celulas_madre_tecnicas

8/7/2019 celulas_madre_tecnicas

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TÉCNICAS

Indice de materias

1. INTRODUCCIÓN HISTÓRICA Y CONCEPTOS ACTUALES DEL CULTIVO DE CÉLULASMADRE

2. MÉTODOS DE CULTIVOa. Aislamiento

i. Células Madre embrionarias ii. Células Madre adultas iii. Células Madre fetales

b. Derivaciónc. Diferenciación

3. CARACTERIZACIÓN

4. BIOLOGÍA DE LA CÉLULA EN CULTIVO. CONDICIONES DE CULTIVOa. El medio de cultivoi. Medio ii. Hormonas y factores de crecimiento iii. Inhibidores del crecimiento de contaminantes

b. El substratoi. Plástico ii. Soportes celulares

c. Métodos de disgregación celulari. Mécanicos ii. Químicos iii. Enzimáticos

5. EL LABORATORIO DE CULTIVO CELULARa. Cabinas de flujo laminarb. Incubador de CO2c. Placas calefactoras.d. Instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fases invertidoe. Congeladores e instalacion de criogenia (depósito de N2 liquido)f. Equipo de esterilización

i. Equipo de filtración ii. Autoclave iii. Mechero Bunsen

g. Otros instrumentosi. Pipeteadores ii. Centrífugas iii. Equipos de purificación de agua

iv. Magdem v. Contador electrónico de células

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Documento de Aplicación Células Madre, Sección Técnica

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1. INTRODUCCION HISTÓRICA Y CONCEPTOS ACTUALES DEL CULTIVO DE CÉLULAS MADRE

Catorce años después del aislamiento inicial de las Células Madre de los blastocitos de ratón, Thompsony colaboradores, en la Universidad de Wisconsin (Madison, WI) establecieron por primera vez, CélulasMadre embrionarias de primate a partir de blastocitos de monos Rhesus.

Después, en 1998, fueron capaces de derivar Células Madre Embrionarias humanas (hESCs) deblastocitos humanos. Desde entonces, la derivación de hESCs de la ICM de blastocitos preimplantadosse ha convertido en un procedimiento muy utilizado por la mayoría de científicos en todo el mundo.

Actualmente, el principal objetivo de la investigación de Células Madre (SC) consiste en su derivacióncomo soporte para la creación de células pre o diferenciadas para su posterior aplicación en medicinaregenerativa. Los campos de aplicación incluyen ensayos clínicos y farmacológicos de enfermedadesneurodegenerativas, cardiovasculares y diabetes, la generación de células donantes universales y laingeniería tisular.

Todas las lineas de hESCs aprobadas actualmente con fondos federales en los EEUU son derivadassobre soportes celulares de ratón (feeder layers) y son expuestas a una variedad de productos de origenanimal escasamente definidos. Actualmente, una de las principales preocupaciones es la exposición delas hESCs a componentes animales, debido al riesgo de contaminaciones por retrovirus y otrospatógenos que pudieran ser transmitidos al paciente (lineas celulares de calidad terapéutica). En losúltimos años se han ido usando feeders humanos (placenta, piel, etc…) para evitar estas posiblescontaminaciones.

Las directrices europeas (2003/94/EC, 2004/24/EC) son muy estrictas en el seguimiento de lascondiciones de las GMPs para la derivación y propagación de las hESCs.

La investigación en SC embrionarias y adultas está en desarrollo y la mejora de nuestro conocimientosobre su biología puede abrir nuevas perspectivas de futuras terapias para una variedad deenfermedades como la diabetes tipo I y el Parkinson.Algunas terapias basadas en el uso de SC están en fase de clínica en animales. En piel y célulashematopoyéticas, la investigación está en una segunda fase, en la cual la corrección de genes encombinación con la terapia celular es usada para remitir enfermedades hereditarias. En los próximos 2 a

5 años, se prevee que más terapias basadas en SC entrarán en ensayos clínicos, sobre todo en el áreade la regeneración muscular y el daño óseo (Stem Cell Research-Status, Prospects, Prerequisites;European Molecular Biology Organization).

