"Reducción del nivel de alcohol en"Reducción del nivel de alcohol en vinos mediante el uso de levaduras."

Ivan Ciklic y Mariana CombinaI tit t N i l d T l í A i (INTA) EEA M dInstituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) EEA Mendoza

Resumen de la presentación

Tradición

1) Importancia de Saccharomyces cerevisiae

ad c ó

Biotecnología

Organismo Modelog

2) Problema abordado, objetivos e hipotesis de trabajo

3) Carecterísticas del factor de transcripción PDC2 y la enzima i d b il

Antecedentes

piruvato decarboxilasa

4) Desarrollo del proyecto Antecedentes

Resultados y Metodologías

5) Proyección a futuro y otros proyectos relacionados

Importancia de Saccharomyces cerevisiae

Biotecnología Tradicional

Uso extensivo en la industria debido a su larga historia en la producción Uso extensivo en la industria debido a su larga historia en la producción De bebidas alcoholicas y en panaderías

Biotecnología

Mejoramiento génetico de levaduras para uso industrial. Producción deenzimas y otros compuestos quimicos en Farmaceutica

Importancia de Saccharomyces cerevisiae

Organismo modelo

✱ Eucariota unicelular con todas las características típicas (e.g.

✱ Microorganismo con tiempos breves de generaión (1,5 h), alta

p ( gorganelas, regulación del ciclo celular, envejecimiento, apoptosis)

c oo ga s o co t e pos b e es de ge e a ó ( ,5 ), a tadensidad (108 cel/ml) y eleveda proporción superficie/volumen

✱ Génetica Mendeliana (ciclo de vida sexual análisis de tetradas)✱ Génetica Mendeliana (ciclo de vida sexual, análisis de tetradas)

✱ Gran eficiencia de recombinación homologa

✱Primer organismo eucariota en contar con la secuencia completa del genoma (1996)

✱Colección de cepas delecionadas para cada uno de los 6000 genes

Problema abordado y objetivos del proyecto

Problema Causas_ Uvas cosechadas con madurez

azucarina muy avanzada

Veranos cálidos con un aumento

“Vinos con alta concentración dealcohol, indeseable para el Mercado de exportación“ _ Veranos cálidos con un aumento

en la incidencia solar

Objetivo general

Obtener una cepa nativa modificada genéticamente que posea una Obtener una cepa nativa modificada genéticamente que posea una leve ineficiencia en la producción de etanol, conservando además

todas las características deseables para la fermentación

Hipotesis de trabajo

PDC2 factor de

PDC2

PDC2 = factor de transcripción que

regula positivamente la expresión de las

Mutagénesis

pdc2 la expresión de las piruvato decarboxilasas

PDC1 y PDC5Selección

Reducción de regulación positiva de PDC1 y PDC5 PDC1 y PDC5 = Dos

isoformas de la piruvato

Reducción nivel de expresión

isoformas de la piruvatodecarboxilasa que

cataliza la conversiónde piruvato en

de PDC1 y PDC5p

acetaldehído

Redución en la producciónde etanol

Metabolismo anaerobico de glucosa en S cerevisiae y disponibilidad de NADH/NAD+S. cerevisiae y disponibilidad de NADH/NAD

0t a

l., 2

010

Kut

ina

ead

o de

D.

Ada

pta

Factor de transcripción PDC2p

✱ Proteína de 925 amino acidos con un peso molecular de ✱ Proteína de 925 amino acidos con un peso molecular de 104 KDa

✱ Se localiza en el núcleo y posee un sitio de unión a ADN de✱ Se localiza en el núcleo y posee un sitio de unión a ADN dela familia CENP-B

✱ Regulador positivo de las dos principales isoformas de piruvato decarboxilasas PDC1 y PDC5

✱ También Regulador positivo de genes involucrados en la síntesis de Tiamina difosfato, cofactor de Pdcs y Pdhs

✱ La deleción ∆pdc2 presenta severas reducciones en la producción de etanol (hasta un 30%) y también en los producción de etanol (hasta un 30%) y también en los niveles de expresión de PDC1 y PDC5

Piruvato decarboxilasa

✱ Cataliza la reacción: Piruvato Acetaldehído CO2

✱ Activa en forma de tetramero, requiere Mg2+ y Tiamina dif f t idifosfato como coenzimas

