Citometría de flujo en el diagnóstico y clasificación de...

Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006

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Solicitud de reimpresos: Q.F.B. Josefa Piedras-Ross. Departamento de Hematología y Oncología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición SZ. Vasco de Quiroga 15, Colonia Sección XVI, Delegación Tlalpan 14000, México, D.F., México. Tel.: 54 870 900 Ext. 2704

Citometría de flujo en el diagnóstico y clasificaciónde padecimientos hematológicos: leucemias agudas, síndromes linfoproliferativos crónicos y glicoproteínas

plaquetarias.

Q.F.B. Josefa Piedras

Departamento de Hematología y Oncologia. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México, D.F., México.

los que usualmente incluyen mediciones de tamaño y granularidad junto con 4 a 8 colores de fluorescencia; cuando miden 8 parámetros es posible resolver hasta 64 poblaciones distintas de células con valores positivos o negativos para cada parámetro (2). Algunos citómetros de flujo pueden separar físicamente las células basado en diferencias de cualquier parámetro medible, y los instrumentos del futuro también permitirán medir microbios y organelos celulares. Una de las áreas más beneficiadas en CF con el análisis multiparamétrico de las células es precisamente la hemato-oncología médica.

INMUNOFENOTIPO.En mayo del 2005 se llevó a cabo en

la Ciudad de Querétaro, México, la segunda Conferencia de Consenso Latinoamericano para la inmunofenotipificación de padecimientos hematológicos malignos (3), cuyo objetivo fue el de actualizar las recomendaciones emanadas de la Primera Conferencia de Consenso (4). Se estableció la utilidad clínica del inmunofenotipo para la clasificación, pronóstico y seguimiento

INTRODUCCIÓN.La citometría de flujo (CF) es la

medición de las propiedades de las células que se encuentran suspendidas en un fluido y que interrumpen un haz de luz láser. El método permite el análisis cualitativo y cuantitativo de diferentes propiedades como tamaño, estructura y contenido (análisis multiparámetro), de poblaciones celulares en líquidos corporales, así como de cualquier partícula tan pequeña como 0.1 µm. La dispersión de la luz fue usada como un indicador de la presencia de una célula, y el reporte Coons y Kaplan de la conjugación de la fluoresceina a los anticuerpos constituyó un descubrimiento importante que permitió la identificación de antígenos tisulares por anticuerpos específicos usando fluorescencia (1). Desde la primera generación de los citómetros de flujo en 1980 ha habido grandes avances, y los citómetros actuales combinan una mezcla de tecnologías modernas tales como: mecánica de fluidos, rayos láser, óptica, electrónica análoga y digital y computer software. Hoy en día con los citómetros de flujo se pueden evaluar de 4 a 8 parámetros,

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de los pacientes con leucemia aguda (LA), y para el diagnóstico, clasificación, pronóstico y seguimiento de los pacientes con padecimientos linfoproliferativos crónicos (PLPC).

Preparación de la muestra. Se recomendó, para la mayoría de los casos, el empleo de muestra total de sangre o de médula ósea sometida a lisis de eritrocitos y fijación, y la separación celular por gradiente de densidad sólo en aquellas muestras contaminadas con células necróticas estromales o grasas. También se recomendó reducir el número de células teñidas con el objeto de disminuir el volumen de anticuerpo monoclonal utilizado, siempre y cuando la reducción sea validada experimentalmente.

Paneles de anticuerpos monoclona-les. Mediante el inmunofenotipo se pueden clasificar cuatro tipos de leucemias: a) leuce-mia aguda linfoblástica de estirpe T (LAL-T), b) leucemia aguda linfoblástica de precurso-res de células B (LAL-B), c) leucemia aguda mieloblástica (LAM) y d) leucemia aguda bifenotípica (LAB).

La combinación de los marcadores CD2, CD7 y CD3 citoplásmico se consideró la más apropiada para definir a la LAL-T, requiriendo la co-expresión de CD3 citoplásmico con cuando menos uno de los otros dos antígenos. Para establecer el grado de madurez se recomendó investigar la expresión de CD34, TdT y la intensidad de expresión del CD45. No se consideró de relevancia clínica una sub-clasificación de la LAL-T.

Para la clasificación de la LAL-B, además de la combinación de anticuerpos anotada en el cuadro 1 se decidió, por utilidad terapéutica y clínica, adoptar la sub-clasificación del EGIL (European Group of Immunophenotyping of Leukemias) en: Pro-B (B-I), Común (B-II), Pre-B (B-III) y LAL de células B maduras (B-IV) empleando los anticuerpos anotados en el cuadro 1.

Al igual que para la LAL-B, para la identificación de la LAM se consideró el uso de tres diferentes categorías de anticuerpos esenciales, junto con un cuarto grupo opcional (cuadro 2) (figura 1).

Cuadro 1Panel de anticuerpos para la inmunofenotipificación de la leucemia aguda

linfoblástica de precursor de células B.Linaje* Madurez Sub-clasificación Opcional**CD19CD79a (citoplásmico)

HLA-DRTdTCD34CD45

CD10Ig superficieCadenas µ citoplásmicas

CD20CD38

*Ambos marcadores CD19 y CD79a deben estar presentes.** La inclusión de CD20 y CD38 se consideró como informativa para la búsqueda de anormalidades genéticas comunes en la LAL-B.

Cuadro 2Panel de anticuerpos para la inmunofenotipificación de la leucemia aguda mieloide.

Linaje* Madurez Sub-clasificación OpcionalMPO (citoplásmica)CD13CD33CD117

HLA-DRCD34CD45

CD15 CD36CD64

* Los blastos deben expresar dos (si MPO+) o más (si MPO-) marcadores mieloides.


55Citometría de flujo en padecimientos hematológicos.

6)(cuadro 3). Estas observaciones, junto con la producción de nuevos anticuerpos que reconocen proteínas de fusión, o proteínas expresadas en células portadoras de una traslocación específica, le han dado mayor valor al inmunofenotipo en la clasificación y pronóstico de las leucemias.

PADECIMIENTOS LINFOPROLIFERATIVOS CRÓNICOS.

En la segunda Conferencia de Consenso Latinoamericano para la

Figura 1.- Paciente con leucemia mielomonocítica. Por expresión de CD45 se identifican dos poblaciones de blastos: la verde (mieloide) con expresión intensa de CD117, CD34, CD13, CD33 y expresión débil de CD15; la azul (monocítica) con expresión intensa de CD64/CD14, CD11b, CD13 y expresión débil de CD34.

La leucemia bifenotípica debe expresar antígenos de dos o más de los linajes mencionados. Los marcadores más específicos para cada estirpe son: CD3 para células T, CD19 y CD79b para células B y mieloperoxidasa para células mieloides.

Inmunofenotipo y alteraciones cromosómicas. En años recientes se ha demostrado la presencia, en las leucemias agudas, de correlación entre algunos de los patrones de expresión de antígenos asociados a la leucemia y traslocaciones genéticas (5,

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inmunofenotipificación de padecimientos hematológicos malignos (3), para la inmunofenotipificación de los padecimientos linfoproliferativos crónicos (PLPC) se acordó el algoritmo del cuadro 4, en el que, el primer paso permite definir el linaje, el segundo la clasificación y el tercero la confirmación de la clonalidad de las células T.

Factores pronósticos de la leucemia linfocítica crónica. La leucemia linfocítica crónica de células B (LLC-B) (figura 2) es un padecimiento heterogéneo, caracterizado por un curso clínico variable. Algunos

pacientes tienen una enfermedad agresiva requiriendo terapia temprana, mientras que otros pacientes muestran una enfermedad indolente, más estable, que no se beneficia con quimioterapia paliativa. Los sistemas de clasificaciones de Rai y col. y Binet y col. permiten predecir la supervivencia y los requerimientos de tratamiento, pero no tienen la capacidad de distinguir prospectivamente pacientes en etapa temprana que progresarán rápidamente a enfermedad agresiva, de aquellos destinados a permanecer en etapa temprana por mucho tiempo.

Cuadro 3Correlación entre características fenotípicas y alteraciones cromosómicas

Alteración cromo-sómica

Fenotipo Oncogen Frecuencia

t(1;14)(p32;q11) LAL-T. CD1-,CD2+CD4-CD7+ y CD10-

TAL1/TCR 20%

t(1;19)(q23;p13) LAL pre B. TdT+CD9+C19+CD22+HLA-DR+ CD10 débily Ag mieloides asociados,ausencia de CD20 y CD34

E2A/PBX1 25% niños3% adultos

t(8;14)(q24;q32)t(8;14)(q24;q11)t(2;8) )(p12;q24)

LAL de células B maduras.100% de todas las LAL-L3

C-MYC/IgK 5% detodas lasLAL

t(9;22)(q34;q11.2) TdT+CD10+CD34+CD38 débil, con Ag mieloides asociados

BCR/ABL 5% niños1 0 - 3 0 % adultos

t(4;11)(q2;q23) CD19+CD24 débil,CD10-CD20-Ag mieloides CD15 ó CD65w+

AF4/MLL >10% de las LAL

t(12;21)(p13;q22) CD10 intenso CD20, CD45 y CD135 débi-les. CD34 débil y heterogéneo.