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2. MÉTODOS DE CULTIVO

a) Aislamiento:

i. Células Madre embrionarias: Los embriones humanos que son utilizados para

obtener las SC son producidos en clínicas de Fertilización In Vitro (donados odesechados), donde son deshidratados, congelados y enviados a los centros deinvestigación de SC para su utilización. Los embriones son, entonces, descongelados yrehidratados al baño maría en placa calefactora, durante 50 segundos a 37ºC. Estosembriones, listos para ser cultivados (derivados), se dejan desarrollar hasta fase demorula en el día 4 y forman el blastocito el día 6.

Fig. 1. Aislamiento y diferenciación de Células Madre embrionarias humanas.

El blastocito es aislado y cultivado sobre una capa de células feeder. El blastocito se fijaa las células feeder y la Masa Celular Interna (ICM) queda expuesta, permitiendo suextracción y disociación mecánica de los blastocitos con número de células y morfologíaadecuadas (derivación).

Otra técnica para la obtención de SCs es la transferencia nuclear, consistente en laintroducción del núcleo de una célula somática en un huevo fertilizado cuyo núcleooriginal ha sido eliminado. El ambiente del huevo fertilizado tiene el efecto dereprogramar el núcleo transferido a su estado primordial, continuando normalmente conla división del huevo.

ii. Células Madre adultas:

Células Madre Hematopoyéticas: Las Células Madre Hematopoyéticas puedendiferenciarse como cualquier tipo celular sanguíneo: eritrocitos, linfocitos B, T y naturalkiller, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos, macrófagos y plaquetas.

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Fig. 2. Diferenciación de células hematopoyéticas y de estroma. Tomado de Stem Cell Information, NationalInstitutes of Health.

Células Madre Mesenquimales : Provienen de tejidos conectivos embrionarios inmaduros.Se diferencian en una gran variedad de tipos de células, como osteocitos, condrocitos,adipocitos y otras clases de células de tejidos conectivos, como tendones.

Células Madre Neurales: Se encuentran en el tejido neural adulto y, en el cerebro, sediferencian en sus tres mayores tipos celulares: neuronas, y dos categorías de celulas noneuronales, como son astrocitos y oligodendrocitos.

Células Madre Epiteliales: Se desarrollan en criptas profundas del tracto digestivo y sediferencian en varios tipos celulares: células de absorción, endocrinas, etc.

Células Madre de la piel : Se desarrollan en las láminas basales de la epidermis y en labase de los folículos pilosos. Las Células Madre Epidérmicas pueden diferenciarse enqueratocitos, que migran a la superficie de la piel y forman una lámina protectora. LasCélulas Madre Foliculares se pueden diferenciar tanto en tejido folicular comoepidérmico.

iii. Células Madre Fetales: Aisladas de embriones muertos y sangre del cordónumbilical.

b) Derivación:

Las colonias formadas a partir de las Células Madre aisladas o de las ICMs, en el caso de SCembrionarias, son disgregadas y sometidas a pases sucesivos hasta obtener líneas celularesestables.

c) Diferenciación:

Es el proceso mediante el que una célula no especializada se transforma en cualquier tipo celular (cardíaco, pulmonar, pancreático, etc...) por la activación o desactivación de determinados genes,regulada por distintos mecanismos celulares (microRNA, activación de receptores, factores decrecimiento, etc).

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3. CARACTERIZACIÓN

Durante el proceso de cultivo y diferenciación de Células Madre, se producen cambios en la composiciónantigénica de superfície, las proteínas intracelulares y los factores de transcripción. La deteccióninmunológica o por PCR de estos marcadores es ampliamente utilizada para caracterizar el estado depluripotencia de las Células Madre humanas y de ratón, los carcinomas embrionarios, así como su

estado de diferenciación en los diversos linajes celulares.

