Bqca. Ivan María Victoria

Hematología Clínica2013

CITOQUIMICA“APLICADA A LA HEMATOLOGIA”

Son un complemento de las tinciones hematológicas. Por medio de ellas se localizan enzimas y sustancias

inorgánicas. Así se mejora la diferenciación celular. También sirven para el diagnóstico

La citoquímica estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos: enzimas, metales

pesados, sustancias orgánicas moléculas de depósito y otras sustancias.

MORFOLOGÍA <-----> BIOQUÍMICA

CITOMORFOLOGIA. 70-80%

CITOQUIMICA. 90-95%

INMUNOFENOTIPO

MICROSC. ELECTRN.MAS 99-

100%

CITOGENETICA Y BIOL. MOLECULAR

CONFIABILIDAD DE LOS METODOS PARA EL Dx DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS

MUESTRAS UTILIZADAS

EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFÉRICA

PUNCION DE MÉDULA ÓSEA

PUNCION DE GANGLIOS

LCR

TIPOS DE TINCIONESSe pueden clasificar en:

Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que se pretende colorear, se pueden dividir en vitales y no vitales.

Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el Dx hematológico, se dividen en tradicionales y especiales.

TINCIONES VITALES Y NO VITALES Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se

practican sobre células que están vivas.

Las tinciones vitales son aquellas que se efectúan sobre células que están vivas, mediante la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. Son colorantes vitales: el verde Jano y el azul de metileno.

Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo del que proceden.

Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas. La coloración de células muertas requiere un proceso previo de fijación, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos.

TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad por las

estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina (eosina).

Colorantes básicos: tienen una especial afinidad por las estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos (azul de metileno).

Colorantes neutros: son sales de un ácido y de una base coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro (eosinato de azul de metileno).

Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante (Sudán III)

También hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polícromas.

Una coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras. (May-Grünwald-Giemsa)

Y es pancrómica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas (azul de metileno, eosina, Wright)

Las reacciones citoquímicas pueden también clasificarse según el mecanismo químico involucrado

1-Progresivas estables: Son reacciones que exigen un tiempo mínimo pero no un máximo.

2-Progresivas indefinidas: En estas la reacción continúa y puede hacer ilegible el preparado o conducir a valores erróneos.

3-Fugaces: Son las que pierden color rápidamente y no pueden conservarse mucho tiempo.

CLASIFICACION DE LAS TÉCNICAS CITOQUÍMICAS

CITOQUÍMICA CLÁSICA

INMUNOCITOQUÍMICA NO FLUORESCENTE

CITOQUÍMICA FLUORESCENTECITOQUÍMICA ELCTRÓNICA

CITOQUÍMICA AUTOMATIZADA

Citoquímica Clásica: Se fundamenta en reacciones coloreadas que pueden observarse e interpretarse con el microscopio óptico común.

Citoquímica electrónica: Se caracteriza por ser una metodología de elevada sensibilidad

Citoquímica Fluorescente: puede o no ser inmunocitoquímica, se fijan sobre distintas estructuras de las células y al ser excitadas por luz UV producen fluorescencias de distintos colores

Inmunocitoquímica no fluorescente:Se basa en la marcación de anticuerpos con sustancias que son capaces de dar reacciones citoquímicas intensamente coloreadas que permiten su revelación.

Fisicocitoquímíca electroforética Permite reconocer determinados componentes de las organelas celulares obtenidas en solución mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis en un

campo eléctrico y la identificación por reacciones citoquímicas, permite identificar complejos isoenzimáticos,

mientras que los métodos citoquímicos simples revelan una enzima en bloque.

Citoquímica automatizada: Es el fundamento de la CMF que utiliza la citoquímica fluorescente

CITOQUIMICA ELECTRONICA:

CITOQUIMICA FLUORESCENTE:

•INMUNES

•NO INMUNESS

INMUNOCITOQUíMICA NO FLUORESCENTEInmunocitoquímica con detección indirecta y enzimática. La sección se obtiene de tejido previamente fijado. Inmediantemante después se incuban en una solución de bloqueo que satura los posibles sitios de unión inespecífica, gracias a una alta concentración de proteína como la albúmina de suero bovino. Tras cada paso de unión de anticuerpos o del complejo avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes en una solución tamponada de fosfato (tampón fosfato), en la que también van disueltos los anticuerpos. La reacción de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidinay el peróxido de hidrógeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio ótico.