TEL/AML-1 >20% de las LAL de precursor de células-B

t(15;17)(q22;q12) LAM. CD34- ó débil, HLA-DR- ó débil, CD13 + heterogéneo CD33++ y CD15- ó débil

PML/RAR 5 a 10% de todas las LAM

t(8;21)(q22;q22) LAM. CD34+CD19+HLA-DR+, CD13 y CD33 débiles. Pueden expresar el CD56

AML1/ETO 5 a 12% de todas las LAM

Inv(16)(p13;q22) ót(16:16)(p13;q22)

LAMMEo. CD33+CD13+. Los mileloablas-tos son MPO+. Los monoblastos son: CD4, CD11b, CD11c, CD14, CD36 y CD64. CD2, CD7 con menor frecuencia.

CBF/MYH1 5 a 10% de todas las LAM

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Cuadro 4Algoritmo para la inmunofenotipificación de padecimientos linfoproliferativos malignos.Primer paso Segundo paso Tercer pasoBúsqueda de linaje Confirmación/clasificaciónCD4CD8CD3*CD19CD56*Cadenas ligeras κCadenas ligeras λ

(∗) Los anticuerpos CD3 y CD56 se debenmezclar en el mismo tubo

Si se sospecha un PLPC de linaje de células T CD7

RCT αβRCTγδ

Confirmación de clona-lidad:Repertorio VβRearreglos del RCT

Si se sospecha un LLC-B/LLCP CD5

CD22CD23 FMC7

Si se sospecha un LF/LCM/LB de células B

CD10CD38Bcl-2

Si se sospecha LCP/LZM:C11c

CD103 CD25

Si se sospecha un PLPC de células NK:CD16CD57

LLC = leucemia linfocítica crónica; LLCP = linfoma linfocítico de células pequeñas; LF = linfoma folicular; LCM = linfoma de células del manto; LB = linfoma de Burkitt; LCP = leucemia de células peludas; LZM = linfoma de zona marginal.

Figura 2.- Paciente con leucemia linfocítica crónica B. El inmunofenotipo de los linfocitos (a) mostra co-expresión de CD19/CD5 (b), CD23+ y ausencia de expresión de FMC7 (c). Restricción de cadenas lambda (e) y expresión de CD38 (f) en los linfocitos CD19+ (d).

Citometría de flujo en padecimientos hematológicos.

En 1999 dos grupos de investigadores (7, 8) demostraron que los pacientes con un inmunofenotipo de células de memoria con genes de inmunoglobulinas (IgVH) mutados, tenían un desenlace mucho más favorable y una baja probabilidad de desarrollar enfermedad progresiva, mientras que aquellos con genes IgVH no mutados, tenían

mayor probabilidad de desarrollar enfermedad progresiva y de tener una supervivencia más corta. Sin embargo, el análisis de la mutación de gen IgVH se basa en la secuenciación de ADN, técnicamente difícil y no disponible para uso clínico rutinario, por lo que, la identificación de marcadores apropiados subrogados para el estado mutacional ha

Figura 3.- Citograma en escala logarítmica de la dispersión frontal (FS) y lateral (SS) de plaquetas de un paciente con síndrome de Bernard Soulier (a). El fenotipo plaquetario muestra la co-expresión intensa de CD61 y CD41a (b) y la ausencia de expresión de CD42a (c, histograma en negro) y CD42b (c, histograma en verde). Paciente con trombastenia de Glanzmann (d, e). Las plaquetas muestran ausencia total de expresión de CD61 y CD41a (d) y expresión normal de CD42a (e, histograma en negro) y CD42b (e, histograma en rosa).

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atraído la atención de muchos investigadores (9). Aún cuando hay una tendencia para que las anormalidades cariotípicas adversas se presenten principalmente en los pacientes con IgVH no mutado, la asociación no es absoluta y el estado mutacional del gen de la inmunoglobulina y el cariotipo son factores pronósticos independientes (10). En estudios con microarreglos de DNA (11) se demostró que las células con el gen IgVH no mutado se podían distinguir de aquellas con el gen mutado por la expresión diferencial de un pequeño número de genes, uno de los cuales codifica para la proteína zeta-asociada de 70 kDa (ZAP-70). La ZAP-70 es una molécula de señalización clave para linfocitos T y NK y aún cuando no se expresa en linfocitos B normales se asocia con incremento en la señalización intracelular del receptor de las Igs en las células de LLC-B. Tomando en cuenta las publicaciones recientes, el ZAP-70 es el marcador subrogado más promisorio para el estado de mutación del IgVH (12). El CD38 es una proteína membranal que marca la activación y maduración celular y tiene actividad de señalización. La expresión de CD38 en células de LLC-B se asocia con un pronóstico global de la enfermedad menos favorable y en los estudios iniciales se consideró como un marcador subrogado para los dos subgrupos importantes de la LLC-B : IgVH mutado y no mutado (8). Sin embargo, después de la publicación de un buen número de trabajos, se ha podido demostrar claramente que aún cuando la expresión de CD38 tiene cierto grado de correlación con el estado de mutación del IgVH, ambos parámetros se consideran variables pronósticas independientes en LLC-B (13, 14). La información pronóstica dada por la expresión de ZAP-70 y CD38 es complementaria. Bakke y col. (15) y Gibbs G y col. (16) demostraron que el método

citofluorográfico para identificar células ZAP-70 en LLC no está completamente estandarizado entre los diferentes laboratorios. En el trabajo de Bakke y col. (15) se analizó la expresión de ZAP-70 en células de LLC empleando 4 diferentes anticuerpos comerciales; con uno de ellos los porcentajes de expresión de ZAP-70 fueron consistentemente elevados, mientras que con los otros tres anticuerpos se obtuvo una amplia oscilación de porcentajes de expresión de ZAP-70 en las células tumorales, mostrando además una pobre correlación entre todos. En este estudio se concluyó que las estrategias analíticas previas no eran reproducibles, y se propone una relación métrica, con la cual se obtuvieron mejores correlaciones. Gibbs y col. (16) compararon la medición de la expresión de ZAP-70 en LLC empleando dos anticuerpos diferentes y dos métodos de tinción. Con el anticuerpo de Caltag y el reactivo de permeabilización de Fix and Perm se obtuvo 91% de concordancia entre la expresión de ZAP-70 y el estado de mutación del gen IgVH. Al igual que otros autores no hubo correlación entre la expresión de CD38 ni con ZAP-70 ni con el estado de IGVH. Los autores consideran que la expresión de ZAP-70 empleando la combinación anticuerpo Caltag/Fix and Perm podría ser introducida en el panel de inmunonofenotipificación de LLC-B.

IDENTIFICACIÓN DE GLICOPROTEÍNAS PLAQUETARIAS.

El estudio de pacientes con alteraciones genéticas de la función plaquetaria ha hecho posible entender la relación crítica estructura-función que determina la función normal de la plaqueta (17). La CF, empleando la dispersión de la luz y los marcadores inmunológicos, permite la identificación inequívoca de las plaquetas en sangre o en mezclas