Existen varios marcadores característicos de la Células Madres embrionarias indiferenciadas:

- Glicolípidos de superfície: glycolipid surface Stage Specific Embryonic Antigens: SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4

- Tumour related antigen TRA-1-60 and TRA-1-8119

- Octamero-4, relacionado con el mantenimiento de la pluripotencia.

- Factores de transcripción, como Sox-2 and Germ Cell Nuclear Factor (GCNF), Rex1 y Nanog.

Posteriormente, las Células Madre embrionarias dan lugar a las tres capas germinales embrionarias queconstituyen la fuente de todo los tejidos de un organismo:

- Marcadores de ectodermo: ASH1, CNPase, Dopamina B hidrolasa, EN1, GBX, LIM-1/ISLET-1, LHX3, NFH

-Marcadores de endodermo: antitripsina, alfa-fetoproteína, allbúmina, amilasa, quimotripsina.

- Marcadores de mesodermo: actinina, cardiotina, CD34 claseI, II y II, troponina, miosina, renal cellcarcinoma.

Como se ha comentado anteriormente, se han identificado Células Madre en tejidos y órganosespecíficos. Los marcadores para estos tipos celulares son:

- Células Madre neurales y linaje neuralo Celulas indiferenciadas: nestina, Sox2o Neuronas: Beta-tubulina II (newborn neurons), Map2, Neurofilamento H, L y M, Neural

specific enolase, Sinaptofisina, Sinaptobrevina, Transportadores nicotínicos, gabaérgicosy de acetilcolina.

o Astrocitos: GFAP, S100

o Oligodendrocitos. A2B5, Ng2 condriotin sulfato proteoglicano.

- Células Madre Hematopoyéticas. Está ampliamente aceptado que la glicoproteína de superficieCD34 es expresada por la mayor parte de las células hematopoyéticas pluripotentes, que sonnegativas para CD45. Para células de ratón se utiliza, sobre todo, CD38.

- Células Madre Mesenquimales: Integrina beta1, colágeno 1, CD54 y fibronectina. Estas célulasdan origen a cardiomiocitos (actina cardíaca+), osteocitos (osteopontina+) y condriocitos(colágeno 1 y 2).

Estudios recientes demuestran que los microRNAs (miRNA) desempeñan un papel crucial en la divisiónde las Células Madre y su autorrenovación, así como en la regulación de su estado de diferenciación y el

linaje al que darán lugar (Sempere et al, 2006; Shu et al, 2004).

Los microRNAs son pequeños ARNs de 17-25 nt que no codifican proteínas y con una estructurasecundaria de horquilla específica. Los miRNAs controlan negativamente la expresión de genes a nivelpostranscripcional. Se han identificado miRNAs específicos en Células Madre y cuyos perfiles deexpresión van disminuyendo a medida que las células se diferencian. La identificación de nuevosmiRNAs y su mecanismo molecular puede contribuir a clarificar el potencial de Célula Madre para suposterior aplicación en medicina regenerativa (Zhang et al, 2006).

Durante el cultivo y diferenciación, además de caracterizar cambios en la expresión de diferentesmarcadores celulares, es necesario el análisis del estado de proliferación celular, los perfiles de muerte y

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viabilidad celular, la activación de señales intracelulares, así como las características morfológicas yfuncionales (motilidad celular, extensión neurítica, etc). En este sentido, el desarrollo de estrategias parael análisis multiparamétrico en formato multipocillo permite obtener resultados fiables con poco materialde partida.

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4. BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS MADRE EN CULTIVO. CONDICIONES DE CULTIVO

Desde la derivación hasta la diferenciación de Células Madre, cada tipo celular tendrá unosrequerimientos distintos de sustrato, pasando desde células en suspensión hasta adheridas, asícomo de nutrientes y factores de crecimiento.

