DOCTORADO EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS

Estudio exploratorio de la bioactividad de hongos microscópicos asociados a restos vegetales, en zonas tropicales de México.

Tesis para obtener el grado de Doctor en

Ciencias presenta:

BIOL. MARÍA MANUELA DE JESÚS REYES ESTEBANEZ

Centro de Investigación Científica de Yucatán

Mérida, Yucatán, México 2009

. '

RECONOCIMIENTOS

Este trabajo se realizó en la Unidad de Biotecnología del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. bajo la dirección de la Dra. María Marcela Gamboa Angula y la Dra. Gabriela Patricia Heredia Abarca del Instituto de Ecología, A.C.

El trabajo fue financiado por los proyectos Consejo Nacional De Ciencia y Tecnología (Proyecto No. 47594) , Fondos Mixtos México-España, FOMIX (157/2005) , Red Iberoamericana Sobre Diversidad, Ecología y Uso de los Hongos Microscópicos del Programa CYTED (Red XII.J) y por la beca de doctorado otorgada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (183272) para María Manuela de Jesús Reyes Estebanez.

DEDICATORIA

A mis padres Mario Reyes Sierra y Rebeca Estebanez Azpeitia, por haberme dado la oportunidad de estar en este mundo y por su apoyo incondicional.

A mis hermanas Lupita y Rebeca por todos los momentos que hemos vivido juntas.

A mis sobrinas Ximena y Danna.

A mis grandes amigas Susana de la Rosa, Cecilia Guízar, Gloria Malina, Yolanda Nava y Maria Eugenia Flores con quienes he compartido momentos de alegría y tristeza, por su gran apoyo en todo momento.

11

AGRADECIMIENTOS

A mis asesoras Dra. María Marcela Gamboa Angula y Dra. Gabriela Heredia Abarca, por su paciencia, tiempo, entusiasmo y dedicación durante el desarrollo de este trabajo.

Al H. Comité Tutoral integrado por la Dra. María del Pilar Rodríguez Guzmán, Dr. Osear Moreno Valenzuela , Dra. María Marcela Gamboa Angula y Dra. Gabriela Heredia Abarca por las sugerencias y aportaciones.

Al H. Comité revisor de este documento Dra. Blondy Canto Canché, Dra. Rosa María Escobedo Gracia Medrana, Dra. María del Pilar Rodríguez Guzmán, Dr. Jairo Cristobal Alejo, Dr. Osear Alberto Moreno Valenzuela, Dra. Gabriela Heredia Abarca y Dra. María Marcela Gamboa Angula, por las aportaciones realizadas.

De manera especial al Dr. Sergio Peraza Sánchez y a los Técnicos QBB. Fabiola Escalante Erosa y M en C. Luis Torres Tapia, por la ayuda en la realización de los perfiles cromatográficos de los extractos fúng icos.

A la Ql. lrma Leticia Medina Baizabal y IBQ. Wendy Chí Agulilar, por su apoyo en el laboratorio y al Lic. Sergio Pérez por el apoyo bibliotecario.

A la Dra. Silvia Capello por las cepas del estado de Tabasco y al Dr. Rafael Castañeda por la identificación taxonómica de las mismas. A la Dra. María del Pilar Rodríguez Guzmán por proporcionarnos algunas de las cepas de hongos fitopatógenos.

A mis compañeros de generación Fulgencio, Yolanda, Daniel , Mayra, Joaquín, Humberto, Suemy.

111

A los doctores del grupo de qU1m1ca orgamca Dra. Rocío Borges Argáez, Dr. Sergio Peraza Sánchez y Dr Luis Manuel Peña Rodríguez y Dra. Marcela Gamboa Angulo por el apoyo brindado.

A mis amigos y compañeros de laboratorio de Química Orgánica, Susana, Cecy, Andrés, Maruja, Chucho, Nacho, Alfredo Tere, Rosani, Carlos Cruz, Carlos Quintal, Arely, Angel , Abril, Edgar, Luis, Karlina, Fabiola, Bella, Lety, Alejandra, Silvia, Rigel , Edith, Memo, Rodolfo, Karina, Marina, Dafne, Claudia, Zhelmy, Elena.

A mis amigos del laboratorio de Fisiología Vegetal Yolanda, Fulgencio y Felipe.

A mis compañeros de postgrado y a todo el personal del CICY que de alguna manera contribuyo en el desarrollo de este trabajo.

IV

RECONOCIMIENTOS DEDICATORIA AGRADECIMIENTOS lndice lndice de figuras lndice de tablas RESUMEN ABSTRACT

INTRODUCCIÓN

Índice

CAPÍTULO 1 Antecedentes, objetivos y estrategia experimental

pag. i ¡¡ ¡¡¡ V

ix xi XV

xvii

1

5

1.1. ANTECEDENTES 5 1.1.1 . Los hongos microscópicos 5 1.1 .2. Importancia y aplicaciones de los hongos 6 microscópicos 1.1 .3. Los hongos microscópicos en el campo de la 1 O industria farmacéutica 1.1.4. Búsqueda de nuevos metabolitos secundarios 16 1.1 .5. Biodiversidad de los hongos y su potencial 19 biotecnológico 1.2. BIBLIOGRAFÍA 21 1.3. OBJETIVOS 27 1.3.1 . Objetivo general 27 1.3.2. Objetivos particulares 27 1.4. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 29

CAPÍTULO 11 Aislamiento, conservación e identificación de 31

cepas fúngicas a partir de restos vegetales

V

11.1.1NTRODUCCIÓN 31 11.1 .1. Medios de cultivo para el aislamiento de hongos 33 microscópicos 11.1.2. Métodos para la conservación en laboratorio de 34 los hongos microscópicos 11.1 .3. Ubicación taxonómica de los hongos 38 microscópicos 11.1.4. La exploración biotecnológica de los hongos 39 microscópicos de las zonas tropicales de México 11.2. OBJETIVO GENERAL 40 11.3. MATERIALES Y MÉTODOS 41 11.3.1. Sitios de colecta y colecta de material 41 11.3.2. Aislamiento , purificación e identificación de las 42 cepas 11.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 44 11.5. CONCLUSIONES 48 11.6. BIBLIOGRAFÍA 49

CAPÍTULO 111 Antimicrobial, antioxidant and chemical profile of 53 anamorphic fungi isolated from plant debris of tropical areas in Mexico 111.1. ABSTRACT 53 111.2. INTRODUCTION 54 111.3. MATERIALS ANO METHODS 55 111.3.1. Fungal isolation and identification 55 111.3.2.Growth conditions 56 111.3.3. Fungal extraction 56 111.3.4. Partition of fungal extracts 56 111.3.5. Preparative TLC 56 111.3.6. Chemical profile 57 111.3.7. Target strains 57 111.3.8. Antimicrobial activity assay 57 111.3.9. Broth microdilution assay MIC 58 111.3.1 O. Antioxidant activity by Reduction of DPPH 59 111.4. RESUL TS ANO DISCUSSION 60 Acknowledgements 65

Vl

111.5. REFERENCES

ANEXO CAPÍTULO 111 Evaluación de la actividad biológica de los

extractos

CAPÍTULO IV Perfíl biológico de hongos anamórficos del

sureste mexicano

66

77

83

IV.1. RESUMEN 83 IV .1. ABSTRACT 84 IV.2. INTRODUCCIÓN 85 IV.3. MATERIALES Y MÉTODOS 86 IV.3.1. Cepas fúngicas 86 IV.3.2. Suspensión de Esporas 87 IV.3.3. Cultivos líquidos 87 IV.3.4. Métodos analíticos 87 IV.3.5. Reducción del radical 2, 2-difenil-1- 88 picrilhidrazilo (DPPH) IV.3.6. Microorganismos patogénicos 88 IV.3.7. Bioensayo Antimicrobiano por el Método de 89 Microdilución IV.3.8. Determinación de la Concentración Mínima 90 Bactericida (CMB) IV.3.9. Determinación de la Concentración Mínima 90 lnhibitoria (CMI) IV.3.1 O. Análisis Estadísticos 90 IV.4. RESULTADOS 91 IV.5. DISCUSIÓN 93 IV.6. BIBLIOGRAFÍA 97

CAPÍTULO V 1 03 Interacciones

V.1. INTRODUCCIÓN 103 V.2. OBJETIVOS 104 V.2.1. Objetivo general 104 V.2.2. Objetivos particulares 105

Vll

V.3. MATERIALES Y MÉTODOS 105 V.3.1 . Preparación del inóculo fúngico 1 05 V.3.2. Determinación del medio de cultivo para la 106 obtención de mayor cantidad de extractos V.3.3. Obtención de micelio y filtrado 107 V.3.4. Obtención del extracto del micelio y del filtrado 107 V.3.5. Cultivo y preparación de los microorganismos 107 patógenos para los ensayos antimicrobianos V.3.6. Evaluación de la actividad antibiótica de los 109 extractos por el método de microdilución en microplaca (Andrews, 2001) V.3.7. Evaluación de la actividad antioxidante 109 mediante ensayo de reducción del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) (Bors et al., 1984; Sánchez et al. , 2001) V.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 111 V.5. CONCLUSIONES 126 V.G.- BIBLIOGRAFÍA 128

CAPÍTULO VI 131

Perfil cromatográfico de las interacciones fúngicas VI.1.1NTRODUCCIÓN 131 Vl.2. Objetivos particulares 133 Vl.3. MATERIALES Y MÉTODOS 133 Vl.3.1. Cromatografía en capa delgada (CCD) 133 Vl.3 .2. Cromatografía de gases-espectrometría de 134 masas (CG-EM) Vl.3.3. Ergosterol (Sigma) (CzaH440) 135 Vl.3.4. Diseño Experimental 136 Vl.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 137 Vl.5. CONCLUSIONES 162 Vl.6. BIBLIOGRAFÍA 164

CAPÍTULO VIl 169 Conclusiones y perspectivas

Vlll

Índice de Figuras

CAPÍTULO 11

Figura 2.1 Localización de los sitios de colecta 41 Figura 2.2 Fotografías de algunas de las especies 47

aisladas CAPÍTULO 111

Figura 3.1 Bioensayo de difusión en agar en disco 77 de extractos fúngicos contra Vibrio sp., B. subtillis, E. carotovora y X. campestris.

Figura 3.2 Bioensayo antifúngico en disco de 78 extracto fúngicos contra Colletotrichum gloeosporioides y Alternaría tagetica .

Figura 3.3 Ensayo antioxidante de la reducción del 78 (DPPH) sobre extractos fúngicos .

Figura 3.4 Cromatografía en capa delgada (CCD), 80 partición hexánica y de acetonitrilo de las cepas activas en el bioensayo antioxidante.

Figura 3.5 Metabolitos antioxidantes de la partición 80 hexano: acetonotrilo revelados en el bioensayo con DPPH.

Figura 3.6 Cromatografía en capa delgada (CCD) y 82 bioautografía partición hexánica y de acetonitrilo de C. casiicola, Phaeobotrys sp. y B. japonica contra S. aureus.

CAPÍTULO V

Figura 5.1 Variación del pH en Czapek Dox con 114 extracto de levadura a los 21 días de incubación de los hongos en forma individual y en cultivos mixtos.

IX

Figura 5.2 Producción de biomasa (g/1 00 mi) de 119 las especies en cultivos individuales y mixtos, después de 21 días de incubación en Czapek Oox con extracto de levadura

Figura 5.3 Actividad antioxidante de las cepas 125 fúngicas cultivadas en medio Czapeck-Oox con extracto de levadura en forma individual y en pares.

CAPÍTULO V 1

Figura 6.1 Esquema de trabajo de los cultivos 136 individuales y por pares para la determinación de su perfil cromatográfico.

Figura 6.2 Perfíl cromatográfico de B. japonica 141 cultivada en arroz fermentado.

Figura 6.3 Perfíl cromatográfico de B. japonica 142 cultivada en COL.

Figura 6.4 Espectro másico de la meleína obtenida 143 del cultivo en COL de B. japonica .

Figura 6.5 Metabolitos mayoritarios y minoritarios 144 detectados en B. japonica cultivada en COL.

Figura 6.6 Ácido ftálico identificado como 146 mayoritario en G. murorum y T. havanensis y metabolito minoritario.

Figura 6.7 Reacción de transformación en 148 presencia de oxígeno en endoperóxido de ergosterol.

X

Índice de Tablas

CAPÍTULO 1

Tabla 1.1 Algunos metabolitos obtenidos de 11 hongos microscópicos en uso comercial

CAPÍTULO 11

Tabla 2.1 Ventajas y desventajas de los métodos 37 usados para la conservación de cultivos fúngicos

Tabla 2.2 Datos geográficos de los sitios de 42 colecta

Tabla 2.3 Total de aislamientos obtenidos por 44 estado y tipo de vegetación

Tabla 2.4 Cepas aisladas de restos vegetales 45 colectados en zonas tropicales de México

CAPÍTULO 111

Table 3.1 Anamorphic fungi isolated from tropical 73 areas in the South-east of Mexico

Table 3.2 Anamorphic species with antimicrobial 75 (disc assay) and antioxidant activity (reduction of DDPH)

Table 3.3 MIC's and CG analyses of the 76 acetonitrile fractions obtained from the active fungal extracts

Tabla 3.4 Partición con hexano y acetonitrilo de 79 los extractos de las ochos cepas elegidas para realizar los estudios de interacciones

Tabla 3.5 Referencia frontal (RF) de los 81 metabolitos antioxidantes en los

Xl

extractos crudos y particionados de las ocho cepas seleccionadas

CAPÍTULO IV

Tabla 4.1 Actividad antimicrobiana en el 101 bioensayo de microdilución y de reducción del OPPH de los extractos crudos obtenidos de cinco cepas fúngicas, cultivadas en dos medios líquidos

CAPÍTULO V

Tabla 5.1 Cepas fúngicas seleccionadas para los 106 ensayos de interacción por pares

Tabla 5.2 Matriz de las interacciones por pares 108 con las especies seleccionadas

Tabla 5.3 Valores de a biomasa del micelio 112 (g/ml) de las cepas seleccionadas después de 21 días en medio Czapek Oox (CO) y Czapek Oox - Levadura (COL)

Tabla 5.4 Características morfológicas de los 113 hongos cultivados en el medio COL

Tabla 5.5 Valores del pH, volumen (mi) peso del 116 filtrado (g/1 00 mi) de las cepas seleccionadas después de 21 días de incubación en medio Czapek Oox con extracto de levadura (COL)

Tabla 5.6 Rendimiento de los extractos del 120 filtrado y micelio de las cepas individuales y en cultivos mixtos cu ltivados en Czapek Oox enriquecido con extracto de levadura

Tabla 5.7 Actividad antioxidante de los extractos 124 de los cultivos fúngicos en arroz

Xll

fermentado y de los extractos del micelio y filtrado de los cultivos fúngicos en medio COL (1 00 ~g de extracto)

CAPÍTULO VI

Tabla 6.1 Componentes detectados en los CG- 138 EM de los extractos fúngicos cultivados en arroz fermentado y COL

Tabla 6.2 Componentes detectados por CG-EM 152 en las interacciones de las siete cepas cultivadas en el medio COL analizados en las columnas Ultra 1 y OB5MS

Tabla 6.3 Metabolitos mayoritarios identificados 159 por CG-EM en los extractos de filtrado y micelio de los cultivos individuales y en las interacciones

Tabla 6.4 Componentes detectados por CG-EM, 161 no identificados de los extractos de filtrado y micelio de los cultivos individuales y en las interacciones en COL

xiii

XIV

RESUMEN

Un total de 48 cepas fúngicas se aislaron a partir de restos vegetales de los estados de Tabasco (14) , Veracruz (7) y Yucatán (27). Quince de ellas se identificaron a nivel de especie y veintidós a nivel de género. Todos los aislamientos se evaluaron contra nueve cepas blanco utilizando el bioensayo de difusión en disco y el ensayo antioxidante de la reducción del DPPH. La actividad antimicrobiana se detectó en 18 extractos (38%), en al menos contra una de las cepas blanco evaluadas. El mayor efecto antagonista se observó con los extractos de MRCICY45 y de Beltraniopsis sp. , con amplios espectros de actividades. En contraste, Memnoniella sp., mostró actividad solo contra el patógeno Gandida albicans. La actividad antioxidante se detectó en cuatro extractos (8%) , que corresponden a Corynespora cassiicola, Beltraniella japonica, G/iomastix murorum y MRCICY44.

De este estudio se seleccionaron las cepas B. japonica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp. , Memnoniella sp., G. murorum, Thozetella havanensis y MRCICY 45 para evaluar su comportamiento en cultivos mixtos por pares. La matriz de interacción generada (21 interacciones y los siete cultivos individuales) se realizó en el medio Czapek Dox enriquecido con extracto de levadura (COL). Al final del ensayo de interacción se separó el micelio de la fase líquida. Ambas fases se sometieron a extracción con acetato de etilo y los correspondientes extractos se evaluaron en ensayos antimicrobianos y antioxidantes; también se determinaron sus perfiles cormatográficos por CCD y CG-EM.

En general , el pH del filtrado mostró una tendencia ligeramente alcalina; el rendimiento de la biomasa micelial fue menor en las interacciones, que en las biomasas alcanzadas en forma individual. Los resultados de la actividad antimicrobiana contra

XV

las cepas blanco Bacil/us subtillis y Staphy/ococcus aureus indicaron que el medio COL y las condiciones de cultivo para este caso no resultaron propicias para la producción de metabolitos antimicrobianos; en cuanto a la actividad antioxidante, esta se detectó principalmente en los extractos de los filtrados de B. japonica , G. murorum y MRCICY-45, y en algunas interacciones, sugiriendo que en este caso el medio COL es adecuado para la producción de metabolitos antioxidantes.

En cuanto al perfil por CG-EM, se detectó una amplia variabilidad de metabolitos tanto en las cepas individuales cultivadas en arroz fermentado y COL, como en las interacciones por pares. Algunos de los metabolitos detectados en las cepas individuales son la 2-hidroxijuglona y el dehidroestigmasterol; en las interacciones se identificaron ácidos grasos, escualeno, liquesterol y otros derivados del ergosterol , compuestos previamente reportados en hongos como la meleína. Asimismo, aproximadamente el 50% de los componentes detectados no se identificaron, así como tampoco muchos no coincidieron con los tiempos de retención detectados en los cultivos de las cepas individuales. Lo anterior permite proponer la biosíntesis de metabolitos diferentes ante la presencia de competencia.

Este trabajo corresponde al primer reporte de evaluación biológica de hongos microscópicos cultivados individualmente y por pares, provenientes de regiones tropicales de México demostrando su potencial para ser utilizados en aplicaciones en farmacia y agricultura.

XVl

ABSTRACT

Forty eight fungal strains were isolated from plant debris in the Mexican states of Tabasco (14}, Veracruz (7) and Yucatan (27). Fifteen strains were identified to specie level and twenty two to genus level. All isolates were screened against nine target strains by the disc diffusion assay; and by reduction of OPPH in the antioxidant assay. Antimicrobial activity was detected in eighteen extracts (38%) against at least one of the target strains tested. The greatest antagonistic actions were produced by MRCICY45 extract with broad spectrum activity. In contrast Memnoniella sp. showed activity only against Gandida albicans. Antioxidant activity was observed in four extracts (8%), corresponding to Corynespora cassiicola, Beltraniella japonica, Gliomastix murorum and MRCICY 44.

In this study, we selected the strains B. japonica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp., Memnoniella sp., G. murorum, Thozetella havanensis and MR45 to evaluate their behavior in paired mix cultures. The interaction matrix corresponding to (21 interactions and seven individual cultures) strains were cultured in Czapek Oox enriched with yeas extract (COL). At the end of the interaction assay, mycelium was separated from the liquid phase. Both phases were exposed to ethyl acetate extraction and the extracts were evaluated using antimicrobial and antioxidant assays; also were determinated their chromatographic profile by TLC and GC-ME.

Antimicrobial activity against Bacil/us subtillis and Staphy/ococcus aureus target strains showed that COL medium and culture conditions in this case was not adequate to the antimicrobial metabolites production. Regarding the antioxidant activity, it was detected in the liquid phase of B. japonica, G. murorum y MRCICY-45, and in sorne interactions too. This

xvn

findings support our suggestion that the COL medium was appropriate for the antioxidant metabolites production.

From GC-MS profiles were detected a broad metabolites variability as in the individual cultures, in fermented rice and in COL cultures, as in the interactions. Sorne individual strains metabolites detected were 2-hydroxyjuglone and dehydrostigmasterol; in the interactions were identified fatty acids, squalene, lichesterol and other ergosterol derivatives, and other compounds previously reported in fungi like melein . Almost 50% of components in the chromatographic profiles were none previously detected in the individual cultures, which let us suggested the production of different metabolites with competitors.

This is the first report on the biological evaluations of microscopic fungi alone and in dual interactions from Mexican tropical regions, demonstrating their potential in applications in pharmacy and agriculture.

XVlll

INTRODUCCIÓN

Entre las posibles fuentes de productos naturales, los microorganismos constituyen un recurso poco estudiado, no obstante su alto potencial para producir estructuras químicas novedosas con acción biológica diversa. Entre éstos, los hongos microscópicos son una fuente prometedora en la búsqueda de metabolitos secundarios para usos farmacéuticos (Tulp y Bohlin, 2004; Misiek y Hoffmeister, 2007).

En su mayoría los metabolitos fúngicos conocidos o que han sido comercializados se han extraído de hongos nativos de ecosistemas templados (Bilis et al., 2002). A la fecha existen pocas regiones tropicales en las que se haya profundizado en el potencial biotecnológico de los hongos microscópicos. Dado que esta clase de ecosistemas son reconocidos como áreas de alta diversidad biológica es factible considerarlos como una fuente promisoria de moléculas con actividad biológica para la elaboración de nuevas drogas. Sin embargo, aún existen pocos estudios que contemplen especies silvestres.

El potencial biotecnológico de los hongos tropicales es evidente, como lo muestran los siguientes ejemplos de productos: a) la apicidina es un metabolito con propiedades antiprotozoarias aislada de Fusarium pal/idoroseum, hongo colectado en Costa Rica, también se ha obtenido de otras especies del mismo género aisladas de semillas de soya (Park et al., 1999). b) la flutimida es un inhibidor de las enzimas endonucleasas del virus A de la influenza, este metabolito se aisló de la especie Delitschia conferlospora, colectada en Namibia (África) a partir de una muestra de estiércol (Tomassini et al. , 1996) y e) el ácido nodulispórico que contiene eficientes propiedades insecticidas contra la larva de Lucilia sericata, éste se ha aislado de varias especies el género Nodulisporium (Bilis et al. , 2002).

1

En México, existen pocos reportes referentes a la exploración de la actividad biológica de especies de hongos microscópicos tropicales nativos. Entre estos se pueden mencionar los trabajos realizados con hongos microscópicos de la hojarasca de Veracruz (Trigos et al., 2005), con endófitos de Quintana Roo (Torres-Barragán et al. , 2004) y con hongos aislados de cenotes en el estado de Yucatán (De la Rosa, 2007). En estos trabajos se detectaron algunas cepas con actividad biológica promisoria, poniendo en evidencia el alto potencial biotecnológico de nuestra micobiota.

Continuando con el objetivo de contribuir a enriquecer el conocimiento de los hongos microscópicos en nuestro país, en el presente trabajo se planteó explorar el potencial biotecnológico destinado a la búsqueda de metabolitos biológicamente activos para su posible uso en farmacia y/o agricultura, en especial de algunas especies aisladas de la hojarasca colectada en regiones tropicales de los estados de Tabasco, Veracruz, y Yucatán. Adicionalmente, con la finalidad de potenciar la producción de los metabolitos bioactivos detectados de las especies más promisorias se realizaron estudios con cultivos mixtos por pares para estimular la competencia por interferencia.

2

BIBLIOGRAFIA

Bilis, G., A. Dombrowski , F. Peláez, J. Polishook and Z. An (2002). "Recent and future discoveries of pharmacologically active metabolites from tropical fung i", in Tropical Mycology; volumen 2: Micromycetes. Watling R. J. Francklan, M. Ainsworth , S. lsacc and C. Robinson (eds). CABI Publising , Wallingford , USA. pp. 165-194.

De la Rosa, G.S. (2007). Evaluación del potencial antimicrobiano de microorganismos aislados de cenotes de la península de Yucatán. Tesis doctoral. Centro de investigación Científica de Yucatán . 184 p.

Misiek, M. and D. Hoffmeister (2007). Fungal genetics, genomics, and secondary metabolites in pharmaceutical sciences. Planta Medica 73, 103-115.

Park, J-S., K.-R. Lee, J.-Ch. Kim , S.-H. Lim, J.-A. , Seo and Y.­W. Lee (1999). A hemorrhagic factor (apicidin) produced by toxic Fusarium iso/ates from soybean seeds. Environmental Microbiology, 65, 126-130.

Tomassini , J.E. , M.E. Davies, J.C. Hastings, R. Lingham, M. Mojena, S. L. Raghoobar S. B. Singh, J.S. Tkacz and M.A. Goetz (1996). A novel antiviral agent which inhibits endonuclease of influenza viruses. Antimicrobial Agents and Chemotheraphy 40, 1189-1193.

Torres-Barragán , A. , A.L. Anaya , R. Alatorre and C. Toriello (2004). Entomopathogenic fungi from "El Edén" Ecological Reserve, Quintana Roo, Mexico. Mycopathologia 158, 61-71 .

Trigos, A., G. Mendoza, M. Luna, G. Heredia y R.M. Arias (2005). Evaluación antibacteriana de hongos

3

microscopJcos del suelo y restos vegetales. Revista Mexicana de Micología, 20, 89-92 .

Tulp , M. and L. Bohlin (2004). Unconventional natural sources for future drug discovery. Drug Discovery Today, 9, 450-458.

4

CAPÍTULO 1

Antecedentes, objetivos y estrategia experimental

1.1. ANTECEDENTES

1.1.1. Los hongos microscópicos

Entre la gran diversidad de especies que habitan en nuestro planeta, los hongos destacan por su amplia distribución y extraordinaria diversidad. Por su tipo de alimentación son organismos heterótrofos, esto significa que a diferencia de las plantas no son capaces de sintetizar su propio alimento, por lo que deben buscar fuentes nutritivas para extraer los compuestos esenciales que requieren para su metabolismo.

La mayoría de las especies fúngicas son saprobias, o sea que habitan sobre materia orgánica inerte; en menor cantidad se encuentran las parásitas, las cuales viven a expensas de los tejidos de organismos vivos y las simbiontes que corresponden a las que tienen la capacidad de establecer relaciones mutualistas con plantas y animales. Con excepción de las levaduras, todos los hongos tienen una estructura somática filamentosa, denominada micelio, la cual está compuesta por delicados filamentos que se bifurcan repetidas veces hasta formar una red que penetra y se expande en el sustrato colonizado. A estos filamentos se les conoce como hifas, a través de ellas, los hongos secretan una amplia gama de enzimas que desdoblan los compuestos orgánicos en moléculas sencillas para posteriormente absorberlas mediante osmosis y así incorporarlas a sus funciones fisiológicas (Dix & Webster, 1995; Herrera & Ulloa, 1998).

Con excepción de unas pocas especies, la reproducción de los hongos es mediante la producción de esporas, las

5

cuales pueden originarse por procesos sexuales o asexuales. Las esporas tienen la función de dispersión y sobrevivencia, mediante ellas, colonizan una gran variedad de hábitats acuáticos y terrestres, entre estos últimos, el suelo, los restos vegetales y animales, son sustratos en los que prolifera una considerable diversidad de especies fúngicas. Su distribución abarca desde las zonas desérticas hasta las áreas gélidas del globo terráqueo (Dix & Webster, 1995; Herrera & Ulloa, 1998).

Aunque en todas las especies del Reino Fungi existe una fase microscópica, constituida por el micelio y las esporas, de acuerdo al tamaño de sus estructuras de reproducción (esporóforos), se distinguen especies macroscópicas y microscop1cas, estas últimas, también conocidas como micromicetos se caracterizan por formar esporóforos de un tamaño menor a 1 mm (Gams, 1992). En todas las categorías taxonómicas del Reino Fungi hay especies microscópicas, constituyen mas del 60% del total de las especies fúngicas, en su mayoría producen micelio ramificado y filiforme por lo que en algunos textos se emplea el término micromicetos filamentosos para diferenciarlos de los micromicetos levaduriformes que desarrollan sencillas estructuras unicelulares, tal es el caso de las levaduras (Heredia et al., 2008).

1.1.2. Importancia y aplicaciones de los hongos microscópicos

Tanto las especies saprobias como las simbiontes y las parásitas, tienen un impacto relevante en la vida del hombre y en el equilibrio ecológico. Por su trascendencia en la salud y en la economía, los hongos fitopatógenos y causantes de micosis han sido ampliamente estudiados quedando en un segundo plano los saprobios, los cuales, como se mencionó con anterioridad, son los mas diversos y abundantes dentro del Reino Fungi.

6

En la naturaleza, los micromicetos saprobios juegan un papel primordial , junto con las bacterias y la fauna del suelo, participan en la degradación de la materia orgánica, proceso que además de permitir el reciclaje de nutrientes, elimina de los ecosistemas los desechos vegetales y animales. Así mismo a nivel de las cadenas tróficas edáficas, forman parte de la dieta de colémbolos, ácaros y lombrices (Dix & Webster, 1995)

Los hongos microscópicos saprobios están ligados a las actividades cotidianas del hombre, ocasionando tanto perjuicios como beneficios. Todas las culturas ya sea en forma conciente o inconcientemente los han empleado para muy diversos propósitos, tales como la preparación de productos alimenticios (p. ej. quesos, pan, mantequilla) y bebidas fermentadas (p. ej . Vino, cerveza, sake y pozal) . También son un recurso importante en la industria por su capacidad para producir compuestos y enzimas utilizados en la elaboración de plásticos y perfumes, así como en el curtido de pieles, mejoramiento de alimento para forraje y obtención de pigmentos.

Uno de los mayores impactos de los micromicetos reside en su capacidad para producir metabolitos secundarios que han sido la base para la obtención de importantes fármacos, entre los que se incluyen antibióticos, antioxidantes, antitumorales e inmunosupresores, los cuales se abordarán con mayor detalle en la siguiente sección (Bigelis, 1991 ; Herrera & Ulloa, 1998).

En las actividades agrícolas y ganaderas, diversas especies de micromicetos son usadas como bioherbicidas y bioplaguicidas. Con respecto a los primeros, su uso a nivel comercial es relativamente reciente, los productos Casst® elaborados con la especie Alternaría cassiae, LuBao # 1 con Colletotrichum gloeosporioides, Collego con C. gloeosporioides var. aeschynomene, DeVine con Phytopthora palmivora y MYX-1200 a partir de Fusarium lateritium son algunos de los

7

productos que se están empleando (Tengerdy & Szakács, 1998).

Como bioplaguicidas se han aplicado en el control de escarabajos (Melolontha melolonthe y Hoplochaelus marginales). Los productos comerciales Engerlingsplilz, Betel y Melocont se han obtenido de Beauveria brongniarti, especie que produce beauvericina compuesto antimicrobiano y antihelmíntico; basianina y tenelina, ambos inhibidores de la ATPasa en la membrana de los eritrocitos; y oosporeina, bactericida contra Gram-positivas (Tengerdy & Szakács, 1998; Strasser et al., 2000; Anke & Sterner, 2002).

Con actividad nematicida se han extraído la epicoclioquinona A de Stachybotrys bisbyi y las ofiobolinas de Cochliobolus heterostrophus (Anke & Sterner, 2002).

-

\ j

~>i-~ Beauvericina

HO

Basianina

8

HO OH o

o

Tenelina OH

Oosporeina oH

Otra importante aplicación de las especies fúngicas es su empleo en la biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos y con los efluentes de las industrias papelera y textil. En cuanto al primer punto, se han evaluado cepas promisorias aisladas de estuarios y ambientes marinos, entre las que están: Corollospora intermedia, C. lacera , C. marítima, Dendryphiella salina (Kirk & Gordon, 1988), Penicil/ium simplicissimum, Psilocybe sp. y Cyclothyrium sp. (Da Silva et al., 2003). En lo que se refiere a su uso en la remoción de los efluentes de las industrias textil y papelera, se han encontrado especies con la capacidad de remover el color de las aguas residuales (Raghukumar, 2000; Ralph & Catcheside, 2002).

