PRODUCCIÓN DE CELULASAS A PARTIR DEL HONGO Trichoderma sp Y APROVECHAMIENTO DE LA FIBRA PRENSADA DE PALMA COMO MEDIO DE CULTIVO

Ramírez, O.L. (olgalramirezf@hotmail.com).* Urrego, F.A. (freddyurrego@tutopia.com) *

RESUMEN A lo largo de la historia, se han venido empleando las enzimas para usos industriales, lo que ha desarrollado la biotecnología como herramienta para que a través de microorganismos se obtengan metabolitos de interés tanto industrial como ambiental. Una de las enzimas comúnmente utilizadas es la celulasa, obtenida mediante diferentes microorganismos, los cuales han sido estudiados en diferentes tipos de sustratos. Trichoderma, es un género de los más estudiados, encontrando que la temperatura óptima de crecimiento se encuentra alrededor de 25 a 30ºC, que debido a que son aerobios requieren de una fuente de oxígeno y toleran un amplio rango de pH (2-8.5). Con el fin de determinar el potencial de aprovechamiento de la fibra extraída de palma africana como medio de cultivo para el hongo Trichoderma sp, para la producción de celulasas se prepararon medios de cultivos (fibra prensada de palma africana molida y agua) en diferentes proporciones (9.09%, 12.5%, 25% y 44.4%), los cuales fueron inoculados con el hongo Trichoderma sp e incubados por quince (15) días bajo distintas condiciones1, transcurrido el tiempo de los medios de cultivo que no tuvieron agitación, las que presentaron mayor crecimiento fueron aquellas que se sometieron a una temperatura de 23ºC, y a una concentración de sustrato de 25%. INTRODUCCIÓN

Los microorganismos producen una amplia gama de enzimas útiles a nivel industrial, muchas de las cuales son segregadas al exterior celular. Estos microorganismos son capaces de desarrollarse fácil y rápidamente en su medio de cultivo cuya tecnología se encuentra hoy bien establecida. La optimización de la producción de enzimas a partir de microorganismos depende de una serie de factores interrelacionados, lo que significa que una enzima solo puede sintetizarse durante parte del ciclo de crecimiento (3). Algunos hongos de importancia industrial empleados para la obtención de metabolitos son los correspondientes al género Deuteromicetos (Deuteromicotina), entre los cuales están Aspergillus niger, Penicillium notatum-chrysogenum y Trichoderma viride. Otros están cobrando importancia debido a su utilización en la biotecnología ambiental ya que son capaces de metabolizar una variedad de compuestos químicos orgánicos, muchos de los cuales son contaminantes (5). Debido a estas características, se pretende contemplar el estado del arte de la producción industrial de celulasas a partir de Trichoderma viride, con el fin de aprovechar su metabolismo para degradar la celulosa presente en la fibra residual del proceso de extracción de aceite a partir de la palma africana. La celulosa es un polisacárido cuya fórmula química corresponde a: C6H10O5, es el principal componente de la membrana celular de la mayor porte de las plantas. La celulosa está constituida por moléculas de D-glucosa unidas por enlaces β (1-4) glucosídicos y es el polímero más abundante en la biosfera, generalmente resistente a la fermentación, no significa que no se pueda hidrolizar, pues existen microorganismos celulíticos que poseen enzimas como: las celobiohidrolasas y las endoglucanasas que se encargan de su degradación. (6).

* Fundación Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano, Ingeniería de Alimentos, X Semestre. 1 Cultivos a 23 ºC (Proporciones de fibra: 9.09%; 12.5%; 25%); Cultivos a 30 ºC (Proporciones de fibra: 9.09%; 12.5 %; 12.5% con agitación; 25%, 44.44%)

