Centrifugación de óvulos de dos células de ratón: Estratificación de citoplasma y recuperación

Resumen. El óvulo de dos células de ratón, el cual fue centrifugado por 1 h a 70000-90000 x g, mostró una estratificación precisa del citoplasma y elongación del núcleo. Los óvulos fueron arreglados a diferentes tiempos y observados por microscopios electrónicos y de luz usando métodos citoquímicos y extracciones detergentes. Dentro de 40 minutos después de la centrifugación la morfología normal fue recuperada excepto por las capas de lípido persistente a los polos centrípetos de los blastómeros. División, compactación y blastulación no fueron prevenidas por la centrifugación. Tratamientos con colcemida o citocalasina D retardaron pero no previnieron la recuperación impar. Estos resultados sugieren que un resistente estructura citoesquelética pueda estar inmersa en esta clase de regulación embriónica.

Palabras clave: óvulo de ratón – centrifugación – regulación – citoesqueleto.

Introducción:El óvulo de dos células en ratón, observado por inmunofluorescencia, mostró una regionalización de miosina (Sobel 1983a, b), fodrina (Schatten et al, 1986) y espectrina (Sobel y Alliegro 1985, pero vea Damjanov et al, 1986) y del estado de 4 células en adelante una fostasa alcalina regionalizada y actividad de la 5’ nucleotidasa puede ser demostrada en la membrana celular (Izquierdo et al. 1980; Izquierdo y Ebensperger, 1982). No han sido reconocidas distintas regiones antes, ni en el oocito o en el óvulo fertilizado, el cual podría ayudar a establecer un lineaje celular que conecte blastómeros tempranos con las células diferenciadas de los blastocistos. Además, embriones experimentalmente desordenados son capaces de regular y desarrollar a blastocistos normales (). Estas observaciones, aun así, descartan la existencia de una estructura espacial consistente que pueda determinar desarrollo, a pesar de eso tal determinación puede ser rechazada por la regulación embriónica. Aquí analizamos la estructura espacial del óvulo de dos células por medios de su centrifugación y subsecuente cultura in vitro. Este método no ha sido usado en mamíferos, excepto por un reporte de búsqueda preliminar por Mulnard (1970).

Materiales y métodos:

Colección de los embriones. Óvulos de dos células fueron colectados en medio Biggers () conteniendo 4 mg/ml de suero de albúmina bovina (BSA) () de ratones superovulados de los CF de 1 tensión, 36 h después del presunto tiempo de ovulación ().Procedimiento de centrifugación. Soluciones de dextrano (MW 40000 Sigma) fueron preparados en medios Biggers a concentraciones de 17%, 15% y 11% (w/v), bebidos separados con CO2 en aire hasta ajustar el pH a 7.2-7.4 y luego e introdució secuancialmente en 0.8 ml de tubos de nitrocelulosa. Los embriones fueron colocados en la parte más clara del gradiente discontinuo y los tubos fueron entrifugados por 60 minutos usando un rotor basculante SW 39 del modelo de centrífuga Beckman L. Las fuerzas centrífugas aplicadas en el rango de 15000 a

120000 x g. La temperatura del contenido del tubo variaba entre 13 y 18 °C, excepto por experimentos en el cual la centrifugación fue realizada a los 4°C.

Cultivo in vitro. Siguiendo la centrifugación, los óvulos fueron enjuagados con medio Biggers y, o arreglados inmediatamente o cultivados en diferentes tiempos antes de la fijación. Los óvulos fueron cultivados en microgotas de medio Biggers con BSA en placas de Petri de plástico (Falcon) en aceite mineral a 37°C en una atmósfera húmeda de CO2 en aire, pH 7.2-7.4. El número de células fue determinado por el método de Tarkowski (Tarkowski, 1966). Antes y durante la centrifugación los óvulos fueron expuestos a temperatura controlada y atmosférica; los tubos control fueron tratados similarmente.

Microscopio electrónico y de luz. Luego de la centrifugación y el cultivo in vitro, los óvulos fueron procesados por microscopios electrónicos y de luz así como los reportados anteriormente () sin agregar ácido tánico. La microscopía fue realizada en grandes cantidades de glicerol. En algunas series experimentales, inmediatamente luego de la centrifugación los óvulos fueron lavados en buffer de estabilización (), permeabilizados con 0.5% de Triton X-100 en buffer de estabilización por 1 minuto a 37°C y lavados en el mismo buffer por 30 s antes de la fijación.

Técnicas citoquímicas. La demostración no específicade lípidos fue lograda por Red Oil, Sudan Negro () y su primera osmofilia. La fosfatasa ácida fue demostrada en grandes óvulos de acuerdo al método Gomori modificado por Weissenfels (). El ADN fue demostrado por un test de Feulgen modificado en óvulos que habían sido arreglados en alcohol formaldehído acético ().

Inhibidores del citoesqueletos. En estas series de inhibidores fueron agregados al medio de cultivo y al gradiente de dextrano. Algunos experimentos fueron empezados con una mezcla de 0.5 ug/ml de colcemida (Sigma) y 0.5 ug/ml de citocalasina D (Sigma), otros fueron empezados con colcemida (2 ug/ml) o con citocalasina (0.5 ug/ml); finalmente, algunos experimentos fueron completados a 4°C. Los óvulos fueron cultivados en medios que contenían inhibidores por 1 h antes, durante y después de la centrifugación. Los inhibidores fueron preparados en dimetilsulfoxido (DMSO) () no se observaron diferencias entre controles con o sin DMSO.

Resultados

Estratificación: observaciones de microscopio de luzLuego de la centrifugación, los óvulos fueron hallados en capas correspondiendo de 13% a 15% de dextrano. Las fuerzas centrífugas mayores que 30000 x g inducidas a estratificación visible y reproducible del citoplasma (). Algunos óvulos empezaron a romperse a 120 000 x g.

Los 71 óvulos arreglados después de la centrifugación a 70 000 x g o 90 000 x g mostraron, mediante un microscopio de luz, una ligera elongación de sus blastómeros en el sentido de las fuerzas de centrifugación y algunas veces una cintura. Los óvulos usualmente se orientan a sí mismos en tal forma que el estrato

estaba en un ángulo de 90° en un plano separando ambos blastómeros. El cuerpo polar ha sido observado mas frecuentemente que en el polo centrífugo.

Una capa de material lípido, fuertemente manchados con Sudan Negro o Aceite Rojo o Tetraóxido de Osmio, se hallaron al polo centrípeto de cada blastómero (). Bajo la capa del lípido, fue hallada una cubierta de hialina, la cual en su margen centrípeto fue marcado ligeramente con actividad de fosfatasa ácida. Bajo la cubierta de hialina, una capa granulada extendida en la parte baja en el polo centrípeto. En esta capa, el núcleo pudo ser visto abarcando desde el centro del blastómero hasta el polo centrípeto, como si fuera jalado en esa dirección por el denso núcleo (). El test de Feulgen reveló que no había presencia de cromatina fuera del núcleo elongado.