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complejas. Mediante la CF se puede aislar electrónicamente a las plaquetas de la sangre total o del plasma rico en plaquetas, evitando la manipulación y en consecuencia la activación de las mismas. Esta metodología ha permitido identificar partículas en la sangre que son fácilmente confundidas con plaquetas, como fragmentos de eritrocitos o de leucocitos, complejos inmunes y microorganismos. La heterogeneidad en el tamaño de las plaquetas (de 1 µm a 4 ó 5 µm) excede al de cualquier otra célula hematológica, similar en tamaño a una bacteria y más grande que los complejos inmunes (18). En la preparación de plaquetas para análisis citofluorométrico es necesario adicionar EDTA al diluyente para evitar agregación de las plaquetas. Una aplicación directa de la CF en la evaluación clínica de las plaquetas es la cuantificación de las principales glicoproteínas de superficie de las mismas. El fenotipo plaquetario se ha usado para definir varios síndromes genéticos, resultantes de la expresión anormal de receptores de superficie, entre otras la trombastenia de Glanzmann y el síndrome de Bernard Soulier. La trombastenia de Glanzmann es una enfermedad autosómica recesiva, caracterizada por alteración en la agregación plaquetaria con ausencia de respuesta a los agonistas necesarios para que el fibrinógeno se una y forma microagregados. Se caracteriza por una anormalidad cualitativa y cuantitativa del complejo glicoproteíco IIb/IIIa en la membrana plaquetaria (19). Existen en el mercado diferentes anticuerpos monoclonales que se pueden usar con CF para demostrar el grado de deficiencia del complejo GP IIb/IIIa (CD41a y CD61, respectivamente) en la superficie de la plaqueta. La principal ventaja de usar la CF como prueba confirmatoria del diagnóstico es que los estudios a los miembros de la familia permiten establecer la severidad del defecto en el caso índice y

el grado de herocigocidad en los familiares. Además con la CF se puede determinar en los heterocigotos si la expresión de GPIIb/IIIa se encuentra uniformemente distribuida en todas las plaquetas, o si tienen una subpoblación de plaquetas con ausencia completa de la glicoproteína. En el síndrome de Bernard Soulier la anormalidad morfológica más consistente es la presencia de plaquetas gigantes (>10 um), aparentemente como resultado de activación in vitro de las mismas. En agregometría el único hallazgo anormal es la respuesta de las plaquetas Bernard-Soulier a trombina o a ristocetina más factor WV. En este síndrome la CF en sangre total permite el análisis de plaquetas sin necesidad de realizar el procedimiento técnicamente difícil de separar físicamente las plaquetas gigantes, de eritrocitos y de leucocitos de tamaño similar. La anormalidad bioquímica de las plaquetas en esta trombastenia, es la ausencia del complejo glicoproteico1b/IX/V en la membrana de la plaqueta y del megacariocito (20). La GPIX (CD42a) y la GP1bα,β (CD42b) son miembros de la familia de glicoproteínas ricas en leucina necesaria para la interacción del factor de Von Willebrand y la membrana plaquetaria esencial para una adhesión normal.

Detección de inmunoglobulinas asociadas a plaquetas. Varios investigadores empleando la CF han encontrado que las plaquetas de la mayoría de los pacientes con púrpura trombocitopénica inmunológica (PTI) tienen cantidades elevadas de inmunoglobulinas en la superficie de las plaquetas (21, 22). Sin embargo, en otros estudios empleando la misma metodología, se ha demostrado que otras formas de trombocitopenia también pueden tener concentraciones elevados de inmunoglobulinas en las plaquetas (23). En un estudio que incluyó, además de controles

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normales pacientes con trombocitopenias no inmunológicas encontramos una sensibilidad de 90.3% con especificidad de 39.3%, en el diagnóstico de PTI, concluyéndose que la detección, por CF, de inmunoglobulinas asociadas a plaquetas, constituye un ensayo sensible pero no específico, haciéndolo innecesario e inapropiado para establecer el diagnóstico de PTI (24).

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Citometría de flujo en el diagnóstico y clasificación de padecimientos hematológicos: hemoglobinuria paroxística

nocturna.

Dr. Xavier López-Karpovitch.

Departamento de Hematología y Oncología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México, D.F., México.

con síndrome mielodisplásico. Un estudio realizado en México en 164 enfermos con HPN mostró que 44 % de ellos presentaron aplasia, 29 % hemolisis, 25 % mielodisplasia y 2 % trombosis (3). Cincuenta años después de la primera descripción de la enfermedad, Ham y Dingle (4) demostraron que los eritrocitos HPN se destruían por presentar mayor sensibilidad al complemento al acidificar el suero y posteriormente otros autores encontraron que también los granulocitos y las plaquetas mostraban el mismo fenómeno (5-7). En 1983 se demostró la deficiencia del factor acelerador del decaimiento (del inglés decay acceleration factor [DAF] o CD55), proteína anclada a la superficie celular mediante GPI que inhibe la formación de convertasas de C3, en la membrana de los eritrocitos de pacientes con HPN (8). Este hallazgo culminó en la demostración de que todas las proteínas ancladas a GPI se encuentran disminuidas o ausentes en HPN y que el anclaje anómalo de las mismas se debe a una alteración bioquímica en la transferencia de N-acetilglucosamina a fosfatidilinositol

Solicitud de reimpresos: Dr. Xavier López-Karpovitch. Departamento de Hematología y Oncología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición SZ. Vasco de Quiroga 15, Colonia Sección XVI, Delegación Tlalpan 14000, México, D.F., México. Tel.: 54 870 900 Ext. 2704

INTRODUCCIÓN. Dentro de la gran variedad de métodos de citometría de flujo empleados en la clínica existen pocos capaces de identificar enfermedades específicas. La detección de moléculas ancladas a glucofosfatidilinositol (GPI) en la superficie celular mediante anticuerpos monoclonales (AcMo) y citometría de flujo son la base de una prueba específica para el diagnostico de hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) (1).CARACTERÍSTICAS DE LA HPN. La HPN es un padecimiento clonal del tejido hemopoyético, adquirido y de etiología desconocida. El amplio espectro clínico y curso variable de la enfermedad son un reto para el clínico en términos de diagnóstico y manejo. La presentación clínica clásica del padecimiento es la anemia hemolítica, intravascular, lo que llevó a Strübing (2) a denominarlo como HPN por acompañarse de hemoglobinuria durante la noche. Además de la hemolisis, al diagnóstico esta entidad patológica puede presentarse como aplasia medular, trombosis e inclusive confundirse

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(figura 1), es decir en la formación de GPI (9-12). Finalmente, Miyata (13) en 1993 y otros investigadores en años posteriores demostraron que la alteración bioquímica en HPN es secundaria a mutaciones del gen Pig-A (del inglés phosphatidylinositol glycan complementation class A) ubicado en el brazo corto del cromosoma X. Una característica biológica importante de la HPN es su mosaicismo fenotípico, concepto establecido por Rosse y Dacie (14,15) en eritrocitos, que consiste en que las células HPN expresan grados variables de deficiencia de moléculas ancladas a GPI. Así, se han identificado células HPN tipo I (expresión normal de GPI), tipo II (parcialmente deficientes) y tipo III (moléculas GPI ausentes) fenotipos que correlacionan con el genotipo Pig-A, v. gr., activado, parcialmente inactivado y completamente inactivado, respectivamente (figura 2).LA CITOMETRÍA EN LA HPN. En 1985, dos grupos de investigación

independientes emplearon citometría de flujo y el AcMo CD55 para estudiar pacientes con HPN (16, 17). En ambos estudios se identificaron eritrocitos, granulocitos, monocitos, linfocitos y plaquetas deficientes en CD55 confirmando la hipótesis de Dacie (7) de que la HPN es un padecimiento clonal que afecta a la célula tronco hemopoyética. Más aún, también se ha reconocido la deficiencia de CD55 en células progenitoras de médula ósea de enfermos con HPN (18). La identificación de otras moléculas (antígenos, enzimas y receptores) ancladas a GPI (cuadro 1) ha permitido avanzar en el conocimiento de la enfermedad facilitando su diagnóstico en particular con el uso de AcMo y citometría de flujo. Para un adecuado análisis citofluoro-métrico de las proteínas ancladas a GPI en células hemopoyéticas es necesario: a) cono-cer la distribución de los antígenos celulares identificados por AcMo (CD del inglés cluster designation) y su expresión de acuerdo al

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Figura 1.- Mecanismos involucrados en la formación deficiente de GPI en HPN.


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Cuadro 1Expresión de moléculas ancladas a GPI en

células hemopoyéticas.Antígeno Distribución celularCD14 Monocitos y granulocitosCD16 Neutrófilos, células NK y subpoblación de linfocitos TCD24 Células B y granulocitosCD48 Linfocitos y monocitosCD52 (Campath) Linfocitos y monolitosCD55 (DAF) Todas las células hemopoyéticasCD58 (LFA-3) Todas las células hemopoyéticasCD59 (MIRL) Todas las células hemopoyéticasCD66b GranulocitosCD66c GranulocitosCD66e GranulocitosCD73 Subpoblaciones de células T y BCD87 Células T, NK, neutrófilos y monolitosCD90 Subpoblaciones células tronco hemopoyéticas y TCD108 Eritrocitos y linfocitosCD109 Células T activadas, plaquetas, megacariocitos, subpoblaciones de células tronco hemopoyéticasCD157 Células estromales de médula ósea, monocitos y granulocitos

estadio de diferenciación de las células hemo-poyéticas, b) emplear AcMo conjugados con fluorocromos (fluorescencia directa) y c) estar familiarizado con las estrategias electrónicas de “ventaneo” (del inglés gatting), así como con los términos de dispersión lumínica frontal (FSC del inglés forward scatter que discrimina tamaño celular) y lateral (SSC del inglés side scatter que discrimina características intrace-lulares). La figura 3 ilustra un caso de HPN en el que se analizó la expresión del antígeno CD55 en linfocitos, monocitos y granulocitos, así como la expresión de CD59 en eritrocitos. Tanto en eritrocitos como en linfocitos y monocitos se identificaron poblaciones tipos I, II y III, mientras que en granulocitos se identificaron poblaciones tipos I y II. Aún cuando en la actualidad no se cuenta con lineamientos consensuados para establecer el diagnóstico definitivo de HPN mediante citometría de flujo, por ello, Hall y Rosse (19) recomiendan identificar la deficiencia de dos moléculas ancladas a GPI en por lo menos dos poblaciones celulares. Esta recomendación se da debido a la existencia

Citometría de flujo en el diagnóstico de la HPN.