Ciertas especies de los géneros Fusarium, Mucor, Penicillium, Trichoderma y Rhizopus poseen la capacidad de acumular cadmio , mercurio, plomo, uranio, oro y plata, por lo que son una alternativa en programas de remoción de metales pesados de las aguas y suelos contaminados, así como en la recuperación de metales preciosos (Kapoor & Viraraghavan , 1997).

9

1.1.3. Los hongos microscop1cos en el campo de la industria farmacéutica

Sin duda alguna, una de las aplicaciones de los hongos microscópicos que ha tenido mayor impacto es la producción de fármacos derivados a partir de su metabolismo secundario. Los productos naturales son aquellas moléculas cuyo peso molecular es menor de 3000 daltons y se producen en respuesta a estímulos externos; a diferencia del metabolismo primario, no son esenciales para el desarrollo y los procesos vitales de los organismos (Strohl , 2000).

Desde el descubrimiento de la penicilina, en el año 1928, se inició una nueva era en la medicina y la biotecnología, orientando a la industria farmacéutica hacia la bioprospección de una gran diversidad de organismos como bacterias, hongos, protozoarios, insectos, plantas y organismos marinos (Bull et a/. , 2000). Actualmente productos derivados del metabolismo secundario de hongos filamentosos son relevantes en la industria farmacéutica pues son ampliamente utilizados como la penicilina, la ciclosporina A y las equinocandinas (tabla 1.1).

Hasta hace aproximadamente 1 O años, el total de metabolitos secundarios extraídos de los hongos filamentosos (antibióticos, micotoxinas, compuestos farmacológicamente activos y otras sustancias sin actividad biológica conocida) se calculaba entre 3000 y 4000 compuestos (Dreyfus & Chapela, 1994). Cabe destacar que aproximadamente el 40% de los antibióticos conocidos han sido obtenidos a partir de especies de los géneros Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium y Penicillium (Herrera & Ulloa, 1998).

10

Tabla 1.1.Aigunos metaboHtos obtenidos de hongos microscópicos en uso come~<cial

METABOLITO ESPECIE ACTIVIDAD ACOIÓ~I PRODUCTO COMPAÑÍA REFERE~lCIA

FÚUGICA BIOLOGICA FARMACOLÓGICA COMERCIAL COMERCIAL

Penicilina Pe nicill.ium Antibiótico 1 nhibe la síntesis de Peni cilina, r.lerck Lo\".e& notetum la pared celular en penicilina ·G, Elander, 1983

bacterias ampicilina, .amoxilina, m.eticilin a,

carbencilin.a Griseo fu lvi n .a Penici/lfi:Jm Antid erm.atofít ico lnh1bid·or de la Fulv'icina Merck Bíllsetal ,

griseofui1um síntesis del grifulvina , 2002 colesterol gris-PEG

Cefalosporina Cepha.losporium Antibiótico de 1 nhibe la síntesis de Cefalcsporin a Merck Billsetat, ..... acremonlum, amplio espectro la. pared celuiar N, ceroxitin a, 2002

..... Emerfce 1/opsis rccofina, Peláez:, 2006

spp. cefzil, monosid

Lovastatina. Aspergfllus H ipoli p~m ia nte Inhibid or de la Mevacocr, Merck t.l ·onahan. &. teff.eusJ síntesis del zccor, Tk acz, ·1990;

Penicillium spp . colesterol prava col Billsetal., Monascus 2002

rubber C.iclosporina A To~pocladitJm lnmunorupresor lnh ibe la actr1ación Sandinmune Sandoz: Monahan .&

spp. de celulas T Tkacz, 1990

Acido Pe n:icillium Antitumoraly 1 nhibe la s íntesis de Cell cept, N ovartis Bird &. micofenólico brevicompectum a.ntivi ra.l nucleótidos de myfortic Ca.mpbell,

y P. citrinum g:u anosina 1982; Bilis et el., 2002

Penicilina Griseofulvina

;__ /'--_ /'--_ ) /'1 "~ l ~ ! ):J~,y

COOH

Cefalosporina

Lovastatina

12

Ciclosporina A

OH

HO

Ácido micofenólico

La búsqueda de metabolitos fúngicos para uso terapéutico es constante, a la fecha algunos de ellos se encuentran en diferentes fases clínicas. Entre éstos destacan los siguientes: a) Mer-WF301 O aislado de Phialophora cyclaminis, el cual inhibe la biosíntesis de la pared celular de Gandida albicans y C. kefry; b) la aureobasidina A producida por Aureobasidium pullulans que actúa como un inhibidor de la biosíntesis de esfingolípidos en hongos, e) la kafrefungina aislada de un hongo estéril no identificado, la cual inhibe la incorporación del inositol a la membrana celular y presenta

13

actividad contra C. albicans, Cryptococcus neoformans y Saccharomyces cerevisiae (Fostel & Lartey, 2000), d) la anidulafungina con actividad antifúngica, aislada de Aspergillus rugulovalvus (Butler, 2004) y e) dos derivados de fumagilinas producidas por A. fumigatus (CDK-732 y PPI-2458) con capacidad de inhibir crecimientos tumorales (Chin et al. , 2006).

Entre las drogas aprobadas producidas por micromicetos, se encuentran el ácido micofenólico aislado de Penicllium brevicompactum, el cual es un inhibidor no competitivo de la monofosfato de inosina deshidrogenasa, enzima crucial para la síntesis de nucleótidos de guanosina. El pivolxilo de cefditoreno, bactericida de amplio espectro que es utilizado en el tratamiento de la bronquitis crónica producida por Streptococcus ¡3-hemolíticos del grupo A; este metabolito ha sido aislado de diversas cepas del género Cephalosporium (Chin et al., 2006).

~ OH

' o

o ~ ~ ~

~0:y:oDi OH

····''\,,OH

HO ¡"',,..... o ''n"····· """" OH OH 1 ~

HO OH

Mer-WF3010

14

OH o

Kafrefungina

o~ N/

1

o

o

~HO~OH OH

o OH

Derivado de fumagilina CDK-732

15

O N

~ ••• ,,,1110YCH3 o

y NH2

Derivado de fumagilina PPI-2458

1.1.4. Búsqueda de nuevos metabolitos secundarios

A pesar de los hallazgos mencionados, la lucha en contra de los padecimientos infecciosos continúa, puesto que en las últimas dos décadas, nuevas enfermedades como el sida, la fiebre hemorrágica (producida por el virus del Ébola) , la enfermedad de Lyme, la colitis hemorrágica entre otras mas, han aparecido, así mismo otras que se creían controladas han re-emergido como la tuberculosis, el cólera , la peste, el dengue hemorrágico e incluso la difteria y la poliomielitis (Cassell & Mekalanos, 2001; Guzmán & Feuerstein, 2004).

Actualmente, se ha reconocido que los microorganismos infecciosos son responsables de al menos un 15% de nuevos cánceres como el gástrico, el hepático y el cervical (Guzmán & Feuerstein, 2004). Aunado a esto, el uso indiscriminado de plaguicidas y antibióticos han inducido la aparición de cepas resistentes a los productos utilizados, como son la nistatina y la anfotericina B, ambos agentes inmunosupresores (Carrillo­Muñoz et al. , 2001 ); igualmente los azoles, como el fluconazol, ha causado resistencia en especies de Gandida, Cryptococcus neoformans, Aspergil/us fumigatus, A. terreus e Histoplasma capsulatum (Rex et al., 2001).

16

Nistatina

HO

F

Fluconazol

OH

:x;c NH2

HOY OY O

HO''''''···~OH

NH,

OH

COOH

Anfotericina B

El contar con moléculas novedosas, cuyas estructuras posean sitios de acción diferentes, con menor toxicidad y económicamente redituables es una necesidad urgente para

17

contrarrestar los padecimientos infecciosos y enfermedades que afectan a la humanidad (Chiou et al. , 2000). Entre los recursos bióticos, los hongos microscópicos sobresalen por su alta biodiversidad y capacidad biosintética por tal razón , representan una atractiva fuente de metabolitos secundarios con múltiples posibilidades en cuanto a su actividad biológica (Gioer, 1995).

Lo anteriormente expuesto, aunado a la existencia de una gran reserva genética microbiana aún desconocida, justifican el planteamiento de exploraciones científicas encaminadas hacia la valoración biotecnológica de las especies fúngicas filamentosas microscópicas (Dreyfus & Chapela, 1994).

Entre las estrategias para la detección de nuevos modelos bioactivos está la bioprospección de hongos que habitan en ambientes extremos (hongos xerófilos, psicrófilos, termófilos) (Bull et al., 2000; Das et al., 2006; Skropeta, 2008) o bien especies ligadas a sustratos específicos ( coprófilas, entomopatógenas, endofíticas) (Gioer, 1995; Lee et al. , 2005; Tan & Zou , 2001). Otra táctica es la exploración de zonas con alta diversidad y pobremente estudiadas, en este contexto, México es un sitio idóneo al contar con regiones prácticamente inexploradas desde el punto de vista micológico, como son las áreas tropicales, en las cuales se piensa que existe un importante banco de germoplasma fúngico.

Una alternativa más consiste en aprovechar las vías biosintéticas desarrolladas por los microorganismos como mecanismos de defensa ante interacciones inter e intra específicas. Las respuestas metabólicas contra competidores se pueden inducir en cultivos in vitro, un ejemplo al respecto es el antibiótico pestalona, producido por el hongo marino Pestalotia sp., el cual es sintetizado cuando el hongo crece ante la presencia de la bacteria (CJN-328) (Cueto et al. , 2001). Otro caso es el estudio realizado en cultivos mixtos entre Streptomyces vio/aceusniger y cepas de Bacillus subtil/is,

18

Colletotrichum graminico/a, Fusarium oxysporum, Gaeumannomyces graminis, (FL 151 y FL 179), Pythium aphanidermatum, P. ultimum y Rhizoctonia solani en el cual se estimuló la producción de los antibióticos nigencma, geldamicina y un complejo de lactonas macrocíclicas (Treja­Estrada et al. , 1998).

HO Cl

OH Cl

Pestalona

1.1.5. Biodiversidad de los hongos y su potencial biotecnológico

Los hongos son considerados los organismos más diversos después de los insectos; la riqueza fúngica se estima en 1.5 millones de especies a nivel mundial (Hawskworth, 1993, 2001 ; Rossman, 1994). Sin embargo, menos del 1% han sido aisladas y solamente de una mínima proporción ha sido evaluado su potencial biológico (Harvey, 2000). En México, se calcula la diversidad fúngica entre 120,000 y 140,000 especies, de las cuales menos del 10% han sido estudiadas, y aproximadamente 2,000 especies han sido descritas para micromicetos y 4,000 para macromicetos (Guzmán, 1995), lo anterior muestra que en nuestro país el estudio de este grupo de organismos esta en una fase primaria.

Como se ha mencionado con anterioridad, las especies saprobias, a pesar de ser las más abundantes en la naturaleza, han sido poco estudiadas. En nuestro país prácticamente

19

desconocemos la magnitud de la riqueza de especies de micromicetos, únicamente existen reportes para los estados de Campeche, Tabasco, Tamaulipas, Veracruz y Quintana Roo (Heredia et al., 2008).

En particular, las zonas tropicales son consideradas como valiosos bancos de germoplasma microbiano; la exuberante vegetación y las condiciones climatológicas favorecen multitud de nichos en los que proliferan los hongos microscópicos. Las zonas tropicales de México abarcan 55.7 millones de hectáreas (Instituto Nacional de Ecología, 2005), su creciente destrucción en los últimos 30 años, ha propiciado la pérdida de biodiversidad, por lo que las áreas que aun existen y que son protegidas son sitios demandantes para ser explorados con el fin de conocer su potencial biológico y fomentar su conservación.

Ante este panorama, el presente trabajo tiene como objetivo estructurar las bases para iniciar un programa a largo plazo en el que se estudie paralelamente la biodiversidad de los hongos microscópicos del trópico mexicano y su potencial biotecnológico.

La presente investigación consta de tres etapas; en la primera se aislaron y seleccionaron especies de hongos microscópicos saprobios, en la segunda, de las especies seleccionadas se evaluó su potencial para producir metabolitos bioactivos y en la tercera etapa se seleccionaron las especies promisorias, con el fin de realizar experimentos de interacción ínter-específica in vitro para estimular la producción de metabolitos secundarios bioactivos diferentes.

20

1.2. BIBLIOGRAFÍA

Anke, S. and O. Sterner (2002). "Insecticida! and Nematicidal Metabolites from fungi", in The Mycota. A Comprehensive Treatise on Fungi Experimental Systems for Basic and Applied Research. X Industrial Applications, Esser, K. and J.W. Bennett (eds) . Springer­Verlag , New York. pp. 109-127.

Bigelis, R. (1991). "Fungal Metabolites in Food Processing", in Handboock of Applied Mycology Foods and Feeds, Arara , D.K., K.G. Mukerji, E.H. Marth (eds). Marcel Deckker lnc, United States of America. pp. 499- 545.

Bilis, G., A Dombrowski, F. Peláez, J. Polishook and Z. An (2002). "Recent and future discoveries of pharmacologically active metabolites from tropical fungi ", in Tropical Mycology; volume 2: Micromycetes, Watling , R. , J. Franckland, M. Ainsworth , S. lsacc and C. Robinson (eds) . CASI Publising. New York. pp. 165-194.

Bird, D. and C. Campbell (1982). Disposition of mycophenolic acid, brevianamide A, Asperptrenamate and Ergostero/ in so/id cultures of Penicillium brevicompactum. Applied and Environmental Microbiology, 43, 345-348.

Bull , A.T. , A.C. Ward and M. Goodfellow (2000). Search and discovery strategies for biotechnology the paradigm shift. Microbiology and Molecul:ar Biology Review, 64, 576-606.

Butler, M.S. (2004). The role of natural product chemistry in drug discovery. Journal of Natural Products, 67, 2141-2153.

21

Carrillo-Muñoz, J.A., S. Brío y G. Quindos (2001). Una nueva generación de fármacos antifúngicos. Revista Iberoamericana de Micología, 18, 2-5.

Cassell , G.H. and J. Mekalanos (2001) . Oevelopment of antimicrobial agents in the era of new and reemergin infectious diseases and increasing antibiotic resistant. Journal American Medical Association, 285, 601-605.

Chiou , C.C., AH. Groll and T.J. Walsh (2000). New drugs and novel targets for treatment of invasive fungal infections in patients with cancer. Oncologist, 5, 120-135.

Chin , Y.W., M.J . Balunas, H.B. Chai, and A.D. Kinghorn (2006). Drug discovery from natural sources. AAPS Journal, 8, E239-E253.

Gueto, M., P.R. Jensen, C. Kauffman, W. Fenical, E. Lobkovsky and C. Jan (2001). Pestalone, a new antibiotic produced by marine fungus in response to bacteria/ change. Journal of Natural Products, 64, 1444-1446.

Das, S., P.S. Lyla and S.A. Khan (2006). Marine microbial biodiversity and ecology: inmportance and future perspectives. Current Science, 90, 1325-1335.

Da Silva, M. , C.E. Cerniglia, J.V. Pathuluri, P. Vanderlei, P. Canchas and E. Esposito (2003). Screening filamentous fungi isolated from estuarine sediments for the ability to oxydize policiclic aromatic hydrocarbons. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 19, 399-405.

Dix, N. J. and J. Webster (1995). Fungal Ecology. Chapman & Hall , London. 549 p.

Dreyfus, M. and I.H. Chapela (1994) . "Potential of fungi in the discovery of novel, low-molecular weight

22

pharmaceuticals", in The discovery of natural products with therapeutic potential, Gullo, V.P. (ed). Butterworth­Heinmann, Boston. pp. 49-80.

Fostel , J.M. and P.A. Lartey (2000). Therapeutic focus. Emerging novel Antifungal agents, Drug Discovery Today, 1, 25-32.

Gams, W. (1992). "The analysis of communities of saprophytic microfungi with special reference to soil fungi" , in Fungi in vegetation science. Wintterhoff, W. (ed). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. pp. 183-223.

Gloer, J.B. (1995). New Antifungal and antiinsectan natural products from fungi: An ecology-based approach, Revista Latinoamericana de Química, 24,191-208.

Guzmán, G. (1995). La diversidad de hongos en México. Ciencias, 39, 52-57.

Guzmán, C.A. and G.Z. Feuerstein (2004). Pharmaceutical biotechnology. Current Opinion in Biotechnology, 15, 503-505.

Harvey, A. (2000). Strategies for discovering drugs from previously unexplored natural products. Drug Discovery Today, 5, 294-300.

Hawksworth , D.L. (1993). "The Tropical Fungal Biota: Census, Pertinence, Prophylaxis, and Prognosis", in Aspects of Tropical Mycology, lssac, S. , J.C. Franckland , R. Watling, A.J. Whalley (eds). Cambridge University Press, Cambridge. pp. 265-293.

Hawksworth, D.L. (2001). The magnitude offungal diversity: the 1.5 mil/ion species estimate revisited. Mycological Research, 105, 1422-1432.

23

Heredia G. , R.F. Castañeda y S. Capello (2008). "Biología e importancia de los hongos microscópicos filamentosos" , en Tópicos sobre diversidad, ecología y usos de los hongos microscópicos en lberoamérica, Heredia, G. (ed). Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el desarrollo (CYTED) e Instituto de Ecología, A.C ., Xalapa, Veracruz. pp. 5-26.

Herrera, T. y M. Ulloa (1998). El Reino de los Hongos. Micología Básica Aplicada. UNAM-Fondo de Cultura Económica, México, D.F. 552 p.

Instituto Nacional de Ecología 2005. Ultima actualización realizada el 31 de Marzo del 2005. http://www.ine.gob.mx/ueajei/publicacionesllibros/421/ca p2.html. Búsqueda realizada en Diciembre del 2007.

Kapoor, A. and T. Viraraghavan (1997) . " Fungi as biosorbents", in Biosorbents for metal ions, Wase, J . and Ch. Forster (eds) . Taylor & Francis, New York. pp. 67-85.

Kirk, P. W . and AS. Gordon (1988). Hydrocarbon degradation by filamentous marine higher fungi. Mycologia, 80, 776-782.

Lee, Y-S., l. Nakahima, F. lhara, H. Kinishita and T. Nihira (2005) . Cultivation of entomopathogenic fungi from the search of antibacterial compounds. Mycopathologia, 160, 321-325.

Lowe, D.A. and R.P. Elander (1983) . Contribution of mycology to the antibiotic industry. Mycologia, 75, 361-373.

Monahan, J.M. and J.S. Tkacz (1990). Bioactive microbial product: focus upon mechanism of action. Annual Review of Microbiology, 44, 271-301.

24

Peláez, F. (2006) . The historica/ delivery of antibiotic from microbial natural product can history repeat?. Biochemical Pharmacology, 7, 981-990.

Raghukumar, Ch. (2000). Fungi from marine habitats: an application in bioremediation. Mycological Research, 104, 1222-1226.

Ralph J.P. and O.E.A. Catcheside (2002). "Biodegradation by white-rot fungi", in The Mycota. A comprehensive treatise on fungi as experimental systems for basic and applied research. Industrial App/ications. Osiewacz, H.D. (ed). Spinger-Verlag, Berlin, Heidelberg , pp. 303-326.

Rex, J.M. , M.A. Pfaller, T.J . Walsh, V. Chaturvedi, A. Espinel­lngroff, M.A. Ghannoum, L.L. Gosey, F.C. Odds, M.G. Rinaldi, D.J. Sheehan and D.W. Warnock (2001). Focus: Antifungal susceptibility testing: Practica/ aspect and current challenges. Clinical Microbiology Reviews, 14, 643-658.

Rossman, A.Y. (1994). "A strategy for an all taxa inventory of fungal diversity", in Biodiversity and Terrestrial Ecosystems, Peng, C.l. and C.H. Chou (eds). lnstitute of Botany, Academica. Scinica, Monograph Series, 14, pp. 169-194.

Skropeta, D. 2008. Deep-sea natural products. Natural Product Reports, 25, 1131-1166.

Strasser H., D. Abendstein, H. Stuppner and T.M. Butt (2000). Monitoring the distribution of secondary metabolites produced by the entomogenous fungus Beauveria brongniartii with particular reference to oosporein. Mycological Research, 104, 1227-1233.

25

Strohl , W.R. (2000). The role of natural products in a modem drug discovery program. Drug Discovery Today, 5, 39-41.

Tan , R.X and W.X. Zou (2001 ). Endophytes: a rich source of functional metabolites. Natural Products Report, 18, 448-459.

Tengendy, R.P. and G. Szakács (1998). Review. Perspectives in agrobiotechnology. Journal of Biotechnology, 66, 91-99.

Treja-Estrada, S.R., l. Rivas-Sepúlveda and D.L. Crawford (1998). In vitro and in vivo antagonism of Streptomyces violaceusniger YCED9 against fungal pathogens of turfgrass. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 14, 865-872.

26

1.3. OBJETIVOS

1.3.1. Objetivo general

Evaluar la actividad biológica y obtener el perfil qUimJco de extractos crudos provenientes de hongos microscópicos filamentosos aislados de restos vegetales colectados en zonas tropicales de México.

1.3.2. Objetivos particulares

1. Colectar, seleccionar y aislar hongos microscop1cos filamentosos poco conocidos que provengan de restos vegetales de zonas tropicales de México.

2. Obtener extractos crudos de cultivos de hongos microscópicos filamentosos y evaluar su actividad biológica contra microorganismos patógenos.

3. Evaluar la actividad antioxidante de los extractos crudos.

4. Determinar el perfil químico de los extractos crudos con potencial biológico.

5. Evaluar el efecto de la interacción de cultivos mixtos (hongo-hongo) en la producción de metabolitos secundarios.

27

6. Valorar la actividad biológica de los extractos crudos obtenidos de cultivos mixtos y determinar el perfil químico de los metabolitos con potencial biotecnológico.

7. Establecer un cepario para futuras investigaciones con los hongos microscópicos filamentosos que resulten con actividad biológica.

8. Fortalecer la colección de extractos crudos del Grupo de Química Orgánica de la unidad de Biotecnología del CICY.

9. Contribuir al conocimiento de la biodiversidad de los hongos microscópicos filamentosos asociados a restos vegetales de zonas tropicales de México.

28

1.4. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

1 Obtención de cepas fúngicas

1

Obtención de extractos

1

Evaluación de la actividad biológica

1 Antimicrobiana 1 1

Antioxidante 1

Perfil químico de los -extractos activos

1

Selección de cepas para estudios de

interacciones

1

Obtención de extractos de interacciones y evaluación

de actividad biológica

1 1

1 Antimicrobiana

1

Antioxidante 1

L u Evaluación del perfil químico de los extractos con potencial biológico

29

30

CAPITULO 11

Aislamiento, conservación e identificación de cepas fúngicas a partir de restos vegetales

11.1. INTRODUCCIÓN

Prácticamente no existe ningún material orgánico vivo o inerte que no sea susceptible a la invasión por hongos; tanto en la naturaleza como en la vida cotidiana del hombre existen multitud de sustratos en los cuales, cuando las condiciones de humedad y temperatura son propicias. se desarrollan múltiples especies de micromicetos, las cuales pasan desapercibidas a nuestra vista debido a su minúsculo tamaño y desarrollo críptico dentro de los materiales o tejidos que colonizan. Por tal razón , para poder detectarlos y estudiarlos, se requiere de metodologías específicas, las cuales día a día han ido perfeccionándose con los avances tecnológicos. Existen diversas metodologías para el aislamiento de los hongos microscópicos que proliferan en los restos vegetales, varían dependiendo del grupo que se desee aislar y los objetivos de la investigación a desarrollar. Las técnicas utilizadas se pueden dividir en métodos, directos e indirectos.

Aislamientos directos. Este procedimiento, además de sencillo es económico, requiere de cierta experiencia y habilidad para distinguir y extraer las diferentes estructuras fúngicas del material vegetal. Consiste en la revisión de los restos vegetales directamente bajo el microscopio estereoscópico. Es recomendable que previamente, para estimular la formación de las estructuras reproductoras, el material se mantenga en cámaras húmedas, las cuales pueden elaborarse con contenedores de plástico o vidrio de diferentes tamaños, según sea el tipo de material con el que se trabaje (hojas, ramas, pedazos de troncos, tallos herbáceos, etc.).

31

Para la elaboración de las cámaras existen diferentes vías para crear un ambiente húmedo; se puede cubrir el fondo de los recipientes con un material absorbente, como vermiculita, perlita o simplemente papel filtro , en todos los casos se añade agua destilada esterilizada, sin dejar películas de agua. Algunos autores colocan por encima de la vermiculita o perlita una malla de plástico o papel absorbente (Krug, 2004) , otros solamente emplean el papel filtro, con el cual , además del fondo forran las paredes del recipiente.

Una vez cubierto el fondo con el material absorbente, los restos vegetales libres de tierra y de exceso de agua se esparcen formando una capa que cubra toda la superficie, los recipientes se cierran con tapas perforadas y se mantienen a una temperatura de 20-28 °C. Es muy importante vigilar constantemente la aireación y humedad de las cámaras, la cantidad de agua no debe exceder, pues favorecería el desarrollo de especies contaminantes del ambiente, actinomicetos y bacterias, así mismo, tampoco debe ser tan baja que seque el papel ya que esto inhibiría el desarrollo de los hongos y consecuentemente la esporulación . Para mantener una adecuada aireación se recomienda, abrir diariamente las cajas y mantener un ventilador a baja velocidad en frente de ellas por una hora. Cuando se tienen los cuidados mencionados esta técnica permite la expresión de una alta diversidad de especies a diferentes periodos, además al estar en el sustrato natural es factible la detección de estructuras distintivas que, no llegan a formarse en los medios de cultivo.

Aislamientos indirectos. Esta metodología consiste en aplicar un tratamiento previo a los materiales vegetales, los cuales posteriormente serán inoculados en medios de cultivo. El método mas efectivo es el de lavado de partículas en el cual el material vegetal se pulveriza con agua destilada estéril en una licuadora, la mezcla se lava con agua a través de un tamiz, permitiendo el paso de partículas de 100 a 200 ¡.Jm de diámetro, las cuales se suspenden en agua destilada para ser

32

lavadas nuevamente, una alícuota de la mezcla se coloca en cajas de petri con agar y las colonias emergentes se transfieren a cajas de petri con medios nutritivos (Parkinson, 1994). El problema de este procedimiento estriba en las especies que no esporulan en medio de cultivo , por lo que no es posible su identificación.

11.1.1. Medios de cultivo para el aislamiento de hongos microscópicos

Los medios de cultivo pueden ser sólidos o líquidos, el agente solidificante mas utilizado es el agar (polisacárido extraído del alga roja Gelidium amansiJ) . Los medios líquidos se emplean para estudios bioquímicos y fisiológicos , para la producción de metabolitos secundarios y en ensayos microbianos; por su parte los sólidos son útiles para el aislamiento, mantenimiento, conservación y estudios de esporulación. Los medios nutritivos los podemos clasificar en naturales, semisintéticos y sintéticos.

Naturales. Se componen de ingredientes naturales, como el V-8 Qugo de vegetales), zanahoria, papa, cebolla, ciruela pasa, estiércol o suelo, pueden utilizarse en forma de extracto, infusión o decocción (Jong & Birminham, 2001).

Semisintéticos. Contienen tanto componentes naturales como los ya mencionados, además de otros definidos como sales, fuentes de carbono, entre estos medios tenemos el de papa dextrosa agar y peptona, glucosa agar, entre otros (Jong & Birminham, 2001).

Sintéticos. Se caracterizan por tener altas concentraciones de carbono (sacarosa, dextrosa, etc.) como fuente de energía; extractos orgánicos (peptona, extracto de malta y de levadura) como factores de crecimiento. Tienen una composición definida

33

y cada componente esta en una concentración conocida, que puede ser controlada (Jong & Birminham, 2001 ).

Uno de los problemas en los aislamientos fúngicos es la contaminación por bacterias y levaduras, para solucionar esto, comúnmente se utilizan antibióticos (penicilina, estreptomicina, cloramfenicol , etc.) , también el método de dilución de esporas es una alternativa para disminuir poblaciones de levaduras y actinomicetos (Jong & Birminham, 2001).

11.1.2. Métodos para la conservación en laboratorio de los hongos microscópicos

El trabajo experimental con microorganismos implica la implementación de métodos para su conservación con el objetivo de preservar cepas puras, viables y estables (evitando cambios morfológicos, fisiológicos o genéticos). La elección de cualquier método de conservación depende de los requerimientos fisiológicos del organismo, uso a futuro, equipo, personal y financiamiento (Smith & Onions, 1994; Nakasone et al. , 2004). Los métodos de conservación se pueden clasificar en los siguientes tres grupos:

a) Métodos de crecimiento continuo Subcultivo . . Involucra transferencias periódicas trasladando micelio de una colonia vieja a medio de cultivo nuevo sólido o líquido, una vez crecido el subcultivo se almacena en refrigeración entre -10 y -20 °C (Smith & Onions, 1994).

Aceite mineral. Este método es semejante al subcultivo, pero el hongo se transfiere siempre de un medio sólido y se cubre el micelio con una capa de 1 O mm de aceite mineral para prevenir la deshidratación y disminuir la actividad metabólica, se almacenan entre 15-18 °C (Smith & Onions, 1994).

34

En agua. En este caso se cortan trozos de agar (6 mm3) de una

colonia colocándolos en viales con agua destilada estéril y se almacenan a 20-25 °C (Smith & Onions, 1994).

b) Métodos por secado Gel de sílice. En recipientes de 30 mi, se aplica gel de sílice a 1/3 de su capacidad y se esterilizan por calor, posteriormente se colocan a -20 °C, adicionando sobre la sílica 1 mi de una suspensión de esporas en leche descremada al 5%, se mezcla y almacena sin tapa a 25°C por 14 días hasta secarse, finalmente se guardan a 4 o 25 °C en un recipiente con un indicador de humedad (Smith & Onions, 1994).

Suelo o arena estéril. En un tubo con suelo o arena esterilizado por dos veces se inocula 1 rnl de suspensión de esporas, posteriormente se incuba a . 20-25 °C por 5 a 1 O días, para llegar gradualmente al estado de latencia, finalmente se almacena entre 4 y 7 °C.

Liofilización. Se prepara una suspensión de esporas al 20% usando un crioprotector estéril (leche descremada, glicerol, etc.), posteriormente se adiciona 1 mi de la suspensión en ampolletas estériles cubiertas con algodón y se congelan a -20°C, a continuación se secan al vacío eliminando agua por sublimación , finalmente se sellan al calor y se almacenan a 4 °C. (Smith & Onions, 1994; Nakasone et al., 2004).

e) Método de suspensión del metabolismo Crioconservación. Para este procedimiento, se emplean criotubos de 2ml, en los que se añade 0.5 mi de una suspensión del hongo en glicerol al 10%, posteriormente se deja reposar la mezcla por 1 hora para permitir el equilibrio entre el glicerol y las células fúngicas y finalmente se guardan en ultracongelación a -70°C.

Crioconservación en nitrógeno líquido. Este procedimiento es semejante al anterior, pero programando descensos de

35

temperatura de -1 o °C/min. , hasta -50 °C, después las muestras se transfieren a un contenedor con nitrógeno líquido (Smith & Onions, 1994).

Para hongos microscópicos la técnica más recomendada es la criopreservación en nitrógeno líquido. Otras opciones adecuadas y económicas son la liofilización , el uso de cultivos en glicerol al 25% o en gel de sílice. En la tabla 2.1 se presentan las ventajas y desventajas de las diferentes técnicas de conservación y el periodo de viabilidad estimado para cada uno (Smith & Onions, 1994; Kitamoto et a/., 2002).

