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Centro Nacional de Investigaciones Científicas Rama de Biotecnología Departamento de Genética Nuevo Mecanismo de Transmisión Horizontal de los Genes que Codifican la Toxina del Cólera Mediado por el Fago Filamentoso VGJo en Vibrio cholerae Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas Javier Campos Gómez Ciudad de la Habana 2004
Transcript of Centro Nacional de Investigaciones...
Centro Nacional de Investigaciones Científicas
Rama de Biotecnología Departamento de
Genética
Nuevo Mecanismo de Transmisión Horizontal de
los Genes que Codifican la Toxina del Cólera
Mediado por el Fago Filamentoso VGJo en Vibrio
cholerae
Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas
Javier Campos Gómez
Ciudad de la Habana
2004
Centro Nacional de Investigaciones Científicas
Rama de Biotecnología
Departamento de Genética
Nuevo Mecanismo de Transmisión Horizontal de los
Genes que Codifican la Toxina del Cólera Mediado por
el Fago Filamentoso VGJ (|) en Vibrio cholerae
Tesis presentada en la opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas
Autor: Lic. Javier Campos Gómez
Tutores: Prof. Tit., Dr. Joaquín Díaz Brito
Dra. Mayra Tejuca Martínez
Ciudad de La Habana
2004
i
AGRADECIMIENTOS Este trabajo hubiera sido imposible de realizar sin la ayuda de:
• En primer lugar, Eriel Martínez, quien estuvo presente desde el principio de esta
investigación, primero como estudiante de tesis y luego como recién graduado. Juntos
logramos formar un excelente equipo de trabajo y en menos de un año logramos obtener
la mayoría de los resultados presentados en esta tesis.
• Mis otros estudiantes de diplomado Risset Silvera y Aminael Sánchez; su ayuda no fue
menos importante por haberse incorporado a mitad del camino de esta investigación.
• Todos mis compañeros del Departamento de Genética del CNIC sin excepción, incluyendo
la reciente adquisición de los miembros del Laboratorio de Criobiología. Un buen ambiente
de profesionalidad, cooperación y discusión científica siempre ha primado entre nosotros
por encima de cualquier diferencia. Muchas sugerencias de todos ellos han quedado
plasmadas en esta tesis.
• Mis tutores, la Dra. Mayra Tejuca y el Dr. Joaquín Díaz de la Facultad de Biología de la UH.
Gracias a su apoyo y a la cuidadosa revisión que hicieron de las primeras versiones de la
tesis esta dio un salto increíble en calidad y organización.
• Los Dres. Juan Arrieta y Ricardo Siva del CIGB. La excelente oponencia que realizaron
durante la predefensa de la tesis hizo que esta diera un salto adicional en calidad.
• El Dr. Seppo Ylá-Herttuala y la Dra. Annikka Linnala-Kankkunen de la Universidad de
Kuopio, Finlandia. El primero por financiar y la segunda por realizar la secuenciación del
extremo amino terminal de la proteína mayoritaria del fago VGJ<t>.
• Los Dres. Richard A. Finkelstein (Universidad de Missouri, EE.UU.), Ronald K. Taylor (Escuela
Médica de Dartmouth, N.H., EE.UU.) y G. Balakrish Nair (Instituto Nacional de Cólera y
Enfermedades Entéricas, Calcuta, India), quienes donaron muchas de las cepas de V.cholerae usadas en este trabajo.
• El Dr. Luis Javier González del CIGB, por la identificación de proteínas mediante
espectrometría de masa.
• La Dra. María Cristina de la Rosa del CIGB, Tania Valdés, Sandra Rodríguez y la Dra. Odelsa
Ancheta del CNIC, por su trabajo en la microscopía electrónica.
• Mi esposa Yohanka, si esta tesis es ahora mucho más diáfana se debe en gran parte a ella.
• Mi hijo Guillermo Javier, sus constantes y bienvenidas interrupciones durante la escritura
de la tesis impidieron siempre a tiempo que mi sistema nervioso se saturara y me hacían
retomar el trabajo con más frescura.
A todos ellos mis más sinceros agradecimientos.
iii
‘Esta tesis la dedico a mi familia. A mi madre, por haber sido
madre y padre contra toda adversidad, por su amor incondicional
y por haberme guiado de algún modo por caminos de inquietud
intekctual. A mi hermana y sobrinos por esa imagen aumentada
que se han fabricado de mí y que les agradezco no por vanidad
sino porque me dice cuanto me estiman. Y a mi esposa Yoha, mi
hijo Guillermo Javier y la o el que viene en camino, por darte
más sentido y momentos felices a mi vida
Dedicatoria
Síntesis
v
SÍNTESIS
La toxina del cólera, el principal factor de virulencia de la bacteria patógena Vibrio cholerae, es
codificada por el operón ctxAB, el cual está contenido en el genoma del bacteriófago filamentoso
lisogénico CTX<j>. Este fago transmite los genes ctxAB entre poblaciones bacterianas de V. cholerae que expresan la fimbria del tipo 4 llamada TCP (del inglés, toxin corregulated pilus),que actúa como receptor del fago CTX<|>. En este trabajo se describe a VGJ<|), un nuevo
fago filamentoso de V. cholerae capaz de transmitir eficientemente los genes que codifican la
toxina del cólera por un mecanismo alternativo independiente de TCP. VGJ< (> infecta V. cholerae usando como receptor otra fimbria del tipo 4, la hemaglutinina sensible a mañosa
(MSHA), y una vez dentro de la célula huésped puede entrar en el estado lisogénico
integrándose por recombinación sitio-específica en el mismo sitio attB cromosomal en el que se
integra CTX ((>. VGJcj) transmite los genes ctxAB a cepas de V. cholerae que expresan el
receptor del fago, MSHA, mediante un nuevo tipo de transducción especializada en la cual la
forma replicativa (FR) de VGJ<t> se recombina sitio-específicamente con la FR de CTX<)>,
originando una molécula de ADN híbrida. Esta FR recombinante genera un genoma híbrido de
ADN de cadena simple que es empaquetado en una partícula viral infectiva que se denominó
HybPcj). El genoma del fago híbrido HybP<)> se replica utilizando la maquinaria replicativa de
VGJ(f> y se empaqueta en la misma cápsida de este último, por lo que mantiene la capacidad
de infectar mediante MSHA. HybP<|> infecta muchas cepas de V. cholerae más eficientemente
que el fago CTX(j>, incluso bajo condiciones óptimas de expresión del receptor de este último.
HybP< (> es capaz de integrar su genoma sitio-específicamente en el cromosoma de V. choleraey de esta forma garantiza la estabilidad genética de los genes que codifican la toxina del cólera
en la célula huésped. La infección y lisogenización con HybP ((> revierten a la virulencia a cepas
vacunales vivas atenuadas de V. cholerae, lo que indica que los genes ctxAB se mantienen
funcionales en el genoma del fago híbrido y que este tiene la capacidad potencial de convertir
a cepas ambientales no-toxigénicas de V. cholerae en cepas virulentas. Estos resultados
demuestran que existe al menos una vía alternativa para la transmisión horizontal de los genes
que codifican la toxina del cólera, por lo que los riesgos potenciales de que las cepas vacunales
vivas atenuadas de \/. cholerae reviertan a la virulencia por readquisición de estos genes en el
ambiente son mayores de lo previsto anteriormente. Igualmente existe la posibilidad de que
cepas ambientales no- toxigénicas de V. cholerae se conviertan en virulentas por el mecanismo
de transmisión genética horizontal descrito en este trabajo y se propone un modelo evolutivo
que explica como pudiera ocurrir la conversión a la virulencia en el ambiente. Finalmente se
describe la construcción de una nueva generación de candidatos vacunales que no expresan el
receptor MSHA, los cuales no pueden readquirir los genes que codifican la toxina colérica
Síntesis
vi
mediante la infección y lisogenización con un fago híbrido del tipo HybP()>.
Abreviaturas
vii
aa Aminoácido
ADN Ácido desoxirribonucleico
ADNcd ADN de cadena doble
ADNcs ADN de cadena simple
Ap Ampicillina
Apr Resistencia o resistente a ampicillina
ARN Ácido ribonucleico.
DO Densidad óptica
EDTA Ácido etilendiamintetracético
FR Forma replicativa
Kb kilobase
Kn Kanamicina
Knr Resistencia o resistente a kanamicina
LD50 Dosis letal media
LPS Lipopolisacárido de superficie
MDI Multiplicidad de infección
MSHA Hemaglutinina sensible a mañosa (por sus siglas en inglés, mannosesensitive hemagglutinine)
ORF Marco de lectura abierto (por sus siglas en inglés, open reading frame) Pb Par de bases nucleotídicas
PBS Solución salina tamponada con fosfato (por sus siglas en inglés, phosphate buffered satine)
PCR Reacción en cadena de la polimerasa (por sus siglas en inglés, polymerase change reaction)
Pol Polimixina
Rpm Revoluciones por minuto
SDS Dodecil sulfato de sodio (por sus siglas en inglés, sodium dodecil sulfate) SDS-PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (por sus
siglas en inglés, SDS-polyacrylamide geI electrophoresis) SM Señal morfogenética
TCP Pilus corregulado con la toxina (por sus siglas en inglés, toxin corregulated pitus) Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano
UFC Unidades formadoras de colonias
ABREVIATURAS
Autobibliografía
ix
AUTOBIBLIOGRAFÍA
Este trabajo está basado en las siguientes publicaciones originales y en algunos resultados
aún sin publicar.
• Novel Type of Specialized Transduction for CTX<|> or its Satellite Phage RS1 Mediated by
Filamentous Phage VGJ<)> in Vibrio cholerae. Die. 2003. Javier Campos, Eriel Martinez,
Karen Marrero, Yussuan Silva, Boris. L. Rodriguez, Edith Suzarte, Talena Ledón y Rafael
Fando. Journal of Bacteriology. Vol. 185, No. 24, pp. 7231-7240.
• VGJ (|>, a Novel Filamentous Phage of Vibrio cholerae, Integrates Into the Same
Chromosomal Site as CTX()>. Oct. 2003. Javier Campos, Eriel Martinez, Edith Suzarte,
Boris. L. Rodriguez, Karen Marrero, Yussuan Silva, Talena Ledón, Ricardo del Sol y Rafael
Fando. Journal of Bacteriology. Vol. 185, No. 19, pp. 5685-5696.
• Cepas atenuadas de Vibrio cholerae mejoradas en su seguridad ambiental presentadas en
forma liofilizada para la vacunación por via oral. (Patente) Solicitud Cubana 2003-0039,
Solicitud PCT/cu04/00002 (Paises: Australia, EE.UU., China, Brasil, Japón, EPO, Malasia,
Suiza, Lituania, India, República de Korea y Rusia). Javier Campos, Tomás Moreira, Boris
L. Rodríguez, Karen Marrero, Eriel Martínez, Talena Ledón, Yussuan Silva, Edith Suzarte,
Herminia de la C. Delgado, Caridad Urra, Rafael Fando.
• Aislamiento y caracterización de VCP1, un nuevo fago filamentoso de Vibrio cholerae 0139.
May.-ago. 2003. Javier Campos, Eriel Martínez, Edith Suzarte, KarenMarrero, Boris
Rodríguez, Yussuan Silva, Talena Ledón y Rafael Fando. Revista CENIC (Ciencias
biológicas). Vol. 34, No. 2, pp. 51-57.
índice
ÍNDICE
Pag.
AGRADECIMIENTOS i
DEDICATORIA iii
SÍNTESIS v
ABREVIATURAS v¡¡
AUTOBIBLIOGRAFÍA ix
ÍNDICE xi
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN .............................................................................. 1
CAPÍTULO 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ................................................................ 7 2.1 Cólera y Vibrio cholerae ........................................................................... 7
2.2 Clasificación .......................................................................................... 8
2.3 El elemento CTX como casete de virulencia: perspectiva clásica ..................... 8
2.4 Factores asociados a la virulencia dentro del elemento CTX ........................... 9
2.4.1 La toxina del cólera .......................................................................... 9
2.4.2 La proteína Cep ............................................................................... 9
2.4.3 La proteína Zot ............................................................................... 10
2.4.4 La proteína Ace ................................................................................ 10
2.5 Factores asociados a la virulencia fuera del elemento CTX ............................ 10
2.5.1 Fimbrias tipo 4 ................................................................................ 10
2.5.2 El factor de colonización accesorio ..................................................... 13
2.5.3 La hemaglutinina proteasa soluble ...................................................... 13
2.5.4 La hemolisina/citolisina ..................................................................... 14
2.5.5 Proteínas de membrana externa ......................................................... 14
2.5.6 El flagelo ........................................................................................ 15
2.5.7 El lipopolisacárido de superficie ......................................................... 15
2.5.8 Sistemas de secreción ..................................................... ................. 15
2.6 Regulación de la virulencia ...................................................................... 16
2.7 El elemento CTX como fago filamentoso CTX<t>: nueva perspectiva .............. 18
2.8 Características generales de los bacteriófagos filamentosos ........................... 18
2.8.1 Estructura del virión ......................................................................... 19
2.8.2 Organización genómica ..................................................................... 20
2.8.3 Infección ....................................................................................... 21
2.8.4 Replicación ..................................................................................... 22
2.8.5 Ensamblaje y secreción ..................................................................... 24
El fago filamentoso CTX<)> y su fago satélite RS1 26
xi
índice
2.9 Características generales de CTX<|)........................................................... 27
2.10.1 CTX<|> comparado con otros fagos filamentosos ............................... 27
.27
2.10.2 Infección ............................................................
2.10.3 Integración de ............................................................................... ^
2.10.4 Replicación de .............................................................................. 28
2.10.5 Secreción de ................................................................................. 2^
2.10 Otros fagos filamentosos de V. cholerae .................................................. 29
2.11 Transferencia genética horizontal .......................................................... 30
2.12 Origen evolutivo de V. cholerae epidémico ................................................. 31
CAPÍTULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................. 32 3.1 Materiales ............................................................................... ............ 82
3.1.1 Cepas, plasmidios, fagos y fagemidios ................................................ 32
3.1.2 Medios de cultivo ............................................................................. 33
3.1.3 Enzimas y reactivos ............................................................... ........ 34
3.2 Técnicas usadas en el trabajo con ADN ..................................................... 34
3.2.1 Purificación de ADN total y plasmídico ................................................ 34
3.2.2 Reacciones de modificación-restricción del ADN ................................... 34
3.2.3 Electroforesis de ADN y purificación de bandas de ADN a partir de geles de
agarosa .......................................................................................... 35
3.2.4 Reacción en cadena de la polimerasa ................................................. 35
3.2.5 Southern blotting ............................................................................... 35 3.2.6 Secuenciación de ADN ...................................................................... 36
3.2.7 Análisis de las secuencias nucleotídicas............................................... 37
3.2.8 Transformación bacteriana ................................................................ 38
3.3 Construcciones genéticas ........................................................................ 38 3.3.1 Clonación de fragmentos de la FR de VGJij) para secuenciación ............. 38
3.3.2 Construcción de VGJ-Kn<|> .............................................................. 39
3.3.3 Mutación del ORF493 de VGJ<t> ....................................................... 39
3.3.4 Construcción de pVGJ-Rep ................................................................ 40
3.3.5 Mutación del ORF359 de pVGJ-Rep .................................................... 40
3.3.6 Construcción del vector suicida pCVAmshA ......................................... 40
3.3.7 Deleción del gen mshA del cromosoma de V. cholerae .......................... 41
3.4 Técnicas usadas en el trabajo con proteínas .............................................. 41
3.4.1 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) ... 41
3.4.2 Western blotting ............................................ 42
3.4.3 Estudio de la expresión de MshA y TcpA en cepas de V. cholerae ............... 42
3.4.4 Identificación de proteínas mediante espectrometría de masa o secuencia-
ción del extremo amino terminal .......................................... ............... 42
xii
índice
3.4.5 Cuantificación de la producción de la toxina del cólera ............................. 43
3.4.6 Análisis de las secuencias aminoacídicas ................................................. 44
3.5 Técnicas usadas en el trabajo con fagos ..................................................... 44
3.5.1 Ensayo de infección-titulación ............................................................... 44
3.5.2 Aislamiento de fagos de V. cholerae ....................................................... 44
3.5.3 Purificación de las partículas virales a partir de cultivos infectados ............. 45
3.5.4 Purificación de ADNcs genómico viral ..................................................... 45
3.5.5 Purificación de la forma replicativa de los fagos ...................................... 46
3.5.6 Microscopía electrónica ........................................................................ 46
3.5.7 Integración de VGJ-Kn<)> en el cromosoma bacteriano ........................... 46
3.5.8 Estabilidad de HybP-Kn<j> en el hospedero bacteriano ........................... 46
3.6 Técnicas utilizadas en el trabajo con V. cholerae .......................................... 47
3.6.1 Evaluación de la virulencia de cepas de V. cholerae .............................. 47
3.6.2 Estudio morfológico ............................................................................ 47
3.6.3 Ensayo de movilidad ............................................................................ 47
3.6.4 Caracterización serológica de V. cholerae ............................................... 47
Ensayo de la actividad endoglucanasa del gen celA en las cepas de V. cholerae marcadas con este gen 48
3.6.5 Determinación del tiempo de duplicación de V. cholerae ........................... 48
3.6.6 Ensayo de colonización de V. cholerae en el modelo de ratón lactante ....... 48
CAPÍTULO 4. RESULTADOS ................................................................................... 49 4.1 Aislamiento de fagos de V. cholerae .......................................................... 49
Caracterización y purificación del fago VGJ<j> 49
4.2 Secuencia nucleotídica y organización genómica de VGJ(j> 53
4.3 Construcción de una versión marcada de VGJ(f> 59
4.4 Titulación de VGJ<|> 60
4.5 El receptor de VGJ<|> es la fimbria MSHA 61
4.6 Perfil proteico parcial de VGJ<j) 62
4.7.1 Proteínas que no forman parte de la cápsida de VGJ<(> .......................... 62
4.7.2 Proteínas que forman parte de la cápsida de VGJ(j) ................................. 64
Espectro de hospederos de VGJ<|> dentro de V. cholerae toxigénico
67
4.7 VGJ<)> se integra en el sitio affRSI del cromosoma de V. cholerae 68
VGJ<)) transmite el genoma de CTX<(> 71
xiii
índice
Formación del fago híbrido HybP-Kn<j) en la cepa clásica 569B
71
4.10.1 Formación del fago híbrido HybP-Kn<j> en la cepa El Tor C72K7 .......... 75
4.8 Composición de las partículas de HybP-Kn<|> ............................................. 76
4.9 El fago híbrido HybP-Kn<|> es estable in vitro e ¡n vivo ................................. 78
4.10 Los genes ctxAB se expresan de la misma forma desde HybP-Kn<|> que
desde CTX<j> ..................................................................................... 79
4.11 HybP-Kn<)> convierte a la virulencia a la cepa atenuada 1333 ................... 80
4.12 Espectro de hospederos de HybP-Kn<j> versus CTX<j) ............................. 80
4.13 Expresión de MshA versus TcpA ............................................................ 81
Construcción y caracterización de mutantes nulos para la expresión
de MSHA 82
4.17.1 Construcción de los mutantes mshA~ ................................................ 83
4.17.2 Caracterización de los mutantes mshA~ obtenidos .............................. 87
CAPÍTULO 5. DISCUSIÓN ............................................................................ 91
CAPÍTULO 6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................. 105 \
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 107 ANEXOS .................................................................................................... 117 A1 Secuencia nucleotídica completa de VGJtj)
A2 Predicción de dominios transmembranosos de diferentes proteínas de VGJ ((>
A3 Espectros de masas de la proteína codificada por el ORF112 de VGJ<|)
A4 Secuenciación automática del extremo amino terminal de la proteína mayoritaria de la
cápsida de VGJ<f>: cromatogramas
xiv
Capítulo 1 Introducción
1
1. INTRODUCCIÓN
Vibrio cholerae es una bacteria gramnegativa capaz de colonizar el intestino delgado humano,
donde secreta una potente enterotoxina, la toxina del cólera (Kaper y cois., 1995). Esta toxina
es responsable de las severas diarreas que se producen durante el padecimiento del cólera, las
cuales pueden ocasionar la muerte por deshidratación en pocas horas (Kaper y cois., 1995).
Los genes que codifican la toxina del cólera, ctxA y ctxB, forman un operón (ctxAB) contenido
en el genoma del bacteriófago filamentoso lisogénico CTX<j> (Waldor y Mekalanos, 1996). En
los serogrupos toxigénicos de V. cholerae, CTX<|> se encuentra integrado en el genoma de la
bacteria, pero a diferencia de la generalidad de los bacteriófagos lisogénicos puede replicarse
desde el cromosoma bacteriano sin escindirse del mismo y dar lugar a partículas virales
infectivas que transmiten el operón ctxAB a diferentes poblaciones de V. cholerae que expresen
el receptor del fago (Waldor y Mekalanos, 1996). El receptor es una fimbria del tipo 4
denominada pilus corregulado con la toxina o TCP (del inglés, toxin corregulated pilus) ya que
su expresión es regulada de la misma forma que la toxina colérica (Waldor y Mekalanos, 1996).
TCP constituye además un factor de virulencia esencial para la colonización del intestino delgado
humano por la bacteria (Herrington y cois., 1988).
Los genes que codifican TCP están contenidos en una región del cromosoma bacteriano llamada
isla patogénica de V. cholerae (VPI, del inglés, vibrio pathogenicity island) la cual codifica además
de TCP, otros factores relacionados con la virulencia (Karaolis y cois., 1998). Se conoce que VPI
puede ser transmitida horizontalmente entre diferentes poblaciones bacterianas de V. cholerae;
sin embargo, el mecanismo de transferencia es aún desconocido. Recientemente Rajanna y
cols. (2003) demostraron que VPI puede escindirse de manera precisa del cromosoma
bacteriano y formar una molécula circular extracromosomal. Estos autores no identificaron
ningún gen de replicación, ni por homología ni por análisis funcional y no se presentaron
evidencias experimentales de que esta forma extracromosomal de VPI sea capaz de replicarse
ni de transmitirse entre poblaciones bacterianas de V. cholerae. No obstante, el hecho de que
VPI es capaz de escindirse de manera precisa del cromosoma bacteriano pudiera ser el primer
Capítulo 1 Introducción
2
paso de un mecanismo específico de transmisión horizontal de VPI que aún no ha sido
descubierto y que actualmente se encuentra en estudio (Rajanna y cois., 2003).
Cualquiera que sea el mecanismo de transferencia, la isla patogénica VPI, que contiene los genes
que codifican TCP, el receptor de CTX<j>, posee al igual que este fago la capacidad de moverse
horizontalmente entre poblaciones bacterianas de V. cholerae. Tal movilidad del fago y su
receptor sugirió un modelo evolutivo sobre el origen de V. cholerae toxigénico que goza de gran
aceptación. El modelo propone que las cepas ancestrales no-toxigénicas de V. choleraeadquirieron primero la isla patogénica VPI, subsiguientemente expresaron el receptor TCP y
finalmente fueron infectadas y lisogenizadas por el fago CTX* (Waldor y Mekalanos, 1996;
Faruque y cois., 1998a; Faruque y cois., 1998b; Davis y Waldor, 2003).