Fig. 3. Diferenciación Celular.

a) El medio de cultivo:

El cultivo celular se realiza en medios artificiales, preparados mediante la mezcla decomponentes purificados o de soluciones orgánicas complejas, en el interior deinstrumentos que mantienen las condiciones físico-químicas adecuadas y sobre soportes orecipientes que los contienen y aíslan del medio exterior. Por ello, consideraremos que elmedio de cultivo estará formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase enque crecen las células, las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio, lanaturaleza y composición de la fase gaseosa y las condiciones de incubación,especialmente la humedad y la temperatura.

i. Medio de cultivo: En la fase de proliferación de Células Madre se suelen utilizar medios de cultivo suplementados con factores de crecimiento y en ausencia desuero, que les permiten no pasar a la fase de diferenciación.

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En la fase de diferenciación, se usan medios de cultivo suplementados con suero yen ausencia de factores de crecimiento

Los principales medios empleados en Células Madre son:

DMEM/F12

DMEM

• IMDM

Para aplicaciones terapéuticas se han desarrollado medios de cultivo libres decomponentes de origen animal.

ii. Hormonas y factores de crecimiento (suero): En los medios no definidossuele aportarlos el suero. En algunas aplicaciones de Células Madre, se suelenaportar individualmente para evitar el uso de sueros.

Los tipos de suero empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suerobovino fetal ("fetal calf serum", FCS) y suero humano ("human serum", HuS). La

utilización de suero es problemática pues siempre existe la posibilidad de quecontenga contaminaciones (micoplasmas y virus), aunque últimamente las distintascasas comerciales han desarrollado sueros testados especialmente para CélulasMadre o sustitutivos del suero.

iii. Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos): Con el fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo,éste se suele suplementar con sustancias antibióticas de diferente espectro deacción. La adición de antibióticos debe controlarse estrictamente para evitar efectos nocivos sobre el cultivo.

Es importante tener especial cuidado cuando se combinan dos o más antibióticos.Las mezclas de uso más común son:

Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 µg/mL). Combinación anti-microbiana.

Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 µg/mL) / Fungizona.Combinación anti-microbiana y anti-fúngica.

Existen diversos métodos para detectar posibles contaminaciones en los cultivos.Para más información, seguir el link Las contaminaciones.

b) El sustrato de cultivo:

En función de si la línea celular precisa o no unirse al sustrato para proliferar, se ladenomina como dependiente (adhesión) o independiente (suspensión) de anclaje:

i. Plasticos: El material más utilizado como sustrato es el plástico desechable, enforma de diferentes tipos de recipientes. Los más comunes son:

Placas de Petri (ventiladas). Disponibles en 3 tamaños: 3’5, 6’0 y 10 cm dediámetro. Son las más empleadas cuando se trata de crecer las célulaspara usar directamente en experimentos. Debido a su escasa

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estanqueidad, no es recomendable su utilización para el mantenimiento delíneas.

(Foto: Catálogo de Corning distribuido por Cultek)

Multiplacas. Es una variante de las placas de Petri. Placas de variospocillos, desde 6 a 96 pocillos.

(Foto: Catálogo de Corning distribuido por Cultek)

Frascos de Roux (botellas ventiladas o no). Disponibles en diferentestamaños, son recomendables para el mantenimiento de las líneas y laproducción de células, así como para el crecimiento de células ensuspensión.

(Fotos: Catálogo de Corning distribuido por Cultek)

El plástico más empleado es el poliestireno, de buena calidad óptica.Debido a que este plástico es hidrofóbico, requiere un tratamientomediante irradiación-gamma, químico o mediante descargas eléctricas queproduzcan una superficie hidrofílica.

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El tratamiento es característico de los diferentes suministradores, y por ellolos productos varían en calidad de uno a otro.En aquellos casos en que las células tengan requerimientos especialespara adherirse, se han desarrollado nuevas superficies que aumentan la

hidrofilicidad mediante tratamientos con plasma en condiciones de vacío.

