Categorías de Categorías de Escherichia coliEscherichia coli diarreigénicodiarreigénicoClasificaciónClasificación

Esta se basa en:

•La interacción que establecen con la mucosa intestinal.

•Los distintos factores de virulencia codificados en

cromosomas, plásmidos , fagos, trasposones.cromosomas, plásmidos , fagos, trasposones.

•El síndrome clínico que producen

•Los diferentes serotipos O:H dentro de cada categoría.

Escherichia coli diarreagénico

� ETEC – E. coli enterotoxigénico

� EPEC – E. coli enteropatogénico

� EAEC – E. coli enteroagregativo

� EIEC – E. coli enteroinvasivo

� EHEC – E. coli enterohemorrágico

� DAEC – E. coli de adherencia difusa

Mecanismo de la infecciónMecanismo de la infección

por por Escherichia coliEscherichia coli diarreigénicodiarreigénico

•Colonización de la mucosa intestinal

•Evasión de las defensas del huésped

•Multiplicación

•Daño celular del huésped

Escherichia coli

enterotoxigénico (ETEC)

Factores de colonización (CFs)

Especificidad antigénica MorfologíaEspecificidad antigénica

CFA (Antígeno factor de colonización)

•CS (Antígeno de superficie de coli)

•PCF (Probable factor de colonización)

•Longus

Morfología

•Fimbrias

•Fibrillas

•Helicoides

•Manojo (bundle-forming )

•Adhesinas no fimbriadas

Factores de colonización de ETECFactores de colonización de ETEC

Enterotoxinas LT y ST de ETEC

LT ST

Mecanismo de patogenia de ETECMecanismo de patogenia de ETEC

LT ST

Áreas de riesgo de diarrea del viajero asociada a ETEC

Alto riesgo

Bajo riesgo

Intermedio

Mecanismo de patogeniaMecanismo de patogeniaEscherichia coli Escherichia coli enteropatógenoenteropatógeno

EPECEPEC

EPEC EPEC -- Lesión A/ELesión A/E

EPEC Adherencia localizadaEPEC Adherencia localizada

Mecanismo de patogeniaMecanismo de patogeniaEscherichia coliEscherichia coli enteroagregativoenteroagregativo

EAggECEAggECADHESINAS

FIMBRIAS

• AAFI

• AAFII

• AAFIIIEASTI

Adherencia de EAggECAdherencia de EAggEC

Mecanismo de patogenia Mecanismo de patogenia Escherichia coliEscherichia coli enteroinvasivoenteroinvasivo

EIECEIEC

Mecanismo de patogeniaMecanismo de patogeniaEscherichia coliEscherichia coli de adherencia difusa de adherencia difusa

DAECDAEC

Factores de adherencia

•Familia adehesinas afa•Familia adehesinas afa

•Adhesina AIDA-1

Adherencia difusaAdherencia difusa

• Persona a persona por la vía fecal-oral

•Ingesta de alimentos contaminados

TransmisiónTransmisión

Dosis infectivaDosis infectiva

• Varía de 108-109 UFC (ETEC, EPEC) a 10-102 UFC (EHEC, EIEC)

Características clínicas Características clínicas de la diarrea por de la diarrea por Escherichia coliEscherichia coli diarreigénicodiarreigénico

� Diarrea acuosa o mucosa, vómitos y poca fiebre: ETEC, EPEC, EAEC, DAEC, EIEC, y EHEC en una primera etapa.EIEC, y EHEC en una primera etapa.

� Diarrea hemorrágica: EIEC, EAEC, y EPEC EHEC, en una segunda etapa.

Escherichia coli diarreigénico

Estrategias de detección

Flora

normal

Categorías deE. coli

diarreigénico

Factores de virulencia específicos

Detección de Categorías de DEC

•Serotipificación

•Ensayos con animales

Asa ligada de conejo (ETEC)

Sereney (EIEC)

•Ensayos fenotípicos que correlacionan con factores de virulencia•Ensayos fenotípicos que correlacionan con factores de virulencia

Adherencia cultivo celular (EPEC, EAEC, STEC, DAEC)

ELISA (ETEC, STEC, EIEC)

•Detección molecular

Hibridación sondas genéticas (EPEC, EAEC, STEC, DAEC)

PCR (EPEC, EAEC, STEC, ETEC, EIEC, DAEC)

Muestra para realizar coprocultivo

Evacuación espontanea

•Recolectar 2 g de materia fecal con una espátula y colocarla en un

recipiente estéril. Conservar refrigerada a 4ºC hasta su procesamiento.