36

T --·- -· • " ......... ~ .... w r '"""''-' ......................................... ,...,..., '''""""'"'""""' .... '""'>J""'"""""" .... ""' .... , ...... ................ , ......... , .,I..A._,.,_,,, ""''""'"''""'"',\J<J , ..... .. ~''""...., .... Método Ventajas Desventajas Periodo de 1

vida : Métodos de crecimiento continuo

Subcultivos Económico Riesgo de contaminación 2 semanas a Fácil recuperación Laborioso 12 meses

Variación genética Aceite mineral Equipo sencillo Riesgo de contamir1ación 1 a30 meses

Económico Recuperación tardía No infestación con ácaros

Agua Económico Puede haber crecimiento 2-3 años Recuperación rápida Pérdida de la viabilidad N o cootam inación

Métodos por secado y secado por congelamiento Gel de sílice Económico Para hongos que esporulan 7-18 años

Cultivos estables Contaminación por uso repetido Previene contaminación como inoculo Uso rep_etidocomo inoculo

Almacenamiento Económico Variación Mas de 10 en suelo Estable Riesgo de contaminación años

Sobreviv enci a Uotilización No hay variación Equipo costoso 2-20 años

Para hongos que esporulan Métodos de suspensión del metabolismo

U ltracongelación Cultivos estables Costoso 5-25 años Sencillo

Nitrógeno Ji quid o Ubre de contaminación Costoso 5-25 años Esporulación no necesaria Evaporación del nitrógeno

Perdida por descuidos

[' (V)

Con el fin de mantener cultivos fúngicos viables, estables y debidamente caracterizados, existen Centros de Recursos Microbianos (MRCs) como la American Type Culture Collections (A TTCC) y el Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS). Cabe mencionar que apenas el 10% (351 263 cepas) de las especies de hongos descritas (72 000 aprox.) se conservan en cultivos in vitro (Sahin , 2006).

11.1.3. Ubicación taxonómica de los hongos microscópicos

Aunque existen hongos microscópicos en todas las categorías taxonómicas del Reino Fungi , alrededor del 80% de los micromicetos corresponden al grupo de hongos conocidos como anamorfos u hongos imperfectos, que son especies a las cuales se les desconoce su reproducción sexual , ya sea por que requieren de mayor estudio o bien por que a lo largo de su evolución han perdido esta capacidad (Kendrick, 1992). Dicha situación dificulta su ubicación dentro del sistema taxonómico de los hongos, el cual se basa en los caracteres sexuales, no obstante, dada la abundancia y diversidad de los hongos anamorfos, algunos autores han propuesto la creación de categorías taxonómicas para estos hongos, las cuales aun cuando son consideradas como artificiales, tienen una gran utilidad para su estudio.

Tradicionalmente a los hongos imperfectos se les ha ubicado dentro de la subdivisión Deuteromycotina, en la que se reconocen tres clases: Blastomycetes, Coelomycetes e Hyphomycetes, en esta última se incluye la mayoría de los hongos microscópicos filamentosos (Herrera y Ulloa, 1998).

38

11.1.4. La exploración biotecnológica de los hongos microscópicos de las zonas tropicales de México

El conocimiento sobre la diversidad de los hongos microscópicos en nuestro país aun es incipiente y en consecuencia son muy pocos los estudios en donde se ha evaluado el potencial biotecnológico de cepas nativas. Entre las contadas aportaciones en las que se han empleado cepas aisladas de ecosistemas tropicales, se encuentra el trabajo de Trigos et al., (2005) en donde 14 extractos de hongos microscópicos aislados de suelo y restos vegetales se evaluaron contra tres cepas bacterianas de importancia médica Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa y tres fitopatógenas E. carotovora , E. carotovora pv. atroseptica y Agrobacterium tumefaciens; los resultados demostraron que las especies Menisporopsis theobomae e ldriella sp., presentaron actividad antibacteriana, este último con el mayor potencial bactericida. Por otro lado, en cenotes del estado de Yucatán , Gamboa y De la Rosa (2008) aislaron 100 cepas de hongos microscópicos y evaluaron sus extractos contra, Bacil/us subtillis, E. carotovora, S. aureus, Xanthomonas campestris, Gandida albicans, Alternaría tagetica Colletotrichum gloeosporioides y Fusarium oxysporum; además realizaron el ensayo antioxidante de la reducción del DPPH, encontrando activos al menos para uno de los ensayos evaluados el 59 % de los extractos, destacando 27 cepas como productoras potenciales de metabolitos con propiedades antimicrobianas y/o antioxidantes.

En el campo de la bioremediación, se encuentran las investigaciones de Tomasini-Campocosio et al., (2001) que versan sobre la biodegradación de compuestos xenobióticos mediante Rhizopus nigricans.

39

Otras aportaciones son las de Espinoza et al., 2008, en donde el filtrado del cultivo de cinco cepas de hongos microscópicos pertenecientes a los géneros Ceratocystis, Curvularia , ldriella , Phythopthora y Rhizopus fueron evaluados contra diversos patógenos de plantas mostrando, dos de ellas con actividad fungicida como posible fuente de compuestos antifúngicos (Espinoza, et al. , 2008). Recientemente se evalúo la actividad antibacteriana de dos metabolitos (5-hidroximetil-2-furaldehido y 1 - n-butii-~-D-fructopiranosido) aislados de la biomasa micelial y el medio de cultivo de la cepa ldriel/a sp., procedente de hojarasca del estado de Veracruz, estos metabolitos presentaron actividad antibacteriana contra bacterias patógenas de humanos y plantas. (Espinoza et al. , 2008).

11.2. OBJETIVO GENERAL

Aislar, purificar y crear un cepario de especies de hongos microscópicos tropicales que no hayan sido estudiados biotecnológicamente y que tengan características adecuadas para su manipulación en el laboratorio.

40

11.3. MATERIALES Y MÉTODOS

11.3.1. Sitios de colecta y colecta de material La localización y los datos de los sitios de colecta se

presentan en la figura 2.1 y en la tabla 2.2.

97' 96" 91" oo· 89" 24.

23'

22" · c. Dzibilchaltún ,

Yuca~, 21' b. Xalapa,

J' 1'

Vera cruz d. ;,érida, {i' 20" Yucatán

• 19" 19'

18' a. Villa He,mosa, 18'

Tabasco 17" 17'

16' 16'

15' 15'

97' 96" 95' 94' 93' 92' 91" oo· 89" 88' 87'

Figura 2.1. Localización de los sitios de colecta. a) La Venta Parque Nacional, Vi/lahermosa, Tabasco. b) Rancho Guadalupe, Xalapa, Veracruz. e) Parque Eco-arqueológico Dzibilchaltún, Mérida, Yucatán. d) Jardfn Botánico Xiitbal neek del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A. C. (CICY), Mérida, Yucatán

41

T bl 2 2 D t a a .. a os geogr áf d 1 ICOS e OS SitiOS d eco ecta Estado Localidad Tipo de Coordenadas Fecha

vegetación de colecta

Tabasco Parque Selva alta 18°03'19" Lat. N Feb./2004 ecológico, 93°03'53"Lon. O La Venta, Villahermosa

Yucatán Jardín Selva baja 21°01 '42"Lat. N Marzo/2004 Botán ico, caducifolia 89°38'17"Lon. O Xiitbal neek, espinosa Mérida

Veracruz Rancho Bosque 19° 30' Lat. N Abril/2004 Guadalupe, mesófilo de 96°56-57'Lon. O Xalapa montaña

Yucatán Parque arqueo- Selva baja 21° 05' Lat. N Junio/2004 ecológ ico de caducifolia 89° 03' Lon. O Dzibilchaltún , espinosa Mérida,

El material vegetal se colectó en áreas sombrías y húmedas con acumulación de hojarasca, se depositó en bolsas de papel las cuales se etiquetaron y trasladaron al laboratorio. En el laboratorio todo el material se incubó a 25 °C, en cámaras húmedas de diferentes tamaños. La humedad y aireación de las cámaras fue revisada a diario.

11.3.2. Aislamiento, purificación e identificación de las cepas

Después de cuatro días de incubación, se revisó el material mediante el uso de un microscopio estereoscópico (Sizze SV6). Los aislamientos se realizaron de forma directa con la ayuda de agujas entomológicas, trasladando esporas, conidióforos o micelio en placas (60 x 15 mm) con agar papa dextrosa (APD) y agar-papa-zanahoria (APZ), las cuales se

42

incubaron a 25 °C. El crecimiento de las colonias se rev1so diariamente, eliminando las contaminaciones hasta lograr la purificación de las cepas mediante resiembras consecutivas.

Paralelamente, al momento de la extracción de los hongos se realizaron preparaciones permanentes en alcohol polivinílico para su identificación y conservarlas como material de referencia. A partir de las preparaciones se efectuaron las mediciones de las esporas, conidióforos, células conidiógenas y se anotaron todos los caracteres morfológicos como son tipo de pared , color, septación , presencia de ornamentaciones, setulas, tipo de conidiogénesis, presencia y forma de setas, setulas, aristas, etc. Con esta información se procedió a la consulta de textos especializados según fuera el caso (Barnett y Hunter, 1998; Carmichel et al., 1980; Ellis , 1971 , 1975).

Una vez purificadas cada una de las cepas aisladas, se conservaron por cuatriplicado mediante la transferencia de un trozo de agar con crecimiento micelial en tubos Falcón (50 mi) con medio APD inclinado y en tubos Eppendorf (2 mi), con APD o agar maíz, los cuales se incubaron a 25 °C hasta cubrir la superficie del agar, posteriormente se mantuvieron en refrigeración a 4°C. Otro método de conservación utilizado fue depositando de tres a cuatro trozos de agar con crecimiento fúngico en crioviales de 2ml con agua destilada estéril, los cuales se conservaron a temperatura ambiente, en un segundo vial se depositaron de tres a cuatro trocitos de agar con crecimiento fúngico conteniendo agua-glicerol al 25%, los cuales se conservaron en ultracongelación a -80°C (Smith & Onions, 1994).

43

11.4. RESUL TACOS Y DISCUSIÓN

De las colectas realizadas se obtuvo un total de 48 cepas diferentes, todas ellas comprenden especies anamorfas saprobias habitantes de restos vegetales. En la tabla 2.3 se presenta el numero de especies para cada sitio , cabe mencionar que algunos micromicetos aunque fueron aislados no se emplearon en el estudio, debido a su escaso crecimiento in vitre.

Tabla 2.3. Total de aislamientos obtenidos por estado y tipo de vegetación

Estado Tipo de Especies Aislamientos vegetación aisladas (%)

Tabasco Selva alta 14 56

Bosque mesófilo Veracruz de montaña 7 15

Selva baja Yucatán caducifol ia 27 29

TOTAL 48 100

En total 22 de los aislamientos se identificaron a nivel de género, 15 a nivel de especie y 11 quedaron sin ubicación taxonómica (tabla 2.4), debido a que no se contó con suficiente material para elaborar una muestra representativa de preparaciones fijas y a que en el medio de cultivo no formaron estructuras reproductoras, las cuales son indispensables para su clasificación.

El 73% de los aislamientos correspondieron a especies foliícolas (habitantes de la hojarasca), el 19% lignícolas (habitantes en ramas y troncos) y el 8%, se encontraron en

44

ambos sustratos. Como era de esperarse, todos los géneros detectados corresponden a hongos tropicales, algunos de ellos como Perelegamyces, Curvicladium y Phaeobotrys podrían considerarse como raros , ya que desde que se describieron no habían sido colectados, e incluso los aislamientos GHCICY-14, y GHCICY29 representan nuevos taxones para la ciencia.

En la figura 2.4 se ilustran algunos de los hongos aislados.

Tabla 2.4. Cepas aisladas de restos vegetales colectados en zonas t . 1 d Mé . rop1ca es e XICO

Clave Especie Sustrato Localidad

MRCICY1 Corynespora cassiico/a H 1 MRCICY2 Veronaea coprophila H 1 MRCICY3 Dactylaria sp. 1 p 1 MRCICY5 Dactylaria sp. 2 R 1 MRCICY6 Vermicu/ariopsiella sp. H 1 MRCICY7 Dactylaria sp. 3 R 1 MRCICY9 N/1 H 1

MRCICY10 Periconia sp. H 1 GHCICY11 N/1 H 2 GHCICY12 Zygosporium sp. H 2 GHCICY14 Phaeobotrys sp. H 2 GHCICY15 N/1 H 2 GHCICY16 N/1 H 2 GHCICY17 Oactylaria sp. 4 H 2 GHCICY18 Beltraniella japonica H 2 GHCICY19 Beltraniopsis sp. H 2 GHCICY20 Chaetopsina sp. H 2 GHCICY23 Hemibeltrania ma/aysiana H 2 GHCICY24 Se/enodriella fertilis H 2 GHCICY25 Perelegamyces parviechinulatus H 2 GHCICY26 Selenosporella sp. 1 H 2 GHCICY29 Curvic/adium sp. H 2

45

Continuación tabla 2.4

Clave Especie Sustrato MRCICY30 N/1 H MRCICY31 Selenosporella sp. 2 H MRCICY32 Geniculosporium sp. H MRCICY33 Memnoniella sp. R MRCICY34 Redbia sp. H MRCICY35 N/1 H MRCICY36 Gliomastix murorum H MRCICY37 Gliomastix sp. H MRCICY38 Cylindrosympodium sp. H MRCICY39 Ramichloridium apiculatum H MRCICY40 Sporidesmium sp. HyR MRCICY41 Cylindroc/adium sp. H MRCICY42 Beltraniella portoricensis H MRCICY43 Thozetella havanensis H MRCICY44 N/1 HyR MRCICY45 N/1 R MRCICY46 Kutilakesa sp. R MRCICY47 N/1 T MRCICY48 He/icosporium talbotii HyR MRCICY49 Helicosporium indicum HyR MRCICY50 Phaeoisariopsis batatico/a R MRCICY51 N/1 H MRCICY52 Spadicoides sp. T MRCICY53 Phaeoisaria c/ematidis T MRCICY54 Phialophora verrucosa H MRCICY55 N/1 H . .

NI /= no tdenttftcado. H = HoJa, R = Rama, T- Tronco, P - Pasto 1 = Xtiibal neek, Jardfn botánico, Mérida, Yucatán

Localidad 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 1 1

2 = Villahermosa, Tabasco. 3 = Xalapa, Veracruz. 4 = Dzibi/chaltún, Mérida, Yucatán.

46

Figura 2.2 Fotografías de algunas de las especies aisladas. a) Perelegamyces parviechinulata. Esporodoquios y esporas en cultivo. b) Selenodriella fertilis. Esporas bajo el microscopio estereoscópico. e) Gliomastix murorum. Masa oscura de esporas. d) Thozetella havanensis. Acérvulo. e) Helicosporium talbotii. Espora helicoidal en contraste de fases. f) Phaeobotrys sp. Conidióforo y esporas. g) Memnoniella sp. Conidióforo y conidios en cadena. h) Corynespora cassiicola. Espora.

Evidentemente que subsecuentes muestreos estacionales, enriquecerían · el conocimiento de los hongos microscop1cos asociados a la hojarasca de los sitios explorados, sin embargo para los propósitos de este estudio se consideró suficiente el material aislado para cumplir con los objetivos planteados para esta fase del trabajo.

47

11.5. CONCLUSIONES

1.- Se aislaron y purificaron un total de 48 especies fúngicas provenientes de restos vegetales del trópico mexicano.

2.- Un total de 30 géneros se detectaron entre los aislamientos.

3.- A nivel de especie se identificaron 15 aislamientos.

4.- La cepa GHCICY-14 y GHCICY-29 son nuevos taxones para la ciencia.

5. La alta diversidad de especies encontradas, evidencia la riqueza micológica de los ecosistemas tropicales.

48

11.6. BIBLIOGRAFÍA

Barnett, H.L. and B.B. Hunter (1972). 11/ustrated genera of imperfect fungi. Burgess Publishing Company, Minneapolis, Minnesota. 241 p.

Carmichael , J.W. , W.B. Kendrick, L. Conners and L. Sigler (1980). Genera of Hyphomycetes. University of Alberta Press, Ganada. 386 pp.

Ellis, M.B. (1971). Dematiaceous Hyphomycetes. Commonwealth Mycologicallnstitute, Kew. 607 p.

Ellis, M.B. (1976). More Dematiaceous Hyphomycetes. Commonwealth Micologicallnstitute, Kew. 507 p.

Espinoza, C., G. Viniegra-González, O. Loera, B. Velásquez and A. Trigos (2008) . Antifungal activity of severa/ fungi against plant pathogens. Mycologia Aplicada Internacional, 20, 63-67.

Espinoza, C. , G. Viniegra-González, O. Loera, G. Heredia and A. Trigos (2008). Antibacterial activity against plant pathogens by cruded extracts and compounds from ldriella sp. Revista Mexicana de Micología, 26, 9-15.

Gamboa, A. y S.G. De la Rosa (2008). "Potencial biológico y creatividad química de los hongos microscópicos del trópico americano", in Tópicos sobre diversidad, ecología y usos de los hongos microscópicos en lberoamérica, Heredia, G. (ed). Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el desarrollo (CYTED) e Instituto de Ecología, A.C. Xalapa, Ver. México. pp. 253-272.

49

Herrera, T. y M. Ulloa (1998). El reino de los Hongos. Micología Básica aplicada. UNAM-Fondo de Cultura Económica, México, D.F. 552 p.

Jong , S.C. and J.M. Birminham (2001). "Cultivation and preservation on fungi in culture", in The Mycota Systematics and evolution VI/, Mclaughin, D.J. , E.G Mclaughin and Lemke, P.A. (eds). Springer-Verlag. Berin , Heidelberg. pp. 193-202.

Kendrick, B. (1992). The Fifth Kindom. Focus information group, lnc. 406 p.

Kitamoto, Y. , A. Suzuki, S. Shimada and K. Yumanaka (2002). A new method for the preservation of fungus stock cultures by deep-freezing. Mycoscience, 43, 143-149.

Krug , J.C. (2004). "Moist Chamber for the development of fungi". in Biodiversity of Fungi lnventory and Monitoring Methods, Mueller, G.M., G.F. Bilis, M.S. Foster (eds). Elsevier. Academic Press. China. pp. 589-593.

Nakasone, K.K., S.W. Peterson and S.-Ch. Jong. (2004). "Preservation and distribution of fungal cultures", in Biodiversity of Fungi lnventory and Monitoring Methods, Mueller, G.M. G.F. Bilis. M.S. Foster (eds). Elsevier. Academic Press, China. pp. 3.7-47.

Parkinson, D. (1994). "Filamentous fungi", in Methods of soil analysis, Part 2. Microbiological and Biochemica/ Properties. Soil Science Society of America (ed). Book Series, No 5.

Sahin , N. (2006). Biosafety, biodiversity and significance of Microbial Resource Centres (MIRCs) in microbiology

50

education. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 22, 219-224.

Smith, D. and A.H.S. Onions (1994) . The preservation and maintenance of living fungi. lnternational Mycological lnstitute. CAB lnternational Second edition . United Kingdom. 122 pp.

Tomasini-Campocosio, V. , D. Flores, D. Cortés and J. Barrios­González (2001 ). An iso/ate of Rhizopus nigricans capable of tolerating and removing pentachlorophenol. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 17, 201-205.

Trigos, A. , G. Mendoza, G.M. Luna, G. Heredia y R.M. Arias (2005). Evaluación antibacteriana de hongos microscópicos del suelo y restos vegetales. Revista Mexicana de Micología, 20, 89-92.

51

52

CAPITULO 111

Antimicrobial, antioxidant and chemical profile of anamorphic fungi isolated from plant debris of

tropical areas in Mexico

M. Reyes-Estebanez1, G. Heredia2 and M. M. Gamboa-Angulo1

1Unidad de Biotecnología, Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Calle 43 No. 130, Chuburná, Mérida 97200, Yucatán, México. 2Departamento de Biología de Suelos, Instituto de Ecología A.C., Km 2.5 carretera antigua Xalapa-Coatepec, Xalapa 91000, Vera cruz, México.

*Corresponding author E-mail: mmarcela@cicy.mx

111.1. ABSTRACT

Forty eight fungal strains were selectively isolated from plant debris in the tropical regions of Mexico, where fifteen of them were identified to specie and twenty two to genus level. All isolates were screened against tour Gram-positive and Gram­negative bacteria, one yeast, three phytopathogenic fungi, the oomycete Pythium aphanidermatum; and by reduction of DPPH in the antioxidant assay. Antimicrobial activity was detected in eighteen extracts (38%) against at least one of the target strains tested . The greatest antagonistic action was produced by MR45 with broad spectrum activity. Antioxidant activity was observed in three extracts (6%), corresponding to Corynespora cassiicola, Beltraniella japonica, and Gliomastix murorum. The active extracts, were partitioned between hexane and acetonitrile, and the active fractions were subsequently

53

analyzed by GC-MS, and their MIC's and antioxidant activity were determined. The chemical profile of these fractions led to the detection of 2-hydroxyjuglone from B. japonica which was identified as a stronger antioxidant metabolite. This is the first report on the isolation and biological evaluations of anamorphic fungi from Mexican tropical regions , demonstrating their potential use in future applications in pharmacy and agriculture.

Keywords: anamorphic fungi , antimicrobial , antioxidant, CG­EM, plant debris

111.2. INTRODUCTION

Anamorphic fung i have been recognized as an interesting resource of secondary metabolites with useful activities for pharmaceutical purposes (Tulp & Bohlin , 2004; Misiek & Hoffmeister, 2007). However, most of the fungal metabolites have been obtained mainly from macro and micro­fungi isolated in temperate regions. Although tropical ecosystems are recognized for their high biodiversity, there are relatively few explorations dealing with their chemical characterization and as a consequence, their ability to produce important novel compounds remains unknown (Bilis et al. , 2002) .

The biotechnological potential of the tropical fung i is evident with examples such as apicidine, an antiprotozoary metabolite isolated from a strain of Fusarium pallidoroseum collected in Costa Rica and from other Fusarium sp. isolated from soybean seeds (Park et al. , 1999). Flutimide from Delitschia confertospora which was isolated from dung in Namibia is able to inhibit influenza A virus transcription (Tomassini et al., 1996), and nodulisporic acid from

54

Nodulisporium spp., as an efficient insecticide against the larva of blowfly Luci/ia cericata (Bilis et al., 2002).

With approximately 2600 genera and 15000 species, plant debris anamorphic fungi represent a rich and susceptible resource to be explored (Cannon & Sutton , 2004). In Mexico, isolation and taxonomic identification of these kinds of fungi have been reported from the states of Campeche, Quintana Roo, Tabasco and Veracruz (Heredia & Mercado, 1998; Torres­Barragán et al. , 2004; Heredia et al. , 2006a; 2006b). However, regarding biological profile, there are very few publications dealing with Mexican fungi, and information on tropical species is particularly scarce (Trigos et al., 2005; Torres-Barragán et al., 2004).

The purpose of this work was to determine antioxidant and antimicrobial properties of 48 plant debris anamorphic fungi isolated from different tropical locations of Mexico.

111.3. MATERIALS ANO METHODS

111.3.1. Fungal isolation and identification Fungi were isolated from plant debris collected in the

following locations in the Mexican south-east; 1. La Venta National Park, Villahermosa, Tabasco; 2. Rancho Guadalupe, Xalapa, Veracruz; 3a. Dzibilchaltun Eco-archeological park, Merida, Yucatan; and 3b. Xiitbal neek Botanical garden of the Centro de lnvestigacion Científica de Yucatan, A.C. (CICY), Merida, Yucatan.

Plant debris was incubated in damp chambers at room temperature to induce sporulation (Krug, 2004). After five days, fungal structures were isolated and cultured in patato dextrose agar (PDA) plates. All strains were incubated at 25°C, with photoperiod 12/12 h (light/dark) until they covered the plate

55

surface. The purified strains were preserved by two methods: in distilled water at room temperature and frozen at -80°C in glycerol (20%, v/v). Fungi were identified according to their morphologic characteristics using taxonomic keys and specialized literature.

111.3.2.Growth conditions Rice (20 g) was fermented with distilled water (30 mi) ,

sterilized at 121 °C for 30 m in and inoculated with a hyphal fragments-spore suspension (2 mi) of each strain. Two flasks per strain were inoculated and maintained at 25°C, using a light-dark photoperiod (12/12 h) for 40 days (Sornan et al., 2001).

111.3.3. Fungal extraction Fermented rice cultures were fragmented and then

extracted three times using ethyl acetate (50 mi each time) . The combined ethyl acetate extracts were filtered to remove solid material and evaporated under vacuum until totally dry. Fungal crude extracts were stored in vials at 4 °C in the dark.

111.3.4. Partition of fungal extracts Sorne active fungal extracts were dissolved in acetonitrile

and defatted with hexane (3 x, 2:1, 1:1, 1:1, v/v) furnishing two fractions, acetonitrile and hexanic, which were then evaluated in antioxidant, microdilution assays and GC-MS analyses.

111.3.5. Preparativa TLC Beltraniella japonica extract (27 mg) was fractioned on

preparative TLC using two silica gel plates (20 x 20 cm, 0.25 mm) as stationary phase and dicloromethane-methanol (95:5) 2 x as mobile phase. The different bands were subsequently extracted with ethyl acetate and concentrated under reduced pressure. Fraction 8 corresponded to 2-hydroxyjuglone.

56

111.3.6. Chemical profile The objective of these analyses was not to provide

absolute identification of all the different compounds found, but to compare the chemical profile of different fungal extracts belonging to diverse species. GC-MS analyses were performed on an 'Agilent Technologies 6890N chromatograph [0.4 1-11 of sample at 2%, HP DB-5MS column [(5 % phenyl)-methyl polisiloxane, 30 m long, 0.32 mm i.d ., 0.5 1-1m film thickness] , helium at flow rate = 1.2 ml/min, T1 = 140°C, T2 = 300°C, gradient = 8°C/min] coupled to an Agilent Technolog ies 59758 mass selective detector. The majority of components remained unidentified because of the lack of library spectra for the corresponding compounds. 1H NMR spectra was recorded at 400 MHz on a Bruker - 400 spectrometer, using d6-acetone as solvent, chemical shift was expressed in ppm.

111.3.7. Target strains All fungal species were tested against nine target strains

which included four bacteria: Bacil/us subtillis (ATCC 6633) , Erwinia carotovora subp. carotovorum (ATCC 138), Staphylococcus aureus (ATCC 6536), and Xanthomonas campestris pathovar carotae (ATCC 10547); a yeast Gandida albicans (ATCC 10231 ); three fungal phytopathogens: Alternaría tagetica (ATCC 58771 ), Col/etotrichum gloeosporioides (CICY002), Fusarium oxysporum (CICY003) , and the Oomycete Pythium aphanidermatum (CICY004) .

111.3.8. Antimicrobial activity assay Antimicrobial activity was determined by the disc

diffusion assay (Bauer et al. , 1966). Tripticasein Soy Agar (TSA) plates were inoculated with bacteria and yeast target strains (final concentration 1.5 x 108 cfu mi-\ and 700 1-11 of pathogenic fungi spore suspension (8 x 105 spores/ml) were applied to PDA plates (Petrikkou et al., 2001 ). Subsequently, each fungal extract (500 1-'9) was dissolved with acetone (1 %) ,

57

impre9nated onto a paper filter disc (6 mm in diameter), and placed on the inoculated a9ar surfaces. Amykacine (5 IJ9) was used as positive control for bacteria; Neomicol (1 0 9) for C. a/bicans; Alliette (3 IJ9) for P. aphanidermatum and Ricoil (25 IJ9) for the other patho9ens.

The plates were incubated for 24 h at 25°C and 37°C for phytopatho9enic and zoopatho9enic bacteria , respectively; 48 h at 37°C for yeast; and 72 h at 25°C, for fun9al phytopatho9ens. All tests were performed in triplicate and the anta9onism was expressed by an inhibition zone around the spot of disc.

111.3.9. Broth microdilution assay MIC The Minimal lnhibitory Concentration (MIC) and Minimal

Bactericida! Concentration (MBC) of the active fractions were determined as previously described (Andrews, 2001 ). Activated bacteria were inoculated on Mueller-Hinton broth (MHB) and cultivated at 3rC (S. aureus) and 25°C (E. carotovora and X. campestris) for 24 hours. The cultures were adjusted to 0.5 McFarland standards to approximately 1 x 108 ufc/ml. Dilutions of the fractions were dissolved in 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) to 0.4, 0.2, 0.1, 0.05 m9/ml and added to MHB. Tests were carried out in duplicate, usin9 indicated positive and ne9ative controls.

After 24 hours, 50 ¡JI of 1% Triphenyl Tetrazolium Chloride (TTC) were added to each well, positive test was detected as colorless (dead bacteria) and ne9ative as red color (bacteria! 9rowth). The MIC was the lowest concentration preventing visible growth. The MBC was considered to be the complete absence of bacteria! growth , to confirm the results of MBC 1 ¡JI was sub-cultured on Mueller-Hinton a9ar (MHA) and incubated 24 hours (Taylor, 1983). Each test was performed in duplicate.

58

111.3.1 O. Antioxidant activity by Reduction of DPPH All samples (1 00 ¡.Jg) were applied on silica gel 60F2s4

TLC plates and developed with dichloromethane-methanol (9:1). Dry TLC plates were sprayed with 0.2 % 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) methanolic solution and kept at room temperature for 12 h. Positive control was vitamin C, and each test was performed in duplicate. DPPH reduction by an antioxidant compound was immediately observed as yellow spots against a purple background , and reported by the spot Rr (frontal reference) (Sánchez-Medina et al., 2001).

59

111.4. RESUL TS ANO DISCUSSION

A total of 48 fungal strains were isolated belonging to different ecosystems in the states of Tabasco (14) , Veracruz (7) , and Yucatan (27) . In Tabasco, Bursera simaruba (L.) , Cedrela odorata (L.), Ceiba pentandra (L.) and Vochysia hondurensis Sprague (Cowan , 1983) are found in a collection site located in a tropical perennial forest; in the rainforest of Xalapa, Veracruz, Liquidambar styracif/ua Oersted, Carpinus caroliniana Walter, Quercus germana Cham. and Sch. and Q. xalapensis Humb. (Heredia, 1999) are predominant; while leguminoseae such as Acacia gaumeri Blake, Apoplanesia paniculata Presl. , Bursera simaruba (L.), Caesalpinia gaumeri Greem and Gymnopodium floribundum Rolfe are common in the tropical deciduous forest of Yucatan (Escalante Rebolledo, 1993; Mondragón-Chaparro, 2000). Among isolates, 16 were identified at species level , and 21 at genus level , the other 11 strains remained unidentified (Table 3.1). In this work, one strategy of selection was to el iminate common fung i (Acremonium, Alternaría, Aspergil/us, C/adosporium, Fusarium, Penicillium, Trichoderma) that could produce known compounds. Therefore, fungi were chosen according to their novelty, being more likely to produce metabolites with potentially new activity and structural diversity.

The antimicrobial activities of the fungal extracts were tested in vitro using the disc diffusion method. Results showed that among all strains tested, 38% have the ability to produce inhibitory substances against at least one target strain (Table 3.2). Most of the activity was observed against bacteria with 94% of the active fungal extracts whereas 22% were against C. albicans, and/or sorne of the phytopathogenic fungi or the oomycete. These results were consistent with previous reports from other screening studies carried out in different substrata

60

and regions in the world (Christophersen et al., 1999; Vizcaíno et al., 2005; Wang et al., 2007).

A broad antimicrobial activity spectrum was detected for eight isolates (B. japonica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp. , C. cassiicola, G. murorum, Phaeobotrys sp., the unidentified strains MR44 and MR45) being able to inhibit Gram-positive, Gram-negative bacteria and/or fungal pathogens. The remaining active isolates were selective in only one of the targets tested (Table 3.2). The strongest antibacterial activity was displayed by Beltraniopsis sp. and MR45 strains (++), the most sensitive bacteria being S. aureus, which was inhibited by 14 fungal extracts, followed by B. subtillis, both are Gram­positive. This is consistent with a previous report in the literatura (Lee et al. , 2005).