✱ Expresión génica activada por el factor de transcripción PDC2

✱ Existen al menos tres isoformas en S. cerevisiae

Piruvato decarboxilasa

3 isoformas con elevada homología

Pdc1p

• La forma principal

Pdc5p

• Forma secundaria

Pdc6p

• Forma minoritaria• La forma principal• Muy activa en

presencia de glucosa

• Forma secundaria• Indetectable en

presencia de glucosa• Represión por tiamina

• Forma minoritaria• Normalmente ausente

en catabolismo de glucosa

• Sin represión por tiamina

• Activa en mutantes ∆pdc1

• Participa en ahorro de azufre en respuesta a

metales pesados

Mutagénesis de PDC2 y reducción de la d ió d t lproducción de etanol

Deleción ∆pdc2

Nevoigt y Stahl 1996 Proyecto Actual

Mutagenesis de PDC2

Reducción actividad 1°Selección: mutantes pdc2Reducción actividad de Pdc - 80%

1 Selección: mutantes pdc2con actividad Pdc reducida

Reducción etanol - 30%

2°Selección: mutantes pdc2con etanol reducido

Fermentación a escala pilotocon mutantes seleccionados

Proyecto actual vs. estrategias anteriores para reducir niveles de etanolpara reducir niveles de etanol

Proyecto actual Ventajas asociadasMutagénesis de PDC2 y selecciónde variantes mutantes apropiadas

y j-Variabilidad genética intraespecie. -Mutaciónintegrada establemente en el genoma. -Efectos moderados sobre el metabolismo.

Estrategia y autores Desventajas asociadasCausa un severo efecto en el metabolismo del

Deleción del gen PDC2(Nevoigt y Stahl 1996)

-Causa un severo efecto en el metabolismo delEtanol con reducciones de hasta un 30 %. -Los mutantes no pueden crecer en glucosa

Sobreexpresión de genes GPD1/2 de la vía de glicerol(Remize et al., 1999; Lopes Barros

t l 2000 E li t t l 2002)

-Aumento en la producción de acidoacético, a consecuencia del desequilibrio redox. -Problemas asociados con plásmidos demulticopia: número variable de copias p/célulaet al., 2000; Eglinton et al.,2002)

Sobreexpresión del gen de la

multicopia: número variable de copias p/célula,es necesario mantener una presión selectiva

-Problemas asociados al uso de plásmidos de La glucosa oxidasa de A. Niger(Malherbe et al., 2003)

multicopia.-Producto transgénico, poca acepta-ción por la industria y consumidores

Construcción de biblioteca de mutantes

lacZ&apos

Clonación de PDC2 en plásmido centromérico

9006 bps2000

6000

8000 PDC2ampClonación de PDC2 en plásmido centromérico

YCplac111

4000

6000

lacZ&apos

CEN4ARS1

LEU2

Amplificación y mutagénesis aleatoria con RCAAmplificación y mutagénesis aleatoria con RCAPDC2

CEN4ARS1LEU2

amp

T f ió d l t S i iTransformación de la cepa receptora S. cerevisiaeBYpdc2∆ (S. Hohmann, Suecia)

YCplac111-PDC2

S. cerevisiae BYpdc2∆

Amplificación mediante PCR de PDC2

ADN λ1 2 3 4 5 ADN λ1 2 3 4 5 ADN λ1 2 3 4 5 ADN λ1 2 3 4 5

2,934 kb3,530 kb

2,027 kb

2,934 kb3,530 kb

2,027 kb

1-5 = Amplificados de PDC2 con primers 01.09.-02.09.1-5 = Amplificados de PDC2 con primers 01.09.-02.09.

Clonación de PDC2 en el plasmido centromerico YCplac111centromerico YCplac111

a1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 C ADN λADN λ

9 kb 9 kb

1 17 = Minipreps ligación PDC2 YCplac111 digeridos SalI BamHIC = Control YCplac111 digerido SalI-BamHI 6,1 Kb 1-17 = Minipreps ligación PDC2-YCplac111 digeridos SalI-BamHI

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101Kb9 kb

b

1-5 = clon 1 6-10 = clon 15

Transformación y complementación en la cepa ∆pdc2la cepa ∆pdc2

Si téti L YEP 3% t l Transformantes YEPD Sintético -Leu YEP 3% etanol

+ + +

Transformantes y cepas control

∆pdc2-pIFC01+ + +

- - +

∆pdc2-pIFC01

∆pdc2

+ + +

+ - +

BY4741-pIFC01

BY4741BY4741

Curva de crecimiento complementación ∆pdc2 vs tipo salvaje BY4741∆pdc2 vs tipo salvaje BY4741

10 Ypdc2 = 0.1773e0.3865r

R2 = 0.9932

10

a b

1

OD

600)

0.1

1

Lo

g (

O 0 1 2 3 4 5 6 7 8

YBy4741 = 0.177e0.3907r

R2 = 0.998

10

0.10 1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (h)

1

Tiempo (h) 0.10 1 2 3 4 5 6 7 8

= ∆pdc2-pIFC01= By4741-pIFC01

r∆pdc2= 0,3865rBy4741= 0,3907

Mutagénesis aleatoria de PDC2g

Método de mutagénesis aleatoria mediante Rolling Circle Amplification (RCA)

¿Por que?q

Amplificación de ADN a partir de ADN circular, se generan copias lineales en tandemdel ADN molde Estas pueden usarse directamente para transformar S cerevisiae odel ADN molde. Estas pueden usarse directamente para transformar S. cerevisiae oE. coli, sin necesidad de pasos previos de restricción o ligación.

