Clonacindegenes

ClonacindelDNADNAforneo(secuenciaquesedeseaclonar)Vectordeclonacin(vehculo)Organismohusped(E.Coli)Seleccindevectores

Vectorhbrido

http://www.dnatube.com/video/556/Plasmid-Vector-Construction

http://www.dnatube.com/video/4036/PCRCloning

UngenAislamientoapartirdelmRNA (yanotieneintrones):usodelatranscriptasa inversaquehacecDNA apartirdelconjuntodemRNA deltejido(LibreradecDNA)

Fragmentosdelgenomapordigestinconenzimasderestriccin:SeobtieneunaLibreraGenmica,juegocompletodefragmentosclonadosdelgenomadelorganismoFragmentosdePCRamplificadoconpartidoresespecficosparalasecuenciaquesebuscaydesdeelcDNA extradodeltejidoendondeelgenseestexpresando

Obtencindelasecuenciaqueseclona

Libreragenmica

AmplificacindeunfragmentoporPCR

Acta

Luego de 30 ciclos, una copia del fragmento se ha amplificado 109 veces:

230 =1.073.741.824 copias del fragmento de inters

Vectordeclonamiento

Caractersticas generales de un vector de expresin(procaritico)

- promotor fuerte (inducible)

- sitio de clonamiento multiple (MCS)

o policonector (sitio con muchas

secuencias reconocidas por enzimas de

restriccin)- seal de trmino de la transcripcin

- sitio de unin del ribosoma (RBS)

- origen de replicacin

- marcador de seleccin:

Los ms usados son los antibiticos

ClonacinysecuenciacindelDNA 14

FormacindelVectorhbridoFragmentosdedistintasprocedenciasqueseuneninvitrotrascortarseconlamismaenzimaderestriccin.Ligasa sellazonahbrida

VectoresdeclonacinPlsmido(215kb)Fago (Lambda)Csmido

PlsmidohbridooPlsmidorecombinanteoDNArecombinante

Fcildecrecerenmediosdecultivosimples

Tiempoprpidodecrecimiento,condivisincelularentre2030minutos

Sugenticaesconocidamuybien,puessesecuencicompletamentesugenoma

Sepuedeintroducirmaterialgenticoforneoenvectores,plsmidosoADNdefagocomocopiasdematerialextracromosomal

Husped:E.coli

Plsmido:resistenciaaantibiticosSeleccindevectoresrecombinantes

Cmo reconocer qu bacterias incorporaron el plsmido recombinante y cuales no?

Slo crecen las bacterias que tienen la resistencia a la ampicilina (otorgada por el plsmido)

Obtencindelgendeintersapartirdeunagenoteca

Depender del tipo de librera que se utilice (de cDNA o genmica), el tipo de gen que se obtiene: el ADNcopia (cDNA) que ser igual a ARNm, no tiene intrones o el GEN completo, tal como est en ADN y seguramente fragmentado en varias colonias positivas

Propagacincelular

PermiteobtenerlasmximasventajasdegeneseucariotasVectoresdelevaduras:cromosomasartificialesdelevaduras(YACs):Plsmidos+Secuenciareplicadora+centrmerodelevadura+(telmerolevadura)

Puedeincorporarmsde500kbdeDNA

Vectoreseucariticos

OrigendereplicacindelDNAdelevadura(ARS)

Regincentromrica(CEN)

Resistenciaaantibitico(p.e.,ampr)

Origendereplicacinbacteriano(ori)

CEN ARSampr ori TelmeroTelmero

Linealizacin(conendonucleasas)yadicindeextremostelomricos

Caractersticas generales de un vector de expresin(eucaritico)

- promotor fuerte (inducible)

- sitio de clonamiento multiple (MCS)

- seal de trmino de la transcripcin

- seal de poliadenilacin

-sitio de unin del ribosoma (RBS)

- origen de replicacin

- marcador de seleccin en bacterias y en clulas eucariticas

PA

PA

Invitrogen