The anti-candida activity was exhibited only by three isolates, which included Memnoniella sp., Phaeobotrys sp., and MR45, not reported previously for those genera. C. albicans is a very important human opportunist pathogen, widely spread with very few safe drugs to control it (Nata rajan et al., 2007). In the present work, Memnoniella sp. displayed high specificity against C. albicans. There are also reports of metabolites isolated from M. echinata such as memnoconols, memnobotrins (Hinkley et al. , 1999) and memnopeptide A active against Gram-positive bacteria (Vertesy et al. , 2001), as well as the cytotoxic mycotoxins trichodermol , trichodermin , dechlorogriseofulvin and epidechlorogriseofulvin (Jarvis et al., 1996). lnterestingly, Phaeobotrys sp. is an uncommon genus with a weak anti­candida activity in the present work, P. acutisporum as its sole reported specie, (Calduch et al., 2002). lnterestingly, Phaeobotrys sp. , showed activity only against C. albicans, this corresponded to an uncommon genus, with only the P. acutisporum specie reported (Calduch et al. , 2002).

61

Antifungal activity against phytopathogenic fungi was exhibited only by B. portoricensis and MR45, the latter being the most promising of this screening, with a broad activity spectrum and the highest (+++) inhibition zones against C. g/oeosporioides and P. aphanidermatum, and moderate activity (++) with the rest of the target strains (Table 3.2) .

On the other hand, compounds with the ability to reduce the radical DPPH were detected in extracts of B. japonica, C. cassiico/a, and G. murorum (Table 3.2). There are no previous reports of antioxidant evaluations in these genera. The importance of antioxidant activity lies in the prevention of free radical formation, the primary cause of illnesses such as diabetes, neurological and cardiovascular disorders and several types of cancer (Cano et al., 1998).

The work was continued by defatting with hexane the active extracts of B. japonica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp. , C. casiico/a, G. murorum, Phaeobotrys sp. and the unidentified strain MR45. Two fractions were obtained from each extract, and tested by broth dilution against S. aureus, E. carotovora , and by reduction of the DPPH radical ; finally, their chromatographic profile was determined by GC-MS (Table 3.1).

The results of the MIC's showéd that the acetonitrile fractions of C. cassiicola and MR45 were more active against S. aureus and E. carotovora, respectively. Both presented appreciable activity with MIC and MBC at 0.2 mg/ml, where C. cassiicola produced bactericida! effect and MR45 bacteriostatic properties. The rest of the fractions did not present activity at 0.4 mg/ml.

Although MR45 is the most promissory strain, its chemical profile revealed a complex mixture in its GC-MS

62

(Tabla 3) and 1H NMR spectra. This requires further study to determine its active principies.

One of the majority components of acetonitrile fraction of B. japonica was fractionated by preparative TLC obtaining a compound with a high ability for scavenging the DPPH radical (Rr 0.3). This presented a retention time of 9.57 min and molecular ion at m/z 190 by GC-MS, which was identified in the MS database software as 2-hydroxyjuglone, and confirmed by NMR data (4.58, 6.9, 7.08 - 7.61, 12.35 ppm). This compound belongs to naphthoquinones, a chemical family recognized for their broad-range of biological action, with the ability to inhibit Gram-positive. Gram-negative bacteria and fungi. In particular, 2-hydroxyjuglone is a cytotoxic agent with inhibitory effect on the basic biochemical processes and membrane systems of the ce lis (Mendentsev & Akimenko, 1998; Bürki et al., 2003). In micromycetes, 2-hydroxyjuglone is considered an intermediary to melanin formation; lt could also play an ecological role as protection against many kinds of environmental stress (Butler et al., 2001 ; Babitskaya & Shcherba, 2002). There are few reports dealing with the mitosporic fungi with antioxidant activity such as acremonin A (Abdei-Lateff et al. , 2002) and graphislactone A (Gunatilaka, 2006). These antecedents suggest that 2-hydroxyjuglone could be the active principie of the antimicrobial activity of B. japonica. Furthermore, in this work it was detected as a promissory antioxidant agent and the first metabolite reported from B. japonica.

Although Beltraniella genera are commonly encountered on tropical leaf litter (Heredia et al., 2002) there are no reports dealing with their biological activity and chemical studies. In this work, two Beltraniella strains were detected which were collected from different localities, and differ in biological profile, whereas B. japonica displayed antibacterial and antioxidant properties, B. portoricensis showed antibacterial and antifungal

63

activity. As was expected, in the GC-MS analyses, two main peaks were observed at 8.57 and 10.29 m in, with molecular ion at miz 167 and 194, respectively. The H 1NMR data (1.0, 2.3, 3.0 - 4.5, 5.3 ppm) of the B. portoricensis fraction indicate the presence of non-aromatic metabolites, which clearly differentiates the chemical profile in comparison with that of B. japonica. Some studies have been carried out on B. portoricensis which report 3-cloro-1 ,2-propanediol (Takahashi et al., 1987) and 1-4-~-D-glucanase with detergent properties (Baba et al., 2005).

The GC-MS profile of C. cassiicola showed two components in the acetonitrile fraction at retention times of 17.32 and 21 .94 min with a molecular ion at miz 246 and 272, respectively. The proton NMR spectra of this fraction suggested the presence af dauble bond (6.61, 6.51 ppm) and methyl graups shifted to low field (2.7-2.39, 2.34 ppm). With regards to C. cassiicola, several metabolites have been isalated, such as 7 -0-methylspinachrome B and 6-(3-hydraxy-n-butyl)-7 -0-methylspinachrame B (Turner & Aldridge, 1983). Therefare, the chemical profile could suggest the presence af phenyl structures in the extract of C. cassiicola.

In general, the chemical profile showed a large variety af campaunds present in the fungal extracts, suggesting that isolates were able to produce metabalites probably unknown as yet. Furthermare, it is widely recagnized that fungal metabalism is able ta change in agreement with the biotic and abiatic factars, in arder ta survive in different environments (Calvo et al., 2002; Peláez, 2006). Hence, this is an impartant cantributian ta the explaratian af the biatechnalagical patential af a minar part of the anamarphic fungi in the sauth-eastern tropical areas af Mexica where there is still a huge fungal diversity ta be isalated.

64

This investigation is the first report on the isolation of anamorphic fungi from the state of Yucatan , where severa! strains are clear evidence of the importance of continuing the search of our mycobiota. Molecular identification of these promising isolates, together with toxicity studies, isolation and structural identification of the active principies from their organic extracts are now in progress.

Acknowledgements

The authors thank Susana De la Rosa-García, Leticia Medina-Baizabal, and Wendy Chí-Aguilar for their valuable technical assistance. We are also grateful to Pilar Rodríguez­Guzmán, for providing sorne target strains, and Silvia Cappello and Rafael Castañeda for facilitating the collection , isolation and determination of the Tabasco material. Osear Moreno­Valenzuela for his valuable comments. This research was supported by REDEMIC (XII .J.) of CYTED, FOMIX CONACYT­AECI (157/2005), CONACyT (Project No. 47549) , and by Graduate Student Fellowship to M.M.R.E. (183272).

65

111.5. REFERENCES

Abdei-Lateff, A. , G.M. Koning , K.M. Fisch, U. Holler, P.G. Jones and A.D. Wright (2002). New antíoxidant hydroquinone derivatives from the algicolous marine fungus Acremonium sp. Journal of Natural Products, 65, 1605-1611.

Andrews, J.M. (2001). Oetermination of mínimum inhibitory concentrations. Journal Antimicrobial and Chemotherapy, 48, 5-16.

Baba, Y., A. Shimonaka J. Koga, K. Murashima, H. Kubota , T. Kono (2005). Purification and characterization of a new endo-1,4-{3-0-g/ucanase from Beltraniella portoricensis. Biosciences Biotechnology and Biochemistry, 69, 1198-1201.

Babitskaya, V.G. and V.V. Shcherba (2002). The nature of melanin pigments of severa/ micro- and macromycetes. Applied and Biochemical Microbiology, 38, 247-251 .

Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris and M. Turck (1966) . Antíbiotíc susceptibility testing by a standardized single disk method. American Journal Clinical Pathology, 45, 493-44.

Bilis , G., J. Pol ishook, F. Peláez, Z, An . (2001). " Recent and future discoveries of pharmacologically active metabolites from tropical fungi", in Tropical Myco/ogy; volume 2: Micromycetes. Watling , R. , J. Francklan, M. Ainsworth , S. lsacc, C, Robinson (eds). CABI Publising , Wallingford, Oxon. p. 165-194.

66

Bürki , N. , A. Michel and R. Tabacchi (2003) . Naphthalenones and isocoumarins of the fungus Ceratocystis fimbriata f sp. platani. Phytopathologia mediterranea, 42, 191-198.

Butler, M.J ., A.W. Day, J.M. Henson and N.P. Money (2001). Pathogenic properties of fungal melanins. Mycologia, 93,1-8.

Calduch, M., J. Gené, J. Guarro, A. Mercado-Sierra and R.F. Castañeda-Ruíz (2002). Hyphomycetes from Nigerian rain forests. Mycologia, 94, 127-135.

Calvo, A.M., R.A. Wilson, J.W. Bok and N.P. Keller (2002). Relationship between secondary metabolism and fungal development. Microbiology Molecular and Biology Review, 66, 447-459.

Cano, A. J. Hernández-Ruíz, F. García-Cánovas, M. Acosta and M.B. Arnao (1998). An end-point method for estimation of the total antioxidant activity in plant material. Phytochemical Analisys, 9, 196-202.

Cannon , P.F. and B.C. Sutton (2004). "Microfungi on wood and plant debris", in Biodiversity of Fungi Jnventory and Monitoring Methods Mueller G.M. , G.F. Bilis, M.S. Foster (ed). Elsevier Academic Press, China. pp. 218-219.

Christophersen , C., O. Crescente, J.C. Frisvad, L. Gram, J. Nielsen, P.H. Nielsen and L. Rahb83k (1999). Antibacterial activity of marine-derived fungi. Mycopathologia, 143, 135-138.

Cowan, C.P. (1983). Flora de Tabasco. Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. 120 p.

67

Escalante Rebolledo, S. (1993). Jardín botánico regional guía general. Centro de Investigación Científica de Yucatán, Gobierno del Estado, Secretaría de Ecología. 53 p.

Gunatilaka, A.A.L. (2006). Natural products from plant­associated mícroorganísms: dístributíon, structural bíodíversíty, bíoactívíty, and ímplícatíons of theír occurrence. Journal of Natural Products, 69, 509-526.

Heredia Abarca, G. and A. Mercado-Sierra (1998). Tropical hyphomycetes of Mexíco. 111. Sorne specíes from the Ca/akmul bíosphere reserve, Campeche. Mycotaxon, 68, 137-143.

Heredia, G. (1999). Diversidad y sucesión de los Hyphomycetes de la superficie de las hojas en descomposición de tres especies árboreas dominantes en un bosque mesófilo de montaña en el centro de Veracruz. Tesis Doctoral. Universidad Nacional Autónoma de México. 169 p.

Heredia, G., R.M. Arias, M. Reyes and R. Castañeda-Ruiz. (2001). New anamorph fungí wíth rhombíc conidia from Mexican tropical forest litter. Fungal Diversity, 11 , 99-107.

Heredia, AG., R. Castañeda Ruiz, H.C. Becerra y R.M. Arias. (2006a). Contribución al conocimiento de Jos hongos anamorfos saprobíos del estado de Tabasco. l. Revista Mexicana de Micología, 23, 53-62.

Heredia, AG. , R.M. Arias, J. Mena-Portales, A. Mercado-Sierra (2006). Adiciones al conocimiento de la diversidad de los hongos conidiales del bosque mesófilo de montaña del

68

estado de Veracruz. 11. Acta Botánica Mexicana, 77, 15-30.

Hinkley, S.F. , J.C. Fettinger, K. Dudley and B.B. Jarvis. (1999). Memnobotrins and memnoconols: novel metabolites from Memnoniella echinata. Journal of Antibiotics , 52, 988-997.

Jarvis, B.B. , Y. Zhou, J. Jiang, S. Wang , W.G. Sorenson E.L. Hintikka, M. Nikulin , P. Parikka, R.A. Etzel and D.G. Dearborn. (1996). Toxigenic molds in water-damaged buildings: dechlorogriseofulvins from Memnoniella echinata. Journal of Natural Products, 59, 553-554.

Krug, J.C. (2004) . "Moist chambers for the development of fungi", in Biodiversity of Fungi lnventory and Monitoring Methods. Mueller, G.M., G.F. Bilis , M.S. Foster (eds). Elsevier Academic Press; China. p. 589-594.

Lee, Y.-S., l. Nakajima, F. lhara, H. Kinoshita and T. Nihira. (2005). Cultivation of entomopathogenic fungi for the search of antibacterial compounds. Mycopathologia, 160, 321-325.

Mendentsev, A.G., and V.K. Naphthoquinone metabolites Phytochemistry, 47, 935-959.

Akimenko of the

(1998). fungi.

Misiek, M., and D. Hoffmei1ster (2007). Fungal genetics, genomics, and secondary metabolites in pharmaceutical sciences. Planta Medica, 73, 103-115.

Mondragón-Chaparro, D.M. (2000). Dinámica poblacional de Tillandsia brachycau/os Schltdl. , en el parque nacional

69

de Dzibilchaltún , Yuc. Tesis doctoral Centro de investigación Científica de Yucatán . p. 92.

Natarajan, D. , N. Nagamurugan, A. Ramachandran, C. Mohanasundari and K. Srinivasan (2007). Anticandidial and anticryptococca/ activity of Euphorbia fusiformis, a rare medicinal plant. World Journal Microbiology and Biotechnology, 23, 719-721 .

Park, J.-S. , K.-R. Lee, J.-C. Kim, S.-H . Lim, J.-A. Seo and Y-W. Lee (1999). A hemorrhagic factor (apicidin) produced by toxic Fusarium iso/ates from soybean seeds. Applied and Environmental Microbiology, 65, 126-130.

Peláez, F. (2006). The historical delivery of antibiotics from microbial natural products-Can history repeat?. Biochememical Pharmacology, 71 , 981 -990.

Petrikkou, E. , J.L. Rodríguez-Tudela, M. Cuenca-Estrella A. Gómez, A. Molleja and E. Mellado (2001). lnoculum standardization for antifunga/ susceptibility testing of filamentous fungi pathogenic for humans. Journal Clin ical Microbiology, 39, 1345-1347.

Sánchez-Medina, A. , K. García-Sosa, F. May-Pat and L.M. Peña-Rodríguez (2001 ). Evaluation of biologica/ activity of crude extracts from plants used in Yucatecan traditional medicine Part l. Antioxidant, antimicrobial and jJ-glucosidase inhibition activities. Phytomedicine, 8, 144-151.

Sornan, AG ., J.B. Gloer, R.F. Angawi , D.T. Wicklow and P.F. Dowd (2001 ). Vertilecanins: new phenopicolinic a cid analogues from Verticillium lecanii. Journal of Natural Products, 64, 189-192.

70

Takahashi, H. , Y. Nakamura, M. Ogura, Y. Shimada and K. Watanabe (1987). Manufacture of optically active 3-ch/oro-1,2-propanedio/ by microorganisms in the presence of a sulfhydryl-containing compound. Eu Pat Appl , EP, 224246.

Taylor, P.C. , F.O. Schoenknecht, J.C. Sherris and E.C. Linner (1983). Determination of m1mmum bactericida/ concentrations of oxacillin for Staphylococcus aureus: influence and significance of technical factors . Antimicrobial agents and Chemotherapy, 23 , 142-150.

Tomassini, J.E. , M.E. Davies, J.C. Hastings, R. Lingham, M. Mojena, S.L. Raghoobar, S.B. Singh, J.S. Tkacz and M.A. Goetz (1996). A novel antiviral agent which inhibits endonuc/ease of influenza viruses. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 40, 1189-1193.

Torres-Barragán, A. , A.L. Anaya, R. Alatorre and C. Toriello (2004). Entomopathogenic fungi from "El Eden" Ecological Reserve, Quintana Roo, Mexico. Mycopathologia, 158,61-71.

Trigos, A., G. Mendoza, M. Luna, G. Heredia y R.M. Arias (2005). Evaluación antibacteriana de hongos microscópicos del suelo y restos vegetales. Revista Mexicana de Micología, 20, 89-92.

Turner, W.B. and D.C. Aldridge (1983). "Poliketides", in Fungal metabo/ites 11. Academic Press, NY. 631 p.

Tulp, M. and L. Bohlin (2004). Unconventional natural sources for future drug discovery. Drug Discovery Today, 9, 450-458.

71

Vertesy, L., H. Kogler, A. Markus, M. Schiell, M. Vogel and J. Wink (2001 ). Memnopeptide A, a novel terpene peptide from Memnoniella with an activating effect on SERCA2. Journal of antibiotics, 54, 771-782.

Vizcaino, J.A. , L. Sanz, A. Basilio, F. Vicente, S. Gutiérrez, M.R. Hermosa and E. Monte (2005). Screening of antimicrobial activities in Trichoderma iso/ates representing three Trichoderma sections. Mycological Research,109, 1397-1406.

Wang , F.W., R.H. Jiao, A.B. Cheng, S.H. Tan and Y.C. Song (2007). Antimicrobial potentials of endophytic fungi residing in Quercus variabilis and brefeldin A obtained . from Cladosporium sp. World Journal of Microbioogy and Biotechnology, 23, 79-83.

72

1

Table 3. 1. Anamorphic fungi isolated from tropical areas in the South-east of Mexico

Anamorphic Fungi

Beltraniella japonica Matsush., GH 18 Beltraniella portoricensis (F. Stevens) Piroz. & S.D. Patil , MR42 Beltraniopsis sp. GH 19 Chaetopsina sp. GH20 Corynespora cassiico/a (Berk. & M.A. Curtís) C.T . Wei , MR01 Curvicladiella sp. GH29 Cylindrocladium sp. MR41 Cy/indrosympodium sp. MR38 Dactylaria sp. 1 MR03 Dactylaria sp. 2 MR05 Dactylaria sp. 3 MR07 Dactylaria sp. 4 GH17 Geniculisporium sp. MR32 Gliomastix murorum (Corda) S. Hughes, MR36 Gliomastix sp. MR37 He/icosporium indicum P.Rag. Rao & D. Rao, MR49 He/icosporium talbotii Goos, MR48 Hemibeltrania ma/aysiana Matsush., GH24 Kutilakesa sp. MR46 Memnoniella sp. MR33 Perelegamyces parviechinulatus W . B. Kendr. & R.F. Castañeda, GH25 Periconia sp. MR10 Phaeobotrys sp. MR14 Phaeoisariopsis batatico/a (Cit. & Bruner) M. B. Ellis, MR50 Phaeoisaria clematidis (Fuckel) S. Hughes, MR53 Phia/ophora verrucosa Mediar, MR54 Ramich/oridium apiculatum (J .H. Mili ., Giddens & AA Foster) de Hoog, MR39

73

Substrate Localities

L 1 L 2

L L 1

3a L L 1

L 2

L 3b

G 3a

B 3a

B 3a

L 1

L 3a

L 3a

L 3b 3a

L-B L-B 3a

L 1

B 2

B 3a L 1

L 3a

L 1 3b

B T 3a

L 3a L 3b

1

Anamorphic Fungi

Redbia sp. MR34 Selenodriella fertilis (Piroz. & Hodges) R.F. Castañeda & W .B. Kendr., GH23 Selenosporella sp. 1 GH26 Selenosporella sp. 2 MR31 Spadicoides sp. MR52 Sporidesmium sp. MR40 Thozetella havanensis R.F. Castañeda, MR43 Vermicu/ariopsie/la sp. MR06 Veronaea coprophila (Subram. & Lodha) M.B. Ellis Zygosporium sp. GH 12 Unidentified MR09 Unidentified GH11 Unidentified GH15 Unidentified GH16 Unidentified MR30 Unidentified MR35 Unidentified MR44 Unidentified MR45 Unidentified MR47 Unidentified MR51

Unidentified MR55 L: Leaves, G: Grass, B: Branch, T: Trunk

Table 3.1 . Continuation

Substrate Localities

L L

L L T

L-B L L L L L L L L L L

L-B B T L

L

3b 1

3a 3b 3a 2

3a 3a 1

3a 1 1 1

3b 3b 2 2 3a 3a 3a

1. Villahermosa, Tabasco; 2. Xalapa, Veracruz; 3a. CICY, Merida, Yucatan; 3b. Dzibilchaltun, Merida, Yucatan

74

Table 3. 2 Anamorphic species with antimicrobial (disc assay) and antioxidant activity (reduction of

DDPHJ------------------------------------------------------------Anamorphic fungi Bs Sa Xc Ec Ca At Cg Fo Pa DPPH (Rr)

BeitraniefJa japonfca + + ++ ++- - - - - 0.12, 0.3 B ertranie/Ja po.rtoricensjs ++ + - - - ++ ++ Beitraniopsis sp. ++ ++ +++ ++ -Corynespora cassHcola + ++ ++ + - - - - - 0.07, 0.47 CurvicfadieJia sp. - + Gfiomasüx murorum + + + - - - - - - 0.3, 0 .5. 0.57 Heficospoñum tafbotii - + Hemibeltrania mafaysiana - + Memnonielfa sp. - - - - ++ -Perefegamyces parviechinulatus - + Phaeobotrys sp. + + + ++ + ·- - - - -Phiafophora ver:rucosa + Ramichloridium apicu/atum - + Thozeteffa hav anensis - + VermicufaropsfeJ/a sp. + Unidentified GH15 - - ++ u nidentified rv1 R44 - ++ + u nidentiífied rv1 R45 ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ - +++ -Blank (extract of felttl ented rice) -

Bs = Ba.dllus subtillis, S a= Staphyloooccus aur.eus, X a= Xanthom o nas campestris, Ca= Cendida eii:Jicens, Ec = E rv.inia car.otovora, At = Alternaria tags!ica, Cg = C olle!o!Jichum gloeospc-crioides, Pa = Pytttium aph aniderm atum Positive Control: emykacine for bacteria; Neo mico/ for y east; R.icoil for fungi and A1Ve!e for P. aphan id·ermatum f.legetiv.r: control: .are tone (12. 5 ¡J./)(- ): no antimicrobfaJeotivl'ty (+}: the fnhibfoon z-one is 1'ess than 10 mm{++): the fnhibition zone ts bel\v.een 10 mm end 20 mm(+++): the inhl'bition zone is aéove 20.

V)

r--

Table 3.3. Nl l e· s and CG analyses of the acetooitrile fracti ons obtained. from the active fungal extracts

str.ain Mini m u:m lnhibitory Concent.at ion M C Majolity peaks in GC IJQ/:ml tRmin

S. a E. e X e c . a Beltranielfa j aponica .200 400 NA NA 9.57

10.6 B elt.raniefla portorlcensis 400 NA NA NA 8.58

10..29 BeJtraniopsJs sp. 400 NA 400 NA 7.96

8..26 10.9 13.32

Corynespo.ra cassHco!a 100 NA NA NA 17.32 \0 t---

21.94 G!iomasüx murorum 400 NA NA NA 10 .20

12 .00 13.91

A4emoonie!Ja sp. NA NA NA 100 13.70 P.haebotrys sp. NA NA NA 400 4 .01 rv1R4-5 100 400 400 400 .8.5

1<8 23

Btank (Fen:n ented rice) NA NA NA NA 18.1 7 Ergosterol l'JA NA NA 1:'-JA .27.28

NA = No actí11e

ANEXO CAPITULO 111 Evaluación de la actividad biológica de los extractos

A continuación se presenta una galería de fotografías, en la cual se ilustran los resultados más relevantes de este capítulo

Actividad antibacteriana

e

Figura 3.1. a) Bioensayo de difusión en agar en disco de C. cassiicola (MRH-1), Phaeobotrys sp. (MRH-14) y G. murorum (MRH-36) contra Vibrio sp. b) Bioensayo contra B. subtillis y halo de inhibición formado por C. cassiicola (MRH-1) e) Actividad de C. cassiicola (MRH-1), Phaeobotrys sp. (MRH-14) sobre E. carotovora y d) Halos de inhibición presentados sobre X. campestris por el extracto de B. japonica (MRH-18) y Beltraniopsis sp. (MRH-19).

77

Actividad antifúngica

Figura 3.2. Bioensayo antifúngico a) Extracto B. portoricensis (MRH-42) y MRH-45 contra Colletotrichum gloeosporioides. b) Halos de inhibición de B. portoricensis (MRH-42) y MRH-45 sobre Alternaria tagetica.

Actividad antioxidante

MRH-1 MRH-18MRBia MRH-36 MRH-41

Figura 3.3. Ensayo antioxidante sobre DPPH. Se observa una marcada actividad en el extracto de Corynespora cassiicola (MRH-1), Beltraniella japonica (MRH-18) y Gliomastix murorum (MRH-36) y Cilyndrocladium sp. (MRH41 ). Vit C, como control positivo.

78

Tabla 3.4 Partición con hex.ano y acetonitrilo de los extractos de las och os cepas elegidas para real izar 1 os. estudios de interacciones Nombre de la c.epa Clave Extracto Hexano Rendimiento A eN Rendimiento

del (mg) (mg) (%) {mg) (%) extracto

Corynespora casiícota MRH-1 2.0·.5 3.5 17 17.1 83.4 Phaeobotrys sp. MRH-14 33.2 11.6 35 13.8 41.6 Beltraniella japonica MRH-18· 33.9 3.7 10.9 27.6 81.4 Beltraniopsis sp. MRH-19 33.1 4.5 13.6 23·.2 70.1

Gliomastix murorom MRH-36 39.1 5.0 12.8 24.6 63

Beltraniella MRH-42 20~ 5 1.8 8.8 10.6 51.7 portoricensis Thozetetla havanensis MRH-43 35.3 1.5.8 44.8 11.4 32.3 MRCICY-45 MRH-45 34.3, 10,.9 31.8 11 .7 34.1

0\ r--

95:5

1 1a 1b 18 18a 18b 36 36a 36bBianco

Figura 3.4. Cromatografía en capa delgada (CCD}, partición en acetonitrilo de los extractos de las cepas activas en el bioensayo antioxidante carriles: 1, 1a y 1b C. cassi icola, 18, 18a y 18b B. japonica y 36, 36a y 36b G. murorum, /os metabolitos se revelaron con ácido fosfomolíbdico. El carril en número corresponde al extracto de arroz fermentado, a es la fracción hexánica y b la de acetonitrilo.

1 1a 1b 18 18a 18b 36 36a 36b Blanco

Figura 3.5. Metabolitos antioxidantes de la partición hexano:acetonotrilo revelados en el bioensayo con DPPH, la letra a corresponde a la fracción hexánica;b fracción de acetonitrilo, 1 C. cassiicola, 18 B. japonica y 36 G.

80

murorum. El blanco corresponde al extracto del arroz fermentado; vit C como control positivo.

Tabla 3.5. Referencia frontal (RF) de los metabolitos antioxidantes en los extractos crudos y particionados de las ocho cepas seleccionadas

Nombre de la RF del extracto RF Partición RF Partición cepa hexanica acetonitrilo

Corynespora 0.1, 0.15, 0.2, 0.2, 0.43, 0.66, 0.1, 0.15, 0.2, casiicola 0.66, 0.7 0.7, 0.78 0.66, 0.7

Phaeobotrys 0.08, 0.16,0.42, 6.6, 7, 0.78 0.08, 0.16, sp. 0.66, 0.7 3.8, 0.42, 0.6,

0.7

Beltraniel/a 0.07, 0.21, 0.41, 0.55, 0.7, 0.21, 0.24, japonica 0.24, 0.37, 0.66, 0.7, 0.78, 0.66, 0.7

0.41, 0.66, 0.7 0.94

Beltraniopsis 0.06, 0.11, 0.34, 0.45, 0.06, 0.26, sp. 0.26, 0.31, 0.57, 0.66, 0.7, 0.34, 0.57,

0.66, 0.7, o. 79,0.92 0.66, 0.7

Gliomastix 0.57, 0.63, 0.57, 0.63, 0.3, 0.32, 0.42, murorum 0.67, 0.74, 0.66, 0.7 0.57, 0.63,

0.78, 0.8 0.67,

Beltraniella 0.08, 1.5, 0.62, 0.6, 0.66, 0.79, 0.21, 0.34, portoricensis 0.76 0.43, 0.6, 0.70,

0.79, 0.88

Thozetel/a 0.5, 0.66, 0.75, 0.66, 0.82, 0.91 0.5, 0.66, 0.75, havanensis 0.82 0.8

MRCICY-45 0.51, 0.61, 0.51, 0.61, 0.75 0.51, 0.61, 0.75 0.75, 0.89

Blanco 0.72, 0.9, 0.95, ND ND 0.97

ND NO determinado

81

Bioautografía

9:1 Bioautografía Staphylococcus sureus

1 1a 1b 14 14a 14b 18 18a 18b 1a 1b 14 14a 14b 18 18a 18b

Figura 3.6. En orden Cromatografía en capa delgada (CCD) y bioautografía contra S. aureus de los extractos provenientes de arroz fermentado, la partición con hexano y acetonitrilo el número arábigo indica el extracto crudo de arroz fermentado de 1) C. cassiicola, 14) Phaeobotrys sp., y 18) B. japonica; la letra a corresponde a la fracción hexánica y la b a la fracción de acetonitrilo en cada una de las cepas.

82

CAPITULO IV

Perfíl biológico de hongos anamórficos del sureste mexicano

Reyes Estebanez, M.1, Heredia Abarca, G.2 y Gamboa

Angulo, M. M.1

1 Unidad de Biotecnología, Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C. Calle 43 No. 130, Chuburná, Mérida 97200, Yucatán, México. 20epartamento de Biología de Suelos, Instituto de Ecología A.C. , Km. 2.5 carretera antigua Xalapa-Coatepec, Xalapa 91000, Veracruz, México.

*Autor de correspondencia: Tel. (999) 9813923; Fax: (999) 9813900 E-mail: mmarcela@cicy.mx

IV.1. RESUMEN

Los hongos Beltraniella japonica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp., Gliomastix murorum y MR45 asociados a hojarasca, se cultivaron en dos medios líquidos, Czapeck-Oox­extracto de levadura (COL) y caldo de papa dextrosa (CPO) . En cada caso, el micelio se separó del filtrado y ambas fases se sometieron a maceración con AcOEt obteniendo los correspondientes extractos fúngicos de filtrado (EFF) y micelio (EFM). Éstos se evaluaron en los ensayos de reducción del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (OPPH) y el antimicrobiano por microdilución contra cuatro patógenos. Los resultados mostraron una alta capacidad antioxidante en los EFF de B. japonica, G. murorum y MR45, en los medios CPO y COL. La actividad antimicrobiana más alta se detectó contra S. aureus, producido por las dos cepas de Beltraniella (200 ¡Jg/mL) en CPO y contra E. carotovora en el EFM de B. japonica en COL.

83

En ambos medios, B. japonica produce meleína, no obstante, para las demás cepas activas no se identificaron los componentes. El perfil biológico y las exploraciones preliminares por cromatografía de gases - espectrometría de masas (CG-EM) de los extractos activos confirman la versatilidad metabólica de los hongos del trópico mexicano, los cuales pueden ser susceptibles de manipulación para la producción de metabolitos útiles en farmacia y agricultura.

PALABRAS CLAVE Antimicrobianos, Antioxidantes, Hongos anamórficos, Meleína.

Biological profile of anamorphic fungi from southeast mexico

IV.1. ABSTRACT

Leaf litter fungi Beltraniella japonica , B. portoricensis, Beltraniopsis sp., Gliomastix murorum and MR45were cultured in two liquid mediums, Czapeck-Oox-yeast extract (COY) and potato dextrose broth (POB). In each case, mycelium was separated from the broth filter, and both were macerated with EtAcO, producing filtrate fungal extracts (FFE) and mycelium extract (MFE). These were evaluated by the reduction of radical 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (OPPH) assay, and by microdilution antimicrobial test against four pathogenic microorganisms. The results showed high ability to OPPH reduction in FFE of B. japonica , G. murorum, and MR45 in POB and COY. The highest antimicrobial activity was detected against S. aureus produced by both Beltraniella strains (200 Og/ml) in POB and against E. carotovora by MFE of B. japonica in COY. In both mediums, this strain produced mellein, no other metabolite was identified from the active extracts. The biological profile and initial chromatographic explorations of the active extracts confirm metabolic diversity in our tropical fungi,

84

which could be utilized to improve the production of metabolites useful in pharmacy and agriculture.

KEY WORDS Antimicrobial , Antioxidants, anamorphic fungi , mellein.

