Obtención de Nuevas Enzimas para la Producción de ... · Celulasas Avicel o CMC, revelado con...
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Obtención de Nuevas Enzimas para la Producción de Biodiesel y Bioetanol mediante Técnicas
Metagenómicas Inés Loaces, Cecilia Rodríguez, Vanesa Amarelle, Francisco Noya
Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas
Instituto de Investigaciones Biológicas “Clemente Estable”
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¿Cuánto bioetanol necesita Uruguay?
0
100
200
300
400
500
600
700
4,5% 5% 15% 85% 100%
3 69
531
630
Etan
ol (
mill
on
es d
e lit
ros)
Vehículos Flex Fuel Vehículos a nafta comunes
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Lignocelulosa a Etanol
La biomasa vegetal es renovable y abundante
Mediante hidrólisis enzimática se liberan azúcares sencillos
que pueden ser fermentados en etanol
20-40% del costo 2 empresas productoras
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Objetivo Desarrollar enzimas nacionales que permitan hacer económicamente viable la conversión de biomasa en etanol.
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Estrategia
• Aprovechar toda la diversidad genética de una comunidad bacteriana especializada mediante la metagenómica funcional.
• Analizar todos los organismos, sean cultivables in vitro o no.
• Seleccionar las mejores enzimas y expresarlas en cepas industriales especializadas en convertir azúcares sencillos en etanol.
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Construcción de bibliotecas metagenómicas
Extraer el ADN
Seleccionar por tamaño
Clonarlo en fósmidos pCC1FOS
Empaquetarlos in vitro e infectar E.coli EPI300
Seleccionar aquellas colonias que adquirieron funciones de interés
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Comunidades Microbianas
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Departamento de Ingeniería de Reactores Facultad de Ingeniería Universidad de la República
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Selección
Función Medio
Celulasas Avicel o CMC, revelado con Rojo Congo Avicel como única fuente de carbono
Hemicelulasas Xilano de Avena, revelado con Rojo Congo
Esterasas/Lipasas Tributirina Trioleína/rodamina
Tamaño de las bibliotecas: 30.000 clones cada una, 42 kbp por clon
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Lipasas
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Celulasas
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Actividad celulolítica
Papel de filtro Bagazo de caña de azúcar
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Cantidad de clones identificados
Función Rumen Lodos de bioreactores
Celulasas 21 6
Hemicelulasas 5 4
Esterasas/Lipasas 11 6
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Genes identificados por secuenciación masiva ORF Predicted function CAZy
Xil3_c1_87 Xylanase, arabinofuranosidase GH43,62,32,68
Xil3_c1_45 Xylanase, arabinofuranosidase GH43,62,32,68
Xil3_c1_71 BACON-glucanase GH5
Csd6_c1_40 BACON-glucanase GH5
Csd9_c1_5 Endoglucanase GH5
Csd8_c5_17 β-xylosidase GH43
Csd18Uruguay_c1_59 Endoglucanase GH5,16
Csd4_endoG Endoglucanase GH5
Csd4_xyl β-xylosidase GH43
Csd4_lac Laccase / Cu-oxydase AA1
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Conversión de celulosa en etanol
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Etanol a partir de celulosa (1% CMC)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 20 40 60 80 100 120
Etan
ol (
g/L
)
Tiempo (h)
C- Csd4 Csd23 Csd18
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Producción de etanol por Csd4
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Glucose CMC Avicel FP Bagasse Xylan Salts
Eth
ano
l (g
/l)
Sustratos al 1%, 48 horas, 37ºC
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Caracterización Enzimática
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Csd4
Putative promoter
Csd4
34406 bp
Endoglucanase
LaccaseCgtA GTPase
Adenylate kinase
Beta-xylosidase
Putative hemin binding
Phosphoenolpyruvate synthase
EndoG
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pH y temperatura óptimos de EndoG
0
20
40
60
80
100
120
10 30 50 70 90
Re
lati
ve a
ctiv
ity
(%)
T (⁰C)
0
20
40
60
80
100
120
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Re
lati
ve
Ac
tivit
y (
%)
pH
-
Actividad de EndoG en distintos solventes
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Re
lati
ve A
ctiv
ity
%
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Especificidad de EndoG
Sustrato Actividad
CMC +
Avicel -
4-MUC +
Celotetraosa +
Xilano +
Lichenan -
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Perspectivas
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Perspectivas
glucanasa xilanasa β-glicosidasa
MS04
CBP Consolidated Bioprocessing
β-xilosidasa
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Perspectivas
Switchgrass Pasto elefante Caña común
Panicum virgatum Pennisetum purpureum Arundo donax
Pretratamientos físicos y/o químicos
“CBP”
Etanol
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Agradecimientos
• BIOGEM • Inés Loaces • Cecilia Rodríguez • Vanessa Amarelle • Daniela Senatore • Uriel Koziol • Elena Fabiano • Andrés Iriarte • Federico Battistoni • Raúl Platero • Federico Rosconi
• Unidad de secuenciación • José Sotelo
• ANCAP • Nikolai Guchin
• FING • Liliana Borzacconi
• Frig. Pando • Betiana Bouzas
• ANII • Laura Barreiro
• UNAM • Alfredo Martínez
• University of Florida • Lonnie Ingram
• Ismael Nieves