•Si la muestra no es procesada dentro de las 2 horas de recolectada,

utilizar medio de transporte (Cary-Blair, Stuart,) conservar a 4ºC.

Toma de muestra para el diagnóstico de la Toma de muestra para el diagnóstico de la infección por DEC infección por DEC

Hisopado rectal• Tomar la muestra con hisopo, conservarlo en un medio de transporte ymantenerlo a 4°C hasta su procesamiento.

•Si el niño usa pañal, tomar la muestra que queda en el mismo con hisopo

o con espátula.

Recomendacionesa)Recolectar la materia fecal lo antes posible después del establecimiento de la

diarrea.

b)El paciente no debe estar con tratamiento antibiótico. Recolectar la muestra

después de suspender la antibioticoterapia por no menos de 48 horas.

Sistema de triple envase para el envío de Sistema de triple envase para el envío de material infecciosomaterial infeccioso

Las muestras deben ser enviadas según las Normas de Bioseguridadque corresponden al transporte de muestras clínicas.

Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de

ETEC, EPEC, EAEC, EIEC, y STECMateria fecal (suspensión)

Agar MacConkey

(MAC)

Tamizaje PCR múltiple Nº1

eae / lt / st

zona de confluenciacolonias lactosa (-) y lactosa (+)

Tamizaje PCR múltiple Nº2

aggR / IpaH / stx1 / stx2

zona de confluencia

37ºC x 18 h

Agar MacConkey Sorbitol

(SMAC)

CT-CTS

SMAC

37ºC x 6 h

37ºC x 18 h37ºC x 18 h

CTS

37ºC x 6 h

37ºC x 18 h

SMAC

Continuar con los colonias lactosa (-) y lactosa (+)

PCR Nº1 Positiva

eae (+) Aislamiento

EPEC

lt / st (+) Aislamiento

ETEC

zona de confluenciacolonias lactosa (-) y lactosa (+)

IpaH (+) Aislamiento

EIEC

aggR (+) Aislamiento

EAEC

stx1 / stx2 (+) Aislamiento

STEC

PCR Nº2 Positiva

•PCR Confirmación

•Identificación Bioquímica

•Seroagrupamiento

Continuar con los procedimientos de

diagnóstico y caracterización de STEC

O157 y no-O157 a partir de especimenes clínicos”

Hisopado rectal

Estrategia de detección Cultivo y PCR múltiple

Hisopado rectal

Siembra

directa

Agar MAC

.....

....

Incubación a 37º por 18 hs

PCR

Toma de muestra para realizar PCR múltiple

Nº1 (eae / lt / st) y Nº2 (aggR / IpaH / stx1 / stx2)

Placa de MAC

. .

•Muestra de zona de cultivo confluente

•Pool de colonias no fermentadoras de lactosa

MAC Grillado

....... . .

•Pool de colonias fermentadoras de lactosa

PCR Tamizaje

EPEC / ETEC PCR múltiple eae / lt / st

2 min72Extensión5

2921 min72Extensión4

1 min56Pegado de primers ó

annealing

3

30 seg94Desnaturalización2

5 min94Desnaturalización1

Nº vecesVa al pasoNº

TiempoTemperaturaºC

EtapaPaso Nº

2 min72Extensión5

2921 min72Extensión4

1 min56Pegado de primers ó

annealing

3

30 seg94Desnaturalización2

5 min94Desnaturalización1

Nº vecesVa al pasoNº

TiempoTemperaturaºC

EtapaPaso Nº

Primer

Secuencia del primer (5’-3’)

Tamaño del fragmento de amplificación (pb)

SK1 CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC 864

SK2 CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG

LT-L TCTCTATGTGCATACGGAGC 322

LT-R CCATACTGATTGCCGCAAT

AL-65 TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG 147

eae

lt

st

4Pausa6 4Pausa6

Referencias

Toma C. 2003. (EPEC, ETEC, EAEC)