Fig. Ejemplo de Células Madre Neurales de rata crecidas en condiciones de baja adherencia(izquierda). Las células mantienen su capacidad de autorrenovación y forman neuroesferasen suspensión. Células crecidas en condiciones de adherencia comienzan su diferenciación

(derecha). Imágenes cedidas por R. Miñana (J. Neurosci. Research, 2006).

Para el caso de Células Madre que requieren estar en suspensión paraevitar su diferenciacion (ej. Hematopoyéticas o neuroesferas), se suelenusar sustratos plásticos tratados para disminuir la posibilidad de fijación.

ii. Soporte celular o Feeder Layers: Hay otras lineas de Células Madre querequieren crecer sobre monocapas de otros tipos celulares (Feeder Layers). Estas

monocapas previas se esterilizan o se inhibe su crecimiento (normalmente por irradiación X o gamma). Actualmente, las monocapas mas empleadas paracrecimiento de hESCs son los fibroblastos humanos.

c) Métodos de disgregación celular:

Durante el cultivo de las células es necesaria su disociación para separar las células entresí y del sustrato, manteniendo la viabilidad celular. Para conseguirlo, se debe romper lamalla de proteínas que forman la matriz extracelular que las mantiene unidas, medianteprocesos que separen las moléculas proteicas de esta matriz extracelular o bien romper proteolíticamente las mismas proteínas.

Generalmente, los métodos empleados se pueden clasificar en tres categorías:

i. Mecánicos: (Scrapers, Lifters, Magdem …) En cultivos celulares se emplean confrecuencia los métodos de rascado (“scrapping”) de la placa para arrancar lascélulas adheridas. Actualmente, el rascado manual puede ser sustituido por unrascado automático, que se realiza mediante imanes que son colocados en elinterior del frasco de cultivo. Son realizados por los equipos denominadosMagdem.

ii. Químicos: Se llevan a cabo mediante la adición de soluciones en las que no

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hay iones divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones. En cualquier caso, se reduce la concentración de los iones que estabilizan las uniones de lasproteínas de la matriz extracelular y de éstas con los receptores celulares.

iii. Enzimáticos: Tratamiento del cultivo celular con soluciones de proteasas

activas (colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, papaína, pronasa, hialuronidasa,etc...).

Existen otros productos sustitutivos de las enzimas de orígen animal, que permitenrealizar la misma función pero sin afectar a las proteínas de la membrana. Son lasdenominadas HyQTasas. Soluciones de orígen no mamífero en D-PBS con EDTA.

(Foto1: Scrapers catálogo de Corning) (Foto2: Magdem catálogo de Consul AR)

La elección de uno u otro procedimiento dependerá, fundamentalmente, de lanaturaleza o cantidad del cultivo disponible y del uso previsto de las célulasobtenidas.

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5. EL LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR

La característica principal que define a estos laboratorios de cultivo celular es el mantenimiento dela asepsia. La tasa de crecimiento de las células en cultivo es muy inferior al de los contaminanteshabituales: hongos, levaduras, bacterias y micoplasmas. Por ello, para el mantenimiento del cultivo,

será vital evitar la aparición en éste de cualquier microorganismo indeseado.

El área de trabajo para realizar cultivos debe instalarse en una zona tranquila del laboratorio,alejada de las vías de paso y, a ser posible, dedicada exclusivamente al cultivo de las células. Lasolución ideal es disponer de una habitación aislada del resto de zonas del laboratorio.

Las aparición de cabinas de flujo laminar redujo las necesidades de aislamiento del área de trabajopero, aún así, es recomendable mantener un gradiente de esterilidad, desde el medio exterior olaboratorio general, al interior de las cabinas de flujo donde se manipularán los cultivos y delincubador donde se mantendrán.