Figura 2.- Representación esquemática del mosaicismo en HPN.

66


de dos padecimientos infrecuentes caracterizados por la deficiencia heredada de los antígenos CD55 y CD59 (20, 21). A continuación, y de manera breve, algunas recomendaciones para el estudio de moléculas ancladas a GPI en HPN (1):• El mejor espécimen para estudiar el

inmunofenotipo HPN es la sangre.• Efectuar el análisis en eritrocitos y

granulocitos.• Tener presente que después del episodio

hemolítico la frecuencia de eritrocitos deficientes en GPI puede encontrarse por debajo del límite de detección del ensayo.

• En pacientes pancitopénicos el número de granulocitos puede ser insuficiente para el análisis.

Figura 3.- Identificación de poblaciones celulares tipos I, II y III, mediante citometría de flujo, en un paciente con HPN. Citograma de eritrocitos mediante SSC y FSC (a). Eritrocitos HPN tipos I, II y III identificados mediante la expresión de CD59 (b). Citograma de linfocitos (morado), monocitos (verde) y granulocitos (azul) mediante SSC y FSC (c). Linfocitos HPN tipos I, II y III identificados mediante la expresión de CD55 (d). Monocitos HPN tipos I, II y III identificados mediante la expresión de CD55 (e). Granulocitos HPN tipos I y II identificados mediante la expresión de CD55 (f).

X López-Karpovitch


67

En resumen, el análisis de proteínas ancladas a GPI mediante citometría de flujo es una técnica específica y sensible para el diagnóstico de HPN. Además, con esta metodología es posible estimar el tamaño de la clona HPN (22).

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68


X López-Karpovitch


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INTRODUCCIÓN En medicina el término quimera se emplea para designar a aquel individuo cuyo cuerpo contiene poblaciones celulares que provienen de diferentes individuos de la misma o de diferente especie, ya sea espontánea o artificialmente (1). La coexistencia de células de dos diferentes organismos en el cuerpo es llamado quimerismo. El trasplante de médula ósea (TMO) es una modalidad de tratamiento cuyo objetivo es proporcionar las condiciones para la reconstitución de la médula ósea dañada. En el TMO alogénico el donante pertenece a la misma especie que el receptor, presenta la mayor compatibilidad y generalmente es un familiar de primer grado (2-6). Se pueden presentar diferentes grados de quimerismo en el TMO. Cuando el paciente no presenta ninguna evidencia de células del receptor después de un tiempo del trasplante se considera quimerismo completo; mientras que si el paciente presenta evidencia de células tanto del receptor como células del donador se considera como quimerismo mixto (cuadro 1)(8). Con el surgimiento de procedimientos de trasplante cada vez más avanzados se

Quimerismo por microsatélites.

Olga Verónica Barrales-Benitez, Samuel Canizales-Quinteros.

Departamento de Hematología y Oncología. Departamento de Medicina Genómica y Biología Molecular, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán,

México, D.F., México.

Solicitud de reimpresos: Olga V. Barrales-Benitez. Departamento de Hematología y Oncología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición SZ. Vasco de Quiroga 15, Colonia Sección XVI, Delegación Tlalpan, C.P. 14000, México, D.F., México. Tel.: 54 870 900 Ext. 2704

ha hecho necesario establecer el grado de quimerismo en los pacientes después del trasplante con el objeto de: a) verificar el éxito del trasplante, b) prevenir recaída de la enfermedad, c) iniciar inmunoterapia (linfocitos del donador) para evitar rechazo, d) observar el origen de las recaídas debidas y e) intentar nuevos esquemas de acondicionamiento (2, 5-7, 9, 10).

METODOLOGÍA. El fundamento en el que se basa la detección del grado de quimerismo es el empleo de diferentes marcadores genéticos polimórficos entre donador y receptor. La elección del marcador y de la técnica a emplear depende de la sensibilidad y especificidad, de si hay diferencia de género entre donador y receptor, y del tipo de enfermedad del paciente pre-trasplante. Las diferentes técnicas de rutina empleadas para detectar grado de quimerismo se muestran en el cuadro 2. A pesar de las diferencias en los protocolos de estas metodologías, todas se basan en que el receptor y el donador son estudiados antes del trasplante en la búsqueda de marcadores genéticos diferentes, los cuales se consideran marcadores “informativos” (figura1). Un

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OV Barrales-Benitez, S Canizales-Quinteros

marcador genético se considera “informativo” cuando: a) se encuentra ampliamente distribuido en diferentes cromosomas; b) presenta gran variabilidad o polimorfismo, lo que permite demostrar múltiples alelos y por lo tanto heterocigocidad. A continuación estos marcadores son analizados en el paciente post TMO alogénico para medir y cuantificar

la cantidad de células del receptor y del donador, y establecer el grado de quimerismo (8). Uno de los métodos más empleado por diversos investigadores se basa en la amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de un sistema STR/VNTR altamente polimórfico que se considera muy

Cuadro 1Diferentes grados de quimerismo.

Grado de quimerismo Definición

Quimerismo completo Se detecta 100% células de donador, completa sustitución hematopoyética.

Quimerismo mixto Se detectan células del receptor, en particular parecen linfo-citos.

Quimerismo dividido Uno o más linajes pueden ser del receptor o del donador (células mieloides 100% receptor, células linfoides 100% donador)

Microquimerismo Se detectan menos del 1% de células del receptor, se observa generalmente en trasplantes de órganos sólidos.

Cuadro 2Métodos para la detección de quimerismo.

TECNICA VENTAJAS DESVENTAJAS INFORMATIVIDAD

Fenotipificacióneritrocitaria

Simple y efectivo en caso de Leucemia Mieloide Crónica.

Transfusiones sanguíneas pue-den interferir. Detecta un solo tipo celular.

Baja

Citogenética Efectivo para células cromosoma Filadelfia positivo.

Menos sensible, evalúa solo células en división; altos falsos positivos.

Baja

FISH Estudia gran número celu-lar; bajos falsos positivos, muy sensible.

Restringido a donador de sexo di-ferente a receptor; requiere gran cantidad de muestra.

Alta

RFLP Evalúa células nucleadas; requiere poca cantidad de muestra.

Baja sensibilidad. Da resultador erróneos por múltiples sitios de restricción.

Alta

STR/VNTR No depende del sexo del donador ni de compatibili-dad de HLA.

Baja sensibilidad (0.4-5 %)por competición por el cebador.

Muy alta

Marcadores para cromosoma Y

Muy sensible Requiere donador de sexo femeni-no, no sirve si son del mismo sexo donador y receptor

Alta

Marcadores para Cromosoma X

Muy sensible Requiere donador de sexo mas-culino, no sirve si son del mismo sexo donador y receptor