AL-65 TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG 147

AL-125 CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC

STEC / EIEC / EAEC PCR múltiple

aggR / ipaH / stx1 / stx2

Primer

Secuencia del primer (5’-3’)

Tamaño

del fragmento de

amplificación (pb)

IpaH8B GTTCCTTGACCGCCTTTCCGA 619

IpaH15B GCCGGTCAGCCACCCTCTGAG

aggRks1 GTATACACAAAAGAAGGAAGC 254

aggRkas2 ACAGAATCGTCAGCATCAGC

Paso

Nº

Etapa Temperatura ºC

Tiempo Va al paso Nº

Nº veces

1 Desnaturalización 94 5 min

2 Desnaturalización 94 30 seg

3 Pegado de

primers ó annealing

58 30 seg

Referencias

Toma C. 2003. (EAEC)

Sethabutr O. 1994. (EIEC)

Leotta G. 2005. (STEC)

stx1

stx2

ipaH

aggR

aggRkas2 ACAGAATCGTCAGCATCAGC

stx1a GAAGAGTCCGTGGGATTACG 130

stx1b AGCGATGCAGCTATTAATAA

stx2a TTAACCACACCCCACCGGGCAGT 346

stx2b GCTCTGGATGCATCTCTGGT

annealing

4 Extensión 72 30 seg 2 29

5 Extensión 72 2 min

6 Pausa 4

Resultados posibles de la PCR múltiple

Nº1 (eae / lt / st) y Nº2 (aggR / IpaH / stx1 / stx2)

Confluencia y pool de

colonias positivas PCR de colonias individuales

1º grilla

Confluencia positiva y pool de colonias negativas PCR seleccionando nuevas colonias

Confluencia y pool de colonias negativas Muestra negativa

2º grilla

Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de

ETEC, EPEC, EAEC, EIEC, y STECMateria fecal (suspensión)

Agar MacConkey

(MAC)

Tamizaje PCR múltiple Nº1

eae / lt / st

zona de confluenciacolonias lactosa (-) y lactosa (+)

Tamizaje PCR múltiple Nº2

aggR / IpaH / stx1 / stx2

zona de confluencia

37ºC x 18 h

colonias lactosa (-) y lactosa (+)

PCR Nº1 Positiva

eae (+) Aislamiento

EPEC

lt / st (+) Aislamiento

ETEC

zona de confluenciacolonias lactosa (-) y lactosa (+)

IpaH (+) Aislamiento

EIEC

aggR (+) Aislamiento

EAEC

stx1 / stx2 (+) Aislamiento

STEC

PCR Nº2 Positiva

•PCR Confirmación

•Identificación Bioquímica

•Seroagrupamiento

Identificación bioquímicaPruebas Bioquímicas Categoría

EPEC /ETEC/ EAEC

Medio de cultivo

Fermentación de

glucosa

+ Agar triple azúcar y hierro

(TSI)

Fermentación de

lactosa

+ TSI

Fermentación de

sacarosa

+ TSI

Formación de H S - TSI

Según Manual of Clinical Formación de H2S

Producción de gas + TSI

Utilización del citrato - Citrato de Simmons

Producción de indol + Sulfuro, indol, movilidad

(SIM)

Movilidad Móvil / no móvil SIM

Actividad

β-glucuronidasa

+ Disco con glucurónido

Actividad lisina

decarboxilasa

+ (90) * Lisina Hierro Agar (LIA)

Actividad ornitina

decarboxilasa

+ (95) Movilidad, indol, ornitina.

(MIO)

Según Manual of Clinical Microbiology (7°ed).

1999

Pruebas Bioquímicas Microorganismo Medio de cultivo

EIEC Shigella spp Shigella sonnei

Fermentación de

glucosa

+(100) +(100) +(100) Agar triple azúcar y hierro

(TSI)

Fermentación de

lactosa

+(25) - +(2) TSI

Fermentación de

sacarosa

+(15) - +(1) TSI

Formación de H2S - - - TSI

Producción de gas +(5) (2) - TSI

Utilización del citrato - - - Citrato de Simmons

Producción de indol +(80) +(50) - Sulfuro, indol, movilidad

(SIM)

Movilidad +(5) - - SIM

Actividad +(45) +(2) +(90) Disco con o-nitrofenil-β-D-

Según Farmer JJ. et al. J. Clin. Microbiol. 1985. 21: 46-76.