El descubrimiento de que el fago CTX* contiene los genes que codifican la toxina del cólera, ha
despertado un interés creciente en el estudio del papel que juegan los fagos en la evolución de
las bacterias patógenas y en la transmisión horizontal de genes entre poblaciones bacterianas,
dentro de una misma especie o entre especies diferentes (Boyd y cois., 2001). Además del fago
CTX<{. se han descrito otros cuatro fagos filamentosos de V. cholerae. 493, VSK, fs1 y fs2 (Kar
y cois., 1996; Ikema y Honma, 1998; Jouravleva y cois., 1998a; Nakasone y cols. 1998), los
cuales han sido poco estudiados. La contribución a la patogénesis y transmisión horizontal de
genes por parte de estos fagos, si es que contribuyen en algo, aún no se conoce. Se piensa que
el fago 493 pudo haber jugado algún papel en la evolución del serogrupo toxigénico 0139 de V. cholerae que surgió como cepa epidémica en la India en 1992 (Jouravleva y cois., 1998a), pero
hasta el momento esto no es más que una especulación.
Actualmente, a pesar de los grandes avances obtenidos en el conocimiento sobre las vías de
prevención del cólera (Holmgren, 1981), esta enfermedad aún constituye una carga para los
países subdesarrollados que no pueden establecer o mantener las instalaciones médicas ni las
condiciones higiénicas necesarias para controlarla. Particularmente en estos países el cólera es
responsable de una significativa mortalidad y un daño económico considerable, por ello obtener
una vacuna eficaz y segura contra esta enfermedad resulta de gran importancia.
Se han desarrollado varios prototipos vacunales contra el cólera entre los que se encuentran las
vacunas de subunidades y de células muertas; sin embargo, el desarrollo de candidatos
vacunales basados en células vivas atenuadas mediante la deleción de los genes que codifican
la toxina del cólera ha brindado los resultados más promisorios (Kaper, 1989; Finkelstein, 1995;
Kenner y cois., 1995; Benítez y cois., 1996). Este último enfoque ofrece ventajas sobre los
demás prototipos vacunales en términos de producción, fácil administración y generación de
una respuesta inmune protectora y duradera. Sin embargo, las desventajas más importantes
asociadas con su uso son en primer lugar, la reactogenicidad residual de muchas de estas
vacunas, inadecuada para su empleo en humanos (Finkelstein, 1995) y, en segundo lugar, los
riesgos potenciales asociados con la liberación al ambiente de estos microorganismos
genéticamente modificados (Taylor y cols., 1988).
Capítulo 1 Introducción
3
Este segundo aspecto relacionado con la seguridad ambiental y la epidemiología del cólera, es
motivo de preocupación para los estudiosos del tema, debido al comportamiento impredecible
de las cepas vacunales atenuadas de V. cholerae cuando sean liberadas durante las campañas
de vacunación masiva, en las que millones de células bacterianas vivas serán excretadas al
entorno por las personas vacunadas (Kaper y cois., 1994). El principal riesgo potencial que se
prevé es la readquisición de los genes que codifican la toxina del cólera por las cepas vacunales
liberadas, lo cual podría ocasionar un efecto totalmente contrario al deseado.
La readquisición de los genes ctxAB en el ambiente, por parte de las cepas vacunales, podría
ocurrir mediante la infección de estas con el fago CTXf Sin embargo, la probabilidad de que esto
ocurra se ve disminuida por el hecho de que el receptor de este fago, TCP, solo se expresa en
condiciones restringidas como las que se hallan en el intestino delgado humano (Waldor y
Mekalanos, 1996). No obstante, existe la posibilidad de que los individuos vacunados se infecten
simultáneamente con una cepa toxigénica, la cual podría transferir los genes ctxAB a la cepa
vacunal en el intestino por mediación de CTX< ().
Cualquier estrategia para prevenir la readquisición de CTX<|> por las cepas vacunales de V. cholerae no puede incluir la deleción de los genes que codifican el receptor TCP, puesto que este
pilus es imprescindible para el proceso de colonización intestinal y por consiguiente para la
generación de una respuesta inmune adecuada en los individuos vacunados (Herrington y cois.,
1988). Es por ello que se han propuesto estrategias diferentes para evitar la readquisición
estable de CTX<)>, como la eliminación del sitio donde se integra este fago en el cromosoma
bacteriano (Kenner y cois., 1995) o la introducción en las cepas vacunales del gen rstR, el cual
codifica un represor de los genes del fago y por tanto confiere inmunidad contra CTX<j) (Kimsey
y Waldor, 1998).
Todas estas estrategias de prevención han sido diseñadas teniendo en cuenta el modelo
evolutivo de adquisición secuencial de la isla patogénica VPI primero y del fago CTX<j> después.
Sin embargo, aunque este modelo es aceptado por muchos científicos, ha sido cuestionado por
otros debido a que se han aislado cepas toxigénicas de V. cholerae que no contienen VPI, pero
que contienen los genes que codifican la toxina del cólera (Said y cois., 1995; Ghosh y cois.,
1997). Se ha sugerido que estas cepas surgieron por el mismo modelo pero que posteriormente
perdieron VPI (Faruque y cois., 1998a; Faruque y cols., 1998b). No obstante, la existencia de
tales cepas toxigénicas ha generado la sospecha entre los investigadores de que pueden existir
vías alternativas de transmisión de los genes que codifican la toxina colérica que no se ajustan
al modelo ortodoxo. Buscando una posible vía alternativa, Boyd y Waldor (1999) encontraron
que la adquisición previa de VPI no es imprescindible para la adquisición subsiguiente de
CTX<J>, pues demostraron que el fago CP-T1 puede transmitir el genoma completo de CTX<|>
mediante transducción generalizada independientemente de la presencia del receptor TCP. Sin
embargo, tal mecanismo es ineficiente y no constituye una vía específica de transmisión
genética horizontal puesto que los fagos capaces de realizar transducción generalizada
Capítulo 1 Introducción
4
transmiten cualquier fragmento del cromosoma bacteriano de manera aleatoria. Ese mecanismo
no explica la existencia de cepas toxigénicas de serogrupos no-01 que contienen CTX<t>, pero
no los genes que codifican TCP, ya que el fago CP-T1 solo infecta cepas del serogrupo 01 de V. cholerae que de hecho ya contienen al profago CTX<|> integrado (Guidolin y Manning, 1985).
La búsqueda de posibles mecanismos alternativos de transmisión horizontal de los genes que
codifican la toxina colérica tiene una gran importancia para el desarrollo de variantes de vacunas
vivas que estén protegidas contra la readquisición de dichos genes en el ambiente. Igualmente
posee un gran interés científico para comprender como pueden surgir nuevas variantes
toxigénicas de V. cholerae. Hasta 1992 todas las epidemias de cólera registradas históricamente
habían sido ocasionadas por el serogrupo 01 de V. cholerae pero desde la segunda mitad de
1992 se han producido epidemias en el subcontinente indio ocasionadas por el nuevo serogrupo
toxigénico 0139 (Ramamurthy y cois., 1993, Ramamurthy y cois., 2003). Las personas que
habían contraído el cólera producido por el serogrupo 01 y que normalmente debían ser inmunes
a la enfermedad volvían a contraer cólera al contagiarse con el nuevo serogrupo epidémico. Esto
indicó que no existe inmunidad cruzada entre los serogrupos 01 y 0139 por lo que el desarrollo
de una vacuna efectiva contra un serogrupo determinado puede ser inútil contra un nuevo
serogrupo emergente.
Se piensa que algún mecanismo de transferencia genética horizontal pudo haber operado en el
surgimiento del serogrupo epidémico 0139 (Comstock y cois., 1995; Jouravleva y cois., 1998a).
Los bacteriófagos son vehículos por excelencia para el transporte de material genético entre
bacterias, ya que su propia existencia está condicionada a la transferencia de sus genomas de
una célula hospedera a otra. El papel que juegan los fagos en los procesos de transferencia
genética horizontal es cada vez más reconocido y existe un interés cada vez mayor en el estudio
de las interacciones entre fagos que conllevan al surgimiento de bacterias patógenas (Boyd y
cois., 2001). Se calcula que el total de bacteriófagos en la naturaleza es al menos diez veces
mayor que el número total de especies bacterianas existentes, que ya de por sí es inmenso
(Rohwer, 2003). Esto hace suponer que la diversidad de mecanismos de transferencia genética
horizontal e interacciones entre fagos pudiera ser mayor de lo que podemos imaginar.
Tomando en consideración estos antecedentes, la hipótesis de este trabajo fue la siguiente:
“Existen bacteriófagos de V. cholerae capaces de transmitir horizontalmente los genes que
codifican la toxina del cólera mediante un mecanismo específico diferente del modelo clásico
aceptado”.
A partir de esta hipótesis nos propusimos como objetivo general aislar al menos un fago de V. cholerae no descrito anteriormente capaz de transmitir horizontalmente los genes que
codifican la toxina del cólera y determinar el mecanismo de transmisión de dichos genes.
Derivadas de este objetivo general se trazaron las siguientes tareas:
• Aislamiento y caracterización molecular de un nuevo fago de V. cholerae.• Evaluación de la capacidad integrativa del fago e identificación del sitio de integración en el
Capítulo 1 Introducción
5
cromosoma bacteriano.
• Evaluación de la capacidad del fago para transmitir los genes de la toxina colérica y
determinación del mecanismo de transmisión de dichos genes.
• Evaluación de la capacidad de tal mecanismo para revertir a la virulencia a cepas vacunales
de V. cholerae.• Obtención de una nueva generación de candidatos vacunales de V. cholerae, imposibilitados
de readquirir los genes de la toxina colérica, mediante mutación del gen que codifica la
subunidad proteica principal del receptor del fago y evaluación de las características generales
de dichos mutantes.
Los resultados que se presentan en esta tesis presentan novedad científica no solo para Cuba
sino también para el resto de la comunidad científica internacional puesto que describen un
mecanismo de transmisión horizontal de los genes de la toxina colérica diferente del mecanismo
clásico mediado por el fago CTX<j). Este nuevo mecanismo es eficiente y altamente específico
y es mediado por el bacteriófago filamentoso VGJ<j), el cual se describe y caracteriza por
primera vez en este trabajo. Estos resultados tienen importancia teórica puesto que describen
un nuevo mecanismo de transducción especializada no informado anteriormente, el cual parece
ser un mecanismo general entre los fagos filamentosos. Dicho mecanismo contribuye a
comprender como los fagos pueden interactuar entre sí y transferir información genética entre
células bacterianas. Como consecuencia se propone un nuevo modelo evolutivo que trata de
explicar como pudieran surgir nuevas variantes patogénicas de V. cholerae. También se
describen aspectos novedosos de la biología molecular del fago VGJ<t> que son fácilmente
extrapolables a otros fagos filamentosos descritos y posiblemente a otros aún por describir.
Además, estos hallazgos tienen una gran importancia práctica en el desarrollo de nuevas
vacunas vivas atenuadas de V. cholerae con características mejoradas de seguridad ambiental,
lo cual se muestra en la tesis mediante la construcción de una nueva generación de candidatos
vacunales imposibilitados de readquirir los genes de la toxina del cólera por el nuevo mecanismo
aquí descrito.
La tesis está estructurada en seis capítulos: Introducción, Revisión Bibliográfica, Materiales y
Métodos, Resultados, Discusión y Conclusiones y Recomendaciones. Además, se incluyen una
Síntesis, las Referencias Bibliográficas, la Autobibliografía relacionada con el tema de la tesis y
cuatro Anexos. En el desarrollo de la tesis se exponen 12 tablas, 38 figuras y se citan 199
referencias bibliográficas consultadas.
Los resultados de esta tesis han sido presentados en varios eventos nacionales e internacionales,
entre los que se destacan la 38 Edición del Evento Conjunto EU-Japón Sobre el Cólera y Otras Infecciones Entéricas Relacionadas (Oct. 2003, Washington D.C., EE.UU.) y el Congreso Biotecnología Habana 2003 (Die. 2003, La Habana, Cuba). Además, estos resultados condujeron
a la presentación de una patente y han sido publicados en la Revista CENIC (un artículo) y en
Capítulo 1 Introducción
6
la revista de alto factor de impacto Journal of Bacteriology (dos artículos). Este estudio también
ha contribuido a la formación de nuevos profesionales lo que se refleja en la defensa exitosa de
tres tesis de diploma de estudiantes de la Facultad de Biología de la Universidad de la Habana
que incluyeron resultados parciales obtenidos en este trabajo. Este estudio recibió el Premio al
Trabajo de Mayor Trascendencia y Originalidad a nivel de CNIC (está optando por el mismo
premio a nivel del MES) y el Premio a la Creatividad Científica en la XI Exposición Forjadores
del Futuro. Algunos de estos resultados avalaron la nominación del Departamento de Genética
del CNIC como Colectivo Forjadores del Futuro (2002).
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Cólera y Vibrio cholerae
El cólera es un síndrome clínico epidémico causado por la bacteria Vibrio cholerae, usualmente de
los serogrupos 01 y 0139 (Kaper y cois., 1995). Este enteropatógeno fue descrito por primera
vez en 1854 en Italia por Pacini, quien lo nombró Vibrio cholera, pero su descubrimiento
permaneció opacado por el trabajo de Robert Koch, que estudió el cólera en Egipto y demostró
en 1883 que el síndrome era causado por esta bacteria en forma de coma (Kaper y cois., 1995).
Koch nombró a la bacteria Vibrio comma, término que se usó varias décadas hasta que se
reconoció el trabajo pionero de Pacini y el nombre fue cambiado al actual Vibrio cholerae (Kaper
y cois., 1995). Esta enfermedad se transmite por vía fecal-oral y en su forma severa, el cólera
gravis, se caracteriza por la presencia de diarreas abundantes con apariencia de "agua de arroz”
que pueden provocar la deshidratación del paciente en pocas horas. Sin un tratamiento adecuado
puede sobrevenir un shock hipovolémico, acidosis y la muerte (Kaper y cois., 1995). El cólera es
endémico de la parte sur de Asia, África y Latinoamérica, donde la extrema pobreza y las pésimas
condiciones sanitarias favorecen la ocurrencia de epidemias de muy rápida expansión (Faruque y
cois., 1998a).
La infección con V. cholerae comienza con la ingestión de agua y/o alimentos contaminados que
ayudan a neutralizar la barrera ácida del estómago. Una vez en el intestino delgado la bacteria
coloniza el lugar y secreta la toxina del cólera, una potente enterotoxina responsable de la
mayoría de los síntomas clínicos de la enfermedad (Kaper y cois., 1995; Faruque y cois., 1998a).
Una característica epidemiológica del cólera es que muestra un patrón de aparición estacional en
áreas endémicas y en forma de epidemias explosivas que surgen en varios lugares a la vez, lo
que indica que factores ambientales pueden desencadenar el proceso epidémico (Kaper y cois.,
1995; Faruque y cois., 1998a). Sin embargo, muchos aspectos de la enfermedad y del agente
causal permanecen desconocidos, particularmente su ecología, sus reservónos interepidémicos,
el papel de la toxina del cólera y de otros factores de virulencia en la selección natural y la posible
asociación ecológica del patógeno con el ambiente acuático, así como con el hospedero humano
(Faruque y cois., 1998a).
Vibrio cholerae es una bacteria gramnegativa con forma de bacilo que mide de 0,5 a 0,8 ^m de
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
7
diámetro por 1,4 ^ma 2,6 |im de longitud, la cual no forma endosporas ni microquistes y posee
tanto metabolismo respiratorio como fermentativo (Kaper y cois., 1995). Puede crecer sin
grandes requerimientos nutricionales y lo hace preferiblemente a pH 7, aunque tolera condiciones
alcalinas hasta de pH 9,5, pero es extremadamente sensible a pHs ácidos lo que hace que la
mayoría de las células bacterianas no sobrevivan al pasar por el estómago (Kaper y cois., 1995).
El vibrión colérico posee un flagelo polar grueso envainado que le confiere alta movilidad y le
permite atravesar la capa de mucus del intestino y alcanzar los enterocitos (Kaper y cols., 1995).
2.2 Clasificación
Vibrio cholerae se clasifica dentro del género Vibrio de la familia Vibrionaceae de la clase
Vibrionales de la subdivisión Gamma de la división Proteobacteria (West y Colwell, 2003). Es una
especie bien definida sobre la base de pruebas bioquímicas y estudios de homología de ADN; sin
embargo, esta especie no es homogénea con respecto al potencial patogénico ya que existen
diferencias importantes dentro de la especie en cuanto a la producción de la toxina del cólera, al
serogrupo y al potencial epidémico (Kaper y cois., 1995; Faruque y cois., 1998a). De acuerdo a
la estructura del antigeno O del lipopolisacárido (LPS), V. cholerae se ha clasificado en, al menos,
155 serogrupos diferentes (Faruque y cois., 1998a). Hasta 1992, todas las cepas epidémicas
pertenecían al serogrupo 01, pero de ahí en adelante se sumaron las cepas del serogrupo 0139
(Ramamurthy y cois., 1993). Dentro del resto de los serogrupos solo se han reportado patógenos
ocasionales que no causan epidemias.
Teniendo en cuenta algunas propiedades bioquímicas, genéticas y fenotípicas, el serogrupo
epidémico 01 de V. cholerae se divide en dos biotipos: Clásico y El Tor. Estos a su vez se
encuentran separados en tres serotipos principales: Ogawa, Inaba e Hikojima, según los
antígenos A, B y C que forman parte del antígeno O del LPS (Kaper y cois., 1995). V. cholerae del
serogrupo 01 y biotipo El Tor es el causante principal de la pandemia actual de cólera (la séptima)
que comenzó en el año 1961. En la segunda mitad de 1992 surgió en la India un nuevo serogrupo
epidémico, el 0139, cuya capacidad para generar epidemias explosivas llevó a pensar a los
investigadores que podía ser el causante de la octava pandemia de cólera (Ramamurthy y cois.,
1993; Kaper y cois., 1995). Sin embargo, este serogrupo ha coexistido desde entonces con el
serogrupo 01, aunque se han desplazado uno al otro en varias ocasiones en diversas regiones del
subcontinente Indio (Faruque y cois., 1997; Ramamurthy y cois., 2003).
8
____________
Revisión bibliográfica Capítulo 2
2.3 El elemento CTX como casete de virulencia: perspectiva clásica
Los genes ctxAB que codifican la toxina del cólera y varios genes adyacentes (cep, ace y zot) que
han sido asociados de algún modo con el proceso patogénico del cólera, se encuentran reunidos
en una zona del genoma de V. cholerae denominada casete de virulencia o elemento CTX (Pearson
y cois., 1993). Estos genes se encuentran flanqueados por uno o ambos lados por secuencias
repetidas directas o RS (por sus siglas en Inglés, repetitive sequences) que marcan los límites del
elemento CTX con el resto del cromosoma. Estas secuencias pueden ser del tipo RS1 (de 2,7 kb,
presentes sólo en las cepas El Tor y 0139) ó RS2 (2,4 kb), que se diferencian entre sí sólo por la
presencia de un gen adicional en el elemento RS1 (Pearson y cois., 1993). El elemento CTX se
puede encontrar formando diferentes arreglos en el genoma,
así, en las cepas clásicas generalmente se encuentran dos copias de este elemento, una en cada
cromosoma de la bacteria, mientras que en las cepas El Tor se encuentran una o varias copias
repetidas en tándem en el cromosoma I de la bacteria (Mekalanos, 1983; Davis y Waldor, 2003).
2.4 Factores asociados a la virulencia dentro del elemento CTX
Varias proteínas codificadas por genes que se encuentran dentro del elemento CTX, además de
la toxina colérica, han sido involucradas con el proceso de patogénesis molecular del cólera. Sin
embargo, dilucidar la contribución real de estas proteínas a la virulencia es muy difícil ya que los
efectos de la toxina colérica pueden enmascarar efectos menores causados por estos otros
factores.
2.4.1 La toxina del cólera. El determinante principal de virulencia de V. cholerae es la toxina del
cólera (Kaper y cois., 1995; Faruque y cois., 1998a). Esta es la causante de las diarreas severas
que se producen durante la enfermedad y que conducen a una rápida deshidratación del enfermo.
La toxina es una proteína oligomérica formada por una subunidad A (CTA, 27,2 kDa) y cinco
subunidades B (CTB, 11,6 kDa). Estas últimas forman una estructura pentagonal con un orificio
central donde queda insertada una larga a-hélice de la subunidad A. El pentámero de CTB es el
que se une al receptor de la toxina, mientras que la subunidad CTA es la porción enzimàticamente
activa (Kaper y cois., 1995; Sears y Kaper, 1996). El anillo pentaméríco de subunidades B
muestra una alta afinidad por el gangliósído GM1, presente en la superficie de los enterocitos, lo
que le permite unir la holotoxína a estas células. Una vez que la holotoxina se une al gangliósido
GM1, la subunidad A es translocada a través de la membrana de la célula epitelial (Kaper y cois.,
1995; Sears y Kaper, 1996) y posteriormente cataliza la transferencia de ADP ribosa desde el
nucleótido de adenina y nícotinamida (NAD) a un residuo específico de arginina de la subunidad
a de la proteina G estimuladora (Gsa), lo cual conduce a una inhibición de la actividad GTP
hidrolasa de la subunidad Gsa. De esta forma la adenilato ciclasa se activa permanentemente, lo
que trae consigo un incremento de los niveles intracelulares de AMP cíclico (AMPC) (Sears y Kaper,
1996). El aumento de AMPC provoca la activación de proteínas quinasas dependientes de AMPC,
lo que conlleva a la fosforilación de determinadas proteínas que afectan el transporte de iones
(Sears y Kaper, 1996). El efecto neto es un aumento de la secreción de cloruro y una inhibición
de la absorción de sodio. El desbalance electrolítico produce una pérdida de agua de los tejidos
hacia el lumen intestinal y la consecuente producción de la diarrea característica del cólera (Sears
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
9
y Kaper, 1996).
2.4.2 La proteina Cep. La proteína Cep (por sus siglas en Inglés, core encoded pilus) fue descrita
¡nicialmente como una fimbria debido a la homología que presenta con la proteína mayoritaria de
un pilus flexible de Aeromonas hydrophila (Pearson y cois., 1993). La delecion del locus cep redujo
de 13 a 21 veces la eficiencia de colonizacion intestinal en ratones neonatos (Pearson y cois.,
1993); sin embargo, este efecto no ha sido observado en humanos (Tacket y cois., 1993).
2.4.3 La proteina Zot. La proteína Zot (zonula ocludens toxin) fue descrita por Fasano y cois.,
quienes informaron que V. cholerae producía una toxina que incrementaba la permeabilidad de la
mucosa del intestino delgado afectando la estructura de las uniones estrechas intercelulares o
zonula ocludens (Fasano y cois., 1991; Fasano y cois., 1995).
2.4.4 La proteina Ace. Inmediatamente cuesta arriba del gen zot se encuentra el gen ace, que
codifica la proteína Ace (accessory cholera toxin enterotoxin), que incrementa la corriente de
corto circuito a través de la mucosa intestinal en cámaras de Ussing (Trucksis y cois., 1993). Al
igual que la toxina del cólera y a diferencia de Zot, esta toxina incrementa la diferencia de
potencial en lugar de la conductividad del tejido, lo que sugiere que afecta el intercambio iónico
a través de la membrana y no las uniones intercelulares como lo hace Zot (Trucksis y cois., 1993).