Alta


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informativo y sensible (11). Los STR (del inglés short tandem repetition, repetidos cortos consecutivos) y los VNTR (del inglés variable number tandem repetition, número variable de repetidos consecutivos) son secuencias repetidas agrupadas de DNA que constituyen aproximadamente de un 10 a un 15% del genoma y consisten en formaciones de varias repeticiones cortas que se organizan consecutivamente (en tandem). Las familias de DNA satélite varían de acuerdo con su localización en el genoma, la extensión total de la formación consecutiva y la longitud de las unidades repetidas que constituyen la formación (12). Cuando la secuencia de repeticiones consecutivas tiene una longitud de 2 a 8 nucleótidos se denomina STR o microsatélite (figura 2); y si tiene de 15 a 50 nucleótidos se llama VNTR o minisatélite (13,14). Estas secuencias polimórficas son heredadas de manera mendeliana codominante. Existen tres características importantes de estas secuencias STR o VNTR que las hacen muy útiles para los estudios de ligamiento genético. Primero, un microsatélite con

frecuencia tiene varios alelos (extensiones de nucleótidos repetidas) presentes en la población, haciendo que la probabilidad de que un individuo sea heterocigoto sea mayor del 70% (figura 3). Los marcadores más informativos tienen hasta varias docenas de alelos o más y, por lo tanto, resulta poco probable que dos individuos no emparentados compartan los mismos alelos Segundo, a diferencia del análisis con RFLP (del ingles restriction fragment lenght polimorfism polimorfismo en la longitud del fragmento de restricción) o con VNTR, la genotipificación con microsatélites no requiere el uso de tediosas técnicas como Southern blot. Con la técnica de PCR se usan cebadores complementarios a secuencias específicas de DNA que flanquean los microsatélites y generan productos de amplificación que difieren en longitud, dependiendo de cuantos repetidos estén presentes (figura 3). Tercero, miles de microsatélites han sido totalmente identificados en el genoma humano, de manera que muy pocas regiones del genoma no pueden ser mapeadas usando estos marcadores (12) Por otra parte, el uso de amplificación del DNA permite determinar el grado de quimerismo con muy poca cantidad de muestra, una gran ventaja cuando el paciente esta rechazando el injerto y presenta severa leucopenia. Dependiendo de la longitud del

Figura 1.- Análisis de quimerismo para marcadores genéticos. A y C son marcadores informativos R = receptor; D = donador.

Figura 2.- Análisis de quimerismo por marcadores microsatélites. Repetidos consecutivos STR que muestran la diferencia en número de repetidos en dos cromosomas. F = cebador delantero, R = cebador inverso.


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fragmento y de la eficiencia de la amplificación, la sensibilidad del método para detectar grado de quimerismo es de 1% a 5 % (15).

EXPERIENCIA EN EL INSTITUTO. En el Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición SZ se emplea un panel de ocho marcadores que se consideran “informativos” por haber sido previamente identificados en un grupo de familias mexicanas (16). Estos marcadores se encuentran ubicados en cromosomas

Cuadro 3Marcadores microsatélites fluorescentes.

Locus Cromosoma Fluorocromo Tamaño

D1s534 1 FAM 196-212

D1s1661 1 FAM 89-101

D2s1360 2 FAM 126-181

D3s1764 3 TET 225-253

D3s4545 3 FAM 192-240

D5s1470 5 TET 163-207

D9s1121 9 HEX 184-212

D12s2078 12 FAM 250-282

Figura 3.- Demostración por microsatélites de los diferentes alelos que presenta un individuo debido al diferente número de repetidos consecutivos . Esto se observa gráficamente en un gel de electroforesis (lado izquierdo).

diferentes y están unidos a diversos fluoróforos (cuadro 3), lo que permite que se pueda amplificar en un mismo tubo de reacción dos o tres marcadores para, posteriormente analizar en un secuenciador automatizado (ABI-PRISM 373). De esta manera se puede mostrar, en un gel de electroforesis, los diferentes alelos que permitan determinar cuales son los marcadores informativos para cada paciente antes del trasplante (figura 4). Los pacientes son estudiados nuevamente a tiempos variables post-trasplante para



73

determinar el grado de quimerismo y de esta forma prevenir un rechazo o recaída de la enfermedad (figura 5). A la fecha se han estudiado 27 pacientes en los que la frecuencia de los 8 marcadores “informativos” fue como sigue: D2s1360 en el 63% de los pacientes; el D3s1764 en 59%; el D5s1470 en 52%; el D9s1121 y el D3s4545 en 48% cada uno de ellos; el D12s2078 en 44%; el D1s1661 en 15% y el D1s534 en 7%.

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Figura 4.- Panel de 8 marcadores microsatélites de un paciente y su donador previo al TMO donde: D2s1360, D3S4545 y D12s2078 resultaron marcadores “informativos”. D = donador, R = receptor.

Figura 5.- Estimación del grado de quimerismo en un paciente post trasplante mediante microsatélites. Los marcadores D2s1360, D3s4545 y D12s2078 son “informativos” para este paciente. D = donador, R(pre) = receptor pre- trasplante, R(post) = receptor post-trasplante.


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Talasemias: aspectos bioquímicos,moleculares y diagnósticos.

Beatriz Ibarra, Francisco José Perea.

División de Genética, Centro de Investigación Biomédica de Occidente, CMNO, Instituto Mexicano del Seguro Social, Guadalajara, Jalisco, México.

INTRODUCCIÓN. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que cerca del 7% de la población mundial son portadores de alguna hemoglobinopatía, y que al año nacen aproximadamente 370,000 niños homocigotos heterocigotos compuestos para anemia drepanocítica o para algún tipo de talasemia severa (1). Las talasemias son un grupo heterogéneo de anemias hemolíticas hereditarias que se caracterizan por la ausencia o disminución en la síntesis de una o más cadenas globínicas, que conducen a un desequilibrio en la relación de cadenas α/no-α. Las más comunes y clínicamente importantes son las talasemias α y β.

TALASEMIA ALFA. El término talasemia α (Tal-α) define los desórdenes hereditarios que afectan la síntesis de cadenas α globina. Debido a que las cadenas α están presentes tanto en hemoglobinas fetales y adultas, la deficiencia de su producción afectará la síntesis de la mayoría de las hemoglobinas. En la vida fetal la ausencia o reducción en la síntesis de

cadenas α resulta en un exceso de cadenas γ, la cual forma tetrámeros γ4 o hemoglobina Bart. En la vida adulta, el exceso de cadenas β, forma tetrámeros β4 o hemoglobina H (2). La familia de genes globínicos α se localiza en una extensión aproximada de 35 kilobases (Kb), región en la que se encuentran además aproximadamente 50 genes (factores de transcripción, dedos de zinc, enzimas, proteínas estructurales, etc.) y la conforman 4 genes, 3 de ellos funcionales: ζ que se expresa sólo en el período embrionario, los α2 y α1, que se sintetizan desde la etapa fetal. El gen θ se localiza en el extremo 3’ del gen α1, su expresión a nivel de ARNm se ha demostrado en saco vitelino, hígado fetal y células eritroides adultas, pero no hay evidencias de la formación de una proteína estable. En este bloque se encuentran también cuatro pseudogenes (ψζ, ψα2, ψα1 y ρ), 5 regiones hipervariables (secuencias de ADN altamente repetitivas) y 12 regiones Alu (secuencias medianamente repetitivas) (figura 1).

TALASEMIA BETA. La Talasemia β (Tal-β) muestra una

Solicitud de reimpresos: Beatriz Ibarra. División de Genética, Centro de Investigación Biomédica de Occidente, CMNO, Instituto Mexicano del Seguro Social. Sierra Mojada No. 800, Col. Independencia, C.P. 44340, Guadalajara, Jalisco, México. Tel.: 01 33 36 18 94 10

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B Ibarra, FJ Perea

considerable heterogeneidad clínica y fenotípica revelada por los parámetros hematológicos y bioquímicos. Sí hay ausencia total de globina-β se llaman alelos β° y si sólo hay reducción de globina-β se denominan alelos β+. Con base en el estado clínico de los pacientes se clasifican en: a) Tal-β mayor o anemia de Cooley, b) Tal-β intermedia, y c) Tal-β menor (2-5). BASES MOLECULARES DE TALASEMIA β. Los genes globínicos no α o semejantes a β, se localizan en 11p15.5 tienen una extensión aproximada de 65 kilobases (Kb) y consta de 5 genes funcionales: ε, γG, γA, δ y β y de un pseudogen llamado ψβ (3). En todo el bloque se encuentran dos secuencias medianamente repetidas de la familia Kpn y ocho de la familia Alu (2, 5) (figura 2). Éstos genes globínicos tienen una estructura interna similar con una longitud

aproximada de 1.6 Kb (figura 2) y están constituidos del extremo 5’ a 3’ como se muestra en el esquema de la Figura 1 (3, 6). Hasta Agosto de 2005, se han descrito 238 alelos que causan Tal-β, la mayoría de ellos tienen debidos a una mutación puntual, como cambios de una base por otra, deleción o inserción de una o varias bases. Una lista completa de las mutaciones que originan talasemia beta puede ser consultada en las páginas de acceso libre en Internet como Globin Gene Server (http://globin.cse.psu.edu), en la Base de Datos inglesa Human Gene Mutation Database (http://www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html), y en la pagina del Online Mendelian Inheritance in the Man (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=141900), que regularmente las están actualizando. Los estudios poblacionales han mostrado que aproximadamente 25 mutaciones representan la mayor parte de los alelos

Figura 1.- Esquema de la familia de genes globínicos α.

Figura 2.- Esquema de la familia de genes globínicos β y organización interna del gen.