Las especies de Trichoderma son hongos que aparecen en cualquier ripo de suelo, produciendo colonias blancas, amarillas o más típicamente verdes cuando se cultivan. Las especies verdes de Trichoderma fueron inicialmente clasificadas como una especie única, T. Viride hasta que fueron subdivididas por Rifai. Las especies de Trichoderma se utilizan para producir celulasas. Sin embargo, son particularmente efectivas como antagonistas del crecimiento de otros hongos, muchos de ellos patógenos de plantas, con el resultado de que las especies de Trichoderma son importantes agentes en biocontrol (5). El hongo Trichoderma reesei es un microorganismo celulítico que contiene cuatro grandes celulasas (1,4-beta-D-glucancelobiohidrolasas CBHI y CBH II, endo-1,4-beta-D-glucanasa EG I y EGII). (7). Desde el punto de vista genético, se han estudiado genes que codifican para las celulasas (cbh1, cbh2, egl1 y egl2), mediante sustitución por el marcador genético amds de Aspergillus nidulans.. Estas investigaciones han sugerido que la CBHII y la EGII son las más importantes en la actividad enzimática de la celulasa porque intervinenen en la formación eficiente del inductor de éstas en T. Ressei y que la eliminación de ambas cadenas celobiohidrolasas (CBHII y EGII) imposibilita a la enzima para desdoblar la celulosa cristalina. (4). La mayor parte de los procedimientos estudiados a escala preindustrial utilizan enzimas producidas por Trichoderma reesei.. Este microorganismo tiene la ventaja de excretar, en grandes cantidades, la mezcla adecuada de enzimas, que permite la hidrólisis de celulosas amorfas y cristalinas. Se ha observado que la celulosa microcristalina (10g/L) es hidrolizada principalmente por dos de estas celulasas (celobiohidrolasa CBH I y endoglucanasa EG II) del hongo Trichoderma reesei. Se han realizado dos tipos de experimentos, donde ambas enzimas se agregaron específicamente y de forma equimolecular, analizando la adsorción de las enzimas y la producción de los azúcares solubles por técnicas de FPLC y HPLC, respectivamente. Los resultados obtenidos por este grupo de investigación sugieren que la CBH I produce azùcares más solubles que la EG II, excepto a concentraciones menores del 1%. Además, mediante simulaciones computacionales se encontró un modelo común de hidrólisis para las enzimas de CBH I y otro modelo claramente discernible para las enzimas del CBH II de muestras de Trichoderma reesei. (4) MATERIALES Y MÉTODOS

Se prepararon medios de cultivo (fibra molida y agua) a concentraciones de 9.09%, 12.5%, 25% y 44.44% en erlenmeyer de 250 ml , luego se esterilizaron a 121ºC por 15 min, se procedió a inocular con Trichoderma sp, se incubaron por 15 días bajo diferentes condiciones2 en una estufa Memmert, una vez retirados los medios se les adicionaron 100 ml de agua destilada, y del sobrenadante se tomó 1 ml en tubos de centrífuga para centrifugarlos por 10 min a 3600 – 4000 rpm, se tomaron 0.3 ml del sobrenadante y se completó a 1 ml con agua destilada en tubos de ensayo, para realizar la prueba de DNS, la cualificación se llevó a cabo en un espectrofotómetro β-helios.

2 Cultivos a 23 ºC (Proporciones de fibra: 9.09%; 12.5%; 25%); Cultivos a 30 ºC (Proporciones de fibra: 9.09%; 12.5 %; 12.5% con agitación; 25%, 44.44%)

RESULTADOS

Tabla 1. Cultivos a 23 ºC

Porcentaje de fibra Absorbancia 9,09 0,098 12,5 0,123

25 0,16 44,44 0,097

Cultivos a 30 ºC 9,09 0,064 12,5 0,109

25 0,146 44,44 0,078

Cultivo a 30 ºC con agitación 12,5 0,242

Gráfico de Absorbancia vs porcentaje de fibra

00,020,040,060,080,1

0,120,140,160,180,2

0,220,240,26

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Porcentaje

Abso

rban

cia Cultivos a 23 ºC

Cultivos a 30 ºC

Cultivo a 30 ºC conagitación

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Para la interpretación de los datos se hace un análisis cualitativo donde por medio de la prueba de DNS se determinan la relación de azucares reductores presentes en las muestras como resultado de la degradación de la celulosa contenida en la fibra de palma africana. Aunque la absorbancia es un parámetro que permite determinar la cantidad de enzima producida de una manera cualitativa, para efectos de determinación de costos, de rendimientos y dimensionamiento de equipos es necesario la realización de una curva de calibración para el DNS que permita cuantificar la concentración de enzima que se produce a partir de medios de cultivos con diferentes condiciones.