CITOQUIMICA AUTOMATIZADA:

Definición de reacción citoquímica

Es la reacción que por el método de uno o mas reactivos químicos: aplicados a la célula en

condiciones definidas; determina la formación de productos coloreados; insolubles; no difusibles; que permiten el reconocimiento microscópico; de sustancias o grupos químicos definidos; en su

real ubicación citológica; para lo cual no deben destruir a la célula, y si lo hacen deben

reemplazar a la sustancia identificada en su topografía

Las finalidades primordiales

El reconocimiento y diagnostico celular

El estudio de la fisiología y la fisiopatología celulares

El Dx de la patología

ESTANDARIZACION DE METODOS EN CITOQUIMICA

Preparación estricta de los reactivos

Practicas permanentes de las reacciones con preparados testigos

Realización, la fijación y conservación adecuada de los preparados y reactivos

Determinación de tiempos exactos para cada uno de los pasos

Ídem de temperatura (especial para enzimas)

Tiempo y condiciones de la inmersión para la lectura

Diámetros y conservación idóneos de los elementos sobre los cuales se lleva a cabo la determinación

Tres pasos fundamentales:

Fijación: preservar las estructuras y reactividad funcional de las células.

Incubación en el medio de reacción: como consecuencia se generan productos que ponen en evidencia el componente a ser estudiado.

Contraste: permite detectar con mayor facilidad el producto de reacción .

Las reacciones deben tener 3 características:

sensibilidad, especificidad y reproductibilidad.

Pueden ser reconocibles….

SUSTANCIAS RECONOCIBLES:

1-DNA Y RNA.2-PROTEINAS.3-HEMOGLOBINA.4-HIDRATOS DE CARBONO.5-LIPIDOS.6-FOSFOLIPIDOS.7-METALES

ENZIMAS RECONOCIBLES

1-MIELOPEROXIDASAS (MPO)2-FOSFATASA ALCALINA (FAL)3-FOSFATASA ACIDA (FAC)4-ESTERASAS (EST)5-FOSFATASA ACIDA TARTRATO RESISTENTE (FAC-TR)6-DEHIDROGENASAS (DH)

CITOQUIMICA CLASICAreconocimiento por:

principios no enzimáticos principios enzimáticos

Hidratos de carbonos: PAS MPO

Fe hemosiderínico: PERLS FAL

Lípidos: Red Oíl/Sudan Black FAL

Hemoglobina fetal: elución acida ESTEARASAS

CATALASAS

ENZIMAS HIDROLITICAS

TINCIONES CLASICAS

1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS

TINCIÓN DE PAS (Peryodic Schiff Acid)

Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la acción del ácido peryódico, potente

agente oxidante, liberándose grupos aldehído que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de

color rojo púrpura intenso.

-C-C- ALDEHIDOS “PURPURA”

ACIDO PERYODICO SCHIFF

RESULTADOS: células (+) con patrón difuso fucsia intenso, lacunar y granular de acuerdo a la progenie

Serie granulocitica normal: (+) difusa en toda la serie mieloide

Basófilos: (+) con patrón lacunar o (–) hasta un 50%

Serie eritroide normal: negativa

Serie megacariocitica normal: (+) en plaquetas con un patrón difuso mas granular o bloques

Precursores linfoides: (-), hasta llegar a linfocito en el que un 30% es (+) en corona de gránulos

NEUTROFILO Y ERITROBLASTOS NORMALES

MEGACARIOCITOS Y PLAQUETAS NORMALES

LINFOBLASTOS LEUCEMICOS PAS (+)LMA6 en MO PAS (+)

TINCION DE PERLS

Se basa en la liberación de los iones férricos de su unión con las proteínas por la acción del ácido clorhídrico; dichos iones férricos al reaccionar con el ferrocianuro potásico dan un precipitado azul verdoso de ferrocianuro férrico.

Por esta reacción se detecta el Fe hemosiderínico, que es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que es hidrosoluble.

Sideroblastos en anilloReflejando una anormalidad en la acumulación de Fe en

las mitocondrias (azul de Prusia)

HEMOSIDENURIA: hierro liberado en orina en una HPN

En el estudio del Fe medular hay que valorar conjuntamente 3 parámetros:

nº de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe macrofágico.

Básicamente se presentas 3 patrones: 1) nº sideroblastos alto y Fe de depósito aumentado: es

frecuente hallarlo en estados anémicos que cursan con sobrecarga férrica.