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implicados en todas la poblaciones con alta frecuencia de Tal-β (7, 8), de manera que con base en su frecuencia se pueden agrupar en: a) alelos frecuentes o comunes, si se encuentran en frecuencias mayores a 10.0%; b) alelos poco frecuentes, con frecuencias entre 5.0% a 10.0% y c) alelos raros con frecuencia menor a 5.0% (cuadro 1).

TALASEMIA β EN MÉXICO. La Tal-β es la hemoglobinopatía más común en nuestro país, ya que se ha encontrado en cerca del 70 % de los pacientes con desórdenes de la hemoglobina estudiados en el Centro de Investigación Biomédica de Occidente y en los Laboratorios Clínicos de Puebla, respectivamente, tanto en estado homocigoto (βTal/βTal) como heterocigoto simple (βTal/β) o compuesto (βTal/βS, βTal/βD) (9, 10) . En nuestro Centro de Investigación hemos analizado la patología molecular de 80 cromosomas, entre los cuales hemos identificado 17 alelos distintos (β0 y β+), incluyendo una nueva mutación, deleción

Cuadro 1Ejemplos de Alelos observados en diferentes regiones geográficas del mundo (7).Frecuencia Mutaciones País o Región

Frecuentes

Sin sentido codón 39 C→TIVS1:1 G→ AIVS1: 6 T→ C

IVS1:110 G→A

África del Norte, Europa Occidental, Balca-nes, Mediterráneo, y Medio Oriente

IVS2:745 C→GIVS 2: 1 G→ A

Italia, Grecia, Turquía, Francia, España, Macedonia, Bulgaria

IVS1: 1 G→ TIVS1:5 G→C

DML codón 41/42 –CTTTDeleción de 619 pb

Oriente Medio, Asia y Sureste Asiático, Malasia

Poco frecuen-tes

-28 A→C Angola, Turquía, Kurdistan, México -87 C→G Italia, Grecia, Turquía, Francia, Yugoslavia

BulgariaSin sentido codón 17 A→T China y Tailandia

IVS1:5 G→A Italia, Turquía, Grecia, España

Raros(δβ)) - Talasemia tipo español

DML codón 11 –TEspaña, México

(δβ)) - Talasemia tipo sicilia Islas de Sicilia y Cerdeña

de una citosina en el codón 77 ó 78. Seis mutaciones constituyen el 78.4 % de los alelos observados. La mayoría de ellos son considerados de origen Mediterráneo (10 alelos), 3 de origen Asiático, 3 alelos privados, uno de ellos particularmente de origen Curdo, y el alelo restante, a la fecha, sólo se ha encontrado en nuestra población (11, 12) (cuadro 2).

El espectro de mutaciones observado en nuestra población, es característico de las poblaciones con baja frecuencia de talasemias. Sin embargo, hace patente la necesidad de considerar la presencia de talasemia al realizar el diagnóstico diferencial de anemia microcítica hipocrómica.

DIAGNÓSTICO DE TALASEMIA EN EL LABORATORIO. El diagnóstico de la talasemia se fundamenta en tres evaluaciones: hematológica, bioquímica y molecular. a) Hematológica. Citometría hemática. El análisis de

Talasemias.

78


los índices eritrocitarios obtenidos en equipo automatizado es fundamental, ya que permite sospechar la presencia de talasemia, en particular de Tal-β. Los valores para considerar el rasgo de Tal-β menores Volumen Corpuscular Medio (VCM) <78 fL y Hemoglobina Corpuscular Media (HCM) <27 pg (13, 14). Frotis sanguíneo. La elaboración de un frotis sanguíneo teñido con Wright-Giemsa ayuda a establecer la presencia de normoblastos, dianocitos, drepanocitos, o punteado basófilo. Para descartar la presencia de un componente hemolítico se recomienda realizar la cuenta de reticulocitos (13, 14).

Cuadro 2Distribución alélica observada en pacientes mexicanos con talasemia beta.

Total % Tipo de alelo1. Alelos Transcripcionales

-87 C→T 2 2.4 β+

-28 A→C 5 6.0 β+

2. Procesamiento ARN IVS1:1 G→A 12 14.5 β°IVS1:5 G→A 5 6.0 β+

IVS1:5 G→C 2 2.4 β+

IVS1:110 G→A 12 14.5 β+

IVS2:1 G→A 1 1.2 β°IVS2:745 C→G 1 1.2 β+

3. Alelos en la Traducción 3.1 Inicio codón

ATG→GTG (MET→VAL) 3 3.6 β°3.2 Sin sentidoCodon 39 C→T 26 31.4 β°Codon 17 A→T 1 1.2 β°

3.3 Desviación Marco de LecturaCodon 6 –A 2 2.4 β°Codon 11 –T 3 3.6 β°

Codon 77/78 –C 1 1.2 β°Codones 41/42 -TTCT 1 1.2 β°4. Alelos por Deleción

(δβ)0-talasemia tipo Español 5 6.0 β°5. Alelos por Fusión

Hb Lepore Washington Boston 1 1.2 β+

Total de genes analizados 83 100.0

Cuando se sospecha de talasemia alfa se puede realizar una incubación de 2 horas a 37 °C, con colorante para reticulocitos una alícuota enriquecida de eritrocitos jóvenes, para observar los cuerpos de inclusión generados por la precipitación de la HbH (15).b) Evaluación Bioquímica. Electroforesis de Hemoglobina. Por muchos años ha sido considerada la prueba ha realizar para la detección e identificación de variantes estructurales y de Tal-β. Este ensayo está basado en las propiedades electroforéticas y cromatográficas de las variantes en estructura. Convencionalmente la electroforesis se

B Ibarra, FJ Perea


79

realiza en acetato de celulosa a pH alcalino (8.6), si se observa algún cambio en la movilidad de las Hbs se realizan estudios confirmatorios a pH ácido (6.2). Con este esquema de trabajo es posible identificar las variantes estructurales más comunes como por ejemplo, HbS, HbC, Hb E, Hb Bart y HbH entre otras. En ocasiones es necesario realizar otras técnicas electroforéticas para identificar y caracterizar variantes estructurales. La alternativa más utilizada es la electroforesis de globinas en condiciones desnaturalizantes, para establecer cual es la globina variante y su comportamiento a pH alcalino y ácido. El isoelectroenfoque es una alternativa reciente con un gran poder resolutivo, pero por su alto costo no se implementa en laboratorios con pocos recursos. Cuantificación de las Hbs F y A2. La HbF se evalúa por métodos que se consideran de alta resistencia a desnaturalización alcalina. Esta Hb se encuentra elevada en diferentes formas de persistencia hereditaria de HbF, así como de Tal-β mayor, Tal-β intermedia y Tal-δβ. La evaluación de HbA2 se realiza por microcromatografía de intercambio aniónico y es fundamental para establecer el diagnóstico de Tal-β. Los métodos automatizados basados en cromatografía líquida de alta resolución permiten cuantificar los diferentes componentes de Hbs con el consiguiente ahorro de tiempo y esfuerzo, sin embargo, resultan demasiado onerosos para utilizarlos de forma convencional para el diagnóstico de hemoglobinopatía. Otros estudios. Para confirmar la presencia de una Hb inestable se realizan pruebas de estabilidad a calor, isopropanol y butanol. Como existen algunas variantes que co-migran con la HbS, además de inducción de cuerpos de Heinz es importante realizar

las pruebas de inducción a drepanocitos con metabisulfito de sodio y de solubilidad, que son positivas en presencia de HbS.c) Evaluación Molecular. La identificación de alelos frecuentes y raros en una población es esencial para la implementación de las estrategias metodológicas apropiadas para realizar la identificación de las mutaciones de manera oportuna. La técnica de Southern blot, que fue utilizada para la identificación de HbS y de algunos alelos de Tal-β, fue entrando en desuso con el advenimiento de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Sin embargo todavía en la actualidad se utiliza para detectar los alelos que conducen a Tal-α-1, debidos a deleción de grandes segmentos de ADN (13, 14). Amplificación de los genes globínicos por PCR. La PCR es fundamental para realizar la detección de mutaciones puntuales en los genes globínicos. El conocimiento de las mutaciones presentes en la población permite establecer una estrategia para el diagnóstico temprano de las hemoglobinopatías. Se emplean una gran variedad de técnicas, basadas en la amplificación con PCR, para la identificación de mutaciones, entre las que se incluyen análisis por hibridación en manchas o dot-blot, análisis reverso de hibridación por mancha (dt-blot reverso), amplificación con iniciadores alelo específico, análisis con enzimas de restricción y Gap-PCR. Cada método tiene sus ventajas y desventajas, y cada laboratorio elige los procedimientos que más convengan a sus capacidades técnicas. Búsqueda de mutaciones comunes en México. La técnica de amplificación con iniciadores alelo específico es ampliamente empleada para identificar mutaciones conocidas de Tal-β y Tal-α. Con esta técnica es posible buscar hasta 3 alelos diferentes en

Talasemias.