IV.2. INTRODUCCIÓN

Los hongos son ampliamente reconocidos como una fuente prolífera de metabolitos secundarios con una gran diversidad estructural , a los cuales se les han atribuido diversas propiedades biológicas de gran beneficio para la humanidad. Entre ellos se encuentran la penicilina (Penicillium chrysogenum) y las cefalosporinas (Cephalosporium chrysogenum) antibióticos de amplio espectro utilizadas en medicina humana (Adrio y Demian, 2003); en el campo de la agricultura se encuentra la beauvericina de Beauveria brongniartii (Strasser et al., 2000), las ofiobolinas de Cochliobolus heterostrophus como nematicidas (Anke y Sterner, 2002); y alantrifenona, alantripineno y alantrileunona (Eupenicillium spp.) como insecticidas (Fabio et al. , 2005), entre otros.

Los reportes en la literatura, sugieren que la producción de metabolitos secundarios se realiza en la idiofase, que es aquella en la cual el crecimiento activo ha cesado (Calvo et al. , 2002; Keller et al. , 2005). Por otra parte, la cantidad y variedad de estos se produce en respuesta a factores abióticos (pH, temperatura, disponibilidad de nutrientes, espacio, luz y agua) y bióticos (interacción con bacterias, actinomicetos, hongos, protozoarios, artrópodos, nematodos, etc) que desvían el curso normal del metabolismo primario (Frisvad et al., 1998; Strohl, 2000; Adrio y Demian, 2003). Esto se refleja en los cultivos in vitro , donde la variación de los nutrientes y las condiciones de incubación son utilizados como una estrategia para inducir o estimular una mayor producción de metabolitos secundarios bioactivos (Casas-López et al. , 2004; Keller et al. , 2005). En

85

general , la industria farmacéutica, prefiere los cultivos sumergidos, ya que el proceso es más simple, la disponibilidad de nutrientes y la aeración son más homogéneos, las rutas bioquímicas oxidativas se conservan el mayor tiempo posible, además de que el tiempo de crecimiento es menor que en el estado sólido, permitiendo el control de parámetros como pH, temperatura, nutrientes, etc. (Robinson et al., 2001 ).

En particular, en nuestros laboratorios se detectaron hongos anamórficos de la región sureste de México con promisorio potencial biotecnológico (Reyes-Estebanez et al., 2008) . Entre éstos se seleccionaron a las cepas de Beltraniella j aponica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp. , Gliomastix murorum y MR45 por mostrar un amplio espectro de actividad antimicrobiana y/o antioxidante al ser cultivados en el arroz fermentado (Reyes-Estebanez et al. , 2008) . Aun cuando éstos géneros han sido aislados en otros sitios, la actividad biológica no ha sido previamente documentada, por lo cual resulta de gran interés continuar estudiando estos hongos. Con estos antecedentes, en el presente estudio se planteó como objetivo evaluar la capacidad metabólica de las cepas seleccionadas para producir principios activos en dos medios líquidos, así como de iniciar la caracterización química de éstos, mediante el análisis por CG-EM.

IV.3. MATERIALES Y MÉTODOS

IV.3.1. Cepas fúngicas Las cepas fúngicas Beltraniella japonica (GH 18), B.

portoricensis (MR42), Beltraniopsis sp. (GH19), G/iomastix murorum (MR36) y MR45 se obtuvieron del cepario del Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C. (Reyes-Estebanez et al. , 2008).

86

IV.3.2. Suspensión de Esporas Las cepas se inocularon en agar-maíz (AM) y se

incubaron a 25 oc, con fotoperíodo de 12/12 horas luz/oscuridad, de 7 a 15 días. Cuando la superficie de la caja se cubrió totalmente se adicionaron 5.0 mLde una solución de cloruro de sodio al 0.85 %- tween 20 al 0.05 % (SST) (Gómez­López et al., 2005) y con un portaobjetos estéril se desprendieron las esporas cuidadosamente para obtener la suspensión correspondiente (Holler et al., 2000).

IV.3.3. Cultivos líquidos En matraces Erlenmeyer de 250 mL se depositaron 100

mL de a) caldo papa dextrosa (CPD, Bioxon) y b) Czapek Dox enriquecido con extracto de levadura (COL), ajustados a pH 5 y 7 con ácido fosfórico, respectivamente. Éstos se inocularon con 1.0 mL de la suspensión de esporas de cada hongo y se mantuvieron a 25 °C, con fotoperíodo de luz/oscuridad de 12/12 horas, con una velocidad de agitación de 150 rpm, durante 20 días. Como blanco se utilizó el medio de cultivo con 1.0 mL de SST, sin inocular. Todos los experimentos se realizaron por triplicado (Trigos et al., 2005).

Al finalizar el período de crecimiento el caldo de cultivo se separó por filtración obteniendo la biomasa micelial y el filtrado. A éste último se le determinó el pH y ambas fases se liofilizaron , reportando la biomasa micelial en peso seco. Posteriormente, los liofilizados se sometieron a extracción con acetato de etilo a temperatura ambiente, por 24 horas, repitiendo el proceso tres veces. El disolvente se eliminó a presión reducida usando un rotavapor (Buchi), con baño de agua a 40 °C (Pittayakhajonwut et al. , 2008).

IV.3.4. Métodos analíticos Los análisis por cromatografia de gases

espectrometría de masas (CG-EM) se realizaron en un cromatógrafo Agilent Technologies 6890N inyectando 0.4 !JL de muestra a una concentración del 2_%, a una columna HP DB-

87

5MS [(5 % difenil- 95 % dimetil polisiloxano, 30 m largo, 0.32 mm d.i, 0.5 Dm espesor de la película], flujo de Helio = 1.2 mllmin , T1 = 140 oc, T2 = 300_°C, gradiente de 8_°C/min] acoplado a un detector de masas selectivo Agilent Technologies 59758 Los componentes se reportaron en minutos por su tiempo de retención (tR) en el CG y por su patrón de fragmentación en el EM, los cuales se compararon con la base de datos NIST 05MS spectra, 2006, software del equipo. El espectro de resonancia magnética nuclear de protón (RMN 1 H) se determinó en un espetrometro Bruker- 400 a 400 MHz, usando acetona d6 como disolvente, los desplazamientos químicos se expresaron en ppm.

IV.3.5. Reducción del radical 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)

Los extractos fúngicos se disolvieron en acetona al 1.0 % (1 00 ¡Jg), se aplicaron en cromatofolios de gel de sílice 60Fzs4 y se eluyeron con una mezcla de diclorometano-metanol 9:1 (por duplicado). El disolvente se eliminó por evaporación y las placas se observaron bajo luz ultravioleta de onda corta (UVzs4) y larga (UV355) , marcando las manchas observadas. Uno de los cromatofolios se reveló con ácido fosfomolíbdico y el segundo con una solución de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) al 0.2 % disuelto en metanol, el cual permaneció a temperatura ambiente durante 12 horas. Como control positivo se utilizaron 1 O IJg de Vitamina C al 1.0 % (Redoxón , Lab. La Rache) . La aparición de manchas amarillas contra un fondo púrpura indicó la presencia de metabolitos antioxidantes que se reportaron por la referencia frontal (Rr = distancia recorrida por el metabolito en el cromatofolio/ distancia recorrida por el disolvente) (Sánchez-Medina et al., 2001) .

IV.3.6. Microorganismos patogénicos Las evaluaciones se realizaron

Staphy/occocus aureus (Gram-positiva, carotovora (Gram-negativa, A TTC

88

contra las bacterias, A TTC 6633), Erwinia 138), Xanthomonas

campestris (Gram-negativa, ATTC 10547) y Gandida albicans (ATCC 10231).

IV.3.7. Bioensayo Antimicrobiano por el Método de Microdilución

Las bacterias blanco se cultivaron en agar Müeller­Hinton (AMH) por 24 horas. Posteriormente, se transfirieron a caldo Müeller-Hinton (CMH) fresco y se incubaron a 37 oc (S. aureus y C. albicans) y 25 oc (E. carotovora y X. campestris) , durante 18 horas. Los cultivos se ajustaron en CMH a una concentración final aproximada de 1 x 108 ufc/mL por comparación visual con el tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland (Andrews, 2001 ).

Los extractos fúngicos se diluyeron en dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración final de 16 ¡.Jg/¡.Jl. En la primera fila de la microplaca se adicionaron 190 IJL de medio CMH estéril y 1 O ¡.JL del extracto fúngico (160 ¡.Jg) . Posteriormente, 100 IJL de esta mezcla homogénea se transfirieron al siguiente pozo y así sucesivamente hasta el pozo No. 4. Finalmente todos los pozos se inocularon con 1 00 IJL de la suspensión de bacteria blanco (200 IJL de volumen final en cada pozo). La concentración final de los extractos fue de 400, 200, 100 y 50 ¡.Jg/mL; para el DMSO de 2.5, 1.25, 0.625, y 0.312 %; y las bacterias a 5 x 105 ufc/ml. Las microplacas se mantuvieron en incubación a las mismas condiciones mencionadas anteriormente para los patógenos, por 24 horas. Como control positivo se utilizó amikacina al 1.0 % (1 .0 IJL) para bacterias y para la levadura neomicol (1 .0 ¡.Jg) . Todos los ensayos se real izaron por triplicado.

89

IV.3.8. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB)

Al finalizar el período de incubación , 1.0 ¡.JL de la mezcla de cada pozo se inocularon en agar Müeller-Hinton (AMH) y se incubaron a 25 o 37 _°C por 24 horas, según el patógeno. La presencia de crecimiento bacteriano indicó un efecto bacteriostático y la ausencia de crecimiento un efecto bactericida. (Taylor, 1983).

IV.3.9. Determinación de la Concentración Mínima lnhibitoria (CMI)

Una vez transcurrido el tiempo de incubación se adicionaron 50 ¡.JL de Cloruro de Trifenil Tetrazolium {TTC) al 1.0 % y se mantuvieron en incubación por 30 minutos. La coloración rojo intensa indicó la presencia de bacterias vivas y aquella concentración que permaneció incolora correspondió a la CMI (Andrews, 2001).

IV.3.10. Análisis Estadísticos El porcentaje de biomasa micelial , los extractos

orgánicos y el pH , se sometieron a un análisis de varianza utilizando el software SAS, seguido por comparación múltiple de medias (Tukey P = 0.05) (Steel y Torrie, 1986).

90

IV.4. RESULTADOS

Rendimientos de biomasa micelial

El análisis estadístico de la biomasa micelial producida en los dos medios de cultivo utilizados mostró que no existen diferencias significativas (P < 0.05) para B. japonica , B. portoricensis, Beltraniopsis sp. y MR45. Para G. murorum si existe diferencia significativa ya que presentó un incremento micelial del 64 % en el cultivo en CPO (1 .06 g/100 ml de medio) respecto al rendimiento micelial en COL (0.41 g/100 mL de medio).

Rendimiento de los extractos

Los EFM y EFF de los hongos en estudio, con excepción de MR45, mostraron diferencias significativas (P = 0.05) en los dos medios de cultivos empleados. En general , los mayores rendimientos en las extracciones con AcOEt se obtuvieron cuando las cepas se cultivaron en el medio CPO; tanto en los EFM (98 - 1645 mg/L de medio CPO) como en los EFF (52. 7 -1190 mg/ L) , con respecto a los correspondientes en COL.

Reducción del radical OPPH

Los resultados del ensayo de la reducción del OPPH mostraron que las cepas B. japonica, G. murorum y MR45 poseen capacidad para producir metabolitos antioxidantes, en los dos medios de cultivo empleados (Tabla 1 ). En los tres casos, la actividad antioxidante se observó únicamente en los EFF. Asimismo, el perfil de composición en R, es altamente variable en cada medio líquido. En COL, cinco componentes diferentes se detectaron para las cepas B. japonica (Rr = 0.05, 0.12, 0.22, 0.4 y 0.8) y G. murorum (Rr = 0.25, 0.29, 0.35, 0.46, y 0.5). En CPO el componente activo para G. murorum es de mayor polaridad ya que se observan en el punto de aplicación (Rr = 0.012) y para B. japonica 0.12, que coincide con uno de

91

los reportados en COL. Por otra parte, la cepa MR45 revela la formación de dos componentes activos tanto en CPO (Rr 0.05 y 0.72) como en COL (Rr 0.21 y 0.72), siendo los de menor polaridad de naturaleza similar en referencia frontal.

Actividad antimicrobiana

La actividad antimicrobiana se detectó en un total de 11 diferentes extractos obtenidos de las cinco cepas en estudio, cultivadas en dos medios líquidos diferentes (Tabla 1 ). La más alta actividad antibacteriana (CMI = 200 Og/mL) se detectó en los EFF en el medio CPO de las dos especies de Beltraniel/a contra S. aureus y en el EFM de B. japonica cultivada en COL contra E. carotovora. En general , todas las cepas fúngicas evaluadas manifestaron actividad inhibitoria cuando menos contra dos patógenos, en al menos uno de sus extractos. La cepa MR45 mostró un espectro amplio de actividad antimicrobiana ya que fue capaz de inhibir el crecimiento de las tres bacterias blanco, E. carotovora, S. aureus y X. campestris. Por otra parte, los extractos de G. murorum no presentaron actividad antimicrobiana alguna.

Entre las cepas patogénicas evaluadas, la más sensible correspondió a E. carotovora la cual se inhibió con los extractos de B. japonica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp. y MR45, cuyos principios activos se detectaron cuando se cultivaron en el medio COL. Otra cepa sensible fue S. aureus, cuyo crecimiento se detuvó ante seis extractos pertenecientes a tres cepas, (B. japonica B. portoricensis y MR45) . Contra X. campestris solo se detectaron tres extractos capaces de inhibir su crecimiento, siendo estos el EFM y EFF de Beltraniopsis sp. y el EFF de MR45, obtenidos de COL. Ninguno de los extractos evaluados mostró capacidad inhibitoria contra la levadura Gandida albicans.

La actividad antimicrobiana se detectó principalmente en los extractos obtenidos cuando las cepas se cultivaron en el

92

medio COL (64 %). Entre éstos, los de B. japonica en COL y todos los de B. portoricensis preentaron efecto bactericida; y para los extractos de Beltraniopsis sp. y MR45 en COL el efecto se determinó como bacteriostático. En el medio CPO se registraron únicamente cuatro extractos activos, los EFM y EFF de B. portoricensis y el EFF de MR45 demostraron ser bactericidas; finalmente , el EFF de B. japonica con efecto bacteriostático sobre las bacterias patógeno.

IV.5. DISCUSIÓN

Un total de 20 extractos orgánicos se obtuvieron a partir del micelio y filtrado al cultivar los cinco hongos seleccionados en dos medios líquidos, uno defin ido (COL) y otro indefinido (CPO). Ambos medios son ampliamente utilizados en el cultivo de hongos anamórficos (Paterson y Bridge, 1994; Vizcaíno et al., 2005), donde las especies seleccionadas crecieron exitosamente. Las evaluaciones antimicrobianas y antioxidantes de los extractos obtenidos tanto del micelio como del filtrado de cultivo demostraron que el 65 % de ellos tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de alguna de las bacterias evaluadas y/o la reducción del radical OPPH. Muy importante es destacar que la actividad estuvo dirigida en un 60 % hacia las bacterias Gram-negativas evaluadas, donde se observó principalmente un efecto bacteriostático (67 %). Para S. aureus la acción se detectó como bactericida en un 83 %.

En cuanto a la actividad antioxidante, las cepas de B. japonica, G. murorum y MR45 mostraron que sus EFF poseen varios metabolitos capaces de reducir el radical OPPH. Particularmente en el medio COL se detectaron un mayor número de componentes activos, los cuales son excretados hacia el medio de cultivo por las células , ya que no se observan en los extractos miceliales. Las cepas mencionadas confirmaron su potencial antioxidante y en el presente estudio

93

MR45 demostró producir metabolitos activos en los dos medios líquidos evaluados.

En general, únicamente el B. japonica mantuvó un perfil de actividad biológica similar al detectado cuando se cultivó en arroz fermentado (Reyes-Estebanez et al. , 2008). Al analizar por CG-EM los cuatro extractos de este hongo, se observó la producción consistente (EFF y EFM en COL; EFF en CPO) de un compuesto mayoritario con un tiempo de retención de 7.95 minutos y un ión molecular a miz 178, el cual se identificó con la base de datos de EM del equipo como meleina. Esto se confirmo por la comparación de sus datos de resonancia magnética nuclear de protones (1.55, 2.95, 4.76, 6.72, y 7.44 ppm) con los reportados en la literatura para este compuesto (Cole et al. , 2003). Meleina, también denominado ochracina, es un meta bolito aislado de Microsphaeropsis sp., y reportado con actividad antimicrobiana (Holler et al. , 1999), pero no antioxidante. Esto concuerda con lo encontrado en nuestro trabajo ya que los tres extractos de B. japonica que contienen meleína demostraron alguna acción antibacteriana. Sin embargo, el EFM en COL no fue capaz de reducir al OPPH, aún cuando diversos derivados de meleina han sido reportados con actividad antioxidante (Choudhary et al., 2004).

El cuanto G. murorum, al ser cultivado en los dos medios líquidos, perdió sus propiedades antimicrobianas, permaneciendo las antioxidantes en los EFF de COL y COP. Los CG-EM de EFM y EFF en COL revelaron dos componentes mayoritarios de tiempo de retención de 9.96 y 18.5 minutos, con su ión molecular a miz 190 y 320, respectivamente. Sin embargo, éstos no correspondieron a ninguno de los compuestos de la base de datos del equipo, surgiendo la posibilidad de que se trate de estructuras poco comunes o novedosas. No se detectaron componentes en los CG-EM de los extractos en CPD, en la columna utilizada. Lo anterior permite deducir la diferencia del contenido en los extractos cuando en G. murorum se varia el medio de cultivo. Gliomastix

94

es un género ha sido muy poco explorado en cuanto a su contenido químico y taxonómicamente ha sido relacionado con el género Acremonium. En este aspecto, de una cepa de Acremonium sp., ha sido reportada la acremonina A y su glucósido como metabolitos antioxidantes (Abdei-Lateff et al. , 2002) .

Los CG-EM del resto de los extractos activos de las cepas en estudio, indicó una alta variabilidad de componentes es sus cromatogramas. La mayor parte de estos no identificados, por lo que resultan de mucho interés para continuar las investigaciones químicas de estas especies.

El análisis integral de los resultados indica que en el medio de COL las cepas en estudio expresan mayor actividad biológica y variabilidad biosintética. Este comportamiento en los hongos ha sido ampliamente documentado en relación a los factores abióticos del medio artificial donde se cultivan (Frisvad et al., 1998; Strohl , 2000; Bode et al., 2002; Adrio y Demian, 2003).

En conclusión, se recomienda continuar el cultivo de estas cepas en el medio líquido de Czapek Dox enriquecido con extracto de levadura, ya que además de las propiedades biológicas y biosintéticas que se detectaron en las cepas estudiadas, resulta más fácil controlar los nutrientes, el pH y la aireación, con el propósito de llegar a optimizar la expresión de los principios activos (Demian, 2006).

Las exploraciones preliminares del comportamiento metabólico de cinco hongos anamórficos pertenecientes a la micoflora del sureste de México, guiaron a confirmar que éstos poseen la capacidad de producir metabolitos secundarios bioactivos aún cuando sean mantenidos en medios de cultivo diferentes. Este trabajo constituye una aportación enfocada hacia la aplicación biotecnológica a futuro de los hongos anamórficos de estas regiones poco exploradas. Estudios de la

95

toxicidad e identificación estructural de los principios activos, así como de identificación taxonómica molecular se encuentran en curso.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Susana De la Rosa-García, Fabiola Escalante y Luis Torres por su valioso apoyo en los CG-EM. Este trabajo fue financiado por la REDEMIC (XII.J.) del CYTED y el CONACyT (Proyecto No. 47549) y se agradece la beca doctoral a M.M.R.E. (84426).

96

IV.6. BIBLIOGRAFíA

Adrio, J.L. and A.L. Demian (2003). Fungal biotechnology. lnternational Microbiology, 6, 191-199.

Abdei-Lateff, A. , G.M. Konig , K.M . Fisch, U. Holler and P.G. Jones, A. D. Wright (2002). New antioxidant hydroquinone derivatives from algicolous marine fungus Acremonium sp. Journal of Natural Products, 65, 1605-1611 .

Andrews, J.M. (2001). Determination of mínimum inhibitory concentrations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 48, 5-16.

Anke, H. and O. Sterner (2002). "Insecticida! and nematicidal metabolites from fungi", in The mycota. A comprehensive treatise on fungi as experimental systems for basic and applied research. Osiewacz, H.D. (ed) . Springer-Verlag , Berlín Heidelberg, Germany. pp. 109-127.

Bode, H.B. , B. Bethe and H.R. Zeeck (2002). Big effects from sma/1 changes: possible ways to explore nature 's chemical diversity. ChemBioChem, 3, 619-627.

Calvo, M.A. , R.A. Wilson , J.W. Bok and N.P. Keller (2002). Relationship between secondary metabolism and fungal development. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66, 447-459.

Casas-López, J.L. , J.A. Sánchez-Pérez, F.G. Fernández­Sevilla, E. Malina Grima and Y. Chisti (2004). Fermentation, optimization for the production of lovastatin by Aspergillus terreus: use of response surface methodology. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 79, 1119-1126.

97

Choudhary, M.l. , S.G. Musharraf, T. Mukhmoor, F. Shaheen, S. Ali and A. .Atta-ur-Rahman (2004). /so/ation of bioactive compounds from Aspergillus terreus. Zeitschrift fur Naturforschung-Section B Journal of Chemical Sciences, 59, 324-328.

Cole, R. and M.A. Schweikert (2003). Handbook of secondary funga/ metabolite .. Academic Press, Unted States of America. 622 p.

Demian, A.L. (2006). From natural products Discovery to commercialization: a success story. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 33, 486-495.

Fabio, A. , P. Barros and E. Rodrigues-Filho (2005) . Four spiroquinazoline a/kaloids from Eupenicillium sp. isolated as an endophytic fungus from /eaves of Murraya peniculata (Rutaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 33, 257-268.

Frisvad, C.J., U. Traen and O. Filtenborg (1998). "Role and use of secondary metabolites in fungal taxonomy", in Chemical fungal Taxonomy. Frisvad , J.C. , P.D. Bridge and D.K. Arara , (eds). Marcei-Decker, Nueva Yor. pp. 289-319.

Gómez-López, A. , A. Aberkane, E. Petrikkou, E. Mellado, J.L. Rodríguez-Tudela and M. Cuenca-Estrella (2005). Analysis of the influence of tween concentration, inoculum size, assay medium, and reading time on susceptibility testing of Aspergillus spp. Journal of Clinical Microbiology, 4, 1251-1255.

Hbller, U., M. Konig, M. A.D. Wright, 1999. Three new metabolites from marine-derivated fungi of the genera Coniothyrium and Microsphaeropsis. Journal of Natural Products, 62, 114-118.

98

Holler, U. , A.D. Wright, G.F. Mattheé, G.M. Konig , S. Draeger, H.-J. Aust and B. Schulz (2000). Fungi from marine sponges: diversity, biological activity and secondary metabolites. Mycological Research, 104, 1354-1365.

Keller, N.P. , G. Turner and J.W. Bennett (2005). Fungal secondary metabolism - from biochemistry to genomics. Nature Reviews Microbiology, 3, 937-947.

NIST 05MS spectra (2006). Departament of Commerce John Wiley & Sons, lnc Product Compilation Agilent Technologies, USA P/N 81030-60305. Registry 7th Edition.

Paterson , R.R.M. and P.D. Bridge (1994). Biochemical techniques for filamentous fungi. lnernational Micological lnstitute. CAB lnternational Wallingford, UK. 84 p.

Pittayakhajonwut, P., P. Sohsomboon, A. Dramae, R. Suvannakad, S. Lapanum and M. Tantichareon (2008). Antimycobacterial substances from Phaeosphaeria sp. BCC8292. Planta Medica, 74, 281-286.

Reyes-Estebanez, M., G. Heredia, M. Gamboa-Angulo (2008). Antimicrobial and antioxidant screening of anamorphic fungi isolated from plant debris of tropical areas in Mexico. (en proceso).

Robinson, T., D. Singh and P. Nigam (2001). Solid-state fermentation: a prom1smg microbial technology for secondary metabolite production. Applied Microbiology and Biotechnology, 55, 284-289.

Sánchez-Medina, A. , K. Garcia-Sosa, F. May-Pat and L.M. Peña-Rodríguez (2001 ). Evaluation of biological activity of crude extracts from plants used in Yucatecan Traditional Medicine. Part l. Antioxidant, antitumoral and fJ-

99

galactosidase inhibition activities. Phytomedicine, 8,144-151 .

Steel, R.D.G. and J.H. Torrie (1988). Bioestadística. Principios y procedimientos. Segunda edición, McGraw-Hill. México D.F. 234 p.

Strasser, H. , D. Abendstein , H. Stuppner and T.M. But (2000). Monitoring the distribution of secondary metabolites produced by the enthomopathogenous Beauveria brogniartii with particular reference to oosporein. Mycological Research , 104, 1227-1233.

Strohl , W.R. (2000). The role of natural products in a modern drug discovery program. Drug Discovery Today, 5, 39-41 .

Taylor, P.C., F.O. Schoenknecht, J.C. Sherris and E.C. Linner, (1983). Determination of mtmmum bactericida/ concentrations of oxacillin for Staphylococcus aureus: influence and significance of technical factors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 23, 142-150.

Trigos A. , G. Mendoza, M. Luna, G. Heredia y R.M. Arias (2005). Evaluación antibacteriana de hongos microscópicos del suelo y restos vegetales. Revista Mexicana de Micología, 20, 89-92.

Vizcaino, J.A. , L. Sanz, A. Basílio, F. Vicente, S. Gutiérrez, M.R. Hermosa and E. Monte (2005). Screening of antimicrobia/ activities in Trichoderma iso/ates representing three Trichoderma sections. Mycological Research , 109, 1397-1406.

100

Tabla 4.1 . Actividad antimicrobiana en el bioensayo de microdilución y de reducción del OPPH de los extractos crudos obtenidos de cinco cepas fúngicas. cultivadas en dos medios líquidos

Cepa Médio S. aureus E. X OPPH (Rr) carotovora campestris

EFM EFF EFM EFF EFM EFF EFM EFF

B elt raniella CPO na 200 na na na na na 0.12 japorica

400" 2oo• 400' COL na na na na 0.05, 0.12,

0.22. 0.4. 0.8

8 elt ranfella CPD 400' 200a na na na na na na port o.ricensfs COL 400' na na 400' na na na na BeJtraniopsis CPO na na na na na na na na .......

o sp.

400° 4001> 400b 400b .......

COL na na na na

GJfomastix CPO na na na na na na na 0.012 muro.rum

COL na na na na na na na 0.25, 0.29, 0.35,

0.46. 0.5 MR45 CPO na 4oo• na na na na na 0.05 .

0.72 COL na na na 400b na 400° na 0.21, 0.72

Blanco CPD na na na na na na na na

COL na na na na na na na na a = Efecto bactericida b = Efecto bacteriostátioo na = No activo EFF =Extracto túngioo del filtrado EFM = Extracto túngico del micelio DPPH: R, de manchas co.'1 capacidad de reducir al DPPH en ciclorometano-metanol 95:5

102

CAPITULO V

Interacciones

V.1. INTRODUCCIÓN

Muchas de las interacciones en la naturaleza involucran dos o más individuos que compiten tanto por espacio para colonizar, establecerse y desarrollarse, como por alimento para su sobrevivencia (Jennings & Lysek, 1999). Se reconocen dos tipos de competencia fúngica; por explotación y por interferencia. El primero involucra el agotamiento del sustrato por un organismo, evitando que otro individuo o población acceda a dicho sustrato. Los hongos adaptados a este tipo de competencia tienen una rápida germinación y subsecuente colonización, además de una alta capacidad para digerir nutrientes y amplia tolerancia a factores ambientales (Moore­Landecker, 1996). En la competencia por interferencia el efecto de la interacción se da directamente en las actividades de los organismos, ya sea parasitismo o depredación, o bien mediante la transformación del ambiente mediante la secreción de sustancias tóxicas. Por ejemplo, las bacterias causan lisis de las hitas lo cual lleva a la muerte de los hongos, o el consumo de esporas por los ácaros, colémbolos, termitas, etc.

Los hongos pueden involucrarse activamente con otros hongos, parasitándolos, induciendo antibiosis o causando interferencia hifal. En la antibiosis, los hongos modifican químicamente el medio excretando restos metabólicos que pueden ser tóxicos incluso al mismo hongo que los generan. Entre los productos metabólicos que pueden ocasionar antibiosis se encuentran el dióxido de carbono, alcoholes, ácidos y antibióticos (Moore-Landecker, 1996).

De esta forma, la capacidad de los hongos para producir sustancias tóxicas bajo condiciones de competencia, puede ser

103

una estrategia en la búsqueda de nuevos metabolitos con alguna aplicación en la industria farmacéutica o agrícola (Yuen, et al., 1999). Existen ejemplos de interacciones in vitro , mediante el reto directo entre dos o más organismos del mismo o diferente phylum (Wald , et al. , 2004) . Gueto et al. (2001) aislaron un nuevo antibiótico -la pestalonona- el cual actúa contra Staphylococcus aureus y Enterococcus faecium. Este compuesto se produce en respuesta del contacto de un hongo aislado de ambientes marinos, perteneciente al género Pestalotia, con la bacteria CNJ-328. Así mismo, (Trejo-Estrada et al., 1998) mediante el establecimiento de cultivos acoplados entre Streptomyces violaceusniger (actinomiceto) y cepas de Bacil/us subtillis, Col/etotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Gaeumannomyces graminis (FL 151 y FL 179), Phytium ultimum, P. aphanidermatum, Rhizoctonia solani, Microdochium nivale y Sclerotinia homeocarpa estimularon la producción de los antibióticos nigericina, geldamicina y un complejo de lactonas macrocíclicas.

El estudio de las interacciones microbianas y la producción de metabolitos secundarios es un campo hasta ahora poco explorado, en el presente trabajo se estudiaron las respuestas de los algunas especies fúngicas ante interacciones entre pares con la finalidad de estimular la producción de moléculas biológicamente activas con aplicaciones biotecnológicas.

V.2. OBJETIVOS

V.2.1 . Objetivo general

Valorar el efecto de cultivos fúngicos mixtos en la producción de sustancias antioxidantes y biocidas en contra de tres organismos patógenos (dos especies de bacterias y un hongo).

104

V.2.2. Objetivos particulares

1.- Determinar el medio de cultivo mas adecuado para la producción de biomasa de las especies seleccionadas para confrontarlas en cultivos mixtos.

2.- Describir las características morfológicas de los hongos durante su crecimiento en forma individual y en pares en el medio seleccionado.

3.- Valorar los cambios del pH en los cultivos durante su crecimiento en forma individual y en pares.

4.- Cuantificar el rendimiento de los diferentes tratamientos en cuanto a la producción de filtrados, biomasa micelial y extractos.

5.- Realizar ensayos para detectar la actividad antioxidante de los filtrados y extractos miceliales de los hongos cultivados en forma individual y en pares.

6.- Valorar la acción biocida en contra de tres organismos patógenos (dos especies de bacterias y un hongo) de los extractos miceliales y filtrados provenientes de cultivos mixtos.

V.3. MATERIALES Y MÉTODOS

Con base en los resultados de la actividad antibacteriana, antifúngica y/o antioxidantes se seleccionaron siete especies (Tabla 5.1 ), las cuales se confrontaron en cultivos pareados.

V.3.1. Preparación del inóculo fúngico Previo crecimiento de las cepas en medio sólido (maíz­

agar) se realizó el raspado de la superficie del micelio con 1 O mi de solución salina de cloruro de sodio al 0.085 %y tween 20

105

al 0.5% estériles (SST) (Siawecki et al., 2002). La suspensión se recuperó en un tubo Falcón. De esta solución se tomó una alícuota de 100 ~1 y se depositó en un vial para realizar el conteo de esporas mediante la cámara de Neubauer y ajustar la solución a 1 x1 05 esporas/mi con SST.