A pesar de estos y otros hallazgos en cuanto al mecanismo de acción de Zot y Ace, el papel que
juegan estas toxinas en el proceso de patogénesis del cólera no ha sido bien dilucidado (Baudry
y cois., 1992; Trucksis y cois., 1993).
2.5 Factores asociados a la virulencia fuera del elemento CTX
La patogénesis del cólera es un proceso complejo en el que intervienen diversos factores que
ayudan al vibrión colérico a establecerse y colonizar el epitelio del intestino delgado humano.
Aunque la toxina del cólera es la responsable directa de la mayoría de los síntomas clínicos de la
enfermedad, la patogénesis involucra la acción sinèrgica de muchas otras proteínas, tales como
factores de colonización, otras toxinas y reguladores de la expresión gènica (Kaper y cois., 1995).
2.5.1 Fimbrias tipo 4. Las fimbrias o pili del tipo 4 son fibras proteicas de 6-7 nm de diámetro,
que se encuentran en la superficie de muchas bacterias gramnegativas y pueden funcionar
como factores de colonización, receptores de bacteriófagos, mediadores de transferencia
horizontal de información genética y en la formación de biopelículas (Marsh y Taylor,
1999). El ensamblaje y la secreción de las fimbrias del tipo 4 requieren de la expresión
coordinada de numerosos productos génicos (Hobbs y Mattick, 1993). Las fimbrias del tipo
4 se clasifican en fimbrias tipo 4a y 4b de acuerdo con la secuencia aminoacídica del
segmento amino terminal de las subunidades proteicas mayoritarias o pilinas que
componen estos pili (Marsh y Taylor, 1999). Los monómeros de pilina son sintetizados
como precursores o prepilinas que presentan un péptido líder hidrofílico de longitud
variable que es procesado en un sitio de corte consenso por una prepilina-peptidasa
durante la secreción del pilus (Marsh y Taylor, 1999). La subunidad de la prepilina del tipo
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
10
4a presenta una secuencia líder corta (5-6 aminoácidos), que después del procesamiento
resulta en la pilina madura con una fenilalanina metilada en el extremo N-terminal, mientras
que en la prepilina del tipo 4b el péptido líder suele ser más largo que el de la subclase 4a y el
aminoácido N-termínal de la pilina madura es variable (metionina, leucina o triptófano) (Taylor
y cois., 1987; Girón y cois., 1994). La organización genética de los loci involucrados en la
biogénesis de las fimbrias del tipo 4 tiende a variar de acuerdo a las subclases. Los genes que
codifican las proteínas requeridas en la síntesis y secreción de las fimbrias del tipo 4b se
organizan por lo general como un simple operón asociado con un plásmído o una isla
patogénica, mientras que los genes que codifican las proteínas que realizan esas funciones en
las fimbrias del tipo 4a generalmente se encuentran dispersos en el genoma bacteriano (Girón
y cols., 1997).
El pilus corregulado con la toxina. Los serogrupos toxigénicos de V. cholerae (01 y 0139) expresan
las dos subclases de fimbrias tipo 4. El pilus corregulado con la toxina (TCP), un miembro de la
subclase de fimbrias 4b, es el factor de colonización más importante de V. cholerae (Taylor y
cois., 1986), además de servir como receptor del fago CTX<|> (Waldor y Mekalanos, 1996). En
V. cholerae, los principales genes de virulencia conocidos se encuentran contenidos en
agrupaciones de genes -en Inglés clusters- (Ogierman y cois., 1993; Pearson y cois., 1993;
Trucksis y cois., 1993; Harkey y cois., 1994). La agrupación de genes que codifica TCP se
encuentra dentro de la isla patogénica TCP o isla patogénica del vibrión (VPI -Vibrio Pathogenicity Island-) (Kovach y cois., 1996; Karaolis y cois., 1998). VPI muestra muchas características
similares a otras islas patogénicas de otras especies de bacterias patógenas, como la presencia
de genes asociados a la virulencia, un gen que codifica una transposasa, sitios att flanqueantes
y un gen que codifica una integrasa homologa a otras integrasas de fagos, así, VPI parece tener
su origen en un fago que ahora parece ser defectivo (Karaolis y cois., 1998).
La biogénesis del pilus TCP requiere de múltiples genes; al menos 15 marcos de lectura abiertos
(ORFs -open reading frames-) se encuentran en la agrupación de genes tcp adyacentes al gen
tcpA que codifica la pilina principal de TCP (Ogierman y cois., 1993) (Fig. 1). El papel crucial de
TCP en la colonización ha sido ampliamente demostrado tanto en modelos animales como en
voluntarios humanos (Herríngton y cois., 1988; Tacket y cois., 1998).
La hemaglutinina sensible a mañosa. La hemaglutinína sensible a mañosa (MSHA, del Inglés,
marinóse sensitive hemagglutinine) es una fimbria del tipo 4 que fue inicialmente identificada como
una hemaglutinina asociada a la célula, que le confiere a V. cholerae la capacidad de hemaglutinar
eritrocitos de diferentes especies (Hanne y Finkelstein, 1982). Aunque el gen que codifica la
subunidad principal de la pilina, mshA, se encuentra presente en
Revisión bibliografía Capítulo 2
11
la generalidad de las cepas toxigénicas de V. cholerae, se piensa que las cepas del biotipo clásico
no expresan MSHA en la superficie debido a la incapacidad que muestran las mismas para
hemaglutinar eritrocitos de pollo (Hanne y Finkelstein RA, 1982). MSHA, fimbria del tipo 4a, no
es requerida por V. cholerae para la colonización del intestino delgado humano ni del ratón
neonato y no parece ser importante para la generación de una respuesta inmune protectora
(Attridge y cols., 1996; Thelin y Taylor, 1996; Tacket y cois., 1998). Sin embargo, MSHA ha sido
involucrada en la formación de biopelículas (biofilms) sobre superficies bióticas y abióticas, lo
cual pudiera ser importante para la supervivencia de V. cholerae en sus reservónos ambientales
(Watnick y Kolter, 1999; Watnick y cois., 1999, Chiavelli y cois., 2001). La formación de
biopelículas constituye un mecanismo de supervivencia de muchas bacterias
Figura 1. Representación esquemática de la isla patogénica VPI. Las zonas representadas en gris corresponden al ADN cromosomal flanqueante, las regiones en negro corresponden a las secuencias att que delimitan la isla patogénica, el ORF rayadorepresenta un gen defectivo de una transposasa. Los números 1, 2, 3 y 4 representan los ORFs de igual número. Se muestran algunos genes de VPI como aldA, tagA, tcpl(l), tcpA(A), toxT, e int. El clusterTCP codifica la fimbria TCP y dentro de este el gen tcpAcodifica la pilina principal. El cluster ACF codifica un factor de colonización accesorio.Dentro de este cluster el gen acfD codifica una lipoproteína y el gen int codifica unaintegrasa. Tomado de Karaolis y cois. (1998), modificado por el autor.
patógenas, protegiéndolas de algunos componentes tóxicos para ellas y de otras condiciones
adversas como la escasez de nutrientes (Watnick y Kolter, 1999; Watnick y cois., 1999; Chiavelli
y cois., 2001). La biopelícula es una estructura tridimensional formada por aglomerados de
bacterias atravesados por canales de agua que permiten la entrada de nutrientes a las células
asociadas y la salida de metabolitos tóxicos (Watnick y Kolter, 1999). En el medio acuático existen
diversas superficies adecuadas para formar biopelículas, como las suministradas por el
zooplancton y el fitoplancton. La quitina, por ejemplo, es un importante
compuesto del exoesqueleto de especies planctónicas y constituye una superficie nutritiva para
V. cholerae, puesto que este es capaz de metabolizarla. (Watnick y Kolter, 1999). Estudios
realizados con mutantes de MSHA demostraron que las cepas 0139 utilizan
solamente como factor de adherencia al exoesqueleto quitinoso a la fimbria MSHA. A su vez,
cepas 01 del biotipo clásico utilizan otro factor de adherencia desconocido diferente de MSHA,
mientras que cepas del biotipo El Tor utilizan una combinación de la fimbria MSHA junto a otro
factor de adherencia desconocido (Chiavelli y cois., 2001). MSHA también actúa como receptor
del fago 493 (Jouravleva y cois., 1998b) y se ha sugerido que también sirve como receptor de
los fagos fs1 y fs2, aunque esto no ha sido completamente demostrado (Ehara y
cois., 1997).
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
12
Los genes requeridos para el ensamblaje y la secreción del pelo MSHA están localizados en una
región de 16,7 kb del cromosoma de V. cholerae que consta de 16 genes continuos orientados en
la misma dirección (genes msh) (Fig. 2). Esta región se encuentra flanqueada por repeticiones
directas de una secuencia de 7 pb (Marsh y Taylor, 1999). Aunque MSHA es una fimbria del tipo
4a, su organización génica se parece más a la de las fimbrias del tipo 4b ya que los genes que la
codifican están todos reunidos en una única agrupación (Marsh y Taylor, 1999). Se ha
demostrado que se requieren dos promotores para conducir la expresión de los genes de MSHA,
lo que indica que estos están transcripcionalmente organizados en dos operones: uno codifica los
componentes secretores y el otro codifica los componentes estructurales de la fimbria MSHA (Fig.
2) (Marsh y Taylor, 1999). Delimitando la región 5'del locus MSHA se encuentran tres genes
adyacentes (yhdA, ssb, uvrA) (Fig. 2). Cuesta abajo de mshQ, en la frontera de la región 3' se
localiza el gen mreB. Estos genes, que no intervienen en la biogénesis de MSHA y que se
encuentran interrumpidos por el locus MSHA en V. choierae, se encuentran juntos en el
cromosoma de E. coli (Fig 2) (Marsh y Taylor, 1999). Esto y el hecho de que el locus MSHA se
encuentra flanqueado por repeticiones directas, sugieren que este grupo de genes pudo ser
adquirido por transferencia genética horizontal (Marsh y Taylor, 1999).
Figura 2. Representación esquemática del locus MSHA. Las flechas representan lospromotores que rigen la transcripción de los dos operones involucrados en la biogénesis de la fimbria MSHA y se muestran las repeticiones directas que flanquean el locus. También se representan los genes flanqueantes del locus (yhdA, ssb, uvrAy mreB). Tomado de Marsh y Taylor (1999), modificado por el autor.
2.5.2 El factor de colonización accesorio. Además de la agrupación tcp, VPI contiene la
agrupación acf (Fig. 1) que codifica ACF (accesory colonization factor), un factor al que se
le ha adjudicado un rol accesorio en la colonización. Aunque acfD, uno de los cuatro genes
de la agrupación acfABCD codifica una lipoproteína que pudiera estar involucrada en la
colonización del intestino humano por la bacteria, el papel real de este factor no está claro
(Parsot y cols., 1991; Parsot y Mekalanos, 1992).
2.5.3 La hemaglutinina proteasa soluble.
La hemaglutinina proteasa soluble (HA/proteasa) de V. cholerae no parece ser un factor de colonización, sino una metaloproteasa dependiente de zinc que introduce cortes en diferentes proteínas como la toxina del cólera, fibronectina, mucina y lactoferrina (Finkelstein y cois., 1983). Esta enzima es producida por los dos biotipos
13
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
del serotipo 01, pero las cepas del biotipo El Tor producen mayores niveles de HA/proteasa que
las del biotipo clásico (Svennerholm y cois., 1983; Dubey y cois., 1990). El gen que codifica la
HA/proteasa (hap) ha sido clonado y la secuencia aminoacídica predicha de la proteína, de 46,7
kDa, muestra un 61,5% de homología con la elastasa de Pseudomonas aeruginosa (Hase y
Finkelstein, 1991). A la HA/proteasa se le ha asignado una actividad “separasa" (en Inglés,
detachase) la cual permite a los vibriones separarse de células intestinales humanas en cultivo
(Finkelstein y cois., 1992). La importancia de esta actividad no se conoce pero presumiblemente
ayuda al vibrión a diseminarse al medio ambiente después de haber colonizado el intestino
humano (Finkelstein y cois., 1992).
2.5.4 La hemolisina/citolisina. La hemolisina fue inicialmente purificada por Honda y Finkelstein,
quienes demostraron que esta tenía actividad citolítica sobre eritrocitos de diversas
especies y células de mamíferos en cultivo, y que tenía un efecto letal sobre ratones (Honda
y Finkelstein, 1979). El gen de la hemolisina (hlyA) ha sido encontrado en V. cholerae no
01 y en ambos biotipos del serogrupo 01 (Manning y cois., 1984), sin embargo, las cepas
clásicas no producen la actividad hemolítica. En una de estas cepas (569B) se encontró
una deleción interna de 11 nucleótidos en el gen hlyA (Alm y cois., 1988). Una sonda
marcada consistente en estas 11 bases hibridó con todas las cepas El Tor analizadas, pero
con ninguna de las clásicas lo cual explica la falta de actividad hemolítica en estas cepas
(Alm y Manning, 1990).
2.5.5 Proteínas de membrana externa. Numerosas proteínas de membrana externa (OMP, outer membrane proteirí) de V. cholerae se han identificado y los genes que codifican muchas de
estas han sido clonados. Sobre IrgA, una OMP de 77 kDa cuya expresión es regulada por
concentración de hierro, se pensó que jugaba un papel importante en la virulencia, pues
una cepa de V. cholerae 01 específicamente mutada en el gen irgA mostró un incremento
en su dosis letal media (LD50) de 100 veces y un descenso en la eficiencia de colonización
de 10 veces comparada con su parental en ratones (Goldberg y cois., 1990). Sin embargo
estudios más recientes con nuevos mutantes de este gen no mostraron una alteración de
la LD50 ni de la colonización, por lo tanto, el papel de IrgA en el proceso de patogénesis es
cuestionable (Mey y cois., 2002) Las proteínas, OmpT (40 kDa) y OmpU (38 kDa) se
encuentran bajo el control directo de ToxR (Miller y Mekalanos, 1988) un regulador
importante de muchos genes relacionados con la virulencia en V. cholerae (ver epígrafe
2.6). Recientemente fue demostrado que un balance correcto de estas porinas es
importante para la virulencia, pues cepas de V. cholerae manipuladas genéticamente para
que expresaran OmpT en lugar de OmpU mostraron una mayor sensibilidad a las sales
biliares, una disminución en la expresión de la toxina del cólera y TCP y una reducción de
100 veces en la capacidad de colonización del intestino delgado en el modelo del ratón lactante. (Provenzano y Klose, 2000; Provenzano
y cois., 2000).
Los dos biotipos del serogrupo 01 de V. cholerae producen la hemaglutinina resistente a mañosa
y fucosa (MFRHA), una proteína asociada a la membrana externa de la célula que no es inhibida
Capítulo 2 Revisión
bibliográfica
14
por mañosa, fucosa u otros azúcares. El gen que codifica esta hemaglutinina fue inicialmente
clonado por Franzon y Manníng (1986) y consta de 693 pb que predicen una proteína de 26,9
kDa (Franzon y cois., 1993). Una cepa isogénica mutada en este gen mostró un aumento marcado
de la LD50, así como una disminución en la eficiencia de colonización de 500 a 1 300 veces
comparada con la de la cepa tipo salvaje en el modelo del ratón lactante (Franzon y cois., 1993).
La naturaleza exacta de MFRHA no se conoce, pero se ha sugerido que esta es una OMP catiónica
que es mantenida en la superficie celular por interacciones de carga con el LPS (Franzon y cois.,
1993).
2.5.6 El flagelo. Los vibriones son móviles en virtud de un único flagelo polar envainado que
poseen. La mayoría de los estudios al respecto han mostrado que la movilidad es un
aspecto importante para la virulencia. Freter y cois, demostraron que los vibrios móviles
se dirigen hacia la superficie mucosa en respuesta a quimiotaxinas (Freter y Jones, 1976;
Freter y cois., 1981; Freter y O'Brien, 1981). Tanto in vitro como en diversos modelos
anímales se ha demostrado que los vibrios móviles atraviesan rápidamente la capa de
mucus de los enterocitos (Jones y Freter, 1976; Schrank y Verwey, 1976; Freter y O'Brien
PC, 1981). Se ha propuesto que el flagelo en sí puede contribuir a la adhesión de los vibrios
al intestino, sin embargo la mayoría de los estudios han concluido que la movilidad es
claramente un factor contribuyente a la patogénesis y colonización y que la estructura del
flagelo en sí misma es menos importante (Richardson, 1991).
2.5.7 El lipopolisacárido de superficie. El papel del lipopolisacárido de superficie (LPS) debe ser
crucial en la virulencia puesto que se conocen más de 155 serogrupos diferentes de V. cholerae en cuanto al LPS y solo dos de ellos (OI y 0139) están presentes en las cepas
epidémicas de este patógeno, sin embargo la función en la virulencia de este factor es
relativamente poco conocida. Se han obtenidos resultados experimentales que sugieren
que el LPS en los vibrios OI está involucrado en la adherencia de la bacteria a la mucosa
intestinal (Freter y Jones, 1976; Chitnis y cois., 1982). Mutantes de V. cholerae en los
genes rfb, los cuales son defectivos en la biosíntesis del antígeno O del LPS se mostraron
severamente atenuados cuando la LD50 se analizó en el modelo del ratón lactante y fueron
además incapaces de ensamblar correctamente el pilus TCP (Iredell y cols., 1998).
2.5.8 Sistemas de secreción. Casi todos los factores de virulencia bacterianos se localizan en la
superficie bacteriana o son secretados. Los sistemas de secreción son esenciales para la patogénesis bacteriana puesto que permiten la liberación de diversos factores de virulencia extracelulares. La exportación de estos factores usualmente depende de cuatro tipos diferentes de sistemas de secreción (del tipo I al tipo IV) que transportan macromoléculas a través de las
15
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
membranas interna y externa de la bacteria (Finlay y Falkow, 1997). V. cholerae utiliza el sistema
de secreción tipo II Eps para secretar diversos factores de virulencia, tales como la HA/proteasa,
la quitinasa y la toxina del cólera (Sandkvist, 2001). El hallazgo de que la subunidad B de la toxina
colérica puede ser secretada por la mayoría de las especies de vibriones sugiere que el sistema
Eps es común a toda la familia Vibrionaceae (Sandkvist, 2001). La mayoría de las especies de
esta familia no son patógenos humanos, por tanto, es probable que los vibriones utilicen el
aparato secretor Eps fundamentalmente para exportar proteínas comunes a toda la familia,
posiblemente proteasas y quitinasas. Esto hace pensar que el sistema Eps no evolucionó con el
propósito de secretar la toxina colérica, sino que por el contrario esta evolucionó de tal manera
que es reconocida y secretada eficientemente por esta maquinaria (Sandkvist, 2001).
2.6 Regulación de la virulencia
Existen múltiples sistemas de regulación de la expresión de los genes asociados a la virulencia en
V. cholerae. La expresión de diversos factores cruciales de virulencia en este patógeno está
regulada coordinadamente de modo que múltiples genes responden del mismo modo a
condiciones ambientales determinadas (DiRita y cois., 1991; Skorupski y Taylor, 1999). La
expresión coordinada de los genes relacionados con la virulencia es controlada por sistemas de
cascadas reguladoras como el reguión ToxR, sistema que regula la expresión de gran cantidad de
genes entre los que se encuentran los que codifican el factor de colonización TCP y la toxina del
cólera (DiRita y cois., 1991; Skorupski y Taylor, 1997; Cotter y DiRita, 2000). ToxR, una proteína
transmembranosa de 32 kDa, es la cúspide de este reguión. Ella regula directamente la
transcripción de algunos genes del sistema o ejerce su función controladora a través de genes
reguladores secundarios que se encuentran también bajo su control (Fig. 3). Entre los genes
regulados directamente por ToxR se encuentran los que codifican las porinas OmpU y OmpT, las
cuales deben ser expresadas en una proporción adecuada durante el proceso de patogenia (Míller
y Mekalanos, 1984; Miller y cois., 1987; DiRita y cois., 1991; Provenzano y Klose, 2000). La
actividad de ToxR es amplificada por otra proteína transmembranosa de 19 kDa, ToxS, la cual
ayuda a ensamblar y estabiliza los dímeros de ToxR, la forma activa de esta proteína (Fig.3)
(DiRita, 1992; DiRita y cois., 1996). El operón toxRS es expresado constitutivamente bajo la
mayoría de las condiciones de cultivo (Hulbert y Taylor, 2002) y actúa cooperativamente con un
segundo par de proteínas, TcpP y TcpH, homologas a ToxR y ToxS, respectivamente, que se
piensa funcionen de un modo similar (Hase y Mekalanos, 1998). Los genes que codifican TcpP y
TcpH se encuentran en la isla
patogénica VPI y su expresión es influenciada por factores como la temperatura y el pH (Carroll
y cois., 1997). La transcripción del operón tcpPH depende de otros dos reguladores, AphA y
AphB, codificados fuera de VPI (Skorupski y Taylor, 1999; Kovacikova y Skorupski, 2001).
Capítulo 2 Revisión
bibliográfica
16
ToxRS y TcpPH actúan cooperativamente en la activación de un segundo regulador, ToxT,
codificado por VPI (DiRita y cois., 1991; Krukonis y cois., 2000; Yu y DiRita, 2002). ToxT activa
los operones tcp y ctxAB (Brown y Taylor, 1995; Champion y cois., 1997), así como otros genes
del reguión, tales como tcpl, acfA, tagA y tagD (DiRita y cois., 1991). ToxT regula su propia
expresión a través de un lazo autoregulatorio (Yu y DiRita, 1999). Por tanto, ToxT funciona
como un regulador coordinado de la expresión de genes de virulencia que se encuentran en la
isla patogénica VPI y en el elemento CTX mediante la activación de estos en respuesta a
factores ambientales. Además de la serie de activadores involucrados en esta cascada
reguladora, los reguladores globales CAP (cyclic AMP receptor protein) y H-NS tienen una
influencia negativa en la expresión de genes de virulencia del reguión ToxR (Skorupski y Taylor,
1997; Nye y cols., 2000). H-NS es una proteína abundante, normalmente involucrada en el
mantenimiento de la estructura cromosomal, la cual actúa sobre los promotores de los genes
ctxAB, toxT, tcpA (Nye y cols., 2000). ToxT contrarresta el efecto negativo de este regulador
actuando directamente en los promotores de estos genes (Nye y cols., 2000).
Figura 3. Esquema muy simplificado del reguión ToxR. ToxRS y TcpPH activan cooperativamente la expresión del regulador ToxT, el cual a su vez activa la expresión de factores importantes de virulencia como la toxina del cólera y el pilus TCP. Los genes que codifican el regulador ToxR, elpilus TCP y los reguladores TcpP y TcpH se encuentran dentro de la isla patogénica VPI. Tomado de Yu y DiRita (1999), modificado por el autor.