En un laboratorio de cultivo de Stem Cells se encuentran los siguientes tipos de instrumentos:

a) Cabinas de Flujo Laminar:

Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posiblescontaminantes (bacterias, levaduras,...), que puedan acceder al cultivo. Esto se consiguemediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un filtro de gransuperficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared frontal (flujohorizontal) y que, con una eficiencia del 99.999%, retiene las partículas por debajo de uncierto calibre (generalmente de 0,2µm).

El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas partículascontaminantes. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro HEPA comopor la velocidad constante del aire y por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de las cabinas, generadores de intensas corrientes deconvección.

Habitualmente, la cabina utilizada en esta aplicación es la denominada Clase Bio IIA:

o Protección personal: protección del personal que está manipulando el cultivo.

o Protección del producto, experimento o cultivo que se encuentra en el interior de lacabina de los contaminantes exteriores o de la contaminación cruzada con otrosproductos o cultivos situados en la misma cabina.

o Protección medioambiental: evitar la salida al medio ambiente de productos oagentes contaminantes.

Fotos extraídas del catálogo de cabinas Faster distribuidas por Cultek

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Cabina de flujo laminar horizontal Cabina de flujo laminar vertical

Dependiendo de la importancia que se le conceda a cada uno de estos factores en eldiseño de la cabina, ésta se podrá clasificar como de clase I, II ó III.

o Cabina de clase I. Se trata de una unidad de contención parcial adecuada para lamanipulación de agentes de bajo riesgo, donde existe una necesidad de proteccióndel operario y del medio pero no del producto. Este es el tipo de cabinasnormalmente denominadas "de gases", y no son de uso común en el laboratorio decultivo de tejidos.

o Cabina de clase II. Este tipo de cabinas protegen el producto, al personal y almedio ambiente. En general las cabinas de clase II se describen como un equipode protección con un panel frontal de acceso y que mantienen un flujo laminar estable en el interior, con una filtración HEPA para el aire recircularizado en cadaciclo y una filtración HEPA del aire exhausto (de salida al medio). Los sucesivosdiseños que se han realizado para cubrir necesidades diferentes permiten clasificar asimismo las cabinas de tipo II en tres subclases:

Tipo A. En este tipo, el 30% del aire es eliminado en cada ciclo y el 70% esrecircularizado. El escape al medio de los agentes potencialmentepeligrosos se previene mediante una corriente de aire entrante en unarejilla frontal.

Tipo B. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general y en ellase recirculariza sólo el 30% del aire en cada ciclo, eliminándose el 70% delaire restante.

Tipo 100% exhausto. Se trata de una cabina en la que el 100% del aire decada ciclo es eliminado hacia dispositivos que puedan retener los posiblesagentes peligrosos. Este tipo de cabinas se emplean fundamentalmente enlaboratorios de toxicología en los que se requieren áreas de contenciónlimpias y eliminación del aire posiblemente contaminado.

Las diferencias entre estos tres subtipos se refieren especialmente a la proteccióndel usuario, superior en el caso del tipo A, y a la eliminación de la cabina deposibles contaminaciones de tipo aerosol, no retenibles por el filtro HEPA. La tipoA, que es la más adecuada para el trabajo con agentes patógenos particulados(filtrables), es la menos adecuada para el trabajo con vapores o aerosolespeligrosos.

Asimismo, se debe tener en cuenta que el funcionamiento correcto para laprotección del producto y del personal depende de una correcta calibración delinstrumento, especialmente de las velocidades respectivas de entrada de aire en el

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Fotos extraídas del catálogo de incubadores CO2 de la marca RS Biotech

Existen en el mercado incubadores de CO2 de pequeño tamaño que permiten el cultivo de

pocas placas, o en su caso, el cultivo de un determinado tipo de SCs que se vayan adiferenciar a una misma línea celular.