Tabla 5.1 . Cepas fúngicas seleccionadas para los ensayos de interacción por pares

Especie

Beltraniella japonica Beltraniopsis sp. Memnoniel/a sp. Gliomastix murorum Beltraniella portoricensis Thozetella havanensis MRCICY-45 Blanco (medio COL + 1 mi de SST)

Clave de la cepa

GHCICY-18 GHCICY-19 MRCICY-33 MRCICY-36 MRCICY-42 MRCICY-43 MRCICY-45

Clave

A 8 e D E F G 81

V.3.2. Determinación del medio de cultivo para la obtención de mayor cantidad de extractos

Para obtener una cantidad adecuada de extractos se valoró el crecimiento de las 7 cepas en medio de cultivo Czapek Dox con y sin levadura. Los cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 250 mi con 100 mi de medio. Para cada tratamiento se añadió 1 mi de la suspensión de esporas/SST de las cepas individuales. El medio se ajustó a pH 7 con ácido fosfórico y los cultivos se mantuvieron a 25 °C, con un fotoperíodo de luz/oscuridad de 12/12 horas y una velocidad de agitación de 150 rpm, durante 21 días (Trigos et al., 2005).

Una vez seleccionado el medio en donde los hongos desarrollaron la mayor cantidad de biomasa, se procedió a la realización de los cultivos por pares. Como control se cultivaron las cepas individualmente y como blanco se empleó el medio

106

de cultivo con 1 mi de solución salina + Tween. De igual forma que en el ensayo anterior, cada tratamiento se realizó por triplicado. En total fueron 29 tratamientos (Tabla 5.2) que corresponden a 7 controles, 21 cultivos por pares y 1 blanco. Para todos los cultivos se midieron el pH y la biomasa micelial y de su respectivo extracto crudo.

V.3.3. Obtención de micelio y filtrado Transcurridos los 20 días de incubación , el micelio se

separó del caldo de cultivo por filtración al vacío, a través de papel filtro Whatman No. 1 previamente pesado. Al filtrado se le midió el pH y posteriormente, al igual que el micelio en el papel filtro , se congelaron y liofilizaron para obtener el rendimiento en base al peso seco del micelio y del filtrado.

V.3.4. Obtención del extracto del micelio y del filtrado Para ambos casos se empleó acetato de etilo , el

extracto del micelio liofilizado se extrajo por maceración (3x) y para el filtrado se realizó una extracción líquido-líquido (3x, 2:1 , 1:1 , 1:1) en la que además se añadió una solución saturada de NaCI, y sulfato de sodio anhidro para remover el exceso de agua. El disolvente se eliminó bajo presión reducida, y los extractos se secaron con nitrógeno y bomba de alto vacío para obtener el peso seco, posteriormente tanto los filtrados como los extractos se mantuvieron a 4 oc en la oscuridad hasta la realización de los bioensayos.

V.3.5. Cultivo y preparación de los microorganismos patógenos para los ensayos antimicrobianos

Las evaluaciones se realizaron contra dos bacterias, Bacillus subtilis (Gram-positiva, ATTC 6536) y Staphyloccocus aureus (Gram-positiva, ATTC 6633) . Como control positivo (+) se utilizó amikacina al 1% (1 !JI) y una cepa de Gandida albicans (ATCC 10231), en este caso se empleó neomicol (1 !Jg/ml) como control positivo, incubándose a 37 °C por 18-24 horas.

107

ro o a> ·o >- ro ~ >...e (/) en ~ e m o :::¡ :::¡ "'O :::¡ (/) ....... >- ·~ :.0 ro ....... a>c ro ..... CD

...... ::¡roa> :::la> '-' "'O ....... (/) "-cro(/)u-ga> ro a> (/) o ·¡:: o ..e O"> ro- ........... roQ) :::lQ)C..O

...... rouEC/)LL ccc·O a>_.. IDa>:::¡cOt::: cE =a>o­o ..... ·O Q) ..e u E ..... o ·¡:: c.. (ñ ro·-·- e a> a> >"-'-o ::¡ro ·- a> (/) u e o- :::¡ ~(/)C _.. -:::¡ o ~ ro :::> 0 ·a> ua.. ...... Uf- _u a> Nz-o (/) . a> a> e c:o C/)Cf) o (/) ro E 1..0 ro ..-o................ . ..... cOiroorox a>..c~-lroLL 0'>-.:t() . u..­·oN ()Noo:::::LO ....... _..0 Q)O:::: . ro.._ r---o ..­c.. o e C'0 ·- Q) (/) c.. .9 -e "'O Q) o .......... cro:::¡o-o E<CJ:C/) ...... ~­Cf)(j)•roroa>ro ·- 1- .._ "-o e E e e a> ·­ro _.. = ..e ::J ·o ._ O"> ro ,:::¡ co .._ a> e o -~ ~ ...-- ~ 'ID :Q Cf)Q)o"-Q)CU O CJ) 0 ....... -CU ro -o c.. ..e a> ..... -lu- o ....... ·- ro ,0 -o e .

o_u..cro-a>.....-... ·- :::¡ ....... Cf) U N "-Cu(f)~CO ...... ocrocoo >.U ·- ..C :::l U N

Tabla 5.2. Matriz de las interacc iones con las 7 especies selecci onadas.

GHCICY1 GHCICY1 tvRCICY MRCICY MRCICY MRCICY MRCICY 8 9 33 36 42 43 45

GHCICY A. Control AS.. 18119 AC. AD. AE. AF. AG . 18 18 1&'33 18/36 18/42 18/43 18/45

GHCICY B. Control BC. BD. BE . BF. BG . 19 19 19/33 19/36 19/42 19/43 19/45

MRCICY C. CD. CE . CF. CG . 33 Control 33/36 33/42 33/43 33/45

33 MRCICY D. DE. DF. DG .

36 Control 36/42 36/43 36/45 36

MRCICY E. DG. DE. 42 Control 42/43 42/45

42 MRCICY F. DF.

43 Control 43/45 43

MRCICY G. 45 Control

--~ " C =control A- B. j aponica. B- Belli-aniopsis sp., C- MemnonieNa sp., D- G. murorum, E- B. porton-censis, F-T. havanensis y G- MRCI CY 45

00 o ........

V.3.6. Evaluación de la actividad antibiótica de los extractos por el método de microdilución en microplaca (Andrews, 2001)

Los extractos fúngicos se disolvieron en DMSO (dimetil sulfóxido) a una concentración de 20 1-lg/¡ .. d. En una microplaca estéril de 96 pozos se agregaron 190 J-LI de medio CMH estéril y 1 O !JI de los extractos activos (200 J-Lg), de esta mezcla se transfirieron al siguiente pozo 100 !JI y así sucesivamente hasta el cuarto pozo. Todos los pozos con un volumen de 100 !JI se inocularon con 100 !JI de la bacteria blanco. La concentración final para el caso del micelio fue de 250, 125, 62.5 y 31.2 J-Lg/mL de extracto; del DMSO 1.5, 1.25, 0.62 y 0.31 %y de las bacterias de 5 x 1 06 ufc/ml. Los filtrados se evaluaron directamente depositando 1 00 !JI en cada pozo y se adicionaron 100 J-LI de la bacteria blanco. Los ensayos se realizaron por duplicado con sus respectivos controles. Las microplacas se incubaron por 18 horas a 3rC y posteriormente se revelaron con la adición de 50 ¡JI de MTI (Trimetil tetrazolium), con este reactivo se puede medir la actividad respiratoria de los organismos mediante un cambio de color cuando el crecimiento del microorganismo es inhibido.

V.3.7. Evaluación de la actividad antioxidante mediante ensayo de reducción del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) (Bors et al., 1984; Sánchez et al., 2001)

De manera independiente 100 ¡.Jg de cada uno de los extractos fúngicos del filtrado y del micelio se aplicaron en dos cromatofolios de gel de sílice 60F2s4 (0.25 J-Lm de grosor, 1 O x 1 O cm2

) y se luyeron con los sistemas de disolventes hexano­acetona (7:3) y diclorometano-metanol (9:1). Las placas se observaron bajo la luz ultravioleta de onda corta (UVzs4) y larga (UV365), marcando las bandas visibles. Una de las placas se reveló con ácido fosfomolíbdico, para su comparación .

109

La segunda placa se impregnó con una solución etanólica de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) al 0.2% y se dejó a temperatura ambiente por 24 horas. La aparición de manchas amarillas contra un fondo púrpura mostró la presencia de los metabolitos con actividad antioxidante. Los resultados positivos se reportaron indicando el Rr de los metabolitos con actividad antioxidante. Los ensayos se realizaron por duplicado, aplicando como control positivo vitamina C a una concentración de 1 ¡.Jg/ml.

11 0

V.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Prácticamente en todas las cepas se obtuvo un mejor crecimiento en el medio de cultivo enriquecido con extracto de levadura (Tabla 5.3) . Ante estos resultados se seleccionó el medio COL para la realización del experimento con los tratamientos en pares o mixtos. Previamente, con el fin de tener un control del crecimiento de cada una de las especies y detectar posibles contaminaciones, para cada caso se realizó la caracterización morfológica de las colonias en el medio COL, de esta forma durante un periodo de 21 días, cada cinco días se registraron las características de los cultivos (color, forma y consistencia del micelio, cambios en la pigmentación en el medio) (Tabla 5.4).

Después del tiempo de incubación mencionado la mayoría de los cultivos formaron estructuras esféricas compuestas de micelio, únicamente la cepa MRCICY-45 formó grupos laxos de agregados de hitas oscuras. Los aislamientos de B. japonica, Beltraniposis sp. y MRCICY-45 excretaron pigmentos en el medio (Tabla 5.4).

111

Tabla 5.3. Valores de la biomasa del micelio (g/ml) de las cepas seleccionadas después de 21 días de cultivo en medio Czapek Dox (CD) y Czapek Dox- Levadura (CDL)

Nombre de las cepas

Beltranella japonica Beltaniel/a portoricensis Beltraniopsis sp. Gliomastix murorum Memnoniella sp. Thozetella havanensis MRCICY-45 NE: no evaluado

CD g/50 mi

0.26 0.35 0.32 0.28 NE

0.25 0.30

COL g/50 mi

0.64 0.68 0.42 0.43 NE

0.52 0.31

Las observaciones macroscop1cas de los cultivos por pares demuestran que el crecimiento micelial es heterogéneo, en algunos casos la formación de esferas de micelio fue evidente como en los cultivos de Memnoniella sp. y G. murorum. En todas las interacciones que involucran a T. havanensis hay formación tanto de esferas como de micelio disperso oscuro, para los hongos restantes el micelio se desarrolló en fragmentos. En las interacciones entre B. japonica-Memnoniella sp., Be/traniopsis sp.-Memnoniella sp., Beltraniopsis sp.-G. murorum y G. murorum-8. portoricensis, se pueden distinguir las mismas características desarrolladas en las cepas cultivadas de forma individual.

En general, en las interacciones con Memnoniella sp. , predominó la formación de colonias en forma de esferas y la consistencia viscosa en el filtrado del cultivo, la cual se puede atribuir a la presencia de polisacáridos. En cuanto a la coloración del medio, se apreciaron algunos cambios, como en el caso de Memnoniella sp.- T. havanensis, en donde en la interacción la coloración se tornó mas obscura en comparación con la observada en los cultivos individuales de ambas cepas.

112

Tabla 5.4. Características morfológicas de los hongos cultivados en el medio Cza~ek Dox- Levadura

Nombre de la Forma de las Color del Coloración cepa colonias micelio del medio

Blanquecino en Beltraniel/a Colonias esféricas, un principio, al

Rojizo japonica compactas madurar café rojizo

Beltraniel/a Colonias esféricas, se Crema a café Incoloro portoricensis compactan al claro

madurar, forman acumulación de micelio en las paredes del matraz

Beltraniopsis sp. Colonias esféricas, se Verde oliváceo Verde compactan al olivácea madurar, forman acumulación de micelio en las paredes del matraz

Gliomastix Se deposita al fondo Crema Incoloro murorum del matraz y en las

paredes, con el tiempo se desprenden algunas concentrados esféricos

Memnoniel/a sp. Colonias esféricas, Ámbar Ámbar compactas

Thozetella Colonias esféricas, Negruzco Incoloro havanensis compactas

MRCICY-45 Masa micelial Gris a verde Verde dispersa, no forma obscuro amarillenta esferas

Beltrania japonica y sus interacciones presentaron una consistencia gelatinosa en el filtrado, además de un color café rojizo. Con G. murorum se formaron pequeñas esferas miceliales y la coloración del medio de cultivo varió de amarillo

113

a ámbar. Con respecto a Beltraniopsis sp. , B. portoricensis y MRCICY-45, el micelio fue disperso y de color obscuro en todas sus interacciones.

En relación al pH , en los cultivos individuales de Beltraniopsis sp. , Gliomastix murorum, Beltraniella portoricensis y Memnoniel/a sp. , el pH se incremento, mientras que en Beltraniella japonica , Thozetella havanensis y MRCICY-45 los valores bajaron ligeramente a 6.5 (Tabla 5.5; figura 5.1). En los cultivos mixtos se detectó en la mayoría de los casos una tendencia hacia la alcalinización; la cual fue mas notoria para algunos de los cultivos pareados con las especies Beltraniopsis sp. , Beltraniella portoricensis, Thozetella havanensis y MRCICY45 en donde se registraron valores por arriba de 9.

10

9

pH de las interacciones y sus cultivos individuales

AB AC AD AE AF AG BC BD BE BF BG CD CE CF CG DE DF DG EF EG FG A B C D E F G Bl

Tratamientos

Figura 5.1 . Variación del pH en Czapek Dox con extracto de levadura a /os 21 dfas de incubación de los hongos en forma individual y en cultivos mixtos.

A- B. japonica, 8- Beltraniopsis sp., C- Memnoniella sp. , D- G. murorum, E- B. portoricensis, F- T. havanensis y G- MRCICY45.

De igual forma, la producción de filtrado y biomasa micelial varió entre los diferentes tratamientos; en la mayoría de los cultivos mixtos el peso del filtrado y de la biomasa micelial fue menor (Tabla 5.5) a la obtenida en los cultivos cuando

114

crecieron las especies en forma individual. Para los filtrados , únicamente los cultivos mixtos realizados con Beltraniella japonica tuvieron un volumen mayor que el encontrado para la especie cuando creció sola.

En relación a la biomasa micelial la disminución del peso en los cultivos mixtos fue más marcada, únicamente en algunas interacciones con las especies Beltraniella portoricensis y la cepa MRCICY 45 se registraron valores ligeramente superiores a los obtenidos cuando estas crecieron en forma individual. Tales resultados indican que en las interacciones probadas existe un efecto inhibitorio en el desarrollo del micelio y que este efecto es variable dependiendo de las especies que se estudien. El caso mas evidente de inhibición fue en el cultivo mixto Gliomastix murorum-Thozetella havanensis, en donde la cantidad de biomasa micelial se redujo respectivamente un 70 y 60%, al que desarrollaron estas especies al crecer en forma separada. Otras combinaciones con efecto inhibitorio fueron las de Memnoniella sp.-Beltraniella japonica y Memnoniella sp.­Beltraniopsis.

115

Tabla 5.5. Valores* del pH, volumen (mi), peso del filtrado (g/1 00 mi) y biomasa micelial (g/100 mi) de las 7 cepas seleccionadas, después de 21 dlas de incubación en forma individual y en pares en el medio Czapek Dox con extracto de levadura.

Claves tratamientos

Bl A B e D E F G

AB AC AD AE AF AG BC BD BE BF BG CD CE CF CG DE DF DG EF EG FG

pH

7 6.5 8.2 9.0 8.2 8.1 6.5 6.5 7.7 8.4 8.5 6.3 8

9.3 8.6 8.5 9.0 9.2 9.0 8.9 8.5 9.2 8.9 8.3 6.1 5.5 8.2 9.4 6.7

Volumen Filtrado

(mi) 100 86 81 70 79 73 86

84.5 85 83 71 74 80 90 86 64 81 79 93 67 67 68 67 76 84 79 72 75 86

WFL

g /100 mi de Medio 2.99 0.57 0.67 0.92 0.87 0.78 0.98 0.68 0.76 0.91 0.75 0.71 0.61 0.79 0.65 0.65 0.74 0.57 0.59 0.80 0.64 0.45 0.79 0.72 0.50 0.53 0.48 0.46 0.54

*Los valores corresponden al promedio de tres repeticiones

WML

g /100 mi de medio

0.881 0.914 1.058 1.388 0.757 1.068 0.683 0.691 0.394 0.552 0.796 0.525 0.465 0.394 0.828 0.796 0.527 0.807 0.709 0.661 0.689 0.792 0.727 0.390 0.481 0.713 0.781 0.568

WFL = Peso del filtrado liofilizado WMF = Peso del micelio liofilizado 81 Blanco Czapeck-Dox mas extracto de levadura. A- B. japonica, 8- Beltraniopsis sp., C- Memnoniella sp., D- G. murorum, E- B. portoricensis, F- T. havanensis y G­MRCICY45

116

Este comportamiento está ligado a la capacidad saprobióica de las especies en cuestión, esta incluye, la velocidad de germinación de la esporas y del crecimiento de las hitas así como la producción de enzimas y sustancias tóxicas que mermen el desarrollo de la especie competidora (Carlile & Watkinson, 1994). Es importante subrayar que de la mayoría de las especies empleadas en este estudio se desconoce su ecología y fisiología, por lo que estos resultados orientan sobre las combinaciones mas apropiadas, tanto para la obtención de mayor biomasa micelial, como de filtrados y sustancias activas. De los cultivos mixtos, la mayor biomasa micelial se obtuvo de la interacción Beltraniopsis sp.-G. murorum y la mayor cantidad de filtrado de Beltrania japonica-Memnoniella sp. (figura 5.2).

Un aspecto que podría interferir en la baja producción de biomasa micelial es el aumento del pH en los cultivos mixtos ya que la concentración de iones hidrogeno influye en la disponibilidad de algunos iones metálicos, como son el Mg y el P, los cuales se encuentran en forma libre a pH bajos, pero a pH alcalinos forman un complejo insoluble que reduce la disponibilidad de estos iones para los hongos. Se sabe que la actividad de los hongos altera el pH del sustrato en donde viven, cuando el N es provisto como nitrato de sodio -NaN03-,

(como lo indica la fórmula del Czpeck) , el medio se convierte mas alcalino a medida que el ión nitrato es consumido (Moore­Landecker, 1996).

En cuanto al rendimiento de los extractos (Tabla 5.6) en todos los cultivos individuales y en la mayoría de los mixtos los valores de los filtrados fueron mayores a los de los extractos del micelio, en este último no hay diferencias aparentes entre los tratamientos solos y los mixtos, no así en los extractos del filtrado en donde los rendimientos variaron dependiendo de las cepas que conformaban los cultivos mixtos. Algunas combinaciones afectaron negativamente el rendimiento que las cepas tuvieron por separado, un ejemplo son los cultivos mixtos con Beltraniella japonica-Memnoniella sp., en donde los valores

117

de estas especies al crecer en forma separada fueron 0.0422 y 0.1070, respectivamente, mientras que en el cultivo mixto el rendimiento decreció a 0.0069. Un caso interesante es la cepa Beltraniopsis sp. , la cual tuvo el mayor rendimiento de los cultivos individuales (0,1509) y en los cultivos mixtos sufrió una inhibición con todas las especies menos con MRCICY45, con la cual aumentó su rendimiento (0,1658). Estos resultados muestran la importancia que tiene valorar la compatibilidad de las especies seleccionadas para los experimentos con cultivos mixtos.

Respecto a los sólidos contenidos en los filtrados liofilizados, en todos los casos se observó una disminución con respecto al blanco 2.99 g/1 00 mi de medio, lo cual se debe al consumo de los nutrientes del medio por parte de las cepas fúngicas, ya sea en cultivo individual o mixto.

En el ensayo de reducción del DPPH se encontró que el número de metabolitos con capacidad antioxidante fue mayor en los extractos del filtrado comparados con los del micelio (Tabla 5.7). De los 28 extractos de filtrado evaluados (21 cultivos mixtos y 7 cepas solas) el 36% (9 extractos) tuvieron compuestos antioxidantes y solo uno (2.8%) resultó activo en el extracto del micelio.

Los extractos con actividad antioxidante inmediatamente después de haber aplicado el agente reductor DPPH presentaron la aparición de una mancha amarilla equivalente a la del control positivo (vitamina C). Estos extractos correspondieron a las cepas individuales de B. japonica (Rr = 0.84), G. murorum (Rr = 0.64), MRCICY 45 (Rr = 0.73) y Beltraniopsis (Rr= 0.87), es importante destacar que para estas dos últimas no se había detectado la presencia de moléculas antioxidantes en los ensayos previos con extractos de cultivos en arroz fermentado (ver capitulo 111), por lo que es evidente que el tipo de medio de cultivo es un factor importante en la

118

inducción de metabolitos antioxidantes y que cada cepa responde de diferente manera.

Cll

"' 'E o ~ o

1.6 1.4 1.2

1 e, !O 0.8 E E ni 0.6 111 ni 0.4

Biomasa de las interacciones y de las cepas individuales

E o i:ñ

0.2 o ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

Tratamientos

Figura 5.2. Producción de biomasa (g/100ml) de las especies en cultivos individuales y mixtos, después de 21 dfas de incubación en Czapek Dox con extracto de levadura. A- B. japonica, B- Beltraniopsis sp., C- Memnoniella sp., D- G. murorum, E­B. portoricensis, F- T. havanensis, G- MRH45 y Bl Blanco COL.

119

Tabla 5.6. Rendimiento de los extractos del fi ltrado y micelio de las cepas individuales y en cultivos mixtos, cu ltivadas en medio Czapek Dox enriquecido con extracto de levadura

Extracto del filtrado Extracto del micelio

Interacción Peso del Rendimiento Peso del Rend imiento extracto mg % extracto mg %

81 3.5 0.0035 - -A 42.2 0.0422 10.9 0.0109 8 150.9 0.1509 9.9 0.0099 e 107.08 0.1070 5.5 0.0055 D 12.3 0.0123 2.5 0.0025 E 24.4 0.0244 4.3 0.0043 F 18.2 0.0182 2.9 0.0029 G 51 .2 0.0512 3.1 0.0031

AS 18.7 0.0187 1.4 0.0014 AC 6.9 0.0069 13.2 0.0132 AD 31 .6 0.0316 3.6 0.0036 AE 32.6 0.0326 4.3 0.0043 AF 36.6 0.0366 31 .6 0.0316 AG 48.4 0.0484 18.4 0.0184 se 39.6 0.0396 8.3 0.0083 BD 48.4 0.0484 12.2 0.0122 BE 29.4 0.0294 6.7 0.0067 BF 17.1 0.0171 4.4 0.0044 BG 165.8 0.1658 9 0.0090 CD 45.9 0.0459 5.1 0.0051 CE 48.1 0.0481 9.5 0.0095 CF 48.5 0.0485 3.1 0.0031 CG 44.6 0.0446 17 0.0170 DE 22.3 0.0223 1 0.0010 DF 12.7 0.0127 20.9 0.0209 DG 21 .8 0.0218 4 0.0040 EF 17.1 0.0071 2.1 0.0021 EG 20.2 0.0202 6 0.0060 FG 14.1 0.0141 1.2 0.0012

81. Blanco Czapeck-Dox mas extracto de levadura. A. B. Japomca. B. Beltramops1s sp. C. Memnoniella sp. D. G. murorum. E. B. portoricensis. F. T. havanensis. G. MRCICY45. Rendimiento calculado en función de 100 mi de filtrado.

120

En cuanto a los cultivos mixtos, las interacciones que presentaron actividad antioxidante fueron B. japonica-G. murorum (Rr = 0.64, 0.68, 0.71, 0.75), B. japonica- T. havanensis (Rr= 0.05, 0.46, 0.6, 0.84) y B. japonica- MRCICY-45 (Rr = 0.05, 0.6, 0.83), y en segundo termino, con una baja respuesta (ya que la reducción del agente oxidante (DPPH) se presentó después de 6 horas y la intensidad de las manchas observadas fue menor a la del control) están Memnoniella sp.­MRCICY45 (Rr= 0.82), G. murorum- T. havanensis (Rr= 0.64) y la interacción G. murorum-MRCICY-45 (Rr= 0.18, 0.64) (Tabla 5.7) .

En los extractos de los cultivos mixtos se obtuvieron Rr similares con los valores de las cepas cultivadas individualmente. Por ejemplo, entre B. japonica- T. havanensis y B. japonica-MRCICY45, el componente a Rr de 0.84 coincide con la presentada en B. japonica y en las parejas G. murorum­T. havanensis y G. murorum-MRCICY-45 hay similitud con la mancha presentada a Rr de 0.64. Esto indica que pueden tratarse del mismo metabolito, algún isomero o algún derivado químico. En las demás interacciones no se observa coincidencia en los Rr obtenidos con las cepas individuales, indicando que sin lugar a dudas los metabolitos son diferentes.

Los resultados obtenidos muestran que B. japonica y G. murorum tienen un buen potencial para la producción de metabolitos con actividad antioxidante. Resultados previos muestran que las especies del género Gliomastix tienen la capacidad para sintetizar una importante gama de moléculas bioactivas, Peraza-Jiménez (2007) y De la Rosa García (2007) detectaron, en una cepa identificada como G/iomastix musicola y aislada de muestras de cenotes del estado de Yucatán, capacidad de reducir el DPPH. Por sus características morfológicas Gliomastix tiene una gran afinidad con los géneros Acremonium y Cephalosporium, de los cuales se han extraído importantes metabolitos con propiedades antioxidantes (Abdei-Lateff, 2002) y biocidas como son las

121

acremonidinas y las cefalosporinas. Dada la similitud morfológica entre estos géneros y la convergencia en la biosíntesis de moléculas, es factible pensar que exista un alto grado de sinonimia entre ellos o bien que conformen un complejo, para tener la certeza de la ubicación taxonómica de las especies incluidas en estos géneros se requiere de una revisión exhaustiva apoyada en estudios moleculares.

Para el género Beltraniella , hasta la fecha no se había registrado ningún tipo de molécula bioactiva, este género forma parte del complejo Beltrania, el cual está constituido por un grupo de hongos anamorfos, de distribución tropical , cuya característica primordial es la producción de esporas rómbicas, en él se incluyen entre otros, los géneros Beltrania y Beltraniopsis; para el primero, de la especie B. rhombica se aislaron los sesquiterpenos rhombidiol y rhombitriol (RRR) y del segundo de la especie B. portoricensis se extrajo la enzima endo-1, 4-13-D-glucanasa (Baba, et al., 2005). Nuestros resultados aunados a los publicados en los últimos años corroboran la necesidad de continuar trabajando con este grupo de anamorfos, que además de ser abundantes en restos vegetales, son de fácil manipulación en el laboratorio.

El perfil de actividad de B. japonica es muy similar cuando interacciona con T. havanensis y MRCICY-45 (figura 5.3) ; en la primera, el perfil muestra cuatro componentes y en la segunda tres, siendo el componente de R, 0.46 la diferencia entre las dos interacciones. A su vez se observó el metabolito de R, 0.84 que se encuentra únicamente en el extracto de B. japonica (figura 5.3).

Un comportamiento similar se observó entre las interacciones de G. murorum con un solo componente antioxidante de R, 0.64, el cual se produce con menor intensidad ante la presencia de T. havanensis y se incrementa con MRCICY- 45. En ambas cepas se detectó un nuevo componente antioxidante de intensidad ligera para T.

122

havanensis y de mediana intensidad para MRCICY-45 de R, 0.18, producido como resultado de la interacción (figura 5.5) .

Es evidente que la producción de metabolitos antioxidantes se acentuó en los cultivos mixtos de las cepas B. japonica y G. murorum respecto a sus cultivos individuales (figura 5.5) , no obstante, cuando estas dos cepas crecieron juntas, ninguno de sus metabolitos predominantes fueron detectados, apareciendo otros dos de R, 0.71 y 0.75. Lo anterior señala que son compuestos diferentes a los originalmente producidos en forma individual, sugiriendo cambios en sus estrategias metabólicas ante condiciones de competencia.

Es importante mencionar que de la misma forma que los cultivos mixtos pueden inducir en las cepas una mayor expresión de compuestos antioxidantes, también pueden inhibirlos dependiendo de la combinación ya que tanto para B. japonica como para G. murorum en los cultivos pareados con Memnoniella sp. , Beltraniopsis sp. y Beltraniella portoricensis no hubo producción de moléculas antioxidantes.

En cuanto a la actividad biológica de los extractos crudos obtenidos de los micelios y los filtrados, la capacidad antibacteriana de las cepas en forma individual se perdió al cultivarlos en el medio líquido COL, así como también cuando se cultivaron en forma mixta, con la excepción del extracto crudo de la interacción entre B. japonica-Beltraniopsis sp. contra S. aureus a 250 ¡..t.g.

Estos resultados pueden deberse al medio de cultivo empleado, el tiempo de crecimiento o la aireación (Granja, 1997; Flores, 2008), ya que como se mencionó anteriormente estos son factores que influyen determinantemente y en forma diferente en cada una de las especies fúngicas. Dado que el presente experimento representa el primero en el que se prueban cultivos mixtos entre las cepas aisladas, se considera

123

que se han creado las bases para continuar con esta línea de investigación.

Tabla 5.7 Actividad antioxidante de los extractos de los cultivos fúngicos en arroz fermentado, de los extractos del micelio y del filtrado de los cultivos fúngicos en medio COL (100 f19 de extracto)

E. arroz E. micelio E. filtrado en Tratamientos fermentado en COL COL

Beltraniella japonica

Gliomastix murorum

MRCICY-45

B. japonica-G. murorum

B. japonica-T. havanensis

B. japonica-MRCICY -45

Beltraniopsis sp.

Memnoniella sp.­MRCICY-45 G. murorum -T. havanensis G. murorum- MRCICY-45 Blanco arroz

Blanco COL

Ergosterol

Reducción del OPPH (Rr)

0.12, 0.30

0.07, 0.3, 0.5, 0.57

124

0.87

0.05, 0.84

0.64

0.73

0.64, 0.68, 0.71 , 0.75

0.05, 0.46, 0.6, 0.84

0.05, 0.6, 0.84

0.82

0.64

0.18, 0.64

Figura 5.3. Adiúdad antX1xidante de las cepas fúngícas cultivadas en medio Czapeck-Dox cr:n extracto de levadura en forma índwidual y en pa1es. 1. B. Japonica-Beltr aniopsís sp. 2 B. japonica-Memnoniella sp. 3. B. japonica-G. mtrorum. 4. B. japonica-B. portoricensis. 5. B. japonica-T. havanensis. 6. B. japoníca-MRCICY-45. 7. Bel1raniopsis sp.-Memnoniella sp. 8. Beltraniopsis sp.-G. murorum. 9. Be11raniopsis sp.-B. portoricensis. 10~ Beltraniopsis sp.-T. havanensis. 11. Belraniopsis sp.-MRC ICY -45. 12. Memnoniela sp.-G. murorum. 13. Memnoniella sp.-8. portoricensis. 14. Memnoniella sp.-T. havanensis. 15. Memnoniella sp.-MRC/CY-45, 16. G. murorum-B. portocicensis. 17. G. murorum-T. havanensis. 18. G. muronm-1!4RCJCY-45, 19. B. portoricensis-T. havanensis. 20: B. portoricensis­MRG/GY~45. 21. T. ha.ranensi~ ... MRCICY~45, 22. B. japonica, 23. Beltraniopsis sp. 24. Memnoniella sp., 25. G. murorum. 26. B. portoricensis, 27. T. havanensis. 28. MRC/CY-45. Bl = Blanco CzaDeck'-Dox con extracto de .levadura. E= Eraosterol. \lit C= Vitamina C.

l/")

N .......

V.S. CONCLUSIONES

1.- En el medio Czapek Oox, suplementado con 1 g/1 de extracto de levadura (COL) se obtuvo el mejor crecimiento para la mayoría de las especies estudiadas.

2.- La actividad metabólica en los cultivos mixtos aumentó el pH , alcalinizándolo.

3.-. Los cultivos mixtos tuvieron un efecto negativo en la producción de biomasa micelial

4. Los extractos de filtrados tuvieron un mejor rendimiento en comparación con los obtenidos a partir del micelio.

5. La mayor actividad antioxidante se encontró en los extractos de filtrados.

6. Las especies Beltraniella japonica y G/iomastix murorum tienen una mayor expresión de metabolitos antioxidantes cuando son cultivadas en algunos cultivos mixtos que cuando crecen en forma aislada.