2) nº sideroblastos bajo y Fe de depósito disminuido o ausente: es el patrón característico de la anemia ferropénica pura; de aparición muy precoz en un balance férrico negativo.

3) nº sideroblastos bajo con acúmulo de Fe en los macrófagos medulares. Este patrón disociado es propio de entidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los macrófagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a los eritroblastos, suele observarse en anemias secundarias.

Hemocromatosis(cortes histológicos de

hígado)

HEMOGLOBINA FETALTest de Kleihauer-Betke

La hemoglobina fetal (HbF o 22) es ácido y álcali resistente. Por consiguiente, sometiendo un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos.

Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean con eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras.

Esta prueba se usa para determinar si hay GR del feto en una mujer embarazada con un grupo sanguíneo Rh(-).

SUDAN BLACK / RED OIL

Ambas se utilizan para la detección de lípidos, en el caso del Sudan Black este tiñe los

fosfolípidos y esteroles de membrana de los gránulos.

Es un colorante lipofilo que se une de forma irreversible a un componente granular indefinido en los granulocitos, en los eosinofilos y en algunos monocitos.

Tiñe tanto los gránulos azurófilos inespecíficos como los específicos

de los neutrofilos

El producto de la reacción es

negro y granular

LMA2 (con eosinofilia t(8;21): intensa tinción delas células en maduración y de los gránulos de

los eosinofilos anormales.

2) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS ENZIMATICOS

MIELOPEROXIDASALa demostración citoquímica de esta enzima se

basa en la acción oxidante de la peroxidasa sobre un sustrato (bencidina) en presencia de peróxido de hidrógeno, apareciendo un precipitado azul en el lugar del citoplasma en donde se ha producido

la reacción.

BENCIDINA

H2O2MPO

Resultados….siempre patrones granulares! ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS (etanol)

GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : (+) patrón granular intenso en toda la serie granulocítica mieloide y en menos del 3% de los blastos en MO. Los blastos mieloides dan un patrón característico polar, en casquete.

EOSINÓFILO (+) en la membrana granular, el fondo del granulo conserva la coloración parda.

BASÓFILO (+) en 50%

LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS

MONOCITOS: (+) patrón granular escaso o disperso

NORMALES..

PATOLOGICOS…

“ESTRES OXIDATIVO”Scorificación de MPO en granulocitos:

Se categorizaron los neutrófilos de acuerdo al contenido de gránulos presente en el citoplasma, en scores que van de 0 a 4, en orden creciente.

Grado 0: Sin granulaciones teñidas. (fig. 1 y 2)

Grado 1: Escasas granulaciones teñidas dispersas (fig.3 y 4)

Grado 2: Regulares granulaciones sin cubrir el núcleo (fig. 5)

Grado 3: abundantes granulaciones teñidas en todo su citoplasma sin llegar a cubrir completamente el núcleo. (fig.6 )

Grado 4: granulaciones que cubren la célula completamente dándoles un aspecto de casquete. (fig.8 y 9)

FOSFATASA ALCALINA

La FA es una fosfomonoesterasa que es activa francamente a ph alcalino y actúa sobre grupos esteres fosforados liberando

el ion fosfato.

La actividad de la FA granulocítica es marcadora de la granulación especifica de los neutrófilos.

Inicialmente se pensó que la FA estaba localizada en gránulos específicos (secundarios), pero se demostró que esta asociada

con un componente membranoso del citoplasma identificado como una estructura tubular de forma irregular distinta de los

gránulos 1 o 2 y de otras organelas citoplasmáticas.

ph alcalinoFAL

Alfa-naftil fostato

naftilo fosfato

Colorante diazoico

Compuesto diazotado

Cuidados: Efectuar la reacción en frotis de no mas de 24 hs. Conservar los preparados en heladera envueltos en

papel absorbente con un desecador. Ph de la reacción

La actividad granulocitica de la FA se manifiesta en forma de un

precipitado de color pardo negruzco localizado en el citoplasma

. Se encuentran actividad FA en algunas células maduras y

semimaduras de la granulopoyesis neutrofilica

(segmentados y bandas)

Índice de actividad de FAL

Grado 0: sin reacción

Grado I: coloración difusa o con pequeños puntos coloreados

Grado II: mayor densidad cromática, por lo general en la zona del hilio nuclear.

Grado III: mayor granulación oscura, tiñe todo el citoplasma.

Grado IV: completamente oscuro

Es la suma de los grados de positividad de 100 neutrófilos.