17
______________ Revisión biblioeráfim Capítulo 2 ____________ __________________________ _____________
La regulación coordinada de los genes de virulencia a través del reguión ToxR demuestra que los
microorganismos han desarrollado mecanismos muy eficientes para detectar señales ambientales
y responder adecuadamente a estas. Además del regulon ToxR existen otros sistemas de
regulación de la expresión génica como el sistema regulado por concentración de hierro (Mey y
cois., 2002), que no describiremos aquí, pero que en su conjunto permiten a V. cholerae optimizar
su supervivencia en ambientes tan diferentes como el intestino humano y los ecosistemas
acuáticos.
2.7 El elemento CTX como fago filamentoso CTX<|): nueva perspectiva
El elemento CTX fue visto históricamente como una región del cromosoma de \/. cholerae donde,
además de ctxAB, estaban reunidos diversos genes relacionados con la virulencia. Aunque la
organización de los genes en el elemento CTX sugirió la posibilidad de que en conjunto formaran
una entidad genética móvil, no fue hasta 1996 que Waldor y Mekalanos demostraron, con una
combinación elegante de genética clásica y molecular, que en realidad el elemento CTX era el
genoma de un fago filamentoso que se encuentra integrado en el cromosoma de las cepas
toxigénicas de V. cholerae, al cual denominaron CTX<J> (Waldor y Mekalanos, 1996). Este fago
es capaz de replicarse desde el cromosoma y producir partículas virales infectivas. Este hallazgo
hizo reconsiderar el concepto de elemento CTX o casete de virulencia desde otra perspectiva. Así,
los genes que codifican las toxinas Zot y Ace (ver epígrafe 2.4), ahora se les atribuye una doble
función al conocerse que son también genes del fago CTX<|> necesarios para el ensamblaje y la
estructura de este (Waldor y Mekalanos, 1996). Igualmente la proteína Cep, que se había descrito
como una pilina importante en la colonización es también la proteína principal de la cápsida de
CTX<|) (Waldor y Mekalanos, 1996). Esto hace reflexionar sobre si la función originalmente
asignada a estos genes es secundaria e incidental, o si los mismos han evolucionado en esas dos
direcciones que le confiere ventajas tanto al vibrión colérico como al fago CTX< ().
2.8 Características generales de los bacteriófagos filamentosos
Los fagos filamentosos pertenecen al género Inovirus de la familia Inoviridae. A diferencia de la
mayoría de los virus bacterianos descritos, que se ensamblan en el citoplasma y provocan lisis
celular para ser liberados, los bacteriófagos filamentosos no producen muerte celular por lisis del
hospedero. La célula hospedera se mantiene viable y los fagos son continuamente ensamblados
y secretados al mismo tiempo a nivel de la membrana mediante un proceso concertado (Russel,
1991; Russel y cois., 1997). Los fagos filamentosos infectan bacterias gramnegativas, aunque
recientemente se informó acerca de un fago filamentoso cuyo hospedero es la bacteria
grampositiva Propionibacterium freudenreichii (Marvin, 1998; Chopin y cols., 2002). Estos fagos
son túbulos proteicos flexibles de aproximadamente 0,8 a 2 ^m de
largo por 6 a 8 nm de diámetro cuyo genoma está constituido por ADN de cadena simple (ADNcs)
circular acomodado en el interior del túbulo (Marvin, 1998).
2.8.1 Estructura del virión. Los fagos filamentosos del grupo Ff (M13, fd y f1), que infectan a E.
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
18
coli, son los más estudiados hasta el momento y son tomados como modelo para la
caracterización morfológica y funcional de los fagos filamentosos en general. En estos
fagos la cubierta tubular consta de cinco proteínas diferentes (Fig. 4) (Marvin, 1998). La
proteína más abundante en la cubierta se denomina pVIII, una molécula de alrededor de
5 000 Da con aproximadamente 2 700 copias arregladas sobre la cadena simple de ADN.
De los estudios de cristalografía y espectroscopia ha sido posible deducir que pVIII tiene
una estructura secundaria de a hélice que va desde el extremo carboxilo terminal hasta
un residuo de prolina en la posición 6 del extremo amino terminal. La a hélice tiene una
inclinación de 20° respecto al eje del virus y se enrolla en una vuelta helicoidal dextrógira
con un paso de 16,5 A, donde cada subunidad se encuentra inclinada 72° con respecto al
plano horizontal y 33° al eje vertical. Esta disposición geométrica del virus se repite a
través de todo su eje de extremo a extremo (Fig. 5) (Marvin, 1998). Las cuatro proteínas
restantes (pVII, pIX, plll y pVI), se encuentran localizadas en ambos extremos del virión:
pVII y pIX representadas por tres a cinco copias en el extremo que sale primero de la
célula y plll y pVI, presentes también en tres a cinco copias en el extremo que sale último
(Fig. 4).
Las proteínas pVII y pIX tienen una masa molecular de 36 000 Dalton, son sintetizadas en forma
madura y poseen un segmento hidrofóbico a través del cual interactúan entre ellas y con pVIII.
En el extremo C-terminal tienen un número variable de aminoácidos cargados positivamente que
contribuyen a formar un complejo de iniciación al unirse al sitio de empaquetamiento o señal
morfogenética (SM) en el ADNcs del genoma del fago durante el proceso de iniciación del
ensamblaje. Diversos experimentos genéticos e inmunológicos han demostrado que pVII está
completamente oculta en la estructura del virión, mientras que pIX presenta el extremo N-
terminal expuesto al medio (Endemann y Model, 1995).
plll pVI pVIII pVII pIX ADN cadena simple Figura 4. Representación esquemática de la estructura de los fagos filamentosos del grupo Ff, donde se muestra la disposición de la proteína mayoritaria (pVIII) y las minoritarias (plll, pVI, pVII, pIX).
Revisión bibliográfica Capítulo 2
19
La proteína plll, también llamada proteína de adsorción, es la que interactua con el receptor y los
correceptores del fago. Experimentos realizados con plll sugieren que esta proteina está formada
por tres dominios: el dominio N1, cuya función consiste en la unión a correceptores importantes
para la internalización de la partícula viral en la célula hospedera; el dominio N2, responsable de
la interacción específica del fago con el receptor y el dominio C1 que interactúa directamente con
la proteína pVIII y pVI estabilizando la estructura y el cierre del túbulo proteico al final del
ensamblaje de la partícula viral (Stengele y cois., 1990; Lubkowski y cois., 1999; Karlsson y cois.,
2003). Estos dominios se encuentran separados por regiones de baja complejidad con función
espaciadora (Heilpern y Waldor, 2003). El aminoácido mayoritario en estas regiones puede variar
entre los distintos fagos filamentosos, encontrándose espaciadores ricos en glicina, como en plll
de M13, o en prolina como en plll de CTX<J> (Heilpern y Waldor, 2003).
Figura 5. Estructura de la cápsida de los fagos del grupo Ff. El eje del virión está representado de forma vertical, y el extremo N-terminal de cada subunidad se ubica hacia arriba. (A) Una subunidad vista como si hubiera sido extraída de la parte izquierda de (B). Los círculos oscuros representan los átomos cargados en los residuos aminoacídicos polares de los extremos amino y carboxilos terminales. El esqueleto proteico está representado por líneas que unen los átomos de Ca. Los átomos cargados positivamente cerca del C terminal forman la superficie interna de la cápsida, donde neutralizan las cargas negativas del ADN empaquetado en el interior (14). (B) Las subunidades ensambladas, cada una representada por un tubo helicoidal. El tramo axial mostrado comprende aproximadamente el 1% de la longitud del virión.
Tomado de Marvin (1998), modificado por el autor.
2.8.2 Organización genómica. El genoma de los fagos filamentosos del grupo Ff está constituido
por una molécula de ADNcs circular de alrededor de 6,4 kb. Este genoma contiene toda la
información necesaria para la síntesis de las 11 proteínas conocidas de los fagos Ff, las
cuales difieren en cuanto a la talla y al número de copias. La disposición de los genes
virales en el orden de la transcripción es: II^X^V-»VII->IX->VIII->III-A/I->I->XI->IV
(Fig. 6). Esta organización génica refleja una relación morfofuncional en la cual genes
relacionados funcionalmente se encuentran agrupados en bloques o módulos. Así, los
genes II, X y V, del módulo de replicación codifican proteínas necesarias para esta función;
los genes que codifican las proteínas de la cápsida, VII, IX, VIII, III y VI forman el módulo
estructural; mientras que los genes I, XI y el IV participan en la morfogénesis del fago y
forman el módulo de ensamblaje y secreción (Marvin, 1998). En diversos fagos
filamentosos se puede distinguir un cuarto módulo que no está presente en los fagos Ff, el
módulo de regulación,
Capítulo 2 Revisión
bibliográfica
20
que contiene genes que codifican represores transcripcionales que regulan la expresión de los
demás genes del fago. El único de estos represores que ha sido bien estudiado es la proteína
RstR de CTX<(), la cual regula la expresión del resto de los genes de este fago (Kimsey y
Waldor, 1998; Davis y cois., 2002).
Figura 6. Genoma de M13 donde se observa la organización de los genes por módulos funcionales: en negro, el módulo de la replicación; en gris, el módulo estructural y en blanco, los genes involucrados en el ensamblaje y la exportación de la partícula viral.
Entre los genes IV y II se encuentra una
región intergénica que contiene la SM y junto a ella, algunas estructuras en forma de horquilla
de gran importancia para la replicación. En el genoma de los fagos filamentosos existe otra
región intergénica entre los genes VIII y III, donde se localiza un terminador de la transcripción
rho-independiente, que es esencial para el mantenimiento del balance transcripcional entre
estos dos genes, cuyos productos se encuentran representados en cantidades bien diferentes
(La Fariña y Model, 1983). Excepto en estas dos regiones no codificantes, los diferentes genes
se encuentran separados por pocos nucleótidos. El gen IX utiliza algunos nucleótidos de los
genes vecinos VII y VIII, y lo mismo ocurre para los genes I y IV (Beck y Zink, 1981).
A partir de experimentos in vivo ha sido posible individualizar los promotores de los genes II,
X, V, VIII, III y IV. Los intentos de explicar el balance traduccional han conducido a diferentes
autores a proponer un mecanismo en cascada según el cual los genes bajo el dominio de mayor
número de promotores son transcriptos más activamente. Esta hipótesis viene avalada por el
hecho de que los genes III, VI y I tienen niveles transcripcionales comparables. Por otra parte
el gen VIII, aunque se encuentra junto a promotores de genes que se transcriben en menor
cantidad (genes V, VII y IX), presenta un promotor específico que mantiene elevado su nivel
transcripcional sin modificar la transcripción de los genes vecinos, debido a la presencia de un
terminador de la transcripción rho-independiente (La Fariña y Model, 1983).
2.8.3 Infección. El reconocimiento de la célula hospedera por el fago se realiza a través de la
interacción específica del dominio N2 de la proteína plll con el extremo de la fimbria sexual
Revisión bibliográfica Capítulo 2
21
F. Se piensa que por un mecanismo desconocido esta fimbria del tipo 4 se acorta por el
desensamblaje de sus subunidades y acerca al fago adherido en su extremo a la célula. Ya en la
superficie celular, plll interactúa con el complejo proteico TolQRA, a través del dominio KM que se
une directamente al dominio D3 de TolA (Fig. 7) (Click y Webster, 1997; Cllck y Webster, 1998;
Lubkowski y cois., 1999; Karlsson y cois., 2003).
Una vez que el fago es anclado a la membrana, la cubierta se desensambla al mismo tiempo que
el ADNcs es inyectado al citoplasma celular por mecanismos aún no muy bien dilucidados. Las
subunidades proteicas de la cubierta viral se insertan en la membrana citoplasmatica a medida
que se desensamblan y pueden ser reutilizadas en el ensamblaje de nuevas partículas virales
(Smilowitz y cois., 1972).
Citoplasma
Figura 7. Representación esquemática de los pasos iniciales de la infección. A) Unión del fago a la punta del pelo F. B) Unión del dominio N1 de plll con el dominio D3 de TolA. Ver más detalles en el texto. MC: membrana citoplasmática; ME: membrana externa. Tomado de Lubkowski y cois. (1999), modificado por el autor.
2.8.4 Replicación. Inmediatamente después de la inyección del genoma de ADNcs del fago
(cadena positiva) ocurre la síntesis de la cadena complementaria (cadena negativa) con la
participación de enzimas bacterianas. La holoenzima ARN polimerasa II unida a la subunidad
sígma 70 inicia la síntesis de un cebador de alrededor de 20 nucleótidos a partir de un sitio
único llamado origen de la cadena negativa que tiene una estructura similar a un promotor y
además presenta dos estructuras en forma de horquillas llamadas B y C (Higashitani y cois.,
1993; Higashitani y cois., 1996; Higashitani y cois., 1997). La síntesis del cebador comienza
en la horquilla C. A continuación la ADN polimerasa III comienza la síntesis de la cadena
negativa a partir del extremo 3 del cebador hasta que da una vuelta completa y alcanza
nuevamente el cebador por el extremo 5'. En este punto la ADN polimerasa I degrada el
cebador de ARN a la vez que termina la síntesis de la cadena negativa dando lugar a la forma
Penplasma
TolA
Citoplasma
Peri plasm a TolA
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
22
replicativa (FR) de ADN de cadena doble (ADNcd) del fago, que es recircularizado por la ligasa
de ADN bacteriana (Fig. 8A) (Higashitani y cols., 1996; Horiuchi, 1997; Higashitani y cols.,
1997).
Figura 8. Replicación del genoma de los fagos Ff. (A) Síntesis de la cadena (-) a partir de la cadena (+) inmediatamente después de la infección, lo cual origina la FR. (B) Síntesis de la cadena (+) mediante el mecanismo de círculo rodante. Tomado de Voet y Voet (2000) modificado por el autor.
Una vez que la FR está disponible comienza la replicación por el mecanismo del círculo rodante.
El producto del gen II (pll) reconoce un sitio específico en la región intergénica entre los genes
II y IV donde el ADN forma una horquilla, realiza un corte en la cadena positiva y junto con
enzimas del hospedero comienza la síntesis de ADN a partir del extremo 3' del corte (Horiuchi,
1997). De este modo se sintetiza una nueva cadena positiva que va desplazando a la cadena
vieja hasta completar un ciclo. En este punto pll, que se mantuvo unida al extremo 5' del corte
en la cadena positiva vieja, reconoce una señal de terminación, que no es más que la misma
horquilla donde comenzó la síntesis. Entonces pll cataliza una reacción de transesterificación
FR con el primosoma asociado
v ARN cebador
1. Replicaión de ADN por Pol I
2. Escisión del ARN y rellenado por Pol I
3. Sellado por ADN ligasa
4. Superenrrollamiento por ADN girasa
| ARN Polimerasa
,.A™Horqui
lla Cadena (+) ̂
O®
<¡> M13 K ADN de la
FR
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
23
que libera una molécula de ADNcs circular (la cadena positiva vieja) y la FR de ADNcd con la
nueva cadena positiva sintetizada (Fig. 8B) (Horiuchi, 1986; Horiuchi, 1997). Durante los
primeros 15 a 20 min de la infección las cadenas positivas que se van generando son convertidas
en la FR de ADNcd (Horiuchi, 1997). Cuando se acumulan entre 100 y 200 copias de la FR
(ADNcd), las nuevas cadenas positivas que se generan ya no son utilizadas para sintetizar más
FR, sino que se combinan con la proteína pV (proteina de unión a ADNcs) a razón de 1 500
copias de pV por cada molécula de ADNcs positiva (Stassen y cois., 1994). De la interacción de
pV con la cadena simple positiva de ADN (el genoma del fago) resulta una estructura filamentosa
de alrededor de 8 nm de diámetro y 800-900 nm de longitud. La unión de esta proteína al ADN
involucra interacciones hidrofóbicas y electrostáticas (Stassen y cois., 1994; Guan y cois.,
1995). Esta unión a la cadena positiva inhibe la síntesis de la cadena negativa. De esta forma
pV regula la concentración de FR presente en el interior de la bacteria a la vez que inhibe la
degradación del ADNcs por parte de las nucleasas bacterianas (Stassen y cols., 1994).
2.8.5 Ensamblaje y secreción. Todas las proteínas de la cubierta viral se integran en la
membrana citoplasmática antes de ser ensambladas en el virión, pero sus propiedades
de inserción son diferentes. La proteína mayoritaria pVIII se inserta en la membrana
citoplasmática con su dominio hidrofóbíco embebido en la bicapa lipídica, el dominio
amino terminal cargado negativamente hacia el periplasma celular y el carboxilo terminal
cargado positivamente hacia el citoplasma. Esta proteína se inserta en la membrana
independientemente de la maquinaria translocasa Sec y es sintetizada con un péptido
señal de 23 aa necesario para que pVIII se inserte en la membrana, el cual es cortado
por una peptídasa-señal bacteriana (Marvin, 1998).
El segmento carboxilo terminal hidrofóbíco de plll ancla la proteína madura al sitio de pre-
ensamblaje en la membrana citoplasmática. Aparentemente, esta proteína no se encuentra
asociada con pVI en la membrana, lo que contrasta con el estado en que encuentran en el
virión, pero cada una se encuentra asociada con pVIII (Endemann y Model, 1995).
Para que se produzca el ensamblaje correcto de las proteínas de la cápsida con el ADN genómico
son necesarias tres proteínas adicionales (pl, pIV y pXI) codificadas por el fago pero que no
forman parte del virión, y al menos una proteína del huésped, la tiorredoxina (Russel y Model,
1985). La proteína pl tiene 348 residuos incluyendo un dominio hidrofóbico integral de
membrana (residuos del 254 al 273). La porción amino terminal (253 residuos) se encuentra
en el citoplasma y el resto de los residuos aminoacídicos forman el dominio periplasmático. La
proteína pXI (ínicialmente llamada pl* ya que se corresponde con una traducción en fase de la
mitad carboxilo terminal de pl), se demostró que también es necesaria para un correcto
Capítulo 2 Revisión bibliopráfím
24
ensamblaje del virión, pero su función exacta es aún desconocida (Rapoza y Webster, 1995).
La proteína pIV se inserta en la membrana externa donde se asocia formando un poro funcional
constituido por 10 a 12 subunidades. Esta proteína es rica en aminoácidos cargados y la
predicción de su estructura secundaria sugiere que posee una serie de 16 hojas (3 lo que permite
asociarle una función de porina (Russel y Kazmierczak, 1993). La tiorredoxina es una proteína
codificada por el hospedero la cual, además de su función como enzima redox, juega un
importante papel en el ensamblaje del virión. En el caso de los fagos filamentosos su papel
específico parece ser en el desplazamiento de pV por pVIII a lo largo del ADNcs (Russel, 1995).
El sitio de empaquetamiento o señal morfogenética interactúa con la proteína I. B) La proteína
I sufre un cambio conformacional y su dominio periplasmático interactúa con pIV. C) Apertura
del poro y ensamblaje simultáneo del fago, pV es sustituida por pVIII. ME: membrana externa,
MI: membrana interna. Tomado de Rusel (1994), modificado por el autor Según las teorías
actuales los procesos de ensamblaje y salida del fago ocurren simultáneamente en la célula. El
primer paso parece ser el reconocimiento de la SM o sitio de empaquetamiento en el ADNcs
por las proteínas pVII y pIX (López y Webster, 1983). Posteriormente este complejo interactúa
con la proteína pl provocando un cambio conformacional que induce una interacción entre los
dominios periplasmáticos de pl y pIV (Fíg. 9). Esto a su vez induce la apertura de pIV que
forma un canal dinámico en cuyo interior se va ensamblando el fago mediante la incorporación
de pVIII, que va desplazando a pV del ADNcs (Russel y cols., 1997). Esta incorporación se
realiza mediante la cooperación dinámica entre todas las proteínas que participan en el proceso
de morfogénesis (Russel y cois., 1997). Las subunidades de pVIII quedan dispuestas en la
estructura del fago de forma tal que los residuos cargados positivamente en el carboxílo
terminal interactúan con las cargas negativas del ADN y los segmentos hidrofóbicos interactúan
entre sí estabilizando la partícula (Marvin, 1998).
Figura 9. Representación esquemática del ensamblaje de un fago filamentoso del grupo Ff. A)
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
25
La terminación de la morfogénesis del fago está determinada por la unión del complejo proteico
pVI y plll a un sitio específico del ADNcs que parece contener una señal de terminación, con la
consiguiente liberación de la partícula viral al medio (Rakonjac y Model, 1998; Rakonjac y cois.,
1999). De esta manera se cierra el ciclo biológico del fago y las partículas liberadas pueden
comenzar el ciclo mediante una nueva infección.
2.9 El fago filamentoso CTX(f> y su fago satélite RS1
El fago filamentoso CTX<j> contiene los genes que codifican la toxina del colera, el principal
factor de virulencia de V. cholerae. El elemento genético relacionado RS1, también es un fago
filamentoso, aunque no es capaz de transmitirse autónomamente, sino que es un fago satélite
de CTX<j> que requiere de los genes de la cápsida y ensamblaje de este último para llevar a
cabo ese proceso (Davis y Waldor, 2003).
Las secuencias de la forma integrada de CTX<j) y RS1 son esencialmente idénticas en su
porción 5’. Esta región codifica las proteínas usadas por ambos fagos para la replicación
(RstA), la integración (RstB) y la regulación de la expresión gènica (RstR) (Fig. 10) (Waldor
y cois., 1997). Los restantes genes de CTX<)>, no presentes en RS1, codifican proteínas
necesarias para el empaquetamiento y secreción del fago (Psh, Cep, OrfU, Ace y Zot) así
como la toxina del cólera, que no contribuye a la formación del virión. El RS1 carece de estos
genes adicionales; sin embargo, como la transmisión de RS1 depende de CTX<j), se cree
que los dos fagos utilizan idénticos procesos para el empaquetamiento, secreción e infección
(Davis y cois., 2002). En lugar de las proteínas necesarias para la morfogénesis, RS1 codifica
una proteína, RstC, la cual se demostró recientemente que actúa como un
antirrepresor del represor RstR (Davis y cols., 2002). En esta misma zona no homologa a
CTX<j>, el fago RS1 contiene un segundo origen de replicación que no parece funcionar por
rslR rstA rslB rslC
Figura 10. Estructura gènica del fago CTX<j> y su fago satélite RS1. Ambos fagos están
representados como se encuentran en su estado integrado. Los genes se representan con
flechas de bloque. El número dentro de cada gen representa el tamaño en aminoácidos
del producto proteico codificado. Las flechas quebradas representan las secuencias
promotoras y las cabezas de flechas en los extremos de cada profago representan los
sitios att flanqueantes. Tomado de Davis y Waldor (2003), modificado por el autor.
RS1
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
26
el mecanismo del círculo rodante (Campos y cois., 1998) y cuya función permanece
desconocida.
El fago RS1 actúa como un parásito y un ayudante de CTX<j> puesto que parasita la cápsida
de CTXcj) para transmitirse y al mismo tiempo asiste a este fago en la replicación (ver
replicación más adelante) y contribuye a aumentar los títulos de CTX<j> ya que su
antirrepresor RstC contrarresta al represor RstR del fago CTX<|> (Davis y cols., 2002).
2.10 Características generales de CTX<j>
El fago CTX< (> se ajusta a las características generales del género Inovirus pero presenta
peculiaridades interesantes que han contribuido a perfilar las variantes virulentas de V. cholerae y al éxito evolutivo de estas.