7.- Las cepas Beltraniopsis sp. y MRCICY45 cultivadas en COL de manera individual y con algunas de las interacciones presentaron actividad antioxidante.

8. Las especies Beltraniella japonica y Gliomastix murorum incrementan su capacidad para la producción de metabolitos antioxidantes al crecer en cultivos mixtos.

9- En la mayoría de los hongos, la actividad antibacteriana contra B. subtillis y S. aureus se perdió cuando se cultivaron en COL, únicamente en los extractos del cultivo mixto Beltraniella japonica-Beltraniopsis sp., se detectó una respuesta inhibitoria ante S. aureus.

126

1 O. El presente trabajo es el primero en el que se demuestra actividad antioxidante a partir de cultivos mixtos con Beltraniella japonica.

127

V.G.- BIBLIOGRAFÍA

Abdei-Lateff, A., G.M. Koning , K.M. Fisch , U. Holler, P.G. Jones and A.D. Wright (2002). New antioxidant hydroquinone derivatives from the a/gico/ous marine fungus Acremonium sp. Journal of Natural Products, 65, 1605-1611 .

Andrews, J.M. (2001). Determination of mínimum inhibitory concentrations. Journal Antimicrobial and Chemotherapy, 48, 5-16.

Baba, Y. , A. Shimonaka J. Koga, K. Murashima, H. Kubota, T. Kono (2005). Purification and characterization of a new endo-1,4-{3-0-g/ucanase from Beltraniella portoricensis. Biosciences Biotechnology and Biochemistry, 69, 1198-1201 .

Bors, W., C.Y. Michael and M. Saran (1984). lnhibition of the b/eaching of the carotenoid a rapid test for cuantifying antioxidant activity. Acta Biochemical and Biophysics, 42 , 219-257.

Carlile, M.J. and S.C. Watkinson (1994). The Fungi. Eds.Academic Press, London. 482pp.

Cueto, M., P.R. Jensen., C. Kauffman. , W. Fenical. , E. Lobkovsky and C. Jan (2001) . Pestalone, a new antibiotic produced by marine fungus in response to bacteria/ change. Journal of Natural Products, 64, 1444-1446.

Flores, G.M.E (2008). Evaluación de la actividad fitotóxica de Phytophthora capsici sobre chi le habanero (Capsicum chinense Jacq.). Tesis de Maestría. Centro de Investigación Científica de Yucatán. 60 p.

128

Forbes, B.A., D.F. Sahm and Weissfeld (2002). ·"Diagnostic Microbiology". Eds. A.S. Baiyle & Scott's 11 1

h. Mosby, St Louis. 1069 p.

De la Rosa, G.S.C. (2007). Evaluación del potencial antimicrobiano de microorganismos aislados de cenotes de la península de Yucatán. Tesis de Doctorado. Centro de Investigación Científica de Yucatán. 184 p.

Granja, P. P. 1997. Identificación de los metabolitos fitotóxicos presentes en cultivos de Alternaria tagetica y optimización de sus condiciones de cultivo . Tesis de Licenciatura, Facultad de Qufmica de la UADY. 96 p.

Jennings D.H. and G. Lysek. (1999). "Fungal Biology: Understanding the Fungal Lifestyle", Bosher A. (ed) . Bios Scientific Publishers, New York. 166 p.

Moore-Landecker, E (1996) . "Metabolism, Part 11 Physiology and Reproduction", in Fundamentals of the fungi Fourlh edition. Prentice Hall , Chapter 13 New Jersey. pp. 383-386.

Peraza Jiménez, K. (2007). Metabolitos bioactivos de hongos microscópicos de la Península de Yucatán . Tesis de licenciatura. 61 p.

Sánchez-Medina, A. , K. García-Sosa, F. May-Pat and L.M. Peña-Rodríguez (2001). Evaluation of biological activity of crude extracts from plants used in Yucatecan traditional medicine Parl l. Antioxidant, antimicrobial and j3-glucosidase inhibition activities. Phytomedicine, 8,144-151 .

Santana, C., D. Segura y S. Sánchez (1994). Síntesis, función y origen de los metabolitos secundarios producidos por

129

microorganismos. Revista Latinoamericana de Microbiología, 36, 139-158.

Slawecki , R.A. , E.P. Ryann and D.H. Young (2002). Novel fungitoxicity assays for inhibition of germination­associated adhesion of Botrytis cinerea and Puccinia recondita spores. Applied and Environmental Microbiology, 68, 597-601.

Treja-Estrada, S.R. , l. Rivas-Sepúlveda and D.L. Crawford (1998). In vitro and in vivo antagonism of Streptomyces violaceusniger YCED9 against fungal pathogens of turfgrass. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 14, 865-872.

Trigos, A. , G. Mendoza, G. Heredia y R.M. Arias (2005). Evaluación antibacteriana de hongos microscópicos del suelo y restos vegetales. Revista Mexicana de Micología, 20, 89-92.

Wald , P., S. Pitkanen and L. Boddy (2004). lnterespecific interactions between the rare thooth fungi Creolophus cirrhatus, Hericium erinaceus and H. coralloides and other wood decay species in agar and wood. Mycological Research, 108, 1447-1457.

Yuen, T.K., K.O. Hyde and I.J. Hodgkiss (1999). lnterspecific interaction among tropical and subtropical freshwater fungi. Microbial Ecology, 37, 257-262.

130

CAPÍTULO VI Perfil cromatográfico de las interacciones fúngicas

Vl.1. INTRODUCCION

La cromatografía de gases es una técnica de separación en donde los componentes o moléculas solutos de una mezcla son transportados por una fase móvil gaseosa, a través de una fase estacionaria, siendo separados de acuerdo a su volatilidad y polaridad. Esta es una técnica de alta resolución, rápida, sensible y sencilla, que permite conocer de forma cualitativa la complejidad de una mezcla de metabolitos (Chan, 1991; Braithwaite & Smith, 2001 ).

El objetivo de esta técnica es determinar los componentes de una mezcla, mediante su separación en una columna de gases acoplada a un espectrómetro de masas (CG-EM); donde cada metabolito detectado es ionizado, formando fragmentos con cargas eléctricas que se agrupan de acuerdo a su masa (m/z) . Los patrones de fragmentación se comparan con los registrados en la base de datos del equipo para su identificación. Estos componentes pueden ser utilizados como marcadores en diversos estudios de monitoreo. Con esta técnica es posible realizar la separación e identificación química de una muestra compleja (Paterson & Bridge, 1994).

Las aplicaciones de la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas son múltiples, ya que permite el análisis de un sin número de muestras de manera rápida y confiable, dicha técnica ha sido adoptada como una herramienta de rutina en hospitales, en la industria y en los laboratorios de análisis de plaguicidas, toxinas, contaminación ambiental etc., así como también en el control de calidad de productos alimenticios (Gutiérrez & Droguet, 2002).

131

En cuanto a sus aplicaciones en el campo de la micología la CG-EM se ha utilizado para la identificación de toxinas , como en el caso de Helmintosporium sacchari (Livingston & Scheffer, 1981 ). Otra de las aplicaciones es en trabajos de ecología qU1m1ca como la detección y caracterización de compuestos volátiles orgánicos (VOC) en el estudio del fenómeno de fungistasis en los hongos Paecilomyces lilacinus, Pccohonia chlamydospora y Clonostachys rosea (Xu , et al. , 2007). Además, la CG-EM ha sido utilizada en la identificación de levaduras, ya que analizando la composición de los ácidos grasos se puede distinguir entre especies de un mismo género, proporcionando una técnica económica, simple y reproducible en el diagnóstico cl ínico (Paredes-Salido, et al., 2001 ).

Otra aplicación se demuestra en un programa de investigación sobre asma y reacciones alérgicas, donde se tomaron muestras de polvo en pisos de viviendas, y se utilizó la presencia del ergosterol como indicador de biomasa fúngica. Los hongos aislados pertenecieron a los géneros Aspergillus, Alternaría, Aureobasidium, Cladosporium, Epiccocum, Fusarium, Paecilomyces, Penicillium, Ulocladium, Waffemia , levaduras y algunos Zygomicetos, proporcionando un método rápido y confiable en el diagnóstico clínico para la detección de posibles alérgenos. (Safar, et al. , 1997).

En estudios sobre biodegradación de hidrocarburos aromáticos se aislaron nueve cepas de los hongos, Al/escheriella sp. , Aspergillus sp., Phlebia sp. y Stachybotrys sp. a partir de suelos italianos contaminados por mas de 100 años con hidrocarburos aromáticos, con el fin de determinar su potencial degradativo. Los resultados de los análisis de CG-EM señalaron a Stachybotrys sp. DABAC3 como el aislamiento más efectivo en la transformación de estos suelos contaminados (D 'Annibale, et al., 2006) .

132

Vl.2. Objetivos particulares

.- Monitorear por cromatografía en capa delgada los extractos obtenidos de los cultivos fúngicos en arroz fermentado .

. - Determinar los perfiles cromatográficos de los extractos con mayor actividad biológica provenientes de los cultivos en arroz fermentado mediante el uso de la cromatografía de gases acoplada a un detector másico .

. - Analizar por cromatografía en capa delgada los extractos del filtrado y micelio obtenidos de los cultivos fúngicos en Czapek­Dox extracto de levadura (COL) de manera individual y en las interacciones por pares .

. - Obtener los perfiles cromatográficos en CG-EM de los extractos de micelio y filtrado provenientes de los cultivos fúngicos de las cepas cultivadas en el medio COL individualmente y en las interacciones.

Vl.3. MATERIALES Y MÉTODOS

Vl.3.1. Cromatografía en capa delgada (CCD) El monitoreo de los metabolitos se realizó por

cromatografía en capa delgada (CCD}, utilizando cromatofolios de aluminio impregnados con gel de sílice 60F254 (E.M. Merck DC-Aiufolien de 0.25 mm de espesor) e indicador fluorescente. Posteriormente se eluyeron en tres diferentes mezclas de disolventes, hexano-acetona 8:2, diclorometano-acetato de etilo 8:2 y diclorometano-metanol 9:1 . Las placas se revelaron bajo la luz ultravioleta de onda corta (254 nm) y larga (365 nm), y se sumergieron en una solución de ácido fosfomolíbdico al 5%, para una visualización permanente. Posteriormente se secaron con una pistola de aire caliente durante uno o dos minutos,

133

hasta observar con la aparición de manchas la presencia de metabolitos.

Vl.3.2. Cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM)

Los análisis por CG-EM, se realizaron en un cromatógrafo de gases Agilent Technologies modelo 6890N Network GC system, acoplado a un detector másico Agilent Technologies modelo 59758 ínter MSD controlado por una computadora HP. De cada uno de los extractos se pesaron entre 2 y 2.5 mg y se diluyeron al 1% con acetona y/o metano! grado analítico (Baker) . En este estudio, se emplearon dos columnas diferentes: A) columna no polar Ultra 1 recomendada para el análisis de hidrocarburos, compuestos sulfurados, pesticidas (100% dimetilpolisiloxano, 25 mL x 0.32 ID), con un flujo de 1.5 mllmin, utilizando como gas acarreador Helio (He) de ultra alta pureza y un programa de doble rampa de Tt = 160°C/min, con un gradiente de 8°C/min hasta una T2 = 240°C/min , alcanzando finalmente una T3 = 280°C con un gradiente de 4 oC/m in. y 8) columna HP DB-5MS no polar recomendada para el análisis de ácidos grasos, metil ésteres, alcaloides, drogas y compuestos halogenados con una composición en la fase estacionaria de (5% difenilpolisiloxano 95% dimetilpolisiloxano, 30 m de largo, 0.32 mm di, 0.5 ¡Jm película) , con un flujo de 1.2 mllmin, utilizando como gas acarreador Helio (He) de ultra alta pureza y un programa de Tt = 140°C y una T2 = 300°C, con un gradiente de 8°C/min . Las inyecciones se realizaron en la mayoría de los casos una sola vez y en otros algunos casos por duplicado o triplicado. Los espectros de masas de los compuestos se compararon en la base de datos NIST 05MS, del mismo equipo, cuya última actualización D.06.01 se registró en febrero del 2006. Los compuestos se reportaron como identificados cuando presentaron 90% o más de coincidencia con la base de datos NIST (Tabla 6.1 y 6.2).

134

Vl.3.3. Propiedades físicas y químicas del Ergosterol

(Sigma) (CzaH440) Polvo blanco, soluble en cloroformo y acetato de etilo R, = 0.34 (hexano-acetona 7:3) y 0.48 (diclorometano- acetato de etilo 8:2) . CG: columna A: tR = 23.04 m in

columna 8: tR= 27.36 min EM (m/z %, abundancia): 396 [M+](20), 378 [M+ - HzO] (20), 363 (100) .

135

cu -S:: Q)

E ·¡: Q) a. >< Q)

o IS::: Q)

.~ e ~ ~

>

AF 40 días ~ Extracto estático total

Cultivos individuales K Extracto de

COL Micelio

21 días

-< Extmctode~~ agitación

Filtrado

Cepas Antimicrobianos Fúngicas Ac0Et3 X (2.1 , 1:1 , 1:1) Antioxidantes activas eco

CG-EM

\ Extracto de Filtrado

K COL Cultivos 21 días

por pc.-es 1-agitación

Extracto de Micelio

Figura 6.1. Esquema de trabajo de los cultivos indiViduales y por pares. para ra determinación de su perfil cromatográfioo.

\0 M .......

Para la matriz de las interacciones por pares entre las cepas activas seleccionadas ver Tabla 5.2 (pagina 1 08).

Vl.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El análisis del perfil cromatográfico se realizó con los extractos crudos de las cepas B. japonica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp., Gliomastix murorum, Memnoniella sp. , Thozetella havanensis y MRCICY-45 cultivadas en arroz fermentado; posteriormente con los extractos del filtrado y micelio correspondientes a los cultivos individuales en COL y finalmente con los extractos obtenidos de los cultivos en interacción de las cepas seleccionadas en medio COL (Figura 6.1).

Con la finalidad de detectar la mayor parte de los componentes de los extractos crudos, en el presente estudio se emplearon dos columnas (Ultra 1 y DB5MS) recomendadas para compuestos no polares como ácidos grasos, ésteres, alcaloides, drogas y compuestos halogenados. En primer lugar se determinó el perfil cromatográfico por CCD y CG-EM de los extractos blanco (arroz fermentado y COL) en las condiciones de corrida establecidas. Desde el inicio se consideró de importancia básica conocer los componentes del medio de cultivo utilizado que son extraíbles en las condiciones de trabajo. Bajo este esquema, se corroboró que los componentes del extracto de arroz fermentado no coincidieron con los detectados en ninguna de las cepas cultivadas en arroz fermentado , lo cual indicó el consumo total del sustrato por los hongos. Por el contrario, en el medio COL se detectaron algunos componentes del medio en tres cepas B. portoricensis, Beltraniopsis sp. y G. murorum, los cuales fueron eliminados al realizar los análisis cromatográficos. Esto puede deberse al tiempo de incubación o a la preferencia nutricional de las cepas (Tabla 6.1).

137

Tabla 6 .1 . C001ponentes detectados en CG-EM de los extractos fúngicos cultivados en arroz fermentado y COL

Col Extracto de arroz ferment ado Extracto de Micel io en COL Extracto de j: iltrado en COL Cepa "' [Ml m'z BD tRmin [Mlmlz BD !R min [M"]m'z BD m in

Be/trame/la 1 4.47 190, 121' 2-Hidro¡qugona 5.33 178, 134' Meleina 5.34 178,134• Meleina j aponica 8.51 125 Nonadeceno

13.5 210 Ciclopentadecano 18.25 410, 69' Escualeno

2 9.57 190, 121' 2-Hidro¡qugona 7.95 178. 134' Meleina 7.96 178. 134 1 Meleina

Beltraniella 1 NO NO NO 18.25 410, 69' Escualeno NO NO NO porfortcenss 21.83 25 1 ni

2 4.08 130. 71' Mevalolactona 5.26 154, 70' 2-0ecenal 3 87 126. 2-cidopentenona 22.16 410, 69' Escualeno

Be!traniopsiS 1 5.47 90' ni NO NO ND 14 88 4 1i1 ni sp. 6.9 4 1 ' ni

7.2 55' ni 2 8.28 55' ni 5.06 ni ni 9.95 136' ni 00

12.04 111 1 ni 5.27 154. 70' 2-Decenal 17.77 95' ni ~ ........

Gliomas5x 1 11.71 129 1 ni 22.42 396, 363' Liquesterol 4 .08 125' ni murorum 13.77 127' ni 16.89 149' 1,2-

bencenodi carboxila to de d~isoocti lo

2 6.52 67' ni 9.93 136 ni 9.96 136' ni 12.06 176' ni 27 40 396, 363' Liqu estero!

Memnomela 1 11.42 129' ni 22..39 396, 363' Liquesterol 5.34 178,134' Meleina sp. 24.88 414 , 329' 22,23-0ehidro 719 136, ni

107' -estigmasterol

396, 363' 178, 134. 2 13.75 ni 27.35 Liqu estero! 7.95 Meleina 18 79 29-1' ni 19.2 1 253' ni

Thozete/la 1 5.47 90' ni 5.34 178,1341 Meleina 9.49 210, 154' ni havanensis 9.72 150' ni

16.89 1491 1.2-bencenodicarboxila

to de d~isooctilo

Continuación tabla 0 .1 2 4 .043 130' ni 7.% 170, 134' Me lema 12.9G 194a Maculooina

30 .58 392, 268' Ergooto 4 ,6,8(14) 18.94 124' ni 18.17 129' ni 22-t<>lr•M-3-ona 19.545 149' 1,2-

bencenodicarboxila to de d-isoodlo

IVR45 1 5.46 192, 90' ni 18.25 410, 69' EsaJaleno 17.04 70. ni 22.44 306, 363' Lique91erol

2 5.26 15-1 . 70' 2-Docen"l 22.16 410, 69' Escualeno 3.91 134 , 78' 2-Coumaranona R !iR 1:10' ni ?7 4h ~!lh 1fi:l' 1 i~OJP.~P.rn l R !i1 1?0 ' ni

30.62 392. 268' Er¡¡osta-4.6,8(14) 22-tetraen-3-ooa

Blanco 1 13.9 77' ni 6.82 154' ni 16.8 41' ni 7.02 244, 154' ni 18.49 69' ni 7.09 134' Maculooina

0\ ?1 !i4 414 . R11 Sit,..t..-nl 7 h.1 ni ni 7.80 112' ni M

........ 11 .74 ni ni 12.72 ni ni

2 3.810 70' ui 3.81 70' lli 4.403 152 . 81' 2,4 Dccodicnol 4 .72 152, 81' 2,4 Dccodicnol 4A22 152, 81 1 2,4-Docadienal 5.02 81 1 ni 4 .724 152' ni 5.09 57 1 n i 5263 70' Ácido 9- octade 526 28' ni

cenoico 14.92 95, ni

Elyu..t .. ul 1 23.04 396, 363' Eryu~wrul

? ?71fi 1!lñ, 1fi1' FraMtP.rnl Col. a Cotui1Yla 1: Utra 1 y 2: OBMSMS (U nida~esdemasa atómica).

t, .a Tiempo de retencion miZ • masa CMga en umas

liD • basededatoscer equ~o ,. o ::1: no <leteda<lo ni -= no ldentl1cado a= piCO base en el e'"

Los análisis por CG-EM de los extractos de arroz fermentado de B. japonica mostraron un metabolito mayoritario de tiempo de retención de 4.47 y 9.57 minutos en la columna Ultra 1 y DB-5MS, respectivamente. Ambos, mostraron un ión molecular de 190 uma, identificado como 2-hidroxijuglona (Figura 6.2) por comparación de su patrón de fragmentación con la base de datos del equipo y confirmado con los datos de su espectro de RMN 1H (4.58, 6.9, 7.08 - 7.61 , 12.35 ppm). Este metabolito es una naftoquinona, familia química reconocida por su amplio rango de acción biológica para inhibir bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, hongos, así como también es un agente citotóxico capaz de inhibir procesos bioquímicos básicos en los sistemas de membranas celulares (Mendentsev et al., 1998; Bürki , et al. , 2003) . La 2-hidroxijuglona se obtuvo por primera vez de forma sintética de la juglona, naftoquinona aislada de Juglans nigra con propiedades alelopáticas (MacLeod & Thomson, 1960) y posteriormente en forma natural de Verlicil/ium dahliae (Scott & Sullivan, 2007). A este metabolito se le ha atribuído un papel ecológico importante en la protección contra diversos tipos de estrés ambiental (Butler, et al. , 2001 ; Babitskaya & Shcherba, 2002).

Al ser cultivada B. japonica en COL se detectó al metabolito meleina, tanto en su extracto del filtrado como del micelio (Figura 6.3.). Este metabolito es una isocoumarina aislada por primera vez de Aspergillus melleus, con un peso molecular de 178 uma y reportado con moderada actividad antimicrobiana contra Eurotium repens. (Holler, et al., 1999), también como inhibidor de las proteasas del virus de la hepatitis C (Dai , et al. 2001 ), actividad algicida, fungicida y herbicida (Tan & Zou, 2001); por otro lado se han realizado estudios de citotoxicidad contra una línea celular de fibroblastos de pulmón (ATCC Nr CCL-171) y otra de fibrocarcinoma gástrico humano (ATCC Nr CRL-1739), presentando una ligera citotoxicidad a concentraciones mayores de 1000 !JM. (Schmeda-Hirschmann, et al. , 2005).

140

a)

b)

e)

1300001 120000

110000

100000

90000

80000

70000

eooool

:::11 Joooo

20000

9570

8 .518

o

OH

~ ·

1 094• /

OH o 10.881

··L___/ ,., . -. .,---. ----,........-.--.-,---.--.. .,

10.00 12.00 14.00 ~6 00 18 00 20 00 22.00 24 00 26 00 10000~-~=t= ...... .,.., .. ()4 ..... ~,,....

TIMe» 400 600 800

7000·

6000 ·

1000

O· • miz-> 20 Abundance

6000

5000

4000

3000·

1000·

1210

92.0

511 6u31 770 1 10S 1 1339 39,

2!1o ,,,.1 ¡IL •• -¡1' ,..~JJ.:b, H ' ,, 1 1 1";,9 -k 40 50 60 70 80 ¡o 100 110 120 ,k, 1~0 ,¿0

Jt-49878 1 4-Naphltta!ene<llone _ 2.5-d ydroxv-

121.0

920 630

134 o 39 o 51 o 770 105.0

162 1 1

1.~ "' 160 l70 180 190 200

1900

162.0

L 1~4 o ·~..--"·· ··--r-4-..,.....,..¡..¡,,.._.~.,.__,_.,._,...!.1'~20.~ .••••• 171,~1~9,~.

70 80 90 100 110 120 130 t40 150 160 170 180 190 200

Figura 6.2. Perfil qUtm!co de Beltraniella japonica cultivada en arroz fermentado a) Cromatograma de gases tR = 9.57 min columna DBSMS correspondiente a meleina, b) Espectro de masas del componente a tR = 9. 57 m in y e) Patrón de fragmentación, comparación con la base de datos NIST y fórmula molecular de la 2-Hidroxijuglona.

141

Cuando B. japonica se cultivó en COL no se detectó la presencia de 2-hidroxijuglona. Sin embargo, este metabolito es considerado un intermediario en la formación de meleina (Figuras 6.3 y 6.4). (Butler, et a/. , 2001 ; Babitskaya & Shcherba, 2002). Esto indica un mayor proceso biosintético de B. japonica en COL, que aunque con menor tiempo de incubación, la oxigenación es más eficiente por la agitación comparado cultiva en condiciones estáticas.

a)

b)

?000001 = ooooool

••ooool • ooooo 350000

'400000

••ooool 200000

ll'liOOOO

•ooooo 50000

.... ~·- ... .. .......

'\00000¡

•000000

5 .342

Figura 6.3. Perfil comatográfico de Beltraniella japonica cultivada en arroz fermentado. a) Meleína tR = 5.342 min columna Ultra 1 y b) Meleina tR = 7. 966 m in columna DBSMS.

142

OH

~¡ 134 1

8000

1000

6000

6000 100 1

4000

3000 781 108 1 149 1

2000 51 1

1000 3SIO 631

0~, 2~.~·--'·•~ ., -~¡j¡. n¡lli¡ ~~~~83],1 .......... .........,............,.4-...,.........,...¡.~jl.l,....--r........,.. mil·> 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 A.bundance J-41302 IH·2~Benzopyr•,....1-one, 3 4--dlhydro-8-hydroxy...J..m thyl- (R)·

134 o 1780

~1 aoco

7000

1800

4000

3000 3$ a st o 780

1080 2000

270 ~o

d} mh->

62j 85 0 u.so 121 0

oL +· ~ - ~ i!:. ,J, -1- + , ~__.... ~ .........,_ 1 -20 30 40 50 60 70 80 go 100 110 120 130 140 150

1000

Figura 6.4. Fórmula molecular de la Melefna obtenida del cultivo de Beltraniella japonica en COL y espectros de masas de la meleina a) patrón de fragmentación del componente a tR = 7.966 y b) Comparación con la base de datos NIST y fórmula molecular de la Meleina.

El escualeno también se detectó en el extracto de micelio de B. japonica en COL (tR = 18.252 y 22.16 m in en Ultra 1 y OB5MS, respectivamente). Este metabolito es un intermediario base de la ruta biosintética de los terpenos y precursor de la biosíntesis del ergosterol (Turner & Aldridge, 1983; Cole & Schweikert, 2003). Otros metabolitos identificados del micelio de B. japonica en el medio COL correspondieron a los de tipo hidrocarburo como el 9-nonadeceno, ciclopentadeceno y escualeno. Como minoritarios se detectaron al ácido hexadecanoico, 2-coumaranona y 1,3, 12 nonadecatrieno (Figura 6.5).

143

a) Ciclopentadeceno

b) Escualeno

e) 9-Nonadeceno

HO

o d) Ácido hexadecanoico

o o e) 2-Coumaranona

f) 1,3, 12 nonadecatrieno

Figura 6.5. a-e) Metabolitos mayoritarios y d-f) metabolitos minoritarios detectados en la base de datos NIST para B. japonica cultivada en COL.

144

En los extractos de B. porloricensis cultivada en COL se detectó el escualeno en el micelio y la 2-ciclopentenona en el filtrado (tR = 3.87 minutos). En el extracto de arroz fermentado y en el extracto del filtrado en COL no se identificó ningún componente (Tabla 6.1)

Los resultados de los perfiles cromatográficos de los cultivos individuales en arroz fermentado y en COL de las cepas B. japonica y B. portoricensis mostraron variabilidad biosintética entre especies de un mismo género, cuyo único componente común en las condiciones utilizadas es el escualeno. Existen reportes en la literatura en donde inclusive distintos aislamientos de una misma especie presentan un perfil metabólico distinto, lo que pudiera ser atribuíble a los factores ambientales que rodean el hábitat de estos microorganismos (Frisvad , et al. , 2004; Sonjak, et al., 2005).

En el micelio de T. havanensis y G. murorum se observó la presencia de un metabolito mayoritario a un tiempo de retención de 16.891 y 19.545 minutos, en la columna ultra 1 y OB5MS, respectivamente. Este compuesto se identificó como el 1 ,2-bencenodicarboxilato de diisooctilo (Figura 6. 7), perteneciente a ésteres arílicos utilizados como plastificantes. Sin embargo, existen algunos reportes en donde se ha detectado la presencia de este tipo de metabolitos en hongos, como el ácido 3-nitro-1 ,2-bencenodicarboxílico (3-ácido­nitroftálico) como una toxina de Phoma herbarum contra Parlhenium hysterophorus (Vikrant, et al. , 2006). También a partir del hongo endófito 12.3.2, aislado de Taxus brevifolia se identificó el ácido 1 ,2-bencenodicarboxílato de diisooctilo presentando una fuerte actividad inibitoria contra Bacil/us subtilis, Staphylococcus aureus y Gandida albicans (Liu , et al., 2008).

En la especie T. havanensis se observó un componente minoritario a tiempo de retención de 9.72 y 12.96 minutos, en las columnas ultra 1 y OB5MS, respectivamente . Este

145

componente se asignó al pirrol-(1,2-a)-pirazina-1 ,4-diona, nombrado también como cicloleucilproliol , maculosina (Stierle et al., 1988) o Gancidina W (Figura 6.6, C11 H1sOzNz), una dicetopiperazina aislada previamente de Streptomyces gancidicus. La Maculosina se ha observado que ayuda en la defensa contra hongos, como el caso de Cyphomyrmex minutus, simbionte de la hormiga Tyridiomyces formicarum donde se ha determinado su poder protector en estos insectos; además presentan actividad antibacteriana y antiviral (Wang, et al. , 1999) y se considera una toxina hospedero específica de Alternaría altemata (Stierle, et al., 1988).

o

o

a) Acido 1,2-bencenodicarboxi/ato de diisooctilo

o

a;NH o

b) Macu/osina

Figura 6.6. a) Acido ftálico identificado como mayoritarios en G. murorum y T. havanensis y b) macu/osina, metabolito minoritario.

146

Finalmente, en el micelio de las cepas de G. murorum, Memnoniella sp. y MR45, se identificó al metabolito ergosta-5,8,22-trien-3-ol o liquesterol, precursor del ergosterol. La diferencia estructural se encuentra en la posición de una de las instauraciones. Este copuesto ha sido previamente detectado en varios hongos como Gandida albicans, Flamulina velutipes, Leptosphaeria typhae, Lobaria pulmonaria, L. scobicu/ata , Nectria galligena, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, Usnea /ongissima y Xahthoria parietina. Este es un esterol que se forma aeróbicamente utilizando la ruta metabólica del isopreno y participa en la biogénesis de las membranas fúngicas (Turner & Aldridge , 1983; Cole & Schweikert, 2003; Nickerson, et a/., 2006); además es precursor de hormonas esteroidales involucradas en la regulación de la reproducción sexual fúngica (Mysyakina & Funtikova, 2007).

HO

Liquesterol

El ergosterol es un metabolito común en las paredes celulares de los hongos, representando entre el 80-90% de los esteroles detectados (Turner & Aldridge, 1983; Trigos, 1995). El producto de la oxidación de este metabolito, ya sea por la presencia del oxígeno del aire, por foto-oxidación o debido a reacciones enzimáticas es el Endoperóxido de Ergosterol (Figura 6.7) . Este producto es un artefacto químico que ha sido reportado con diversas propiedades bioactivas (Pasanen , et al., 1999; Charcosset & Chauvett, 2001 ; Trigos & Ortega-Regules 2002). Dada la abundancia del ergosterol en el metabolismo fúngico, se utilizó un estándar comercial para detectar y/o

147

descartar su presencia y atribuír la actividad biológica a la formación de su derivado oxidado, el endoperóxido de ergosterol.

Ergosterol

PM = 396 (CzaH440) Endoperóxido de ergosterol

PM = 428 (CzaH4403)

Figura 6. 7. Reacción de transformación de ergostero/ en presencia de oxfgeno en endoperóxido de ergostero/.

Como es común, la actividad biosintética de cada especie fúngica varía dependiendo de las condiciones nutricionales y de cultivo, lo cual se refleja en los metabolitos detectados en los cromatogramas realizados. Este estudio indica un total de 68 componentes mayoritarios, de los cuales el 32 % se identificaron en los extractos de los cultivos en arroz fermentado y 68 % en los cultivos en COL. Estos incluyeron al 2-decenal , 22,23-dehidrostigmasterol , ergosterol , 2-hidroxijuglona, y la mevalolactona en arroz fermentado; 1 ,2-bencenodicarboxilato de di-isooctilo, ciclopentadecano, 2-Ciclopentenona, 2-coumarenona, liquesterol , escualeno, meleina y nonadeceno para COL. En total se identificaron 34 de los componentes mayoritarios, siete en arroz y 27 en COL.