Los equipos más pequeños (14 litros) pueden ponerse en el interior de las cabinas de flujo.De esta manera, eliminamos el transporte desde la cabina al incubador con el riesgo decontaminación que conlleva.

Fotos extraídas del catálogo de incubadores CO2 de la marca RS Biotech

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c) Placas calefactoras:

Actualmente los laboratorios de investigación con Células Madre, así como los distintosBancos de Líneas Celulares que realizan el paso de Derivación, tienen la necesidad deutilizar placas calefactoras en el interior de las cabinas de flujo, para descongelar losembriones provenientes de los Centros de Fecundación In-Vitro. Para ello, existen unascampanas especialmente diseñadas en las que existe un área de la superficie de trabajocalefactada, además de poder acoplar distintos dispositivos de visión microscópica(microscopio invertido, lupas, etc.…) así como mini-incubadores para poder mantener elmaterial en buenas condiciones de CO2, temperatura y humedad, evitando dispositivosmas aparatosos e incómodos como los inyectores de CO2 por burbujeo.

d) Instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fasesinvertido:

El control morfológico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio. El hecho deque las muestras a observar se encuentren en recipientes de un cierto grosor (más de 3

cm en el caso de frascos de Roux de 250 mL) hace que un microscopio convencional nosea adecuado (por su pequeña distancia frontal), por lo que se han desarrolladomicroscopios de diseño original, en los cuales la fuente de iluminación y los objetivos seencuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio óptico convencional.

La segunda característica que condiciona el instrumento óptico es su ausencia de color, esdecir, se trata de muestras vivas y con poco contraste. El microscopio se equipa con eldispositivo de contraste de fases (diafragmas anulares a nivel del condensador y placa defases entre las lentes del objetivo). De esta forma, el contraste de la imagen aumenta y lacalidad obtenida es muy superior.

Es de gran utilidad disponer, asimismo, de un dispositivo de captación de imágenes,fotográfico o de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de loscultivos.

Microscopio Invertido

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e) Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N2 líquido):

Es recomendable que los congeladores y la instalación de criogenia estén en recintosseparados a la unidad de cultivo propiamente dicha, pues los ventiladores y compresores

son una fuente importante de turbulencias y suciedad en el laboratorio.

Es preciso el almacenamiento de soluciones y células a diferentes temperaturas, para loque se requiere:

o Neveras (4ºC) para el almacenamiento de medios, PBS, ...

o Congeladores de -20ºC para el almacenamiento de suero, aditivos (glutamina,antibióticos) y soluciones enzimáticas (tripsina, colagenasa, …)

o Congeladores de -80ºC para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos delmedio (suero, glutamina, antibióticos,...) y de sustancias especialmente sensibles(factores de crecimiento, mitógenos, inductores,...).

o Unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196ºC) para el almacenamiento

de las líneas celulares.

Sistemas de almacenamiento de muestras.

f) Equipo de esterilización:

La necesidad de asepsia para el cultivo se extiende no sólo al medio en que se realiza eltrabajo, sino muy especialmente a los recipientes en que se realiza, a los medios líquidos osólidos y a los instrumentos que puedan entrar en contacto con éste en algún momento desu manipulación (pipetas, puntas de pipeta automática, pinzas, tubos, material variado devidrio...).

Para esterilizar todo este material, de variada naturaleza, se emplean una serie demétodos: irradiación con radiación gamma o rayos X, esterilización por gas, autoclavado,filtración,... En el laboratorio general de cultivo se suele disponer de un equipo de filtracióny autoclave. La esterilización por gas y la irradiación son técnicas propias de grandesinstalaciones, por ejemplo hospitalarias o industriales.

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i. Equipos de filtración: En la actualidad se dispone de unidades de filtraciónestéril muy recomendables para el trabajo rutinario. Sin embargo, su elevado costepor unidad hace que en muchos casos aún se empleen unidades reutilizables.