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
27
A diferencia de los colifagos Ff, CTX(|) es más dependiente de proteínas codificadas por el
hospedero, pues necesita proteínas codificadas por la bacteria para la integración y la secreción
(Davis y cois., 2000a; Huber y Waldor, 2002). Análisis genómícos de diversos fagos filamentosos
sugieren que en este aspecto CTX<)> parece ajustarse más a la regla que constituir una
excepción (Davis y Waldor, 2003).
2.10.1 CTX<J> comparado con otros fagos filamentosos
En muchos aspectos CTX<|) es muy parecido a los fagos filamentosos canónicos Ff de E. coli. En
particular, varios de sus genes comparten un tamaño y posición relativa similar dentro de los
genomas respectivos de cada fago aunque comparten poca homología aminoacídica (Waldor y
Mekalanos, 1996). Además, los procesos de infección de la célula huésped y secreción del fago
parecen ser similares. Sin embargo los colifagos Ff generalmente producen títulos que superan
por amplio margen los títulos producidos por CTX(*)> (máximo de 1011 contra 107). Esto se debe,
probablemente, a que la FR de los fagos Ff se mantienen como plasmidios de alto número de
copias y sus genes son expresados continuamente, mientras que CTX<j> se mantiene integrado
en el cromosoma y la expresión de sus genes está restringida por el represor del fago RstR
(Kimsey y Waldor, 1998). A causa de esta represión, la mayoría de las células dentro de una
población de V. cholerae no producen partículas virales.
2.10.2 Infección. La infección de V. cholerae por CTX(j> parece ser similar a la infección de E. colipor Ff. Ambos fagos utilizan una fimbria como receptor (TCP para CTX<|> y el pelo sexual
F para Ff) y ambos requieren también las proteínas del hospedero TolQ, ToIR y TolA para
la infección (Heilpern y Waldor, 2000). Cada uno de estos fagos interactúa con su receptor
respectivo a través de la proteína de adsorción plll. La proteína de adsorción de CTX<)>
fue llamada inícialmente OrfU por su función desconocida (ORF of unknown functiorí), pero
recientemente fue renombrada plllCTX por su función homologa a la proteína plll de los
fagos Ff (Heilpern y Waldor, 2003).
2.10.3 Integración de CTX<j>. A pesar de que CTX<|> se integra de forma sitioespecífica en un
sitio del cromosoma de V. cholerae conocido como aííRSI, su genoma no incluye ningún
gen cuyo producto sea homólogo a alguna integrasa conocida. Aunque se piensa que la
proteína RstB del fago contribuye a la integración, el papel que esta juega en este proceso
no está claro (Waldor y cois., 1997). Recientemente se demostró que las recombinasas
XerC y XerD del
Revisión bibliografía Capítulo 2
28
hospedero se requieren para la integración de CTX* (Huber y Waldor, 2002). La función primaria
de estas recombinasas es convertir los dímeros de cromosomas generados durante la replicación
en monómeros, catalizando la recombinación en una secuencia cercana al sitio de terminación de
la replicación. Esta secuencia, conocida como sitio dif, se superpone con el sitio atfRSI de
integración de CTXf sin embargo, la integración de este fago no afecta la conversión de dímeros
de cromosomas en monómeros (Huber y Waldor, 2002).
2.10.4 Replicación de CTX<(>. Como CTX<)> se mantiene como un profago integrado en las
cepas toxigénicas de V. cholerae, la producción de partículas virales requiere un proceso
adicional además de los procesos requeridos para la replicación de otros fagos filamentos
como los Ff de E. coli, este es la producción de la forma extracromosomal o FR del fago.
Otros fagos temperados se escinden del cromosoma usandi, CTX produce la FR mediante
un proceso replicativo que depende de la presencia de orígenes de replicación en tándem
en el cromosoma bacteriano (Fig. 11) (Davis y Waldor, 2000 y cols., 2001).
Figura 11. Mecanismo de producción de ADN extracromosomal de CTX(f> a partir de un arreglo en tándem CTX<|>/RS1. (a) La proteína de la replicación, RstA,introduce un corte en el origen de replicación del profago CTX<)>. La síntesis de ADN comienza a partir del extremo 3’ del corte y la nueva cadena va desplazando la vieja hasta alcanzar el próximo origen de replicación en elemento en tándem cuesta abajo (en este caso RS1), donde RstA introduce un nuevo corte, (b) Una vez que la síntesis de la nueva cadena de ADN se ha completado, la cadena vieja desplazada se recirculariza, generando un genoma de ADNcs viral que sirve de sustrato para la síntesis de la FR viral. A la vez, una copia del ADN del fago permanece intacta en el cromosoma bacteriano. Tomado de Davis y Waldor (2003), modificado por el autor.
La ventaja aparente de este proceso replicativo es que permite la producción de partículas de
CTX<j) sin que se pierda la copia que está integrada en el genoma de la bacteria, garantizando
tanto la transmisión horizontal como vertical del fago (Davis y Waldor, 2003). El profago CTX<t>
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
29
no se encuentra organizado en tándem en el cromosoma de las cepas clásicas de V. cholerae, las
cuales tampoco poseen el fago satélite RS1, por tanto estas cepas no pueden producir partículas
de CTX<(> (Davis y cois., 2000b).
2.10.5 Secreción de CTX<J). El gen IV de los colífagos Ff codifica un canal de membrana externa
conocido como secretina, a través del cual las partículas virales son ensambladas y
secretadas al mismo tiempo (Kazmierczak y cois., 1994; Linderoth y cois., 1997). Sin
embargo, CTX<|> carece de este gen y para realizar esas funciones depende de EpsD,
una secretina codificada por el hospedero, la cual es un componente del sistema de
secreción de proteínas Eps que pertenece al tipo II del sistema de secreción general (Davís
y cois., 2000a). Es muy interesante el hecho de que la porina EpsD también es necesaria
para la secreción de la toxina del cólera (epígrafe 2.5.8) (Davis y cois., 2000a). Este hecho
sugiere que tanto la toxina del cólera como CTX<|) han evolucionado de manera
convergente hacia el aprovechamiento de un poro que está ampliamente distribuido en la
familia Vibrionaceae (Sandkvist, 2001).
2.11 Otros fagos filamentosos de V. choleraeSe han encontrado cuatro fagos filamentosos (493, VSK, fs1 y fs2) que infectan V. cholerae además de CTX<j>, pero han sido poco estudiados en comparación con este último. Se sabe que
el fago 493 utiliza MSHA como receptor y se ha sugerido que jugó algún papel en el surgimiento
del serogrupo epidémico 0139 (Jouravleva y cois., 1998a; Jouravleva y cois., 1998b), pero su
secuencia y estructura genómica no han sido determinadas. El fago VSK es capaz de integrase
en el cromosoma del vibrión (Kar y cois., 1996), pero se desconoce el sitio de integración. Aunque
la secuencia genómica de VSK fue depositada en las bases de datos internacionales, su
organización genómica no se ha descrito en ninguna publicación. De los fagos fs1 y fs2 se han
determinado sus secuencias y se han descrito sus estructuras genómicas (Honma y cois., 1997;
Ikema y Honma Y, 1998), además se tienen indicios de que estos fagos usan MSHA como
receptor, pero esto último no ha sido totalmente demostrado (Ehara y cois., 1997).
Karaolis y cois. (1999) publicaron resultados que sugerían que la isla patogénica VPI era el
genoma integrado de otro fago filamentoso lísogénico, VPI<{>, capaz de transmitir
horizontalmente los genes que codifican TCP. Estas evidencias resultaron muy interesantes; sin
embargo, hasta este momento, esa hipótesis ha generado más preguntas que respuestas y los
resultados publicados por Karaolis y cois, no han podido ser reproducidos por otros investigadores
(Davis y Waldor, 2003; Faruque y cois., 2003; Miller, 2003). Respecto a su morfología, VPI<t>
fue clasificado como fago filamentoso. Sin embargo, la organización y el tamaño genómico de la
isla patogénica VPI difieren totalmente de lo conocido para los fagos filamentosos descritos hasta
el presente y ninguno de los productos proteicos codificados por
VPI es homólogo de alguna protelna conocida de los fagos filamentosos. No obstante, nadie parece
poner en duda que VPI es capaz de transmitirse horizontalmente en el ambiente entre poblaciones
bacterianas, quizás a través de más de un mecanismo.
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
30
Recientemente Rajanna y cois. (2003) demostraron que VPI puede escindirse de manera precisa
del cromosoma bacteriano y formar una molécula circular extracromosomal. Estos autores no
identificaron ningún gen de replicación, ni por homología ni por análisis funcional y no se
presentaron evidencias experimentales de que esta forma extracromosomal de VPI sea capaz de
replicarse ni de transmitirse entre poblaciones bacterianas de V. cholerae. No obstante, el hecho
de que VPI es capaz de escindirse de manera precisa del cromosoma bacteriano pudiera ser el
primer paso de un mecanismo específico de transmisión horizontal de VPI que aún no ha sido
descubierto y que actualmente se encuentra en estudio (Rajanna y cois., 2003).
2.12 Transferencia genética horizontal
Los factores de virulencia bacterianos, tales como las toxinas, son frecuentemente codificados por
elementos genéticos accesorios (bacteriófagos, plasmidios, islas patogénicas y transposones)
(Waldor y Mekalanos, 1996; Eisen, 2000). Se supone que estos elementos genéticos pueden
moverse tanto horizontalmente (entre cepas y especies diferentes) como verticalmente (dentro
de la misma cepa o especie) a través de las poblaciones bacterianas (Eisen, 2000). De esta forma
confieren una mayor adaptación evolutiva a sus huéspedes patógenos y por tanto a ellos mismos.
En algunos casos, estos elementos pueden ser transmitidos entre cepas bajo condiciones de
laboratorio, pero se conoce poco acerca de las condiciones ambientales que estimulan la
transferencia genética entre especies y clones bacterianos.
La transferencia horizontal de genes es más que la simple transferencia de genes, en realidad
debe ser considerado como un proceso de múltiples etapas. En primer lugar el o los genes a
transferirse evolucionan junto con la línea celular del donador. En algún momento en el tiempo,
el material genético se transfiere a otra línea celular, ya sea a través de un virus, por conjugación,
transformación o alguna otra vía (Eisen, 2000). El material genético transferido debe presentar
un formato adecuado (señales de transcripción, traducción, etc. compatibles) para que funcione
en el nuevo hospedero, así como para mantenerse permanentemente en él (replicación autónoma
o integración). La diseminación del material adquirido por la nueva línea receptora se piensa que
está generalmente dirigida por fuerzas selectivas (Eisen, 2000). Finalmente, después que el
material genético ha sido transferido comienza a adaptarse en muchos aspectos (uso de codones,
señales reguladoras de la transcripción, traducción, etc.) al nuevo hospedero, en un proceso que
se conoce como optimización (Eisen, 2000).
2.13 Origen evolutivo de V. cholerae epidémico
Dos eventos cruciales en la evolución de las variantes patogénicas de V. cholerae fueron la
adquisición de los genes que codifican TCP y la toxina del cólera. Como TCP es el receptor de
CTX<(>, que porta los genes ctxAB, es muy probable que la isla patogénica VPI, que incluye
genes que codifican TCP, se haya adquirido primero (Waldor y Mekalanos, 1996; Faruque y cois.,
1998a; Davis y Waldor, 2003). Existen diferencias notables en algunos segmentos de VPI entre
las cepas 01 de biotipo El Tor y las del biotipo clásico, sin embargo, un análisis de estas secuencias
sugirió que VPI fue adquirido por ambos biotipos en la época en que estos divergieron, por tanto,
VPI debió de ser adquirido por un ancestro común (Karaolis y cois., 2001). Alternativamente,
Capítulo 2 Revisión bibliográfica
31
ambas líneas adquirieron cada una un elemento VPI muy similar. En ambos casos, la integración
al cromosoma bacteriano del nuevo ADN adquirido debió estar catalizada por la integrasa
codificada a un extremo de la isla patogénica (Davis y Waldor, 2003).
En cambio, CTX<|> debió ser adquirido por ambos biotipos después que estos divergieron de un
ancestro común; por tanto, V. cholerae toxigénico se ha originado al menos dos veces durante la
historia evolutiva de esta especie bacteriana (Boyd y cois., 2000). El fago satélite RS1 está
presente en las cepas del biotipo El Tor, el causante de la última pandemia de cólera, pero nunca
ha sido detectado en las cepas del biotipo clásico (Davis y cois., 2000b). No está claro por qué
CTX<j> y RS1 están tan ligados en el biotipo El Tor pero probablemente este último confiere
alguna ventaja adaptatíva que ha hecho que este biotipo desplazara al clásico en la séptima
pandemia. Un hecho muy enigmático, y quizás ventajoso evolutivamente, es que genes asociados
a la virulencia y adquiridos mediante eventos separados (esto es ctxAB y la agrupación de genes
TCP) están controlados por el mismo regulador ToxR.
Aunque el modelo evolutivo de adquisición secuencial de VPI y CTX<|> está bastante aceptado,
ha sido cuestionado debido a que se han aislado cepas toxigénicas de V. cholerae, tanto de los
serogrupos OI y 0139 como de otros serogrupos, que no contienen VPI pero que contienen los
genes que codifican la toxina del cólera (Said y cois., 1995; Ghosh y cois., 1997). Tales cepas
toxigénicas podrían surgir por escisión de VPI del cromosoma bacteriano (Rajanna y cois., 2003),
no obstante, la existencia de estas ha hecho pensar a los investigadores que pueden existir vías
alternativas de adquisición de los genes que codifican la toxina colérica que no se ajustan al
modelo aceptado. Aunque las cepas toxigénicas de V. cholerae pertenecientes a serogrupos no-
OI, no-0139 solo producen casos aislados o pequeñas epidemias esporádicas de cólera, existe el
riesgo potencial de que surjan nuevas variantes epidémicas. Tales variantes pudieran surgir por
el modelo evolutivo aceptado o por algún (o algunos) otro mecanismo diferente.
Materiales y Métodns Capítulo 3
32
3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.10 Materiales
3.10.2 Cepas, plasmidios, fagos y fagemidios. Las cepas bacterianas, plasrmidios, fagemidios
y fagos usados en este trabajo con sus características fenotipicas y genotípicas más
importantes se presentan en la Tabla 1
Capítulo 3 Materiales y Métodos
33
a
Centro de Enfermedades Infecciosas, Cuernavaca, México. b Centro Nacional de Investigaciones Científicas, La Habana, Cuba. No publicado aún.
3.1.2 Medios de cultivo. Los medios de cultivo utilizados fueron: Luria-Bertani (LB) (triptona,
10 g/L; extracto de levadura, 5 g/L; cloruro de sodio, 10 g/L y agar 15 g/L para medio
sólido) ajustado a pH 6,5 o a pH 7,0; LB-sacarosa (triptona, 10 g/L; sacarosa 100 g/L;
extracto de levadura, 5 g/L y agar 15 g/L para medio sólido); AKI (peptona bacteriológica,
15 g/L; extracto de levadura, 4 g/L; cloruro de sodio, 5 g/L y bicarbonato de sodio, 3,2
g/L); TSBG (digerido pancreático de caseína, 17 g/L; digerido papaínico de semilla de
soya, 3 g/L; NaCI, 5 g/L; fosfato de potasio dibàsico, 2,5 g/L y glucosa, 2,5 g/L), TSB
(ídem al anterior pero sin glucosa), Dulbecco's Modified Eagle s Medium (DMEM) (Sigma,
EE.UU.), Protein Free Hybridoma Medium (PFHM) (Gibco BRL, EE.UU.). Cuando fue
necesario, a los medios se les añadió antibióticos a las concentraciones siguientes:
ampicíllina (Ap), 100 (ig/mL; kanamicina (Kn),
100 (ig/mL y polimixina (Pol), 100 U/mL. Cuando no se especifica la fuente, los componentes de
los medios de cultivos fueron adquiridos de Oxoid (RU).
3.1.3 Enzimas y reactivos. Las enzimas de modificación/restricción utilizadas en este trabajo
fueron adquiridas de las firmas Promega (EE.UU.), Amersham (RU) y New England Biolabs
(EE.UU.). Para su uso se tuvieron en cuenta las recomendaciones de los fabricantes. Los
Materiales y Métodos Capítulo 3
34
reactivos empleados fueron adquiridos de las firmas Merck (EE.UU.), Sigma (EE.UU.) y
Promega. Los oligonucleótidos utilizados se muestran en la Tabla 2 y se sintetizaron en el
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB, La Habana, Cuba).
3.2 Técnicas usadas en el trabajo con ADN
3.2.2 Purificación de ADN total y plasmídico. El aislamiento del ADN total de V. cholerae se realizó
según Ausubel y cois. (1995) y para la purificación del ADN plasmídico se utilizaron los
sistemas Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System y Wizard Plus Midipreps DNA Purification System, ambos adquiridos de la firma Promega (EE.UU.).
3.2.3 Reacciones de modificación-restricción del ADN. Todas las reacciones enzimáticas de
modificación-restricción de ADN se realizaron teniendo en cuenta las recomendaciones de
los proveedores. Cuando fue necesario digerir un mismo ADN con más de una enzima de
restricción se utilizó un tampón de reacción en el cual todas las enzimas tuvieran una
actividad lo más óptima posible. Cuando esto no fue posible, la digestión se realizó con
cada enzima por separado cambiándose el tampón óptimo de reacción entre una digestión
y la siguiente mediante precipitación del ADN y resuspensión en el tampón óptimo de cada
enzima.
Para ligar fragmentos digeridos de ADN se utilizó la enzima ligasa de ADN T4 en su tampón óptimo
de reacción. Todas las reacciones de ligamiento se realizaron en un volumen final de 20 |^L
teniendo en cuenta que la concentración de extremos libres de ADN siempre fuera menor de 1
|aM. Se utilizó 1 U de enzima en cada reacción para ligar extremos cohesivos y 5 U para ligar
extremos romos. En cada caso la mezcla de reacción se incubó toda la noche a 16°C.
3.2.4 Electroforesis de ADN y purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa.
La separación de bandas de ADN se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa al
0,8% (m/v) en tampón TAE (40 mM Tris-acetato, 20 mM EDTA) y a una intensidad de 4
Tabla 2. Oligonuceótidos utilizados en este estudio. Oligonucleótido Secuencia
VGJphil 5'-CAAGTCGAGACGAACTMGC-3' VGJphi2 5'-CC AAGT AAT ACGAT AAACGC-3'
VGJphi3 5-CGGCAI I I IGTGGGGCATCAG-3' VGJphi4 5'-CGGCCTAT GGTAAAAGTT GC-3' VGJph¡5 5'-T CT CT GGTAT CACCGAT GCG-3' VGJphi6 5-GCGCTTCCT CCCGT GT CCT C-3' VGJphi7 5-GCT AT GGCT AG AAT C AAAGGG-3' VGJphi8 5-AAGCTAAAGAGCAAGGCG-3' VGJphi9 5-GCT CT GGTT CAGGGTT AG-3' VGJphilO 5-GTT ATGCGT GT GT AGCT C-3' VGJphil 1 5'-GT GT AT G AAT C AGG AACG-3' NJ1 5'-GGAT GTTT ACG ATAGC-3' NJ2 5-TAGAACGT GTCATT GCATCG-3' NJ4 5'-GC ACAC AATT G ACGTAAGT AC-3' CTA 5’-AT G AT C AT GCAAGAGG AACT C-3’ CTB 5-AGGT GTT CC AT GT GC AT AT GC-3’ CTB1 5-GCGATT GAAAGGAT GAAGG-3' CNC-8125 5’-AT G AT CGT G AAGT CG ACT ATG-3' CNC-8126 5’-C AGC AACCGAGAATT AC AAT C ACC
ACG-3' CNC-8127 5’-ATT CT CGGTTGCT GG AACTGCTT GT G-3’ CNC-8128 5'-GCT CT AG AGT ATT CACGGT ATT CG-3'
Capítulo 3 Materiales y Métodos
35
V/cm. Se utilizó bromuro de etidio (1 jig/mL) o naranja de acridina (1 fig/mL) para
visualizar el ADN mediante la incidencia de radiación UV en un transiluminador FBTIV-88
(Fisher Biotech, EE.UU..). La purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de
agarosa se realizó utilizando el sistema GFX PCR DNA and gel Band Purification(Amersham) y siguiendo el protocolo indicado por el fabricante.
3.2.5 Reacción en cadena de la polimerasa. Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se
llevaron a cabo en un termociclador PTC150 (MJ Research, EE.UU.) y cada reacción de
amplificación se realizó en un volumen final de 50 |^L que contenía: 20 ng de ADN molde
cuando este era ADN plasmídico o 500 ng cuando el molde era ADN genómico, 5 JJ.L de
tampón de reacción 10X (Promega), 5 jiL de una solución de los cuatro
desoxírribonucleótidos dATP, dCTP, dGTP y dTTP (dNTPs) (2 mM), 30 pmol (total en la
reacción) de cada oligonucleótido, 1 U de la polimerasa empleada -Pfu o Taq (ambas de
Promega) según la fidelidad requerida- y H20 destilada estéril hasta completar 50 jiL. Las
mezclas de reacción se sometieron a 30 ciclos de 1 min de desnaturalización a 94°C, 45
segundos a 5 grados por debajo de la Tm de cada par de oligonucleótidos (generalmente
entre 50-58°C), un tiempo de extensión variable según la longitud del producto a
amplificar (1 min/kb si la polimerasa empleada era Taq y 1,5 min/kb cuando era Pfu) a72°C y 5 min a 72°C para el ciclo de extensión final.
3.2.6 Southern blotting. La técnica de hibridación de Southern se realizó esencialmente según fue
descrito por Sambrook y cois. (1989). Las muestras de ADN, digeridas con las enzimas de
restricción de interés fueron fraccionadas mediante electroforesis en gel de agarosa y
transferidas a una membrana de nylon Hybond-N (Amersham Pharmacia Biotech)
siguiendo un procedimiento de transferencia alcalina que utiliza capilaridad descendente
Materiales y Métodos
Capítulo 3
36
(Chomczynski, 1992). Para el mareaje y detección de la sonda se utilizo el sistema no radioactivo
DIG labeling and detection Kit (Roche, Suiza).
Se utilizaron dos métodos para marcar las sondas de ADN, el método de oligonucleótidos al azar
(Sambrook y cois., 1989) y una variante de PCR para generar sondas de ADNcs para el
reconocimiento de una cadena específica de ADN. Este último método consistió en realizar una
variante de una PCR con un solo oligonucleótido específico para una de las cadenas del ADN molde
en lugar de un par de cebadores como es lo usual, y en presencia de los cuatro
desoxirríbonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP: 100 ^M; dTTP: 65 jxM) más dUTP marcado con
digoxigenina (35 ^M). Todos los demás reactivos que se añadieron, así como los ciclos de
amplificación fueron los mismos de una PCR normal (epígrafe 3.2.4) y en este caso específico el
tiempo de extensión fue de 1 min. El único oligonucleótido utilizado sirve como cebador en cada
ciclo de extensión a 72°C y la polimerasa incorpora los nucleótidos incluyendo el marcado. En
este caso el ADN se amplifica de manera aritmética en lugar de hacerlo de manera exponencial
como ocurre en una PCR normal. Al final de la reacción se obtienen fragmentos marcados de
ADNcs que constituyen una sonda cadena-específica puesto que solo reconoce la cadena de
secuencia complementaria a la de la sonda. Todos los análisis mediante hibridación de Southernfueron realizados con las sondas especificadas en la
3.2.6 Secuenciación de ADN. Las reacciones de secuencíación se realizaron con el sistema
Thermo Sequenase CyS Dye Terminator Kit (Amersham Pharmacia Biotech) y las secuencias
fueron obtenidas con un secuenciador de ADN ALFexpress (Amersham Pharmacia Biotech).