La más alta actividad, en cuanto a diversidad estructural se puede atribuir a la cepa B. portoricensis, la cual utiliza la vía de los policétidos y los terpenos. No así para otras cepas donde los derivados del ergosterol, ruta de los terpenos, son los metabolitos principales biosintetizados por ellos (Smith & Berry, 1976; Turner & Aldridge, 1983).

148

Con los resultados obtenidos a partir de los cultivos individuales de las cepas fúngicas se analizaron y compararon los cromatogramas generados de las interacciones por pares. Un total de 146 componentes mayoritarios se detectaron, de los cuales se identificó al 40%, que correspondieron a 21 metabolitos diferentes. La mayoría de estos metabolitos se obtuvieron del micelio (Tabla 6.3) , entre ellos los esteroles ergosterol, ergostan-4,6,8-(14)-22-tetraen-3-ona y liquesterol ; los ácidos 7 -octadecenoico, octadecanoico, E-9-octadecenoico, 9, 12-octadecanoico y tetradecanoico; los hidrocarburos lineales no ramificados, etil oleato y 2-Undecenal. Estos últimos, similares a los encontrados en un estudio realizado con cuerpos fructíferos del basidiomiceto Ganoderma australe (Nieto & Valencia, 2002). Únicamente dos metabolitos están presentes tanto en el micelio como en el filtrado de varias de las interacciones, la meleina y la 2-ciclopentenona (Tabla 6.2) .

En general, los metabolitos escualeno, liquesterol y meleina se detectaron con mayor frecuencia en las interacciones. Tanto escualeno, como meleina se detectaron como componentes mayoritarios en las interacciones entre B. japonica-G. murorum, B. japonica- T. havanensis y B. japonica­MR45. El primero también apareció en las interacciones de Beltraniopsis sp.- B. portoricensis y Beltraniopsis sp.-MR45 y en los cultivos individuales de B. japonica , B. portoricensis y MRH-45; no así en Beltraniopsis sp. Por otra parte, meleina apareció en B. japonica-Memnoniella sp., detectándose como minoritario cuando se cultiva con B. portoricensis (Tablas 6.2 y 6.3).

Otros de los metabolitos identificados en las interacciones son los ftalatos, en algunos de los casos se ubicaron como componentes mayoritarios como en B. japonica­Beltraniopsis sp. G. murorum-B. portoricensis y Memnoniella sp.-B. portoricensis donde se detectó el ácido 1,2-bencenodicarboxílico mono (2-etilhexil) ester. También se identificó al dibutil ftalato (Tabla 6.2 y 6.3).

149

Por otra parte, el metabolito liquesterol se observó en todas las interacciones que involucran a Memnoniel/a sp. , con excepción de T. havanensis, la cual no lo produce cuando es cultivada individualmente. La presencia de este compuesto esta relacionada con la defensa de la integridad de la membrana celular en respuesta a la sobrevivencia (Gottlieb & Van Etten, 1966).

Al crecer en paralelo Memnoniella sp .-Beltraniopsis sp. , G. murorum- T. havanensis y T. havanensis-MR45 muestran la presencia de componentes con diferente tiempo de retención , no detectados previamente en los cultivos individuales. Esto permite sugerir la formación de metabolitos diferentes como una respuesta a la competencia por espacio y nutrientes entre estas especies.

Al evaluar los extractos individuales en el ensayo antioxidante, los resultados mostraron que los extractos del filtrado de B. japonica , G. murorum y MR45 tuvieron la capacidad de reducir al DPPH con intensidad. Entre estos, B. japonica continuó produciendo los metabolitos antioxidantes como se observó en los filtrados de los extractos de las interacciones entre B. japonica-G. murorum, B. japonica­Memnoniel/a sp., B. japonica- T. havanensis y B. japonica­MR45, Memnoniella sp.-G. murorum, que presentaron una reacción intensa con el DPPH (ver Figura 5.6) , Todas estas interacciones tienen en común a la Meleina, lo que sugiere que esta isocumarina pudiera ser la responsable de esta propiedad biológica. Sin embargo, este metabolito no ha sido reportado con esta propiedad biológica anteriormente. Algunas interacciones presentan moderada actividad antioxidante como Memmnoniella sp.-G. murorum, Memmnoniella sp.- T. havanensis; Memmnoniella sp.-MR45 , en las cuales se detecta meleina como parte de los componente minoritario. Las otras dos cepas pierden por completo esta capacidad de producir metabolitos antioxidantes.

150

Contrariamente a lo esperado, la actividad antimicrobiana contra S. aureus y B. subtilis se pierde en los extractos obtenidos en las interacciones, quizá debido al medio de cultivo utilizado (COL) y a las condiciones de cultivo empleadas (agitación constante y menor tiempo de incubación). La única interacción que presentó actividad fue B. japonica­Beltraniopsis sp. con un MIC de 250 ¡..Jg/mL, contra S. aureus. Los extractos de las cepas cultivadas individualmente no presentaron actividad a la concentración evaluada.

151

Tabla 6.2. Componentes detectados por CG-EM en las interacciones de las siete cepas cultivadas en el medio COL analizados en tas columnas Ultra 1 y DB5MS

Extfllclo del Micelio Ex tracto del F illrado

Interacción Col. CG [~.f) BD CG [M] BD tRmin miz tRmin miz

4.81 "194. ni 7.730 m• 4,4' -diisopropilbifenil 22.64 39&:363· Ergosterol

AB OB5t.1S 17.12 57' ni 15.89 91' ni

19.22 116. ni 19.55 279, 148' Ácido 1 ,2-bencenodicarboxílico mono (2-erilhexil) e:oter

~ V)

Ultca 1 21 .66 ss• ni 5.355 178134' 121 Meleina .......

22.:32 251' ni 7.3:94 . ni 24.08 392268. Ergosta, 4,6,8(14)22-tetra-

AC en-3-ono

OB5MS 9.95 13&· ni 10AJ6 136. ni 27.54 396:363. Ergosterol

Ultra 1 4 .83 194 4 ni 9.15 81° ni 11.99 79 ' ni 12.63 57 ' ni

AD 0851o1S 22.15 41 0, ss• Escua leno 7.13 178134' l.leleina 10.39 121. ni

Continuación tabla 6.2

Extracto del Micel.io Extracto del Filtra db

Interacción Col. CG rr.n CG [Mj

tR rri n miz BD t,R rri n miz BD Ultra 1 ~.47 148° ni 10.95 148. ni

14.4B1 149~

AE DB5MS 17.11 95~ ni 10.97 148~ 1 ,2-Á cido bencen ooicarboxi lico,

18.97 129 4 ni mono(2~flhexil)ester nd Ultra 1 18.25 41 O, 69~ Escualeno 5.33 178~ Meleina

19.40 200~ ni 724 121 ~ ni M 22.56 396363. E rgosterol

DB5MS 7.95 178,1.344 M ele in a 7.97 178134~ M eleina 22.16 41 o, 69. -Escualeno ·1(}.42 121. ni

M Ultra 1 9.86 294 67. 9, 12 adrlo 5.34 178a t.1eleina lr)

....... AG 2(}.72 396. octad ecadienoico

n.i

DB51.1S 7. 9~ 1781 '34 4 M ele in a 7.7B '1],8 134. Meleina 22.16 41069 4 Escu.aleno 27.27 396363. Lanosterol

Ultra 1 4.80 194. ni 3.30 124" ni BC 11.98 ss• ni 15.87 43. ni

22.4B 396363~ Lan osterol

DBSMS 18.99 129. ni 3.17 1(}282. Lacto na D ehidromevalon ica 3.7~ 13691~ Áddo bencenacético

18.79 79 ... n·i

Continuación tabla 6_2

Extracto del Micelio Extracto del Filt rado

Int eracción Col. CG [P.1"] CG [Mj t" min m'z BD t,. min miz BD

Ultra 1 10.45 264" Etil oleato 15.84 294 ni BD 19.48 25·1· ni

21.73 410° AcidG (.E )-9-oct adecanoico

D65J.IS 4.02 41° ni 18.76 294° ni 5.28 168 70° 2-undecenal

Ultra 1 18.26 41 o 69. Escualeno 16.89 149° ni BE 21 .74 ss• ni

22.01 251° ni -.:t V) .......

D65MS 3.88 126° 2-ciciGpentenon a 3.88 126° 2-ciclope nten o na 5.27 28 ° ni

BF Ultra 1 21 .92 251' ni 4.05 125° ni

D65J.IS 3.86 126° 2-ciclopentenon a ND NO ND

BG Ultra 1 4.80 136° ni 4.08 125° ni 18.26 41 o 69 . Escua lenG

DB5J.IS 4.08 7(}. ni 3.86 126° ni 5.27 28° ni

13.27 228 73° Ac. tetradecanoico

Continuación tabla 6.2

Extracto del Micelio Extracto del Filt rado

Int er-acción Col. CG [r.n CG [Mj

t,.rnn miz BD t,; rrin miz BD Ultra 1 22.57 396363" Lanosterol 5.34 178134" M·eleina

co 12.4(} 79 '0 ni

DBSI.IS 18.98 129" ni 7.95 178134" Meleina 19.22 98" ni 12.71 67" n.i ll.59 396363" Lan ost-ero.l 15.,06 43° ni

15.21 148"

Ultra 1 22.64 396363° Lanosterol ND ND ND CE 1/")

1/") .......

'D 85r.tS 23.93 251 4 ni 15.21 79 '0 ni 27.56 396363" Lan ost-erol 19.51 279, 148" Ácido 1,2-bencenodicarbo:xílico·

mono (2~etilhexil) ester

Ultra 1 22.6 l96 363" Lan osterol 5.34 178134. Meleina CF 9.72 154" n.i

DB51.1S 27.59 396363° Lanostercl 7.95 178134 '" 1.1 -eleina 12.95 21(} 154 " M aru losina 21.87 337 5:9" 13-d ocosenam ida

Continuación tabfa 6_2

Extractodel Mic·elio Ext racto del Filtrado

lnieracción Col. CG rr.n CG (P.(] tR·min m'z BO tR min miz 60

CG Ultra 1 22.60 396 363~ E rg.ostero 1 5.34 178134"' Meleina

DB5r.1S 27.59 3.96 363. ~ Lan osterol 5.34 178134~ t.lelein a

Ultra 1 8.53 28488"' Acido hexadecanoico 4 01 154" ni DE 1(}.44 31(} 55" Etil olea.to 9.16 164"' ni

20.79 251'" ni

\0 V)

OB5t.IS 13.62 28488" Acido hexadecanoico 6.25 154 .. Ni ....... 15.96 312 ·88" Addo oct.arlecanoico 6.64 102° ni 17.76 '95" ni 12.74 154 .. ni

12.31 164" ni 8.38 279, 148" Ácido 1 ,2-be.noen adicarbDXÍ.Iioo•

mono (2-et ilhexil) esler

DF Ultra 1 11 .99 95" ni 7.18 136'" ni 22.63 ?.96363° Lan osl·erol

DB5MS 17.84 95 .. ni 9.95 "136" ni

Continuación tabla 6.2

Extracto del Micelio Extracto del Filtrado

Interacción ca. CG [M1 BO

CG [P.f] BO t¡, rnin m'z t¡, rnin miz

Ultra 1 11.99 95~ ni 720 136" ni OG 19.43 251. ni

19.74 253. ni 22.64 271. ni

OB5MS 18.94 130" ni 9.98 136 4 ni 20.31 43~ ni

EF Ultra 1 12.81 270 7 4° AcidG hexadecanoiCG 13.17 134" ni 14.94 296 ss• Addo 7-octadecenGico 13.96 222. ni

OBSI,IS 19.48 251° ni 4.78 104. ~li t-111

19.79 376° ni 9.16 164 ° ni ....... 9.91 135. ni

10.97 222. ni

Ultra 1 22.03 127° ni 5.34 178134. l.leleina EG 17.96 59 4 ni

OBSI.IS 10.97 ni ND ND NO

FG Ultra 1 11.25 129° ni 9.5 154" ni 11 .97 129° ni 9.72 154° ni

22.22 153" ni OB5MS NO NO ND ND ND ND

Interacción Col.

Ultra 1

Blan co

DBSI.I S

E rgos!erol Ultra 1

CG tRmin

[M •] miz

Extracto del Micelio

BD CG

tR rnin 6.82 7 .~2

7.~9

7.63 7 .8~

11.74 12.72

3.81 4.03 4.72 5.02 5.09 5.26

23.04

Continuación tabla 62

Extracto del fil t rado [,.n miz BD 1 54~ ni

244, 154~ ni 43° ni 28 ni

112" ni 7~ ni 95 ni

125" ni 55" ni

152 81. 2,4decad ie na l 84 ' ni 57~ ni 28" nd

396363" Ergosterol

DBSI.I S 27.36 398 271 ~ E rgost a-7,22- dien~l-ol AB B. japonica-Beltraniopsis sp. AC B. japonica-lvlemnoniella sp. , AD B. japonica-G. murorum, AE B. japonica­B. portoricensis AF B. japonica-T. havanensis AG B. japonica-MRC/CY-45, BC Beltraniopsis sp-Memnoniella sp., BD BeJfraniopsis s~G . murorum, BE Beltraniopsi s sp-B. portoriscensis, BF Beltranio psis sp.-T. hava nen sis, BG Beltraniopsis sp.- MRCICY-45, CD Memnoniella sp-G. murorum. CE Memnoniella sp.-B. portoricensis. CF Memnoniella sp.-T. havanensis. CG Memnoniella sp.- MRCICY- 45, DE G. murorum.-B. portoriscensis DF G. murorum.-T. havanensis, DG G. murorum-MRC/CY-45, EF B. portoricensis-T. havanensis, EG B. portoricensis­MRCICY-45, FG T. havanensis-MRC!CY-45, A B. japonica , B Beltraniopsis sp., C Memnoniella sp., D G. murorum, E B. portoricensis, F T. havanensis, G MF{C/CY-45 y Bl COL Blanco Czapeckc-Dox mas Extracto de levadura. Col. = Columna 1: Utra 1 y 2: DBlvt5MS fR. = Tiempo de retención miz = masa carga en umas (Unidades de masa atómica) . BD = base de datos NIST ND = no detectado ni= no identificado a =

00 V) .......

Tabla 6.3 Metabolitos mayoritarios identificados por CG-EM en los extractos de filtrado y micelio de los cultivos individuales y en las interacciones en CDL

Meta bolito

Acido bencenacético

Ácido 1,2-bencenodicarboxílico mono (2-etilhexil) éster

Acido hexadecanoico

Acido E-9-octadecanoico

Ácido 9, 12 octadecanoico

Acido 7 octadecenoico

Acido tetradecanoico

Ciclopentadecano

2-Ciclopentenona

2-Coumarenona

2-Decenal

4,4 '­Diisopropilbifenilo

13- Docosenamida

HONGO/interacción

Beltraniopsis sp.-G. murorum

T. havanensis

B. japonica- Beltraniopsis sp. G. murorum-B. portoricensis

Memnoniel/a sp.-B. portoricensis

G. murorum.-B. portoricensis y B. portoricensis -T. havanesis

Beltraniopsis sp.-MR45

B. japonica-MR45

G. murorum- B. portoricensis B. portoricensis _ T. havanensis

Beltraniopsis sp.- G. murorum

B. japonica

Beltraniopsis sp.

Be/traniopsis sp.- B. portoricensis Beltraniopsis sp- T. havanensis

MR45

Beltraniopsis sp., y Memnoniel/a sp.

B. japonica- Beltraniopsis sp.

Memnoniel/a sp.- T. havanensis

159

Detectado en

Filtrado

Filtrado

Micelio

Micelio

Micelio

Micelio

Micelio

Micelio

Filtrado Micelio Micelio

Filtrado

Micelio

Filtrado

Filtrado

Continuación tabla 6.3

Metabolito HONGO/interacción Detectado en

Ergosterol B. japonica- Beftraniopsis sp. B. japonica- Memnoniella sp. Micelio B. japonica- B. portoricensis

Memnoniel/a sp.-G. murorum.

Ergosta B. japonica- Memnoniella sp. Micelio 4,6,8(14 )22 tetra-en-3-ona

Escualeno B. japonica , Beltraniopsis sp. y MR45

B. japonica -G.murorum, Micelio B. japonica -T. havanensis

B. japonica - MR45 Beltraniopsis sp.-B. portoricensis

Beltraniopsis sp.-MR45

Etil oleato Beltraniopsis sp.-G. murorum Micelio G. murorum-B. portoricensis

Mevalolactona Beltraniopsis sp.-Memnoniella sp. Filtrado

Lanosterol G. murorum, B. portoricensis y MR45

B. japonica - MR45 Beltraniopsis sp.-Memnoniella sp.

Memnoniel/a sp.-G. murorum. Micelio Memnoniel/a sp.-G. murorum.

Memnoniella sp.-B. portoricensis Memnoniella sp.-T. havanensis

Memnoniel/a sp.-MR45 G. murorum-T. havanensis

Maculosina B. portoricensis y T. havanensis. Filtrado

Memnoniella sp.-T. havanensis

Meleina B. japonica, B. portoricensis y T. Micelio y havanensis Filtrado

Nonadeceno B. japonica Micelio 2 Undecenal Beltraniopsis sp.-G. murorum Micelio

160

De igual forma en la tabla 6.4 se presentan los tiempos de retención de los componentes no identificados por la base de datos que se encontraron con más frecuencia en las interacciones. El metabolito a tR = 5.35 y 7.13 minutos en columna ultra 1 y DB5MS, respectivamente se detectó con mayor frecuencia en el filtrado de nueve interacciones. De estas, en cinco participa B. japonica, en cuatro Memnoniella sp. y en tres MR45, este componente no coincide con ninguno de los detectados en las cepas cultivadas en forma individual, lo que podría sugerir que este metabolito se sintetiza en respuesta a la competencia ejercida en las condiciones de cultivo evaluadas. Otros casos similares se observaron con los componentes a tR = 11.99, 17.12 y 22.64 y 27.54 minutos.

Tabla 6.4. Componentes detectados por CG-EM, no identificados de los extractos de filtrado y micelio de los cultivos individuales y en las interacciones en CDL

=----------------c=l~a_v_e ______________ ___

m in

11 .991 ,2 17.122

21 .152, 18.251 27.2h 22.481

ACf1 , ADf2, AFf1, AFmf2, AGmf2, CDf1 ,2. CFF1,2. CGf1.2. EGf1,

ADm1, 8Cm2, DFm1, DGm1, FGm1 ABm1 , AEm2. DEm2, DFm2. DFm2

ADm2, AFm1, AFm2, AGm2. 8Em1. 8Gm1, AGm2, BCm1, CDm1, CDM2, CEm1 , CFM1.2. CGm2.

DFm1, 22.641, 27.542 ABm1, ACm2, AFm1, CDm1 ,

AB B. japonica-Beltraniopsis sp. AC B. japonica-Memnoniella sp., AD B. japonica-G. murorum, AE B. japonica-B. portoricensis AF B. japonica-T. havanensis AG B. japonica-MRC/CY-45, BC Beltraniopsis sp.-Memnoniella sp., BE Beltraniopsis sp.-B. portoricensis, BG Beltraniopsis sp.-MRC/CY-45, CD Memnoniella sp-G. murorum, CE Memnoniella sp.-B. portoricensis, CF Memnoniella sp-T. havanensis, CG Memnoniella sp-MRC/CY-45, DE G. murorum-B. portoricensis DF G. murorum-T. havanensis, EG B. portoricensis-MRC/CY-45, FG T. havanensis-MRCICY-45 1 =columna ultra 1 y 2 =columna DB5MS f =filtrado, m =micelio.

El número de componentes no identificados tanto en las cepas cultivadas individualmente como en pares, indican la gran diversidad biosintética que tienen estas cepas en respuesta a cambios a sus nutrientes y competidores. Muchos de estos componentes pueden llevar a estructuras novedosas, no

161

reportadas previamente, lo cual representa el arsenal metabólico que poseen los hongos anamórficos para su supervivencia.

Vl.5. CONCLUSIONES

1. Existe una alta variabilidad en el perfil cromatográfico de los extractos de los hongos al ser cultivados en arroz fermentado y en el medio líquido COL.

2. La mayor diversidad estructural se detectó cuando las cepas se cultivan en el medio de COL.

3. En las interacciones se observaron 141 componentes, de los cuales 42% se identificaron por comparación con la base de datos del equipo. Esto indica que la mayor parte corresponden a metabolitos poco comunes o nuevas estructuras químicas.

4. La 2-hidroxijuglona es un componente mayoritario del extracto de Beltraniella japonica en arroz fermentado, al igual que la meleína cuando se cultiva en COL.

5. El liquesterol es un terpeno producido por Memnoniella sp., en el medio COL y en sus interacciones, confirmando la presencia de esteroles como componentes mayoritarios en las membranas celulares fúngicas.

6. Las cepas fúngicas cultivadas en el medio COL de forma individual o en pares no biosintetizan metabolitos antimicrobianos contra B. subtilis y S. aureus.

7. Las cepas Beltraniella japonica y Gliomastix murorum cultivadas individualmente en COL mantienen sus

162

propiedades antioxidantes al igual que cuando éstas se cultivaron en arroz fermentado.

8. El medio COL induce la producción de metabolitos antioxidantes en la cepa MRCICY-45.

9. La cepa MRCICY-45 es capaz de mantener la producción de metabolitos antioxidantes cuando interacciona con Memnoniella sp, Gliomastix murorum y Thozetella havanensis.

163

Vl.6. BIBLIOGRAFiA

D'Annibale , A.D. , F. Rosetto., V. Leonardi , F. Federici andM. Petruccioli (2006). Role of autochthonous filametous fungi in bioremediation of a soil historical/y contaminated with aromatic hydrocarbons. Applied and Environmental Microbiology, 72, 28-36.

Babitskaya, V.G and V.V. Shcherba (2002). The nature of melanin pigments of severa/ micro- and macromycetes. Applied and Biochemical Microbiology, 38,286-291 .

Bode, H.B and A. Zeeck (2000). Sphaero/one and dihidrosphaerolone, two bisnaphthyl-pigments from the fungus Sphaeropsidale sp. F-24707. Phytochemistry, 54, 597-601.

Braithwaite, A and Smith, F.J. (2001). Cromatographic Methods. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. PAGINAS

Bürki , N, A. Michel. , R. Tabacchi (2003). Naphthlenones and isocoumarins of the fungus f. sp. platani. Phytopathologia mediterranea, 42, 191-198.

Butler, M., A.W. Day., J.M. Henson and N. Money (2001). Pathogenic properties of fungal melanins. Mycologia, 93, 1-8.

Chan, P.M.V. 1991 . Manual práctico de cromatografía. Monografía. Facultad de Ingeniería Química. Universidad Autónoma de Yucatán. 96.

Charcosset, J-Y. and E. Chauver (2002). Effect of culture conditions on ergosterol as an indicator of biomass in the aquatic hyphomycetes. Applied and Environmental Microbiology, 67, 2051 -2055.

164

Cale, R. and M. A. Schweikert (2003). Handbook of secondary fungal metabolite vol/l. Academic Press, Unted States of America. 819 p.

Dai , R. , B.K. Carté, P.J. Sidebottom, A.L.S. Yew, S. Ng, Y. Huang and M.S. Butler (2001 ). Circumdatin G, a new alkaloid from the fungus Aspergillus ochraceus. Journal of Natural Products, 64, 125-126.

Frisvad , J.C. , R.A. Samson and J. Simedsgaard (2004). Emericella astellata, a new producer of aflatoxin 81 , 82 and sterigmatocystin. Letters in Applied Microbiology, 38, 440-445.

Gotlieb, D and J.L. Van Etten (1966). Changes in fungi with age. Journal of Bacteriology, 91 ,161-168.

Gutiérrez, M.C and M. Droguet (2002). La cromatografía de gases y la espectrometría de masas: identificación de compuestos causantes de mal olor. Boletín intexter (U .P.C.), 122, 35-41 .

Holler, U., M. Konig and A.D. Wright (1999). Three new metabolites from marine-derivated fungi of the genera Coniothyrium and Microsphaeropsis. Journal of Natural Products, 62, 114-118.

Liu , J. , S. Chen and H. Gong (2008). ldentification of bioactive compounds isolated from Taxus yunnanensis endophytic fungal12.3.2 http://www.paper.edu .ch.

Livingston, R. S. and R.P. Scheffer (1981 ). lsolation and characterization of a Host-selective toxin from Helminthospirium sacchari. Journal Biological Chemistry, 256,1705-171 O.

165

Macleold, J.W . and R.H. Thomson (1960). Studies in the juglone series. IV. The addition of aniline and Toluene-p­thiol to 5-substituted 1,4-naphthoquinones. Journal Organic Chemistry, 25, 36-42.

Medentsev A.G, and V.K. Akimenko (1998). Naphthoquinone metabolites ofthe fungi. Phytochemistry, 47, 935-959.

Mysyakina l. S. and N.S. Funtikova (2007) . The Role of Sterols in Morphogenetic Processes and Dimorphism in Fungi. Mikrobiologiya, 76, 5-18.

Nickerson, K. , A.L. Atkin and J.M. Hornby (2006). Quorum sensing in dimorphic fungi: Farnesol and Beyond. Papers in Microbio/ogy. Applied & Environmental Microbiology, 72, 3805-3813.

Nieto, l. and M.A. Valencia (2002) . Estero/es, ácidos grasos e hidrocarburos de los cuerpos fructíferos de Ganoderma australe. Boletín de la Sociedad Chilena de Química. 47:0N UNE

Paredes-Salido, F., J.M. Gutiérrez. , P.S. Macías and P. García­Martos (2001 ). La cromatografía gas-líquido con espectrometria de masas en la identificación de levaduras. Revista Iberoamericana de micología, 18, 33-37.

Pasanen , A.L., K. Yli-Aetila, P. Pasanen, P. Kalliokoski and J. Tarhanen (1999). Ergosterol content various fangal species and biocontramined buildings materials. Applied and Environmental Microbiology, 65, 138-142.

Paterson, R.R.M and P.D. Bridge (1994). Biochemical techniques for filamentous fungi . CAB lnternational Micological. United Kingdom. 83 p.

166

Safar, A. , L. Larson , A. Burge and D. Milton (1997). Quantification of ergosterol and 3-hydroxyl Fatty acids in settled house dust by gas chromatography-mass spectrometry: Comparison with fungal culture and determination of Endotoxin by a Limulus Amebocyte lysate assay. Applied and Environmental Microbiology, 63, 2554-2559.

Schmeda-Hirschmann, G. E. Hormazabal, L. Astudillo , J. Rodríguez and C. Theoduloz (2005) . Secondary metabolites from endophytic fungi isolated from the Chilean gymnosperm Prumnopitys andina (L/euque). World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21 , 27-32.

Scott, R and W.C. Sullivan (2007). A review of suitable companion crops for black walnut, 71 , 185-193.

Sonjak, S. , J.C. Frisvad and N. Gunde-Cimerman (2005). Comparison of secondary metabolites production by Penicillium crustosum strain, isolated from arctic and other various ecological niches. FEMS Microbiology Ecology, 53, 51-60.

Smith J.E. and D.R. Berry (1976). The filamentous fungi Vol. 2 Biosynthesis and metabolism. Edward Arnold London. 519 pp.

Stierle, A.C ., J.H. Cardenilla and G.A. Strobel (1988) . Maculosin, a host-specific phytotoxin for spoted knapweed from Alternaría altemata. Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A., 85,8008-8011.

Tan R.X and W.X. Zou (2001 ). Endophytes: a rich source of functional metabolites. Natural Products Repport, 18,448-459.

167

Trigos A. (1995). Estudio de la vanac1on del contenido de ergosterol en diversos hongos presentes en México. Revista Latinoamericana de Química, 24,141-147.

Trigos, A and A. Ortega-Regules (2002). Selective destruction of microscopic fungi through photo-oxidation of ergosterol. Mycologia, 94,563-568.

Turner W .B and Aldridge, D.C. (1983). Fungal metabolites 11 Academic Press Great Britain pp. 631

Vikrant, P., K.K. Verma, R.C. Rajak and A.K. Pandey (2006). Characterization of a Phytotoxin from Phoma herbarum for Management of Parthenium hysterophorus L. Journal Phytopathology, 154,461-468.

Xu , Ch ., M. Mo, L. Zhang and K. Zhang (2007). Soil volatile fungistasis and volatile fungistatic compounds. Soil Biology & Biochemistry, 36,1997-2004.

NIST 05MS spectra (2006) Departament of Commerce John Wiley & Sons, lnc Product Compilation Agilent Technologies, USA P/N G1030-60305. Registry 7th Edition.

168

CAPÍTULO VIl Conclusiones Generales

La estrategia de aislamiento y selección seguida en el presente trabajo llevó al aislamiento de 48 cepas de hongos asociados a hojarasca y restos vegetales en los estados de Yucatán, Tabasco y Veracruz, todos pertenecientes a la clase Hifomicetos. Una parte de estas cepas se identificaron con base a sus caracteres morfológicos dictados por la taxonómica clásica a nivel de especie para 15 cepas y a nivel de género 21 , lo que corresponde al 75 % del total. Estos resultados corresponden a la primera contribución al conocimiento de los hongos de hojarasca para el estado de Yucatán y una aportación para los estados de Tabasco y Veracruz.

La actividad antimicrobiana (38 %) y producción de moléculas antioxidantes (1 O %) detectada de la evaluación de las propiedades biológicas de los extractos obtenidos de la micobiota aislada corrobora que los hongos microscópicos saprobios del trópico son un recurso importante para la obtención de moléculas activas para la industria farmacéutica y para el control de fitopatógenos.

La respuesta antibacteriana encontrada fue mejor que la antifúngica con los extractos obtenidos de los cultivos en arroz fermentado. Las especies Beltraniella japonica , Beltraniopsis sp., Corynespora cassiico/a, Phaeobotrys y MRCICY45 inhibieron en diferente intensidad todas las especies de bacterias probadas, sobresaliendo Beltraniopsis sp. por presentar la mayor actividad antibacteriana contra Xanthomonas campestris.

Solamente las cepas Memnoniella sp. y GHCICY15 presentaron una respuesta inhibitoria específica; la primera

169

contra Gandida albicans y la segunda contra Xanthomonas campestris, en ambos casos la inhibición fue moderada.

La especie Beltraniella portoricensis y la cepa MRCICY 45 fueron las únicas con actividad antifúngica. La primera capaz de producir los extractos con mayor capacidad inhibitoria contra los fitopatógenos fúngicos Col/etotrichum gloeosporioides y Pythium aphanidermatum, además esta cepa sobresalió por tener un amplio espectro antimicrobiano, inhibiendo todos los patógenos bacterianos probados.

Los extractos de Beltraniel/a japonica , Be/traniopsis sp., Corynespora cassiicola, Gliomastix murorum y MRCICY 45 tuvieron actividad antioxidante, esta es la primera ocasión en que se registra dicha actividad para las especies mencionadas.

Del perfil químico de los extractos se obtuvo el primer metabolito hasta ahora reportado para la especie Beltraniella japonica, se trata del 2-hidroxijuglona, el cual pertenece a la fam ilia de las naftoquinonas, moléculas con un amplio rango de acción biológica.

En los experimentos con cultivos mixtos se encontró que para Beltraniella japonica y G/iomastix murorum se incrementa la capacidad para producir metabolitos con actividad antioxidante al cultivarse juntas y en las combinaciones con Thozetel/a havanensis y MRCICY 45.

La serie de metabolitos detectados en los perfiles cromatográficos de los cultivos mixtos confirma el variable comportamiento biosintético de las especies en dependencia de diversos factores bióticos y abióticos.

170

Perspectivas

El alto numero de cepas raras o poco conocidas aisladas en los cuatro muestreos realizados para este estudio, corroboran la gran riqueza de especies que albergan los restos vegetales en las zonas tropicales y ponen en evidencia la necesidad de implementar un programa de colecta a largo plazo, sobretodo en los sitios que son objeto de constantes perturbaciones.

Aunado a la exploración de campo es necesario el planteamiento de proyectos interdisciplinarios en los que se investigue en forma paralela la ecología, la fisiología y el contenido qU1m1co de las especies con potencial biotecnológico. Al respecto cabe señalar que los cultivos mixtos son una alternativa prometedora que requiere de mayor investigación, ya que las respuestas de las especies son específicas y varían según las combinaciones entre cepas, el medio de cultivo y el tipo de extracto

171