Al analizar la gráfica de absorbancia versus concentración se observa que para todas las concentraciones de los medios que no fueron sometidos a una agitación durante la incubación, hay una mayor producción de azúcares reductores a una temperatura de 23 ºC, valor que se aproxima a los datos óptimos de crecimiento encontrados en la literatura. Igualmente se observa que la concentración de sustrato donde hubo mayor producción de celulasa fue de 25% de fibra de palma africana para cada una de las temperaturas evaluadas, debido a que concentraciones menores hay un exceso de humedad en el medio que inhabilita el crecimiento del hongo Trichoderma sp, y a su vez la degradación de celulosa debido a que se disminuye la concentración de sustrato para consumo. Por otra parte, en concentraciones mayores de sustrato el medio de cultivo queda bastante seco para el crecimiento del hongo. Se obtuvo un valor de absorbancia alto para el medio de cultivo sometido a un proceso de agitación durante la incubación, que inicialmente pude indicar que bajo este proceso físico se aumenta la producción de celulasa, sin embargo, no se cuenta sino con un solo dato y no es posible generalizar con este ya que no se cuenta con más valores que hagan veraz esta suposición. No obstante, al analizar las condiciones del proceso de agitación, sería lógico que una mejor distribución del sustrato homogenizara las condiciones del medio y el hongo tendría una mejor disposición de estos para su crecimiento. Los diferentes medios preparados permiten identificar algunas de las condiciones óptimas que se pueden adoptar a nivel industrial para la producción de celulasas, sin embargo, un factor que se debe considerar es el hecho de haber tomado las lecturas a los 15 días de inoculado el cultivo, ya que entonces se hace necesario determinar en investigaciones posteriores la curva de crecimiento con respecto al tiempo del hongo Trichoderma sp, para determinar el tiempo mínimo necesario para la producción de determinada cantidad de enzima.

CONCLUSIONES

Al observar el crecimiento del hongo Trichoderma sp en cada uno de los medios preparados se asume que este posee la cantidad necesaria de nutrientes para el desarrollo del mismo, y que la fibra puede ser utilizada como fuente de celulosa para implementación a nivel industrial. Se determinaron algunas de las condiciones óptimas de crecimiento necesarias para una mayor producción de celulasas utilizando como medio de cultivo fibra prensada de palma, y con el empleo del hongo Trichoderma sp, como lo fueron una concentración de fibra de aproximadamente 25%, con una temperatura de incubación cercana a los 23 ºC, como un método alternativo de aprovechamiento de este subproducto, que posteriormente puede ser materia prima para otro tipo de procesamiento (extracción de carotenos del aceite residual, o empleo en las calderas de las plantaciones). Se determinó la importancia de establecer el tiempo mínimo necesario para que se produzca una cantidad específica de enzima, así como la elaboración de la curva de calibración para la prueba de DNS, para poder cuantificar la cantidad de enzima producida y establecer ciertas condiciones de diseño como el tamaño del biorreactor y los rendimientos obtenidos bajo las diferentes condiciones evaluadas. Se comprobó el potencial que posee la fibra prensada de palma como fuente rica de nutrientes para el crecimiento del hongo Trichoderma sp, y como resultado de esto la producción de celulasas para dos fines: 1) comercialización de la enzima concentrada, y 2) reutilización de la fibra agotada para otros fines como extracción de carotenos o empleo como combustible en las calderas de las plantaciones.

BIBLIOGRAFÍA

1. CASTILLO, M.R., M. Gutiérrez-Correa, J. Linden y R.P. Tengerdy. 1994. Mixed culture solid substrate fermentation for cellulolytic enzyme production. Biotechnol. Lett. 16(9):967-972. 2. DUEÑAS, R., R.P. Tengerdy y M. Gutierrez-Correa. 1995. Cellulase production by mixed fungi in solid substrate fermentation of bagasse. World Journal of Microbiology and Biotechnology 11(3):333-337. 3. GACESA, P. 1990. Tecnología de las enzimas. Editorial Acribia S.A. Zaragoza España. Pp 15 – 24. 4. SEIBOTH B; Hakola S; March Rl; Suominen Pl; Kubicek Cp. Role de four major cellulases in triggering of cellulase gene expression by celloluse in Trichoderma reesei. J bacteriol, 1997 sep, 179:17, 5318-20. 5. WAINWRIGHT, M. 1992. Introducción a la biotecnología. Editorial Acribia S.A. Zaragoza España. Pp 18 – 21. 6. http://www.monografias.com/trabajos5/recicla/recicla.shtml 7. http://webcd.usal.es/web/transgen00/otrdoc/prodacetetona/prodacetetona.htm#cuatro 8. http://www.lead.virtualcentre.org/es/enl/BTJ%20Taller/garciayaneysi.htmç 9. Revista Novo Nordisk, 1992.