Score: 95+/-20

Su máximo interés se centra en el estudiodelos síndromes mieloproliferativos: LMC valores muy bajos o nulos. Su determinación es muy útil para establecer el diagnóstico diferencial entre LMC y reacciones neutrofílicassecundarias que cursan con valores elevadísimos.

Hemoglobinuria Paroxística Nocturna Hipofosfatemia hereditaria.

FOSFATASA ACIDASe basa en la hidrólisis del substrato

naftol-AS-Bi-fosfato.

La aplicación práctica del estudio de la FA se refiere sobre todo al estudio de los síndromes linfoproliferativos

crónicos (LPC) y leucemia aguda linfoblástica (LAL), dónde existe una buena correlación entre el tipo de positividad y

el fenotipo de membrana.

FAC LT(+) Y LB (-)

El 90% de las LAL de origen T dan una reacción + intensa de localización centrosómica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores

elevados de FAC que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B.

LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA EN MAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS.

Tricoleucemia: Tinción fosfatasa ácida (+) tartrato resistente

ESTEARASAS Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar

una variedad de esteres alifáticos u aromáticos en condiciones neutras o ácidas.

Se distinguen tres tipos: Esterasa específica para línea granulocítica Esterasa monocítica Esterasas comunes: son expresadas por varias

células hematopoyéticas

La demostración citoquímica de las esterasasleucocitarias se basa generalmente en la habilidad de

reaccionar con el grupo ester del Naftol AS.

Los sustratos para las esterasas de uso común enhematología incluyen:

• Naftol AS-D Cloroacetato• Naftol AS-D acetato ( NASDA)

• α-Naftil acetato• α-Naftil butirato

Estos sustratos al ser hidrolizados en presencia de unasal diazoica dan un precipitado insoluble en el lugar de

la reacción.

CLOROACETOESTEARASA (CEA) SUSTRATO ESPECIFICO: Naftol AS-D CloroacetatoEs una esterasa que muestra una actividad específica para la línea granulocítica. Aparece ontogénicamente posterior a

mieloperoxidasa por lo que es menos sensible para los blastos muy inmaduros.

Los eosinoblastos que son positivos para peroxidasano muestran actividad para esta reacción.

Las líneas monocítica, eritroide, linfoide y megacariocítica son negativa.

NAFTOL AS-D ACETATO ( NASDA)

• Detecta las 3 esterasa: granulocíticas: N, Eo, BaMonocítica comunes

La esterasa granulocítica es resistente a la inhibición con Fna mientras la monocítica es sensible al FNa.

Las esterasas comunes tienen un comportamiento variable frente al FNA.

Los precursores de la línea eosinofila son normalmentenegativos sin embargo la LMA M4 Eo es consistentemente

positiva a esta reacción ( inv 16).

α-NAFTIL ACETOESTERASA (ANAE)

Detecta las esterasas monocítica y esterasascomunes.• Las esterasas granulocíticas son normalmente noreactivas.• El patrón observado en las esterasas monocíticas esdifuso moderado a intenso y sensible a la inhibición conFNa.• Las esterasas comunes muestran diferentes grados de sensibilidad al FNa y presentan patrones de reacción granular o focal.

α-Naftil butirato

Es el sustrato específico para las esterasasmonocítica pero a pesar de su aparente especificidad no es recomendado por el Comité Internacional de Hematología por su costo

Granulocitos Linfocitos Monocitos Plaquetas Eritrocitos

Mb Seg

Lbl Lin

Mbl Mon

Mg Pq PEbl GR

PAS

Fe

MPO

FAL

FAC

ANAE

NCAE

Sudan Black

EN RESUMEN…..

Progenie linfoide normales (-) Hasta llegar al linfocito donde un 30% es (+) en corona de gránulos

Linfoblastos leucémicos (+) Positividad en mazacotes

Serie roja normal (-) Serie roja anormal (+) [LMA6]

Serie granulocitica (+) difusa

PAS en neutrofilos con un patrón difuso

Reacción de PAS, médula ósea. Gránulos gruesos en el citoplasma de los linfoblastos.

LMA6 (eritroide) MO “PAS”: todos los precursores eritroide contienen glucógeno, nunca los normales.

La demostración citoquímica se basa en la hidrólisis de ciertos substratos, de los cuales se liberan unos productos intermedios que combinados con una sal

diazoica dan un precipitado coloreado.