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un tubo de reacción. La técnica se fundamenta en la utilización de un iniciador común y un iniciador que presenta la mutación buscada en el extremo 3’, de tal forma que si la mutación está presente es reconocida y se logra un fragmento amplificado. Pero si no está presente la mutación buscada, no amplifica. Esta técnica permite un procedimiento rápido, sencillo y económico para la identificación de mutaciones. El análisis de restricción es un procedimiento que se emplea cada vez menos en nuestro laboratorio para la búsqueda de mutaciones en el gen globínico beta, ya que siete de las mutaciones descritas son identificadas por enzimas de restricción. Estos dos procedimientos nos permiten identificar cerca del 80% de las mutaciones que conducen a talasemia beta en los pacientes mexicanos. El 20% restante entra a la búsqueda de mutaciones desconocidas. Búsqueda de deleciones conocidas. Actualmente se emplea la variación denominada Gap-PCR que consiste en utilizar iniciadores que hibridan en las zonas cercanas a los sitios de ruptura y unión de las deleciones. Con esta técnica se detectan cerca de 8 deleciones comunes de talasemia alfa, aproximadamente 5 deleciones de talasemia beta, 4 deleciones de tal-δβ y 5 deleciones de Persistencia Hereditaria de Hemoglobina fetal (13, 14). Búsqueda de mutaciones desconocidas. Para la identificación y caracterización de mutaciones desconocidas en los genes globínicos se han descrito varios procedimientos entre los que se encuentra polimorfismo conformacional de cadena sencilla, análisis de Heteroduplex, electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante. Los fragmentos que muestran alguna anomalía en las técnicas antes mencionadas son después dirigidas a secuenciación de nucleótidos. En nuestro

laboratorio empleamos directamente la secuenciación de nucleótidos para detección y caracterización de mutaciones puntuales desconocidas. Finalmente, el estudio de las talasemias en México de una forma integral (hematológica, clínica, y molecular), permitirá definir con mayor certeza la evolución clínica del paciente, así como las bases moleculares de la fisiopatología. Estamos convencidos de que esta enfermedad hereditaria en nuestro país es mucho más compleja de lo que parece, por lo que se requiere realizar más investigación en este campo.

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B Ibarra, FJ Perea


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Talasemias.


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Diagnóstico en el laboratorio delanticoagulante lúpico.

Virginia Domínguez-Martínez, Rosario Villa-Márquez, Darinel Hernández-Hernández.

Laboratorio de Coagulación. Departamento de Hematología-Oncología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México, D.F., México.

se emplean fosfolípidos con una conformación específica (v. gr.: fosfolípidos en fase hexagonal). Ambos procedimientos acortan el tiempo de coagulación en los plasmas que contienen AL (1). De acuerdo a este principio, el diagnóstico de laboratorio del AL debe seguir 4 pasos: 1) Presencia de los tiempos de coagulación dependiente de fosfolípidos alargados (escrutinio). 2) Presencia de un inhibidor demostrado con el procedimiento de mezcla de plasma problema con plasma normal sin corrección del tiempo de coagulación. 3) Confirmación de la naturaleza antifosfolípidica del inhibidor por corrección del defecto de la coagulación, mediante el uso de un procedimiento de neutralización del inhibidor (incremento de la cantidad de fosfolípidos). 4) Ausencia de inhibición específica sobre un factor de la coagulación. Los primeros 2 pasos son necesarios para probar la presencia de un inhibidor y los otros

INTRODUCCIÓN. El anticoagulante lúpico (AL) está compuesto de anticuerpos heterogéneos dirigidos en contra de los fosfolípidos con carga negativa. Esta reacción es dependiente de la presencia de ciertas proteínas plasmáticas como la β2-glicoproteína 1 (β2-GP1), protrombina, proteína S y anexina V. Desde los años 60 existe evidencia que indica que la presencia de AL se asocia con incremento en el riesgo de tromboembolismo arterial/venoso, en pacientes con o sin enfermedades autoinmunes. Además, se ha asociado a perdida fetal en mujeres “sanas”. Los procedimientos para detectar el AL se basan en la prolongación de los tiempos de coagulación de las pruebas dependientes de fosfolípidos, y se sospecha la presencia de éste cuando al agregar una cantidad igual de plasma normal al plasma problema, esta prolongación no revierte. Para la confirmación de la presencia del AL se realizan pruebas en las cuales se incrementa la concentración de fosfolípidos, o

Solicitud de reimpresos: Virginia Domínguez-Martínez. Departamento de Hematología y Oncología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición SZ. Vasco de Quiroga 15, Colonia Sección XVI, Delegación Tlalpan, C.P. 14000, México, D.F., México. Tel.: 54 870 900 Ext. 2704

www.imbiomed.com.mx

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para diferenciar un AL de otro inhibidor de la coagulación (figura 1)(2, 3). A pesar de estos criterios, en pacientes con alteraciones diferentes a la presencia de AL, la interpretación de los resultados en las pruebas de detección de AL resulta

problemática (cuadro 1). Un ejemplo específico lo constituyen los pacientes con anticoagulación oral (ACO), por la dificultad en la interpretación de los resultados en las pruebas de coagulación dependientes de fosfolípidos. La interpretación de la

V Domínguez-Martínez, R Villa-Márquez, D Hernández-Hernández

Cuadro 1Diagnósticos diferenciales de inhibidores de la coagulación.

1. Inhibidores asociados con sangradoa) anti-factor VIIIb) anti-factor II, VII, IX, X, XIc) anti-fibrinógeno/fibrinad) anticoagulantes similares a la heparina

2. Inhibidores con o sin sangradoa) anti factor V

3. Inhibidores usualmente no asociados con sangradoa) anticoagulante lúdicob) antifactor XII

Figura 1.- Abordaje diagnóstico en el laboratorio para la detección de anticoagulante lúpico. ACO = anticoagulación oral. LA1 y LA2 = fosfolípidos a diferentes concentraciones.


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magnitud de la corrección o acortamiento del tiempo de coagulación, que precisamente constituye la base de muchos procedimientos confirmatorios diseñados para detectar AL, se hace muy difícil, ya que la prolongación en el tiempo de coagulación causada por la ACO se traslapa con la inducida por el AL. Se han descrito procedimientos confirmatorios que aparentemente no son modificados por el ACO, sin embargo, su eficacia no está plenamente evaluada ni comprobada. En nuestro laboratorio, la causa principal de prolongación de los tiempos de coagulación esta dada por los pacientes con ACO. Muchos de estos pacientes se encuentran en estudio de una probable trombofilia, y entre estos estudios se incluye la búsqueda de AL. En esta situación, sería necesario esperar al término del periodo de anticoagulación para realizar la determinación, o suspenderla transitoriamente. Ambas alternativas pueden ser deletéreas para el paciente. Sin embargo, el conocer la condición respecto al AL ayudaría a la decisión de la duración e intensidad de la ACO, para prevenir recurrencia de la trombosis. Por las razones mencionadas, en los últimos 20 años se han desarrollado diversos tipos de pruebas de escrutinio y confirmación para la identificación de AL, no obstante hasta la fecha no hay una única prueba para detectar AL que sea 100% específica. Estas pruebas incluyen varios procedimientos o modificaciones de los mismos, como el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa), tiempo de coagulación con caolín, tiempo de coagulación con sílice (SCT), tiempo de protrombina diluido o inhibición de la tromboplastina tisular (TPd) y tiempo de veneno de víbora de Russell diluido (TVVRd). Desafortunadamente, hay variaciones en la sensibilidad y especificidad de estas pruebas para la detección del AL o inhibidores similares, ya que la composición de fosfolípidos es un

determinante crítico para la sensibilidad de una prueba determinada; y como se ha mencionado previamente, esta variación se incrementa en los pacientes con ACO (3, 4). La mezcla de plasma del paciente con plasma normal es una forma de compensar la prolongación en el tiempo de coagulación en este tipo de muestras, sin embargo, este procedimiento consume tiempo y reactivo, por lo que resulta una solución cara (1, 5)

