-

Líneas T2

Tesis

Diego

Zavallo

-

¿Y este es el final del trabajo en un laboratorio

con plantas transgénicas??

Luego comienza el camino de los desafíos a

los estreses, analizar la equivalencia

sustantiva, observar si aparece el

silenciamiento génico, la estabilidad de los

transgenes, los niveles de expresión, etc.

Esto en invernáculos de bioseguridad

Y así comienza el camino de la desregulación

(Fase I).

- Por último comenzar el camino de la desregulación en Fase II,

que son las pruebas a campo.

Hasta el momento no existen desarrollos argentinos liberados en el mercado

Clase 4 2015 Transformacion Fondo Blanco

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