Para obtener la secuencia completa del genoma del fago VGJ<|> primeramente se
clonaron diversos fragmentos de la forma replicativa (FR) de este fago en el vector pUC19
según se describe en el epígrafe 3.3.1 (Fig. 12). Cada fragmento clonado se secuenció por
ambas cadenas con los oligonucleótidos universal y reverso, los cuales hibridan con el
vector pUC19 dirigidos hacia el inserto. El resto de la secuencia se obtuvo secuenciando
directamente el ADNcs genómico del fago con los oligonucleótidos VGJphil al 11 (Tabla 2,
Fig. 12). Cada secuencia obtenida suministró la información para sintetizar el
Tabla 3.
Tabla 3. Sondas específicas utilizadas en este trabajo.
Sonda ADN molde usado para el mareaje Método de mareajeVGJ-S1 Genoma completo de VGJi|>. Oligonucleótidos al azar.RS1-S Fragmento EcoRI-Psíl de 2,9 kb del plasmidio pURS1 que
contiene el elemento RS1 completo.Oligonucleótidos al azar.
ctxAB-S Fragmento de 643 pb que contiene la mayor parte de los genes ctxAB del fago CTX<|> amplificado por PCR usando los oligonucleótidos CTA y CTB (Tabla2).
Oligonucleótidos al azar
VGJ-S2 Fragmento Sacl-EcoRI de 954 pb de la FR de VGJ<j>, que contiene los ORF81, 44, 29 y parte del ORF493.
Oligonucleótidos al azar.
AmshA-S Fragmento de 2,6 kb con el gen mshA delecionado, obtenido mediante fusión por PCR de las zonas flanqueantes (1,3 kb) a este gen (epígrafe 3.3.6).
Oligonucleótidos al azar.
HybP-A Sonda de ADNcs acotada por la región 5’ con el oligo CTB1 usando la FR de HybP-Kn<|> como molde.
Variante de PCR utilizando un solo oligonucleótido3.
HybP-B Sonda de ADNcs acotada por la región 5’ con el oligo NJ2 usando la FR de HybP-Kn<)> como molde.
Variante de PCR utilizando un solo oligonucleótido3.
Ver detalles del método en el texto.
Capítulo 3 Materiales y Métodos
37
oligonucleótido utilizado en la secuenciación de la región contigua en el caso de la región
del genoma que no fue clonada en pUC19. Cada reacción de secuencia se realizó al menos
dos veces y se asumió como secuencia confiable cuando esta se repitió idéntica en cada
reacción. Cuando la secuencia fue dudosa se realizaron nuevas reacciones de secuencia
con el mismo oligonucleótido u otro diferente hasta obtener una misma secuencia
coincidente al menos dos veces.
Figura 12. Representación esquemática de la estrategia seguida para secuenciar elgenoma de VGJ<)>. Varios fragmentos Hind\\\ de la FR del fago fueron clonados enel vector pUC19. En el esquema se indican los plasmidios resultantes (pUC-A hasta E) con el fragmento clonado correspondiente en cada caso. También se indican losoligonucleótidos (VGJphil-11) utilizados para secuenciar directamente sobre el genoma de ADNcs del fago en la región que no fue clonada en pUC19. Aunque los marcos de lectura abiertos (ORFs) no se conocieron hasta después de obtenida y analizada la secuencia completa del genoma, estos se muestran en el esquema a modo de orientación.
3.2.7 Análisis de las secuencias nucleotídicas. Los datos generados por todas las reacciones de
secuencia que se consideraron confiables se ensamblaron automáticamente con el programa
ContigExpress del paquete de programas Vector NTI suite 6 (InforMax Inc, EE.UU.) para obtener
la secuencia completa del fago. El análisis de esta secuencia para determinar la estructura
genómica (sitios de restricción, marcos de lectura abiertos, etc.) se realizó también con el paquete
de programas Vector NTI suite 6. El programa BLASTN (Altschul y cois. 1997), con sus parámetros
por defecto, se utilizó para buscar similitud con secuencias nucleotídicas depositadas en las bases
de datos internacionales. El programa Alignment del paquete de programas Vector NTI suite 6 se
utilizó para realizar los alineamientos de secuencias con los parámetros por defecto del programa.
3.2.8 Transformación bacteriana. La transformación de E. coli con ADN plasmídico se realizó
mediante electroporación como fue descrito por Dower y cois. (1988) a un voltaje de 2,5 kV en
cubetas de 1 mm de separación entre los electrodos. Para la transformación de V. cholerae se
utilizó el mismo protocolo pero con pequeñas modificaciones. En este último caso las células
VGJphi3
VGJph¿5
Materiales y Métodos Capítulo 3
38
fueron lavadas tres veces con una solución tampón que contenía 272 mM de sacarosa, 13,4 mM
de Na2HP04 y 1 mM de MgCI2 en lugar de agua destilada estéril y se utilizó un voltaje de 1,8 kV en
cubetas de 1 mm de separación entre los electrodos.
Para transformar V. cholerae con plasmídios suicidas se utilizó el método de conjugación
bacteriana. Para ello se sembraron mezcladas en una misma placa de LB sólido la cepa donante
de E. coli S17-1 Ipir transformada con el vector suicida y la cepa receptora de V. cholerae. Al cabo
de 4 h de incubación a 37°C la superficie de la placa se lavó con 1 mL de LB para colectar las
bacterias. Se realizaron diluciones seriadas de la suspensión bacteriana, de las cuales se
sembraron 100 |iL en placas de LB-Ap-Pol. En presencia de estos antibióticos sólo crecen los
transformantes de V. cholerae que adquirieron e integraron a su genoma el plasmidio suicida de
E. coli. La presencia de Pol en el medio contraselecciona las células de E. coli que son sensibles a
este antibiótico y la Ap contraselecciona las células de V. cholerae que no recibieron el plasmidio.
3.3 Construcciones genéticas
3.3.1 Clonación de fragmentos de la forma replicativa de VGJ<|> para secuenciación.
Cinco microgramos de la FR de VGJ<j> se digirieron con la enzima Hind\\\. La digestión se sometió
a electroforesis preparativa en gel de agarosa. Se obtuvieron 4 fragmentos de ADN de
aproximadamente 2,9; 2,8; 1,6 y 0,25 kb. Los fragmentos de 2,9 y 2,8 que migran juntos se
copurificaron a partir de gel así como los fragmentos de 1,6 y 0,25 kb. Se tomaron 600 ng de cada
banda purificada, se mezclaron por separado con 300 ng de pUC19 linealizado con H/ndIII y se
ligaron con lígasa de ADN T4 según se describe en el epígrafe 3.2.2. La cepa de E. coli JM109 se
electroporó con las tres mezclas de ligamiento por separado y las células transformadas de cada
electroporación fueron seleccionadas en medio sólido LB-Ap suplementado con
ísopropiltiogalactósído (IPTG) a 1 mM y Xgal (50 |ug/mL). De cada transformación se analizaron
varios clones provenientes de colonias blancas mediante digestión del ADN plasmídico con
diferentes enzimas de restricción. Se seleccionaron tres clones -uno de cada ligamiento- que
contenían el vector pUC19 con los fragmentos clonados.
La construcción que contenía el fragmento de 0,25 kb se denominó pUC-A, la construcción que
contenía el fragmento de 1,6 kb, pUC-E y la construcción que contenía el fragmento de
2,8 kb, pUC-BCD (aunque el fragmento de 2,9 kb se copurificó con el de 2,8 no se obtuvieron
clones que contuvieran el fragmento de 2,9 kb). El plasmidio pUC-BCD se utilizó para dividir el
fragmento de 2,8 kb en fragmentos más pequeños para secuenciar. Así, 2 |ag de pUC-BCD se
digirieron con EcoRI y como resultado se obtuvieron dos fragmentos de 3,8 y 1,7 kb. Se purificó
el fragmento de 3,8 kb a partir de gel y 100 ng de este se utilizaron en una reacción de
religamiento con ligasa de ADN T4 como se describe en el epígrafe 3.2.2. A continuación E. coliJM109 se transformó con el producto de la reacción de ligamiento, se analizaron varios
transformantes resultantes y se seleccionó un clon que contenía una construcción de 3,8 kb al
digerirse con EcoRI, la cual se denominó pUC-D. Por otra parte, 2 jag de pUC-BCD se digirieron
con Sacl y EcoRI y como resultado se obtuvieron los siguientes fragmentos: un fragmento Sacl-
EcoRI de 3,8 kb, un fragmento Sacl-EcoRI de 1,0 kb y un fragmento Sacl de
0, 7 kb. Se purificaron los fragmentos de 1,0 y 0,7 kb a partir de gel y 600 ng de cada uno se
Capítulo 3 Materiales y Métodos
39
mezclaron por separado con 300 ng de pUC19 digerido con Sacl-EcoRI o Sacl, respectivamente.
Las mezclas del vector digerido con cada fragmento se ligaron por adición de T4 ADN ligasa como
se indica en 3.2.2. Las dos mezclas de ligamiento fueron introducidas por electroporación en la
cepa de E. coli JM109 y las células transformadas fueron seleccionadas en medio sólido LB-Ap
suplementado con IPTG (1 mM) y Xgal (50 |ig/mL). De cada transformación se analizaron varios
clones -que provenían de colonias blancas- mediante restricción del ADN plasmídico. Se
seleccionaron dos clones (uno de cada ligamiento) que contenían el vector pUC19 con los
fragmentos clonados. La construcción que contenía el fragmento de 0,7 kb se denominó pUC-B y
la construcción que contenía el fragmento de 1,0 kb se denominó pUC-C. Los plasmidíos pUC-A,
-B, -C, -D y -E fueron utilizados para secuenciar el fragmento clonado según lo descrito en el
epígrafe 3.2.5 (Fig. 12).
3.3.2 Construcción de VGJ-Kn<)>. Un microgramo de la FR de VGJ<j>, linealizada por digestión
con la enzima Xba\, se mezcló con 500 ng del plasmidio pKOri igualmente linealízado con Xba\ yse añadió T4 ADN ligasa en las condiciones que se indican en 3.2.2. La mezcla de ligamiento fue
introducida por electroporación en la cepa 569B de V. cholerae y varios transformantes que
crecieron en presencia de Kn se analizaron mediante restricción del ADN plasmídico, de los cuales
se seleccionó un clon que contenía a VGJ<)> más pKOri ligados. La construcción obtenida fue la
FR del fago VGJ-Kn(|>.
3.3.3 Mutación del ORF493 de VGJ<t>. Un microgramo de la FR del fago VGJ-Kn<j> fue
linealizada por digestión con EcoRI y los extremos protuberantes del fragmento de ADN generado
(9,2 kb) se rellenaron con la enzima Klenow como se indica en 3.2.2. El ADN tratado
Capítulo 3 Materiales y Métodos
40
resultante se purtficó mediante el, sistema GFX™ PCR DNA and ge/ Band Punte*» (Amersham
Pharmacia Biotech) y fue ligado con ligasa de ADN T4 según se describe en 3.2.2. La mezcla de
ligamiento fue introducida por electroporación en la cepa de V. cholerae 569B y se seleccionó en
LB-Kn. Se escogió un clon en el cual la molécula de ADN perdió el sitio de restricción EcoRI. La
construcción obtenida se denominó pVGJ-Kn+glir.
3.3.4 Construcción de pVGJ-Rep. De la FR de VGJ-Kn<|. se digirieron 5 mS con Kpnl y la mezcla
de digestión se aplicó en un gel de agarosa preparativo. Se obtuvieron fragmentos de ADN. uno
de 4,0 kb que fue desechado y uno de 5,3 kb que fue purificado 3c gel Del fragmento purificado
se usaron 500 ng para montar una reacción de ligamiento con T4 ADN ligasa según 3.2.2. La
mezcla de ligamiento fue introducida por electroporación en la cepa de V. cholerae 569B y se
estudiaron varios clones Kri por restricción con Kpnl. Se seleccionó un clon que contenía el
plasmidio de 5,3 kb y se denominó pVGJ-Rep. Esta construcció contiene los ORFs 104, 136, 154,
58, 67 y 359 del fago VGJf
Mutación del ORF359 de pVGJ-Rep. Un microgramo de pVGJ-Rep se linealizó por digestión con
A/del y los extremos protuberantes del fragmento de 5,3 kb obtenido se rellenaron con polimerasa
Klenow. El ADN tratado se purificó mediante el sistema GFX 1,1 PCR DNA and gel Band Purrfication(Amersham Pharmacia Biotech) y 500 ng del fragmento purificado fueron ligados
intramolecularmente según se indica en 3.2.2. La mezcla de ligamiento fue introducida por
electroporación en la cepa de V. cholerae 569B y se estudiaron varios clones Kn por restricción.
Se escogió un clon en el cual la molécula de ADN perdió el sitio de restricción A/del. La
construcción obtenida se denominó pVGJ-Rep-gil*.
3.3.6 Construcción del vector suicida pCVAmshA. La construcción del vector suicida
pCVAmshA se realizó en varias etapas. En la etapa inicial se amplificaron por PCR en reacciones
independientes cada uno de los fragmentos flanqueantes al gen mshA de la cepa N16961
utilizando los oligos CNC-8125 y CNC-8126 (Tabla 2) para el fragmento 1, localizado en la región
5’ inmediata del gen y los oligos CNC-8127 y CNC-8128 (Tabla 2) para el fragmento 2, inmediato
al gen por la región 3’. La reacción de amplificación se realizó esencialmente como se explica en
la sección 3.2.4. En una etapa posterior, los fragmentos 1 y 2 de ~1,3 kb, obtenidos en las
reacciones de amplificación iniciales, fueron purificados a partir de gel y 50 ng de cada uno se
mezclaron para utilizarlos como ADN molde en una segunda reacción de fusión-amplificación con
el objetivo de fusionar los dos fragmentos flanqueantes al gen mshA. En esta reacción se usaron
solo los oligos externos CNC-8125 y CNC-8128 como cebadores y las condiciones utilizadas para
la PCR fueron iguales a la amplificación anterior. La fusión fue posible porque los oligonucleótidos
internos CNC-8126 y CNC-8127 fueron diseñados de modo que sus extremos 5' fueran
complementarios. De este modo los dos productos amplificados hibridaron por las regiones
complementarias en los primeros ciclos de la PCR y sirvieron de cebador mutuo para que la
polimerasa extendiera hasta el extremo del fragmento de ADN opuesto (ver detalles en la Fig. 34
del epígrafe 4.17.1). El fragmento resultante de la fusión (de -2,6 kb) fue purificado de gel y 300
ng de este se mezclaron con 100 ng de pGEM-T-Vector (Promega). A la mezcla se adicionó ligasa
Capítulo 3 Materiales y Métodos
41
de ADN T4 según se indica en 3.2.2. Seguidamente el ADN ligado fue introducido por
electroporación en la cepa de E. coli JM109 y las células transformadas fueron seleccionadas en
medio LB sólido suplementado con Ap, IPTG (1 mM) y Xgal (50 |ag/mL). Se analizaron varios
clones de la transformación -que provenían de colonias blancas- mediante restricción del ADN
plasmídico. Se seleccionó un clon que contenía el vector pGEM-T-Vector con el fragmento de 2,6
kb clonado y esta construcción fue denominada pGAmshA. Seguidamente se digirieron 3 |ag de
pGAmshA con Sac\-Sph\ y se obtuvieron dos fragmentos, uno 2,8 kb correspondiente al vector y
uno de 2,6 kb que contenía la fusión. Este último se purificó a partir de gel y 600 ng se mezclaron
con 600 ng del vector suicida pCVD442 -digerido con Sac\-Sph\- y los fragmentos de ADN fueron
ligados como se describe en 3.2.2. La cepa de E. coli S17-1 Xpir se transformó con el producto
de la reacción y se seleccionó un clon que contenía el vector pCVD442 con el fragmento de 2,6
kb clonado y la construcción resultante se denominó pCVAmshA.
3.3.7 Deleción del gen mshA del cromosoma de V. cholerae. El plasmidio suicida pCVA mshA fue
introducido en V. cholerae mediante una conjugación, realizada en las condiciones que se indican
en 3.2.8. Se seleccionaron al azar varios de los clones Apr obtenidos (recombinantes simples) y
se crecieron por separado en LB líquido sin antibiótico a 37°C y 240 rpm durante toda la noche.
Alícuotas de estos cultivos crecidos se sembraron en placas separadas de LB-sacarosa y se
dejaron crecer a 37°C. Se tomaron diez colonias de cada placa y se replicaron en nuevas placas
de LB y LB-Ap. Se tomaron los clones que crecieron en LB pero no en LB-Ap (o sea que segregaron
el plasmidio anteriormente integrado) y se usaron para realizar un ensayo de infección (epígrafe
3.5.1) con el fago VGJ-Kn<(). Se tomaron varios clones resistentes a la infección con este fago
provenientes de cada cepa (638 ó 1333) y se estudiaron mediante hibridación de Southern para
corroborar que el gen mshA fue delecionado del cromosoma bacteriano.
3.4 Técnicas usadas en el trabajo con proteínas
3.4.1 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). Las
electroforesis de proteínas se realizaron según Laemmli (1970), utilizando geles con porcientos
de acrílamida variables adecuados para cada caso. Para proteínas pequeñas se realizó SDS- PAGE
en presencia de tampón trís-tricina (Ausubel y cois., 1995). Los geles fueron revelados con azul
Coomasíe o tinción de plata (Ausubel y cois., 1995).
3.4.2 Western blotting. Las muestras de proteínas a analizar fueron fraccionadas mediante SDS-
PAGE y transferidas a filtros de nitrocelulosa según lo descrito por Towbin y cois. (1979). Después
de bloquear el filtro con leche descremada al 5% en solución salina tamponada con fosfato (PBS:
NaCI, 137 mM; Na2HP04l 9,58 mM; KCI, 2,68 mM; KH2P04> 1,47 mM; pH 7,2), se añadió un
anticuerpo monoclonal (a una dilución apropiada en PBS/leche 2%) específico para cada proteína
analizada. Las membranas fueron lavadas con PBS-Tween (0,01%) e incubadas con conjugado
anti-lgG de ratón-peroxidasa (Sigma) en PBS/leche 2%. El revelado se realizó por adición de
diaminobenzidina (0,12 mg/mL) y H202 (0,012%) en Tris 20mM, pH 7,6.
3.4.3 Estudio de la expresión de MshA y TcpA en cepas de V. cholerae. La expresión de las
Materiales y Métodos Capítulo 3
42
subunidades proteicas MshA y TcpA en las cepas de interés se estudió en las siguientes
condiciones de crecimiento bacteriano: LB (pH 6,5; 30°C), LB (pH 7,0; 37°C), TSB (37°C) o TSBg
(37°C) a 240 rpm toda la noche y en medio AKI (por el procedimiento de Iwanaga y cois., 1986).
También se analizó la expresión en los medios DMEN y PFHM (epígrafe 3.1.2) los cuales se
inocularon a razón de 106 bacterias/mL como concentración celular inicial para cada cepa
analizada y se incubaron durante 8 h de manera estática a 37°C en una atmósfera de C02 al 5%.
Al final del crecimiento en cada condición la biomasa bacteriana fue sedimentada por
centrifugación a 10 000 x g durante 5 min y utilizada para preparar suspensiones celulares
homogéneas de densidad óptica a 600 nm (DO600) igual a 5. Estas suspensiones bacterianas se
mezclaron en una proporción 1:1 con tampón muestra SDS (SDS buffer sample) (Ausubel y cois.,
1995) y fueron hervidas durante 5 min. Seguidamente se aplicaron 10 pl de cada suspensión
bacteriana lisada en una SDS-PAGE y se analizaron mediante Western blotting con los anticuerpos
monoclonales antí-TcpA 10E10E1 (Falero y cois., 2003) y anti-MshA 2F12F1 (Falero y cois. 1998).
3.4.4 Identificación de proteínas mediante espectrometría de masa o secuenciación del extremo
amino terminal. Para la identificación de proteínas por espectrometría de masa se contrataron los
servicios de la División de Química-Física del CIGB. El análisis se realizó como sigue: la banda de
la proteína a analizar proveniente de una SDS-PAGE y teñida con azul de Coomasie fue cortada
del gel de poliacrilamida y desteñida 15 min en una solución de NH4HCO3 (50 mM) que contenía
50% de acetonitrilo y seguidamente fue lavada con agua (MiliQ, Millipore) durante 1 min. El trozo
de gel con la proteína fue cortado en cubos de aproximadamente 1 mm y se le adicionó acetonitrilo
al 90% hasta su deshidratación. El solvente fue desechado y los cubos de gel secados en la
centrífuga evaporadora y vueltos a hidratar en 25 ^l de NH4HCO3 (50 mM) más 12,5 ng de
tripsina. La mezcla de reacción se incubó toda la noche a 37 C en un agitador termostatado
(Millipore, EE.UU.) para producir la digestión proteolítica. Para extraer los péptidos producto de
la digestión se incubaron los cubos de gel en 40 jil de NH4HCO3 (50 mM) a 37 C durante una hora
para facilitar la difusión. A continuación, los péptidos fueron extraídos utilizando Ziptips C18
(Millipore, EE.UU.). La solución con los cubos de gel se acidificó con 2 jil de ácido fórmico al 90%
y se volvieron a extraer los péptidos empleando los Ziptips, los cuales fueron lavados
extensivamente con solución acuosa de ácido fórmico al 1%, los péptidos fueron eluidos en un
volumen de 2-3 jil de agua/acetonitrilo al 60% que contenía ácido fórmico al 0,1%. La solución de
péptidos eluidos fue aplicada en un capilar de borosilicato recubierto en oro (Micromass, RU) para
su análisis por espectrometría de masa. Los espectros de masas fueron obtenidos en un
espectrómetro de masas híbrido con geometría octogonal QTOF-2 (Micromass, RU) equipado con
una fuente de ionización nanospray. Los voltajes del capilar y el cono de entrada fueron fijados a
900 V y 35 V respectivamente. La entrada de la aguja fue ligeramente presurizada para garantizar
una buena calidad en el spray. El espectrómetro fue calibrado con una mezcla de yoduro de sodio
y cesio en el rango de 50-2 000 Da. El primer cuadrupolo fue fijado a una resolución de 3 a 4 Th
para seleccionar el ión precursor a fragmentar. El gas de colisión fue argón y la energía de colisión
empleada osciló entre 23 y 45 eV hasta lograr un espectro de masas con suficiente información
Capítulo 3 Materiales y Métodos
43
estructural que permitiese una identificación confiable de la proteína de interés en las bases de
datos. El programa de procesamiento de los espectros de masas empleado fue el MassLinx versión
3.5 (Micromass, RU). La identificación de proteínas se realizó utilizando el programa MASCOT(http://www.matrixscience.com/).