Estos equipos de filtración constan, bien de una fuente de vacío conectada a unkitasato dotado de una unidad de filtración esterilizada por autoclavado, o bien deuna bomba peristáltica que fuerza el flujo de solución a través de una unidad defiltración hermética.

En ambos casos, la esterilización se produce al atravesar la solución un filtro deporo de 22 µm.

Fotos: Sistemas de filtración. Catálogo de Corning

ii. Autoclave: Un autoclave es un instrumento que permite la esterilización por calor tanto de sólidos como de líquidos. La esterilización se realiza habitualmente a121ºC, 1 atmósfera de sobrepresión durante un tiempo superior a 20 min.

Un autoclave de uso normal en el laboratorio de cultivo de tejidos suele disponer de temporizador y regulador de presión y, en algunos casos, de un ciclo de secadopara permitir secar el material sólido (material de vidrio, instrumentos quirúrgicos,tubos,...)

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Fotos obtenidas del catálogo para manejo de líquidos de Integra Biosciences

ii. Centrífugas: En el laboratorio de cultivo es necesario disponer de unacentrífuga refrigerada, preferentemente con posibilidades de usar en ella desdetubos de pequeño volumen (1 a 2 mL) a botellas de gran capacidad (250 a 500mL).

Normalmente, para la mayor parte de las aplicaciones bastará con un instrumentoque desarrolle hasta 2000 × g. La centrífuga se debe instalar, en la medida de loposible, alejada de las cabinas de flujo laminar para evitar las turbulencias de aireque genera.

iii. Equipo de purificación de agua: Es de gran importancia en la preparación delos medios, de los aditivos, o en cualquier solución que pueda estar en contacto

con el cultivo, una absoluta esterilidad y ausencia de sustancias que puedanprovocar alguna alteración al cultivo. Por ello, se utiliza siempre agua de la máximacalidad (tipo MilliQ) obtenida mediante equipos de doble destilación o deintercambio iónico y filtración. Es muy importante la eliminación de apirógenos, yrestos de materia orgánica.

iv. Magdem: Equipo desarrollado para automatizar los procedimientos manualesque se usaban para el tratamiento en los cultivos celulares. Se produce unaestandarización del sistema.

El equipo está compuesto de dos partes:a) Un generador de campo magnéticob) Scrapers móviles (FLYcons)

Los FLYcons están fabricados en un plástico inerte biológico con un ratio departículas paramagnéticas que le confieren la capacidad de ser desplazados por elcampo magnético generado por el equipo. El tamaño que tienen les permitemoverse por toda la superficie que se ha de “scrapear”. Como son estériles einertes, pueden permanecer en el cultivo por cierto tiempo, sin interferir en elmismo.

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v. Contador electrónico de células ("cell counter"): Un contador electrónico decélulas es un instrumento capaz de contar y medir partículas en suspensión. Esteinstrumento fue comercializado por Coulter Electronics, y a pesar queposteriormente se han desarrollado métodos alternativos es aún hoy en día elmecanismo más empleado.

El sistema está formado por los siguientes elementos:

Dos electrodos, uno en el interior de un tubo con un pequeño orificio quese introduce en la suspensión de partículas a contar, y un segundoelectrodo que se introduce directamente en dicha suspensión. El tubo conel orificio está conectado a un manómetro de mercurio y a una bomba. Elmanómetro controla mediante el desplazamiento del mercurio la conexióny desconexión de los electrodos.

Un amplificador electrónico de la señal, un analizador de altura de lospulsos, y una escala, conectados a los electrodos.

Cuando la válvula que controla el manómetro se abre 0.5 mL de la suspensiónentran en el interior del tubo por el pequeño orificio. Durante ese tiempo, loselectrodos están conectados y registran y transmiten al equipo de amplificación yanálisis de la señal las oscilaciones de resistencia que detectan.

Cada vez que una célula atraviesa el orificio se produce una variación de laresistencia proporcional al tamaño. Estos datos se registran para ser analizadosposteriormente.


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