La reacción transcurre a temperatura constante por lo que no se requiere de equipostermocicladores. Tampoco se necesitan primers específicos.

Manipulando la concentración de MnCl se obtienen librerías de mutantes con unaManipulando la concentración de MnCl2 se obtienen librerías de mutantes con unafrecuencia de mutación de 3-4 por kilo base de ADN plasmídico.

Mutagénesis aleatoria mediante error prone RCAy construcción de la librería de mutantes pdc2y construcción de la librería de mutantes pdc2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 y 11 = λ HIndIII2 = PUC19

5-6 = RCA 1/507-8 = RCA 1/100

pIFC01

2 PUC193-4 = RCA 1/20

7-8 = RCA 1/1009-10 = RCA 1/200

amp PDC2

CEN4ARS1LEU2

PDC2

CEN4ARS1LEU2

ampAmplificación y mutagénesis aleatoria con RCAAmplificación y mutagénesis aleatoria con RCAAmplificación y mutagénesis aleatoria con RCAAmplificación y mutagénesis aleatoria con RCA

PDC2

CEN4ARS1LEU2

PDC2

CEN4ARS1LEU2

amp

Transformación de la cepa receptora S. cerevisiaeTransformación de la cepa receptora S. cerevisiae∆pdc2 (S. Hohmann, Suecia)

pIFC01

S. cerevisiaeS. cerevisiae ∆pdc2

211 mutantes

Secuenciación y calculo de la tasa d t ióde mutación

N° muestrassecuenciadas

N° mutaciones N° mutacionespor muestra

Tasa de mutación

ació

nl 2

0 8 1 0,125 0,043/Kb

Con

cetr

aM

nC 1,5 mM 6 3 0,5 0,17/Kb

2 mM 2 2 1 0,34/Kb

Planeamiento de tres etapas de selección fenotípica para el aislamiento de la variantefenotípica para el aislamiento de la variante

pdc2 deseada

Transformates elegidos al azar mutantes seleccionados 2° etapa

Curvas de crecimiento en medio selectivo – Leu con glucosa como

fuente de carbono

Curvas de crecimiento en medio selectivo –Leu con glucosa como

fuente de carbono

Selección de mutantes con actividad enzimática PDC entre

15- 50 % menor que el control

Selección de mutantes con actividad enzimática PDC entre15-50 % menor que el control

Fermentaciones de mosto sintetico a escala de laboratorio y cuantificación del etanol

Fermentaciones de mosto sinteticoa escala de laboratorio y cuantificación del etanol

Selección de transformantes contasas de crecimiento menores a

Preparación de extractos crudosy determinación de la actividad

Selección de mutantes contasas de producción entretasas de crecimiento menores a

las del control ∆pdc2-pIFC01y determinación de la actividad

enzimática de PDC

mutantes seleccionados 1° etapa

tasas de producción entre5-20 % menor que el control

fenotipo deseado 3° etapa

Integración de subclones de PDC2 en el d l ti INTA MZAgenoma de la cepa nativa INTA MZA

Variantes mutantes de PDC2preseleccionadas

Variantes mutantes de PDC2preseleccionadas

R bi ióPDC2CEN4ARS1

LEU2amp

RecombinaciónhomologaPDC2

CEN4ARS1LEU2

amp

Serie de cruzamientosPDC2CEN4ARS1

LEU2amp

Cepa de laboratorio BYpdc2∆ Cepa Nativa INTA MZA

Serie de cruzamientos

Ensayos de fermentación a escalaEnsayos de fermentación a escalade laboratorio y eventualmente a

escala piloto

Proyección a Futuro y otros t l i dproyectos relacionados

✱ Continuar desarrollando la aplicación de la igeniería génetica de levaduras en otros aspectos importantes para la industría del vino

✱ Identificar nuevos problemas y aspectos de la elaboración regional de vino susceptibles de mejora mediante el mejoramiento genético de vino susceptibles de mejora mediante el mejoramiento genético de levaduras

✱ Desarrollar nuevas estrategias específicas para construir una cepa con potencial para la aplicación en el contexto de la producción debio-etanol a partir de desechos de la industria vitivinícola

✱ Actualmente se ha comenzado a trabajar en un nuevo proyecto con la levadura contaminante Brettanomyces con miras a desarrollar la levadura contaminante Brettanomyces con miras a desarrollar un método efectivo para el tratamiento de barricas contaminadas

AgradecimientosAgradecimientos

✱ A Mariana Combina y a todo el grupo de Microbiología Enologica delINTA Mendoza y a todos los compañeros de la experimental que INTA Mendoza y a todos los compañeros de la experimental que colaboran para un buen clima de trabajo

Material adicional: Glucolisis y vía del li lglicerol

Material adicional: Glucólisis y el desvío de la piruvato dehidrogenasa