La identificación de proteínas mediante la secuenciación del extremo amino terminal se realizó
como sigue. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y fueron electrotransferidas hacia
membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) según fue descrito por Ausubel y cois. (1995).
Después de la transferencia, las membranas fueron teñidas con azul de Coomassie (0,1% en
metanol al 50%) durante 5 min y desteñidas con metanol al 50% agitando hasta que las bandas
de proteínas fueron claramente visibles (5-10 min). Seguidamente las membranas desteñidas
fueron lavadas dos veces con agua destilada durante 5 min y la banda correspondiente a la
proteína de interés fue recortada con un bisturí nuevo. La pieza de membrana recortada fue
utilizada para secuenciar el extremo amino terminal de la proteína medíante el método de
degradación de Edman utilizando un secuenciador automático Applied Biosystem Procise (Foster
City, California, EE.UU.) según fue descrito por Geisow y Aitken (1989).
3.4.5 Cuantificación de la producción de la toxina del cólera. La producción de toxina colérica fue
determinada en medio AKI (Iwanaga y Yamamoto, 1985) o LB. La determinación se realizó
mediante un ensayo inmunoenzimático de enzima ligada dependiente del gangliósido GM1 (GM1-
ELISA) según fue descrito por Holmgren (1973) y utilizando una curva
Materiales y Métodos Capítulo 3
44
patrón de toxina colérica purificada (Sigma) y el anticuerpo monodonal 1G10G5 (Benítez y cois.,
1996) contra la subunidad A de la toxina.
3.4.6 Análisis de las secuencias aminoacídicas. El programa BLASTP (Altschul y cois.
1997) se utilizó para buscar similitud con las secuencias peptidicas depositadas en las bases de
datos internacionales. El programa ClustalW (Thompson y cois., 1994) se utilizó para realizar los
alineamientos de secuencias. Las predicciones de regiones transmembranosas en las proteínas
estudiadas y su orientación en la membrana se realizaron con el programa TMpred (Hofmann y
Stoffel, 1993) (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html).
3.5 Técnicas usadas en el trabajo con fagos
3.5.1 Ensayo de infección-titulación. Para los ensayos de infección la cepa de V. cholerae donante
del fago se cultivó hasta una DO600=1,5 en LB. Se eliminaron las células de 1 mL de este cultivo
mediante centrifugación y filtración (filtros Sartorius de 0,22 fim) del sobrenadante. Se sembró
una alícuota de 50 (iL del filtrado en una placa de LB sólido, la cual se incubó a 37°C toda la noche
para comprobar la esterilidad por ausencia de colonias. Se usaron 100 p.l del sobrenadante libre
de células, o diluciones del mismo, para infectar ~10 células de un cultivo fresco de la cepa usada
como receptora (suspendidas en 20 jíL de LB) y esta mezcla de infección se incubó durante 20
min a temperatura ambiente. Seguidamente, la mezcla se añadió a un tubo de ensayo que
contenía 3 mL de LB-agar suave (agar 0,4%, Oxoíd, RU) fundido a 42°C, se homogeneízó y se
vertió rápidamente sobre placas Petri de LB sólido. Las placas se incubaron toda la noche a 37°C
y a continuación se contaron las unidades formadoras de placas (UFP). En el caso de los fagos
marcados con un gen de Knr la mezcla de sobrenadante filtrado y células receptoras se sembró
directamente en LB sólido suplementado con Kn. Igualmente, las placas se incubaron toda la
noche a 37°C y a continuación se contaron las unidades formadoras de colonias (UFC) Knr. En
ambos casos el número de UFP y UFC es aproximadamente equivalente al número de partículas
de fago en el sobrenadante filtrado, lo cual permitió determinar los títulos de partículas virales en
cada sobrenadante ensayado. Alternativamente, la mezcla de infección se sembró en LB líquido
para purificar partículas virales o ADNcs genómico según se describe en los epígrafes 3.5.3 y
3.5.4.
3.5.2 Aislamiento de fagos de V. cholerae. El aislamiento de fagos de V. cholerae se realizó
mediante una búsqueda entre todas las cepas tipo salvaje que se muestran en la tabla
excepto 569B, que se conocía de antemano que no portaba ningún fago activo. El método de
búsqueda consistió en realizar ensayos de infección, como se describe en el epígrafe 3.5.1,
utilizando sobrenadantes de cultivo filtrados de todas estas cepas tipo salvaje como donantes y
como cepa receptora a la cepa 569B. La infección con un posible fago, proveniente de alguna de
las cepas donadoras analizadas, se evaluó en primer lugar mediante la formación de placas de
lisis en un césped de células de la cepa receptora 569B. Debido a que no se observaron placas
de lisis se utilizó un segundo procedimiento para detectar la presencia de fagos. Este consistió
en evaluar la adquisición, por la cepa receptora 569B, de un elemento genético
extracromosomal (episoma) ausente en esta cepa antes del ensayo de infección. La presencia de
algún episoma después del ensayo de infección se evaluó mediante purificación de ADN
plásmidico (epígrafe 3.2.1) de la cepa receptora 569B. Cuando se detectó la presencia de algún
episoma se confirmó si este estaba presente en la cepa donante usada en el ensayo de infección
respectivo (igualmente medíante purificación de ADN plásmidico). Para comprobar la identidad
entre el episoma purificado de la cepa receptora y la donante los ADNs de ambas cepas fueron
digeridos con varías enzimas de restricción. Seguidamente los ADNs digeridos se aplicaron en
Capítulo 3 Materiales y Métodos
45
una electroforesís de ADN para comparar los patrones de bandas. Una vez comprobado que las
cepas donante y receptora contenían un mismo episoma se asumió que este era la FR de un
fago, puesto que se transmitió de la cepa donante a la receptora sin que mediase contacto
célula-célula.
3.5.3 Purificación de las partículas virales a partir de cultivos infectados. Se tomaron 100 mL de
un cultivo infectado (como se describe en el epígrafe 3.5.1) crecido durante 14 h y se
centrifugaron a 8 000 x g durante 10 min. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de
0, 45 (Sartorius) para eliminar las células que aún pudieran estar presentes. Al filtrado se le
añadió polietilenglicol 6000 al 5% y NaCI al 3% m/v. La mezcla se incubó 30 min en hielo para
precipitar las partículas de fago y se centrifugó a 12 000 x g durante 20 min. El sedimento, que
contenía las partículas virales, se resuspendió en 1 mL de PBS.
3.5.4 Purificación de ADNcs genómico viral. Las partículas de fago aisladas según se explicó en
3.5.2 fueron tratadas con fenol/cloroformo (1:1) para eliminar las proteínas de la cápsida. Para
ello se tomó una alícuota de 200 |aL de la suspensión de fagos y se mezcló vigorosamente con
un volumen de fenol/cloroformo, las fases se separaron por centrifugación (1 min a 12 000 x g) y
se tomó la fase acuosa superior a la cual se le repitió el procedimiento hasta que la interfase se
observó limpia de proteínas. Una vez eliminadas las proteínas, el ADNcs en la fase acuosa se
precipitó con 1/3 de volumen de NH4Ac 7,5 M y 2,5 volúmenes de etanol absoluto. La mezcla se
incubó 10 min a temperatura ambiente y se centrifugó a 12 000 x g durante 15 min. El ADNcs
obtenido en el sedimento se lavó con etanol al 70%, se centrifugó nuevamente a 12 000 x g
durante 2 min. El ADN fue secado y resuspendido en 100 I^L de agua desíonizada estéril y se
chequeó por electroforesís.
3.5.5 Purificación de la forma replicativa de los fagos. Como la forma replicativa se comporta como
un plasmidio, la misma fue purificada según se describe en el epígrafe 3.2.1.
3.5.6 Microscopía electrónica. Las partículas de fago purificadas fueron teñidas negativamente
con acetato de uranilo al 4% (m/v) y se montaron en rejillas de cobre recién cubiertas con
Formvar, las cuales fueron observadas en un microscopio electrónico de transmisión JEM-
2000EX (JEOL, Japón). Varias partículas individuales del fago fueron medidas y se calculó la
talla promedio de éstas.
3.5.7 Integración de VGJ-Kn<j> en el cromosoma bacteriano. La integración de VGJ-Kmj) en
el cromosoma de la cepa 1333 de V/. cholerae se obtuvo utilizando una estrategia in vivo en la
cual 105 células diluidas en 50 \d de PBS de esta cepa, infectada con VGJ-Kn<t>, fueron
inoculadas orogástricamente en ratones Balb/c lactantes sometidos a 4 h de ayuno antes y
después de la inoculación. Los ratones inoculados fueron devueltos a sus madres y al séptimo
día se sacrificaron para extraer los intestinos delgados, que se homogeneizaron en 5 mL de
PBS con un homogeneizador de cuchillas modelo Ultraturrax (IKA, Ebersberg, Alemania) a 13
500 rpm durante 10 s. Los homogenados puros o diluidos se extendieron en placas de LB sólido
46
suplementado con Kn para recobrar los vibriones colonizadores que retenían el fenotipo Knr.
Doce clones Knr fueron analizados en cada caso para estudiar la integración de VGJ-Kn<j> en
un sitio predicho del cromosoma bacteriano mediante hibridación de Southern. La integración
se confirmó mediante amplificación por PCR y secuenciación (como se describe en las secciones
3.2.4 y 3.2.6) utilizando oligonucleótidos que hibridaban a ambos lados de cada una de las
nuevas uniones entre el ADN del fago y el cromosoma bacteriano. Los oligonucleótidos NJ1 y
NJ2 (Tabla 2) fueron usados para amplificar la región de ADN que contenía la unión izquierda,
mientras que los oligonucleótidos VGJphi3 y NJ4 (Tabla 2) fueron usados para amplificar la
región que contenía la unión derecha. Los productos amplificados fueron secuenciados con los
mismos oligonucleótidos.
3.5.8 Estabilidad de HybP-Kn<(> en el hospedero bacteriano. La estabilidad de HybP-Kn<j)
in vitro se evaluó en la cepa 1333 infectada con este fago [1333(HybP-Kn<)))], está se inoculó
en caldo LB sin antibiótico y se incubó a 37°C y 240 rpm hasta la fase estacionaria tardía (24
h) de crecimiento. Seguidamente, diluciones del cultivo se sembraron en LB sólido con y sin
Kn para determinar la proporción de células infectadas (Knr) con respecto al número total de
bacterias (UFC KnVUFC totales). Paralelamente se estudió la integridad de HybP-Kn<)> por
análisis de restricción de la FR purificada de 12 clones independientes Knr.
La estabilidad de HybP-Kn<j> en su estado replicativo o integrado se estudió in vivo en el
modelo del ratón lactante. Diez ratones Balb/c fueron inoculados orogástricamente con 10®
células de 1333(HybP-Kn<|>) o 1333-Hybl2 (un integrante de HybP-Kn<t> en 1333), e
incubados 24 h a 30 C sin sus madres. Los ratones se sacrificaron y los intestinos delgados se
extrajeron y homogeneizaron en 5 mL de PBS con un homogeneizador de cuchillas Ultraturrax
(13 500 rpm, 10 s) para recobrar los vibrios que colonizaron. Nuevamente se determinó la
proporción de células Knr sobre el total de vibriones recobrados y se estudió la integridad de
HybP-Kn<t> mediante un análisis de restricción de la FR en el caso del estado replicativo o
mediante Southern blotting en el caso del estado integardo.
3.6 Técnicas utilizadas en el trabajo con V. cholerae3.6.1 Evaluación de la virulencia de cepas de V. cholerae. La toxicidad fue evaluada en el
modelo del ratón lactante mediante inoculación orogástrica de grupos de 15 ratones lactantes
Balb/c. Cada ratón se inoculó con 106 células de la cepa a evaluar diluidas en 50 pl de PBS. Los
ratones se sometieron a 4 h de ayuno antes y después de la inoculación, posteriormente se
devolvieron a sus madres y se incubaron durante 6 días. La sobrevivencia fue seguida
diariamente durante ese tiempo.
3.6.2 Estudio morfológico. Muestras de la fase exponencial y de la fase estacionaria de cultivos
de V. cholerae fueron observadas al microscopio óptico para analizar la morfología de las células
bacterianas. Para ello se tomaron 10 p.L de los cultivos y se extendieron en un portaobjeto.
Las preparaciones se fijaron con calor, se tiñeron con violeta cristal durante 1 min, luego se
lavaron con agua destilada y se observaron al microscopio. Se analizaron cualitativamente
Capítulo 3 Materiales y Métodos
47
varios aspectos: forma de coma, largo y grosor bacteriano.
3.6.3 Ensayo de movilidad. Para evaluar la movilidad de V. cholerae, colonias aisladas de una
placa fresca de LB fueron inoculadas por punción (2-3 mm de profundidad) en una placa de LB
con agar al 0,3%. El diámetro de expansión de cada colonia en el agar suave fue medido al
cabo de 24 h de incubación a 30 °C. Se considera que una cepa bacteriana no es móvil si posee
un diámetro de 2 mm o menos a partir del punto de aplicación.
3.6.4 Caracterización serológica de V. cholerae. Una colonia fresca de ~1,5 mm de diámetro
de la cepa a caracterizar crecida en LB fue resuspendida en 30 |iL de solución salina (NaCI
0,9%) y esta suspensión bacteriana fue depositada en tres gotas separadas de 10 ^l cada una
sobre un portaobjetos. Seguidamente se añadieron 10 ^iL de cada uno de los antisueros anti-
OI, anti-Ogawa o anti-lnaba (Murex Biotech Ltd, RU) a cada gota, se homogeneizaron las tres
suspensiones por movimiento suave circular del portaobjetos y se inspeccionó visualmente la
presencia de aglutinación.
Materiales y Métodos
Capítulo 3
48
3.6.5 Ensayo de la actividad endoglucanasa del gen celA en las cepas de V. cholerae marcadas
con este gen. Las cepas a evaluar fueron estriadas por agotamiento en placas de LB sólido e
incubados toda la noche a 37°C. Posteriormente las placas fueron cubiertas con una capa fina
de agar-carboximetilcelulosa (0,5% de agar y 0,1% carboximetilcelulosa en tampón fosfato-
citrato (K2HP04 65 mM y ácido cítrico 13 mM) e incubadas durante 3 h a 70°C. Una vez
transcurrido este tiempo las placas se tiñeron con rojo congo (Sigma) al 1% durante 5 min y
posteriormente se lavaron con NaCI al 10% para desteñir. Las colonias con un halo transparente
alrededor que contrasta con el fondo rojo se consideraron celA*.
3.6.6 Determinación del tiempo de duplicación de V. cholerae. Se determinó el tiempo de
duplicación de cada cepa estudiada en 50 mL de medio LB (en erlenmeyers de 250 mL) a 37°C
y 240 rpm. Para ello se inocularon ~107 células de cada cepa en los 50 mL del caldo de cultivo
a partir de un precultivo crecido durante toda la noche en LB. La DO600 fue determinada cada 30
min luego del comienzo de la fase exponencial del cultivo y hasta que se alcanzó la fase
estacionaria. Se tomaron varios tiempos de la fase exponencial temprana del cultivo con sus
valores logarítmicos de DO600 respectivos y se realizó una regresión lineal con estos datos. El
valor de la pendiente de la recta de mejor ajuste (B) se utilizó para calcular el tiempo de
duplicación (tdupt) de cada cepa según la siguiente expresión: tdupi=lg2/B. Los valores del tdupi
se obtuvieron de al menos tres réplicas independientes para cada cepa y se calculó el valor
promedio y su desviación estándar.
3.6.7 Ensayo de colonización de V. cholerae en el modelo de ratón lactante. Grupos de
10 ratones BalB/c de 3 a 5 días de nacidos y separados de sus madres durante 4 h fueron
inoculados orogástricamente con 107-108 células de las cepas a evaluar suspendidas en 50 (iL
de PBS. Las células para el inoculo fueron crecidas en 5 mL de LB a 37°C hasta una D060o=1-
Los ratones se sometieron a 4 h de ayuno antes y después de la inoculación y fueron
devueltos a sus madres. Al cabo de las 24, 72 y 120 h fueron sacrificados grupos de 3 ratones
por cada cepa inoculada, se les extrajeron los intestinos delgados y luego de lavarse con PBS,
estos fueron homogeneizados en 5 mL de PBS (13 500 rpm, 10 s con un homogeneizador
Ultraturrax). El extracto crudo y diluciones seriadas de cada homogenado fueron extendidos en
placas de LB-Pol para contar los vibriones que fueron capaces de colonizar el intestino de los
ratones.
Capítulo 4 Resultados
49
4 RESULTADOS
4.1 Aislamiento de fagos de V. cho/eraeCon el objetivo de aislar fagos de V. cholerae se realizó una búsqueda (como se describe en el
epígrafe 3.5.2) entre todas las cepas tipo salvaje que se muestran en la tabla 1 (excepto 569B).
Estas cepas se utilizaron como donantes en ensayos de infección (epígrafe 3.5.1) y como
receptora se utilizó la cepa 569B, puesto que se conocía de antemano que esta no portaba
ningún fago activo. La infección de 569B con un fago proveniente de alguna de las cepas
donantes se evaluó medíante purificación de ADN extracromosomal (plasmídico) de 569B. El
hallazgo de transmisión de elementos extracromosomales (episomas) desde alguna de las
cepas donantes tipo salvaje hacía 569B, sin que mediase ningún tipo de contacto célula- célula,
sería indicativo de que estos episomas eran las formas replicativas (FRs) de fagos que
generaban partículas infectivas al sobrenadante de cultivo de la cepa donante. Siguiendo este
procedimiento se encontró que las cepas de U. cholerae SG25-1 y M045, pertenecientes al
serogrupo 0139, transmitieron un episoma cada una a la cepa receptora 569B en ensayos de
infección y por tanto estos episomas se consideraron como las FRs de fagos. Un análisis de
restricción de las FRs indicó que estas pertenecían a fagos diferentes. El fago proveniente de
la cepa SG25-1 se denominó VGJ<)> y el proveniente de la cepa M045 se denominó VEJ<t>.
Se seleccionó el fago VGJcJ) arbitrariamente para realizarle una caracterización más
exhaustiva.
4.2 Caracterización y purificación del fago VGJ (|>
Con un propósito confirmatorio se estudió la capacidad de la FR del fago VGJ<j) para
transmitirse horizontalmente desde la cepa 569B hacia otras cepas de V. cholerae, en este caso
las cepas 0395 y Peru-15. Se comprobó que células de 569B, que adquirieron el episoma de la
cepa SG25-1, también fueron capaces de transmitir este elemento extracromosomal hacia las
cepas 0395 y Peru-15 sin necesidad de contacto célula-célula, lo que confirmó que el episoma
transmitido era la FR de un fago (Fig. 13). En ningún caso se observó lisis celular en los cultivos
infectados con VGJ<j>, lo que sugirió que podía ser un miembro de los fagos filamentosos, los
cuales son secretados continuamente por las células infectadas sin provocar lisis del hospedero
(Marvín, 1998). Un análisis de restricción con varias enzimas indicó que la FR de VGJ<|) era
una molécula de ADN de cadena doble (ADNcd) circular superenrrollada. Se llegó a la
conclusión de que era una molécula circular ya que la FR sin tratar con ninguna enzima de
restricción y sometida a electroforesis migró con una talla molecular aparente más pequeña
que cuando fue digerida con enzimas que cortan solo una vez en la molécula (Fig. 14). Además,
Capítulo 4 Resultados
50
si la molécula fuera lineal debió producir dos fragmentos de ADN al ser digerida con estas
enzimas de sitio único, lo cual no fue observado en el experimento. El mismo análisis de
restricción permitió estimar que el tamaño aproximado de la
FR es ligeramente menor que 8 kb (Fig. 14), talla que también es compatible con el tamaño
genómico de los fagos filamentosos, el cual fluctúa entre 5 y 10 kb. El patrón de bandas de la
FR, obtenido del análisis de restricción (Fig. 14), fue diferente al que producirían las FRs de los
fagos filamentosos de V. cholerae previamente descritos de los cuales se conoce la secuencia
nucleotídica completa o el mapa de restricción. Por tanto, este fago proveniente de la cepa
SG25-1 era un fago no descrito anteriormente y era probablemente un miembro de los fagos
filamentosos.
1 2 3 4 5 6 7
Figura 13. Electroforesis en gel de agarosa de preparaciones de ADN plasmídico sin digerir purificado de las siguientes cepas de V. cholerae: 1,SG25-1; 2, 569B; 3, 569B/Ep¡ (569B expuesta a sobrenadante de cultivo libre de células de la cepa SG25-1); 4, 0395; 5, 0395/Epi (0395 expuesta a sobrenadante de cultivo de la cepa 569B/Epi ); 6, Peru-15 y 7, Peru-15/Epi (Peru-15 expuesta a sobrenadante de cultivo de la cepa 569B/Epi). Se puede apreciar más de una banda debido a la presencia de diferentes isoformas de la misma molécula de ADN.
Capítulo 4 Resultados
51
Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa de la FR del fago VGJ<|> digerida con diferentes enzimas de restricción. En los extremos del gel se aplicaron los marcadores de talla molecular (MTM) con la talla de cada banda señalada en pb. En el resto de los carriles se aplicó la FR sin digerir o digerida con las enzimas que se indican encima de cada carril. Comopuede observarse el tamaño de la molécula linealizada (enzimas Avall,Bgl\, C/al, EcoRI, EcoRV, KpnI, Xba\ y Xho\) es de aproximadamente 8 kilobases.
VGJ<|) se purificó a partir del sobrenadante de cultivo de la cepa 569B infectada con dicho fago
mediante precipitación (epígrafe 3.5.3). Se utilizó la cepa 569B para purificar el fago porque
esta pertenece al biotipo clásico, que contiene profagos defectivos de CTX<t> integrados en el
cromosoma; o sea, profagos incapaces de generar la FR extracromosomal y por tanto incapaces
de exportar partículas virales (Davís y cois., 2000b), característica que elimina la posibilidad de
contaminación con partículas del fago CTX<j>. El proceso de purificación empleado no afectó a
las partículas virales de VGJ<j>, al menos apreciablemente, ya que el fago purificado mantuvo
su capacidad infectiva. El ácido nucleico extraído de las partículas virales purificadas fue
resistente a la digestión con ribonucleasa H (Fig. 15A), lo que indicó que el genoma no estaba
compuesto por ARN, sino por ADN. Este ADN fue resistente al tratamiento con diferentes
enzimas de restricción, pero fue sensible al tratamiento con enzimas que degradan al ADN de
cadena simple (ADNcs) como la nucleasa Mung-Bean, resultados que indicaron que el genoma
del fago estaba constituido por ADNcs (Fig. 15A). Para confirmar esto se realizó una
electroforesis en gel de agarosa del ADN genómico del fago en presencia de naranja de acridina
(Carmichael y McMaster, 1980). Bajo esas condiciones el ADN genómico del fago fluoresció
naranja, lo que demostró que estaba compuesto por ADNcs (Fig. 15B), mientras que su FR
fluoresció verde, lo que indicó que estaba compuesta por ADN de cadena doble (ADNcd) (Fig.
15B) Carmichael y McMaster, 1980). También se detectó la presencia de cierta cantidad de
ADNCS en preparaciones de ADN de la FR lo que demuestra que l aFR coexiste con el ADNCS
genómico en le citoplasma de las células infectadas (Fig. 15B, carril 2).