(figura1). Debido a que muchos de los pacientes a quienes se les solicita AL se encuentran anticoagulados, en estudios previos se ha reportado que ciertas pruebas como el SCT, realizado con concentraciones bajas y altas de fosfolípidos sin adición de plasma normal y el TVVRd, procesado con fosfolípidos y sin adición de plasma normal no son alteradas con la ACO y se sugiere que pueden ser usadas para la detección de AL en este tipo de pacientes (6). En el Instituto se realizó un estudio para establecer la utilidad diagnóstica del TPd (con una tromboplastina tisular recombinante), y del TVVRd (sin la adición de plasma normal) en la detección de AL en pacientes anticoagulados y no anticoagulados, empleando como “estándar de oro” la prueba de fosfolípidos hexagonales (FH) (1, 3). Se estudiaron 40 muestras de pacientes de la Clínica de Anticoagulantes del Instituto con ACO y cuadro(s) de trombosis previa(s). De estas muestras, 12 pertenecían a pacientes con diagnóstico de síndrome antifosfolípido (SAF) primario o secundario, 9 eran de pacientes con enfermedad inmunológica (lupus eritematoso generalizado (LEG), artritis reumatoide (AR), hepatitis autoinmune, enfermedad de Graves) y sospecha de SAF; 17 muestras eran de pacientes anticoagulados por otras razones (fibrilación auricular, prótesis valvulares, cáncer, etc.) y 2 de pacientes en estudios de trombofilia: 1 con antecedente

Aticoagulante lúpico.

de trombosis recurrente y otra con abortos recurrentes. Además se estudiaron 27 muestras de pacientes no anticoagulados, 20 de ellas para detección de AL, y el resto con prolongación del TTPa por otras razones (cirrosis hepática, metástasis hepáticas, cáncer hepático). Para la obtención de cifras de referencia se estudiaron 26 muestras de individuos clínicamente sanos (cuadro 2). Métodos. Las muestras de plasma citratado se almacenaron a –70°C hasta la realización de las pruebas. El TPd se realizó en un instrumento automatizado (BCS®, Dade Behring) en el modo de TTPa, usando tromboplastina tisular recombinante (Innovin®, Dade Behring), diluida 1:100 y 1:200 en buffer veronal. Los cocientes del TPd se calcularon dividiendo el tiempo obtenido en cada muestra problema entre la media del valor obtenido en los controles: 34.1 para la dilución 1:100 y 46.1 para la dilución 1:200. El TVVRd se realizó en el mismo equipo automatizado, empleando muestras de plasma pareadas, a las que se les agregó como activador el veneno de víbora (Dade Behring) y 2 concentraciones diferentes de fosfolípidos (LA1 y LA2). Los resultados se expresaron como porcentajes de corrección, de acuerdo a la siguiente formula:% corrección = [(VVRd1p /VVRd1n) - (VVRd2p /VVRd2n)] / ((VVRd1p /VVRd1n) x 100 Para la prueba de FH se empleo el reactivo Staclot® LA (Stago) procesándose como prueba pareada de TTPa sin (tiempo de coagulación 1) y con (tiempo de coagulación 2) fosfolípidos hexagonales (FH), agregados a

una mezcla de plasma problema con plasma normal, y de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como la diferencia en segundos entre el tiempo de coagulación 1 y 2. Se consideró un plasma positivo para AL cuando la diferencia entre el tiempo de coagulación 1 y el tiempo de coagulación 2 estuvo por arriba del valor de corte de la población control. De los 67 plasmas analizados, (59.7%) trece correspondieron a pacientes anticoagulados. (32.5%) de éstos con diagnóstico de SAF primario o secundario. Los otros 27 plasmas eran de pacientes no anticoagulados: 20 fueron enviados para la detección de AL, la mayoría de ellos de pacientes con enfermedades inmunológicas y con TTPa prolongado que no corrigieron al mezclar con plasma normal, 8 plasmas con TTPa prolongado debido a falla hepática. La prueba de los FH fue positiva en 33 de los 67 plasmas analizados y de éstos 19 correspondieron a pacientes anticoagulados. La sensibilidad en la identificación de AL del TPd 1:100, 1:200 y el TVVRd en los pacientes con ACO fue muy similar a la encontrada en los pacientes sin ACO (cuadro 3), sin embargo, la especificidad de las tres pruebas fue menor en los pacientes con ACO. Con la prueba del TVVRd se obtuvieron las cifras más altos de sensibilidad (>90%) y especificidad (de 86% a 92%), mientras que con el empleo del TPd 1:100 y 1:200, en los pacientes con ACO la especificidad disminuyó a 33% y 57%, respectivamente. En forma similar de las 3 pruebas de laboratorio estudiadas, con el

Cuadro 2Valores de la percentila 95 de un grupo de 26 sujetos sanos para las pruebas

fosfolípidos hexagonales (FH), tiempo de protrombina diluido (TPd) y tiempo deveneno de Rusell diluido (TVVRd).

FH TPd !:100 TPd 1:200 TVVRd

Punto de corte 6.0 s 1.66 2.0 21.7%

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TVVRd se obtuvieron las cifras más altas de valor predictivo positivo y negativo en los 2 grupos de pacientes (cuadro 4). El AL se identificó en 78.5% de pacientes con SAF (11/14 pacientes con diagnóstico conocido de SAF; 2 de ellos no anticoagulados), en 69% de pacientes con enfermedad inmunológica y/o sospecha de SAF (20/29 muestras con solicitud de AL; 11 de ellos anticoagulados) y en 20.8% de pacientes con otras enfermedades (2 con cáncer, 2 con hipertensión arterial pulmonar e insuficiencia cardiaca y 1 con DM 2). Aunque el porcentaje de detección de AL en pacientes con diagnóstico conocido SAF es aceptable, existe la posibilidad que sean positivos para anticuerpos antifosfolípidos en fase sólida,

Cuadro 3Sensibilidad (sens.) y especificidad (esp.) del tiempo de protrombina diluido (TPd) y del tiempo de veneno de Rusell diluido (TVVRd) en la detección de anticoagulante lúpico en pacientes con y sin anticoagulación oral (ACO) y empleando como prueba diagnóstica los fosfolípidos

hexagonales.

PACIENTES TPd 1:!00 TPd 1:200 TVVRd

sens. % esp. % sens. % esp. % sens. % esp. %

Todos n=67 85 50 85 65 94 88

Con ACO n=40 84 33 84 57 95 86

Sin ACO n=27 86 77 86 77 93 92

Cuadro 4Valor predictivo positivo (vpp) y valor predictivo negativo (vpn) del tiempo de protrombina diluído (TPd) y del tiempo de veneno de Rusell diluído (TVVRd) en la detección de anticoagulante lúpico en pacientes con y sin anticoagulación oral (ACO) y empleando como prueba diagnóstica

los fosfolípidos hexagonales.

PACIENTES TPd 1:!00 TPd 1:200 TVVRd

vpp % vpn % vpp % vpn % vpp % vpn %

Todos n=67 62 77 70 81 89 94

Con ACO n=40 53 70 64 80 86 95

Sin ACO n=27 80 83 80 83 93 92

pero no para AL. Los resultados del estudio indican que el mejor balance de sensibilidad especificidad se observó en los pacientes no anticoagulados. Considerando ambos grupos de pacientes el TPd 1:100 y 1:200 mostró sensibilidad adecuada, pero pobre especificidad para la búsqueda de AL, y aunque en estudios previos se ha reportado que la dilución 1:200 es la que tiene mayor sensibilidad, en nuestra experiencia ésta fue muy similar a la obtenida con el TPd 1:100. En conclusión, de las tres pruebas analizadas, el TVVRd es una prueba útil para detectar AL en pacientes con o sin ACO. La ventaja de esta prueba, comparativamente con la de FH, se basa principalmente en que puede

Aticoagulante lúpico.

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automatizarse, lo cual reduce el tiempo de realización, economiza reactivos, minimiza las variables pre-analíticas que pueden alterar los resultados y por lo tanto reduce los costos. La prueba de FH (Staclot® LA) es difícil de realizar en sistemas automatizados, ya que la cantidad de reactivos usados y los tiempos de incubación necesarios exceden la capacidad de la mayoría de los instrumentos automatizados. Además, el costo institucional por paciente con cada prueba de Staclot® LA es de aproximadamente $300 pesos, mientras que el de TVVR es de $100 pesos. Estos hallazgos han hecho que en el Instituto se emplee el TVVRd, sin añadir plasma normal, como primera elección para la búsqueda de AL en pacientes con ACO. Sin embargo, el diagnóstico de AL sigue basándose en la realización de varias pruebas de escrutinio y de confirmación que implican ambas vías de la coagulación. Aunque hay lineamientos internacionales para tratar de estandarizarlas, la principal limitante es la ausencia de controles internacionalmente aceptados, lo que obliga a llevar el control de calidad interno en las muestras positivas de pacientes, lo cual dificulta la estandarización.

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