Capítulo 4 Resultados
52
La sonda VGJ-S1, generada usando como molde el ADNcs genómico de VGJ(*)> (Tabla 3),
hibridó tanto con el ADNcs genómico como con la FR de VGJ<j) (Fig. 15C), lo cual confirmó
que el ADNcs del genoma viral es producido a partir de la FR en el citoplasma celular. Estos
resultados fueron compatibles con la hipótesis de que VGJ<|> podía ser un miembro de los
fagos filamentosos, los cuales poseen un genoma circular de ADNcs que se genera a partir de
la FR de ADNcd por el mecanismo de replicación del circulo rodante (Asano y cois., 1999). La
naturaleza filamentosa de VGJ* se comprobó mediante observación al microscopio electrónico
de las partículas virales purificadas (Fig. 16). Solo se observaron estructuras filamentosas en
las preparaciones de fagos que provenían de los sobrenadantes de cultivos infectados y no asi
en los cultivos sin infectar usadcs como control (datos no mostrados), lo que excluyó la
posibilidad de que los filamentos observados fueran fimbrias o flagelos de las células
bacterianas. Las partículas vírales de VGJ* mostraron una tendencia a asociarse íntimamente
bajo las condiciones de preparación utilizadas en este estudio (Fig. 16), incluso en
preparaciones diluidas. Sin embargo, se lograron observar algunos filamentos aislados, lo que
permitió estimar el tamaño aproximado del vírión en 7 nm de diámetro por 1 000 nm de
Longitud.
Figura 16. Microfotografía del fago VGJ<)> observado almicroscopio electrónico. La mayoria de los filamentos que se observan están formados por dos o tres filamentos de fagos individuales trensados entre sí e interconectados formando una red. La zona enmarcada en la imagen de la izquierda fue ampliada a la derecha. En la ampliación se observa una partícula viral individual señalada por flechas. La barra en la imagen izquierda equivale a 500 nm y en la derecha a 100
Capítulo 4 Resultados
53
Tanto SG25-1, la cepa de donde se aisló originalmente VGJ<|), como 569B, utilizada para la purificación, son cepas toxigénicas de V. cholerae que contienen profagos CTX<|> residentesen el cromosoma bacteriano cuyos genes son funcionales (Davis y cois., 2000b). Por tanto, existía la posibilidad de que algún o algunos de los genes del fago CTX<j) contribuyeran a la morfogénesis de VGJ<t>, tal como ocurre con el fago satélite RS1 (Davis y Waldor, 2003). Sin embargo, VGJ<j> es un fago independiente de CTXf ya que la cepa Peru-15 de \/. cholerae, que carece de todos los genes de este último (Kenner y cois., 1995), fue infectada eficientemente por este fago y secretó partículas virales al medio de cultivo de modo normal (Fig. 13).
4.3 Secuencia nucleotídica y organización genómica de VGJ<(*)
La secuencia nucleotídica completa de VGJij) se determinó ensamblando las secuencias
obtenidas de varios fragmentos de la FR del fago, clonados en el plasmidio pl) C19, y las
secuencias obtenidas mediante secuenciación directa del ADNcs genómico del fago (Fíg. 12).
La secuencia completa del fago se muestra en el anexo A1 y fue depositada en las bases de
datos GenBank (National Center for Biotechnology Information -NCBI-, USA), EMBL (European Bioinformatic Institute) y DDBJ (DNA Data Bank ofJapan) con el número de acceso AY242528.
El genoma de VGJ<|> está compuesto por 7 542 nucleótidos y posee un contenido de G+C
de un 43,4%, que difiere ligeramente del contenido de G+C de su hospedero V. cholerae -47,7% el cromosoma I y 46,9% el cromosoma II- (Heidelberg y cois., 2000).
Un análisis de la secuencia obtenida mediante el paquete de programas Vector NTI Suite 6 (InforMax, Inc.) permitió identificar los marcos de lectura abiertos (ORFs) que con mayor
probabilidad constituían genes funcionales del fago. Se analizaron todos los ORFs con un
tamaño mayor de 25 aa de las secuencias de las dos cadenas complementarias de ADN de la
FR de VGJf Los productos proteicos teóricos de estos ORFs fueron comparados mediante el
programa BLASTP (Altschul y cois. 1997) con la base de datos no redundante del NCBI. En la
Tabla 4 se muestran los ORFs de VGJ<t> para los cuales se encontró similitud con una o más
proteínas de la base de datos, así como los valores de identidad y similitud entre ellas.
También se muestra el equivalente funcional hipotético de cada ORF de VGJ<)> (cuando
existe) en el fago M13. De un total de 13 ORFs seleccionados sobre la base de similitud a nivel
de secuencia aminoacídica con otras proteínas, 10 codificaban productos proteicos similares a
proteínas de fagos filamentosos previamente descritos. Esto permitió confeccionar un mapa
de la estructura genómica de VGJ<)> con los ORFs que con mayor probabilidad constituían
genes funcionales del fago (Fig. 17). Cada ORF fue nombrado de acuerdo al número de
aminoácidos (aa) del producto respectivo que codifica. Tomando en cuenta estas similitudes a nivel proteico se realizó un alineamiento del mapa genómico de VGJ<t> con los mapas genómicos de fagos filamentosos canónicos bien conocidosdel grupo Ff de E. coli (fagos M13, f1 y fd) y con el mapa del fago CTX<j> de V. cholerae (Fig.
Capítulo 4 Resultados
54
17). Como resultado del alineamiento los ORFs de VGJ<|), cuyos productos proteicos presentaron similitud con proteínas de función conocida de otros fagos filamentosos, alinearon correctamente con los genes de función equivalente en CTX<j> y M13 (fago que se tomó como modelo del grupo Ff) (Tabla 4, Fig. 17). Aun cuando no se encontró similitud significativa entre las secuencias peptídicas codificadas por los ORFs de VGJ<j> y las proteínas conocidas de M13, los mapas genómicos de ambos fagos presentaron una similitud evidente en cuanto a tamaño y posición relativa de los ORFs/genes dentro de sus genomas respectivos (Fig. 17). En el caso de CTX<|), además de la similitud en cuanto a tamaño y posición de los ORFs/genes, se
encontró similitud a nivel de secuencia aminoacídica con los productos proteicos de dos ORFs
de VGJ< (> (Tabla 4, Fig. 17). Estos resultados indicaron que VGJ<)> presenta una
organización genómica modular similar a la de los fagos filamentosos bien conocidos M13 y
CTX<j> (Waldor y Mekalanos, 1996; Marvin, 1998), en la cual los genes con funciones
similares se encuentran agrupados en módulos morfofuncionales (Hill y Petersen, 1982; Waldor
y Mekalanos, 1996) (Fig. 17).
Capítulo 4 Resultados
55
Figura 17. Organización genómica del fago VGJ<j> comparada con la de los fagos CTX(j)y M13. Los mapas lineales de los fagos VGJcj), CTX<)> y M13 aparecen alineados por la primera base del gen que codifica la proteína de la replicación. Los ORFs o genes se representan como flechas orientadas en el sentido de la transcripción. El módulo de replicación se representa en negro, el módulo estructural en gris y el módulo de ensamblaje y secreción en rayado con líneas inclinadas hacia la derecha. El módulo de regulación de VGJ<j> que codifica a represores hipotéticos, así como el gen que codifica al represor RstR de CTXcf) se muestran en rayado con líneas inclinadas hacia la izquierda. Las funciones de algunos ORFs de VGJ<j> fueron asignadas por similitud a nivel de secuencia aminoacídica o por presentar un tamaño y posición similar dentro del genoma con respecto a genes conocidos de otros fagos como CTXtj) y M13. Los ORFs de VGJ fueron denominados de acuerdo con el número de aa especificados por estos. Los genes de M13 y CTX<f> se representan con sus denominaciones usuales y el tamaño en aa de cada producto génico se indica entre paréntesis. También se muestran las principales regiones intergénicas de VGJ (Ig) y la región que contiene los sitios att. La zonaenmarcada con líneas discontinuas denota una región aumentada en la Fig. 20B.
La secuencia de la proteína codificada por el ORF359 de VGJ (|> y de la proteína RstA de CTX<}> comparten un 40% de identidad aminoacídica a lo largo de una región de 264 aa. Además, ambas proteínas poseen igual tamaño y ocupan una misma posición relativa dentro de los genomas de ambos fagos (Tabla 4, Fig. 17). La proteína RstA es necesaria para la replicación de CTX<(> mediante el mecanismo del círculo rodante (Waldor y cois., 1997). El ORF359 también es similar en cuanto a secuencia peptídica, tamaño y posición relativa dentro del genoma a genes de otros fagos filamentosos previamente descritos (Tabla 4), los cuales a su vez son homólogos al gen gli de M13.Este gen codifica la proteina pll, necesaria para la replicación del genoma de este fago por el mecanismo del círculo rodante (Horíuchi, 1986;
56
Capítulo 4 Resultados
Horiuchi. 1997). Al Igual que RstA en CTX y pll en M13, el producto codificado por el ORF359 pudiera codificar una
proteína necesaria para la replicación en VGJf
La secuencia aminoacídtaa deducida del ORF112 fue también similar en cuanto tamaño y posición relativa en el
genoma a proteínas que tienen función de unión a ADNcs (single- stranded DNA binding proteins) en otros fagos
filamentosos como M13, Ike, I2-2 y f (Wen y Tseng, 1994; Marvin, 1998). Estas proteínas son equivalentes
funcionales de la proteína pV del colifago M13. La proteína pV impide que durante la replicación el genoma viral de
ADNcs sea convertido a la FR de ADNcd antes del ensamblaje de la partícula viral (Stassen y cois, 1994). El ORF112
podría realizar una función similar en la replicación de VGJ (>. Estos resultados indicaron que los ORF359 y el
ORF112 podrían formar el módulo de la replicación de VGJ<f>, representado en negro en la Fig. 17.
Los productos proteicos de los ORFs 81, 44, 29, 493 y 80 exhibieron similitud en cuanto a secuencia proteica y/o
tamaño y posición con los genes que codifican las proteínas estructurales de la cápsida de otros fagos filamentosos
previamente descritos (Tabla 4), entre los que se encuentran M13 y CTXc|> (Fig. 17). Un análisis teórico de los
productos codificados por estos cinco ORFs, realizado con el programa TMpredict, reveló la existencia de dominios
transmembranosos en estas proteínas (Anexo A2). Esto concuerda con lo que está comprobado experímentalmente
para las proteínas de la cápsida de los colifagos Ff, las cuales se insertan en la membrana interna bacteriana antes
de ser ensambladas para formar el virión (Marvin, 1998). Estos resultados sustentan que los ORFs 81, 44, 29, 493
y 80 podrían formar el módulo estructural que codifica los genes de la cápsida de VGJtj (*).
Figura 18. Alineamiento de la secuencia aminoacídica del ORF44 de VGJ<j) con la de las proteínas pVI11 de losfagos M13 e Ike de E. coli y Vf33 de V. parahaemolyticus. La posición que contiene residuos cargados en lasregiones NH2- o COOH-terminales de cualquiera de los péptidos maduros se muestra encima de cada posición con - o + según la carga del residuo. El número entre paréntesis al inicio de cada secuencia denota la posición del primer aa incluido en el alineamiento para cada proteína. El color de cada residuo sigue el siguiente esquema: negro, residuos no similares en ninguna de las proteínas; rojo, residuo completamente conservado en la posición respectiva, azul, residuo consenso conservado más de un 50% en la posición respectiva; verde, residuo similar al residuo consenso de la posición respectiva y gris, residuo débilmente similar al residuo consenso de la posición respectiva.
Particularmente, el producto codificado por el ORF44 fue similar a algunas de las proteínas mayoritarias de la
cápsida de otros fagos filamentosos conocidos (Fig. 18). Una comparación de las secuencias aminoacídicas de estas
proteínas y el producto del ORF44 reveló que este último contiene un dominio central hidrofóbico rodeado por las
regiones NH2- y COOH- terminales ricas en aminoácidos cargados (Fig. 18). Se conoce que la proteína mayoritaria
de la cápsida de los fagos filamentosos como el M13 posee un dominio central hidrofóbico rodeado por la región
NH2-terminal cargada negativamente, que interactúa con el medio hidrofílico, y por la región COOH-terminal
cargada positivamente, la cual interactúa con el ADN del interior de la cápsida (Marvin, 1998). Estos resultados
sugierieron que el ORF44 codificaba la proteína mayoritaria de la cápsida de VGJ<j).
Por otra parte, el ORF493 fue similar en cuanto a tamaño y posición a los genes glll de M13 y g///0™ de CTX<)>, que
codifican a plll y plllCTX (Fig. 17), proteínas minoritarias de la cápsida de estos fagos necesarias para el
Capítulo 4 Resultados
57
reconocimiento de las fimbrias receptoras en la célula hospedera (Lubkowski y cois., 1999; Heilpern y Waldor,
2003). Por tanto, el ORF493 de VGJ<)>, es probablemente un homólogo funcional de los genes glll y g///01* de
M13 y CTXf El producto codificado por el ORF384 resultó ser homólogo a la proteína pl del fago <(>Lf de
Xanthomonas campestrís (31% de identidad a lo largo de 164 aa) (Chang y cois., 1998b) y a la proteína Zot de
CTX<)> (25% de identidad a lo largo de 247 aa) (Waldor y Mekalanos, 1996) entre otras (Tabla 4). El ORF384 de
VGJ<)) es también similar en cuanto a tamaño y posición relativa dentro del genoma al gen gl, que codifica la
proteína pl en el fago M13, la cual es necesaria para la morfogénesis de las partículas virales (Marvin, 1998). Es
altamente probable que el producto del ORF384 realice la misma función en el ensamblaje de VGJ<j> que realiza
pl en el ensamblaje de M13. Por tanto, el ORF384 debe corresponder al módulo de ensamblaje y secreción de
VGJtj). Este módulo estaría formado por un solo gen en VGJ<f> ya que no se encontró ningún ORF similar al gen
glV de M13 (Fig. 17), el cual codifica la porina pIV que es necesaria para la secreción de este fago y que forma
parte del módulo de ensamblaje y secreción del mismo (Marvin, 1998).
Los péptidos codificados por el ORF136 y el ORF154 fueron similares a reguladores transcripcionales hipotéticos de
otros fagos filamentosos (Tabla 4). Además, el péptido codificado por el ORF154 fue similar a represores
transcripcionales bacterianos codificados cromosomalmente, tales como TrbA de Rhodococcus equis (Takai y cois.,
2000) y un regulador transcripcional de la familia Lacl de Thermotoga marítima (Nelson y cois., 1999) (Tabla 4).
Tanto el ORF136 como el ORF154 se localizaron en dirección opuesta a todos los ORFs de VGJ<j) descritos
anteriormente (Fig. 17). En CTX<)>, el gen rstR, se transcribe en dirección opuesta al resto de los genes de este
fago, y se sabe que codifica el represor de la transcripción RstR, que regula la expresión de todos los demás genes
de CTX<|> (Kimsey y Waldor, 1998; Davis y cois., 2002). Probablemente, los productos codificados por el ORF136
y el ORF154 tengan una función similar en la regulación de la expresión génica en el fago VGJ<j> y en conjunto
formen el módulo de regulación de este fago.
Se identificaron otros tres ORFs: el ORF67, el ORF58 y el ORF1Q4, los cuales no pudieron ser ubicados claramente
en ninguno de los módulos descritos anteriormente. El ORF67 se encuentra conservado solamente en el fago fs1
(tabla 4), y el producto codificado por el ORF58 no está relacionado con ninguna proteína de fagos filamentosos
previamente descritos, pero presenta una región que es similar a una región de la proteína E1 del virus del papiloma
humano tipo 60 (tabla 4), una helicasa dependiente de ATP necesaria para la iniciación de la replicación del ADN
viral (Matsukura y cois., 1992). El producto del ORF104 no mostró homología significativa con ningún producto
proteico conocido hasta el momento. Este ORF está localizado en una región distintiva del genoma de VGJ<|>, que
contiene 775 nucleótidos cuya secuencia no muestra homología con ninguna entrada en las bases de datos
internacionales (región DR1 en la Fig. 19 y anexo A1).
La secuencia nucleotídica del genoma de VGJ<t> también reveló que estaba estrechamente relacionado con los
Capítulo 4 Resultados
58
C
fagos filamentosos VSK y fs1 de V. cholerae, con los cuales comparte 82,8 y 77,8% de homología a nivel de ADN,
respectivamente, mientras que VSK y fs1 comparten un 87,4% de homología entre sí. (Fig. 19). Las diferencias de
secuencia nucleotídica entre VGJ<|) y los fagos VSK y fs1 están concentradas principalmente en las regiones
distintivas RD1 y RD2 del genoma de VGJ< (> (Fig. 19). La región RD1 está ausente en los fagos VSK y fs1,
mientras que la región RD2 está ausente sólo en el fago fs1. Adicionalmente, hay una acumulación significativa de
cambios nucleotídícos a lo largo del ORF384 en ambos fagos con respecto a VGJ<t> (Fig. 19). Estos resultados
indicaron que VGJ<j>, VSK y fs1 muy probablemente evolucionaron a partir de un ancestro común.
La secuencia nucleotídica de VGJ<)> también reveló la presencia de dos sitios att homólogos a secuencias attP,que intervienen en la integración sitio-específica al cromosoma bacteriano de fagos filamentosos integrativos como
CTX<j) de V. cholerae (Huber y Waldor, 2002), f237 de Vibrio parahaemolyticus (lida y cois., 2002), Cf1c, Cf16-v1
y <|) Lf de X. campestris (Dai y cois., 1988; Kuo y cois., 1991; Un y cois., 2001) (Fig. 20A). Los sitios attidentificados en VGJ<|>, se encuentran superpuestos y en dirección opuesta uno al otro. Estos sitios se localizaron
en una posición relativa dentro del genoma similar a la posición que ocupan los att de todos estos fagos en sus
respectivos genomas (Fig. 20B). El sitio att de VGJ<)> orientado en el mismo sentido de la cadena positiva viral
(la cadena que se empaqueta en el virión) fue designado att- VGJ<|>-d¡r Y el sitio att opuesto y solapado de la cadena
negativa, aft-VGJ<¡>-rev. Ambos sitios se encuentran localizados dentro del ORF154 (Figs. 17 y 20B). En este
trabajo también se encontraron, por analogía con VGJ<)>, sitios homólogos a att en los fagos integrativos Vf33
de V. parahaemolyticus (Chang y cols., 1998a) y VSK de V. cholerae (Kar y cois., 1996). Los sitios att identificados
en estos fagos se encuentran organizados en una estructura similar a la de VGJ<t> (Fig. 20B), ausente en los
fagos fs1 y CTX<j>.
Capítulo 4 Resultados
59
Construcción de una versión marcada de VGJ<*>
Para facilitar el estudio de VGJf se construyó una versión marcada de este fago mediante la
inserción de un casete que contenía un gen de resistencia a kanamicina (Kn) y el origen de
replicación R6K en el sitio único Xba\ de la FR de VGJtj) (Fig. 21). El sitio de inserción se escogió
de tal, manera que no interrumpiera ninguno de los ORFs identificados del fago, de modo que
mantuviera, en el mayor grado posible, todas sus funciones inalteradas (Fig. 21). La nueva
versión marcada del fago, que se denominó VGJ-Kn*. puede ser segu,da fielmente en
experimentos de transducción mediante la transmisión del gen de Kn' a nuevos hospederos
sensibles a este antibiótico, los cuales se convertirían en resistentes por !a infeccón con VGJ-
Kn* Por otra parte, el nuevo origen de replicación insertado (ori R6K) solo funciona en cepas de
E cali lisógenas del fago Xplr, las cuales expresan la proteína * necesaria para el funcionamiento
de este ori, por lo cual se dice que este es un origen condicionado a la expresión de * (Miller y
Mekalanos, 1988). La incorporación del ori R6K al genoma del fago fue de gran utilidad para
estudiar las funciones replicativas del mismo como se vera mas adelante (epígrafe 4.7)
Capitulo 4 Resultados
60
4.5 Titulación de VGJ<|)
Al gual que otros fagos filamentosos, VGJ<j> no produce lisis celular del hospedero, pero retarda el
crecimiento de los cultivos infectados al desviar recursos de la célula para la producción del fago. Esto
hizo suponer que VGJ<j> podía producir placas opacas de "pseudolisis" al infectar células sensibles del
hospedero, al igual que otros fagos filamentosos
bien conocidos como M13. El conteo de las placas opacas producidas por algunos fagos
filamentosos permite titular la concentración de partículas virales en una solución (Sambrook
y cois., 1989). Se comprobó que VGJ<t> también era capaz de formar placas opacas, lo que
permitió titular la producción de partículas de este fago por diferentes cepas de V. cholerae infectadas.
La titulación de la cantidad de partículas producidas por 569B infectada con VGJf reveló que
esta cepa produce aproximadamente 3x10" partículas virales por mililitro de medio de cultivo
a las 6 h de infectada, cuando las células se cultivaron en medio LB a 37°C y 240 rpm (título
promedio de tres experimentos independientes). Si tenemos en cuenta que a las 6 h el cultivo
infectado alcanzó una densidad óptica (DO) igual a 3 y que 569B alcanza una densidad celular
aproximada de 8x108 células/mL por unidad de DO, entonces cada célula infectada produjo
como promedio alrededor de 125 partículas virales (3x1011/3x8x108). Esto indica que VGJ<j>
es un fago muy prolífico comparado con CTX<)>, que en ¡guales condiciones no llega a
producir una partícula viral por célula (Davis y Waldor, 2003) mientras que VGJ<)> produce
una cantidad de partículas por célula similar al fago M13 (Marvin, 1998).
La versión marcada del fago VGJ-Kn<j> es más fácil de titular mediante el conteo del número
de transductantes Knr de la cepa receptora. La cepa 569B infectada con VGJ-Kn<t> produjo
alrededor de 1,8x1011 partículas transductoras de Knrpor mililitro de medio de cultivo a las 6 h
de infectada bajo las mismas condiciones de cultivo usadas para medir el título de VGJ<|)
(título promedio de tres experimentos independientes). Por tanto, la inserción del gen de Knr
en el genoma de VGJ<|> no afectó seriamente la replicación ni la morfogénesis del fago, lo
que indicó que el sitio Xba\, donde se insertó el gen, es permisivo para la clonación de
fragmentos foráneos en el genoma de VGJ<|>. Este resultado también indicó que el fago
marcado VGJ-Kn<|> era adecuado para realizar diversos estudios, pues sus propiedades
fundamentales se mantuvieron inalteradas.
4.6 El receptor de VGJ<|> es la fimbria MSHA
Los fagos filamentosos de V. cholerae previamente descritos y de los cuales se conocen sus
receptores, utilizan como tales las fimbrias TCP o MSHA (Waldor y Mekalanos, 1996;
Jouravleva y cois., 1998b). Por esta razón se utilizaron dos mutantes isogénicos de la cepa de
V. cholerae C6706 inactivados en el gen que codifica la pilina principal de cada una de estas
fimbrias para estudiar el receptor de VGJ<t>. Estos mutantes isogénicos fueron KHT46