β-galactosidasa galactósido (ONPG)

Actividad lisina

decarboxilasa

+ (40) - - Lisina Hierro Agar (LIA)

Actividad ornitina

decarboxilasa

+ (20) +(1) +(98) Movilidad, indol, ornitina.

(MIO)

Utilización del acetato +(40) +(2) - Prueba del acetato

Fermentación D-

Sorbitol

+(75) +(30) +(2) Fermentación azúcares

Fermentación de D-

Xilosa

+(70) +(2) +(2) Fermentación azúcares

Fermentación de

Dulcitol

+(40) +(2) - Fermentación azúcares

Fermentación de

Mucato

+(30) - +(10) Fermentación azúcares

Fermentación de

salicina

+(10) - - Fermentación azúcares

SeroagrupamientoSeroagrupamiento

�Incubar colonias caracterizadas en un medio de cultivo como agar TSA.

�Realizar suspensión bacteriana con SF y hervir 1 �Realizar suspensión bacteriana con SF y hervir 1 hora.

�Realizar seroagrupamiento con antisueros polivalentes y monovalentes según disponibilidad y categoría.

� Tener en cuenta las características clínicas de ladiarrea

� Vía de transmisión o fuente de infección

� Realizar la identificación bioquímica de E. coli

� Identificar características bioquímicas de la cepa

Recomendaciones para la detección deETEC, EPEC, EAggEC, DAEC y EIEC

� Identificar características bioquímicas de la cepa

Ejemplo: Lactosa (-), Movilidad (-), LIA (-) ,

E. coli / Shigella ?

� Técnicas de Biología molecular para detectarfactores de virulencia

� Enviar aislamiento, datos del paciente, y lascaracterísticas mencionadas, al Laboratorio deReferencia para la identificación final

DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE CEPAS DE Escherichia coli ENTEROINVASIVA POR PRUEBAS BIOQUIMICAS Y MOLECULARES

� Autores: Servicios Fisiopatogenia y Enterobacterias del INEI y Servicio de Sueros y antígenos del INPB “Carlos G. Malbrán”

� Objetivo: Identificar y caracterizar cepas EIEC aisladas en el período 1994–2003 mediante la aplicación de pruebas bioquímicas diferenciales, seroagrupamiento y métodos moleculares.

� Materiales y métodos: 102 cepas EIEC, PCR para la detección del gen ipaH, pruebas bioquímicas y seroagrupamiento con antisueros “O”.

� Resultados: Porcentaje de positividad (%)

PRUEBA BIOQUIMICA EIEC E. coli * Shigella spp.*

Triptofano 100 98,0 50,0

Porcentaje de positividad (%)

PRUEBA BIOQUIMICA EIEC E. coli * Shigella spp.*

Triptofano 100 98,0 50,0

SH2 (SIM) 0 0 0

Producción de indol 80,0 98,0 50,0

ONPG 100 95,0 2,0

Movilidad 0 95,0 0

Rojo de Metilo 100 100 100

Voges-Proskauer 0 0 0

Citrato de Simmons 0 0 0

Citrato de Christensen 26,4 76,4 2,0

Acetato (utilización) 68,6 90,0 2,0

Mucato (fermentación) 10,8 10,8 0

Esculina (hidrólisis) 5,9 35,0 0

Arginina dihidrolasa 33,3 17,0 5,0

Lisina descarboxilasa 39,2 90,0 0

Ornitina descarboxilasa 59,8 65,0 1,0

Arabinosa (fermentación) 96,1 99,0 60,0

Dulcita (fermentación) 14,7 60,0 2,0

Glucosa (ácido) 100 100 100

Glucosa (gas) 100 95,0 2,0

Lactosa (fermentación) 78,4 95,0 30,0

Maltosa (fermentación) 97,0 95,0 50,0

Rafinosa (fermentación) 29,4 50,0 50,0

Ramnosa (fermentación) 72,5 80,0 5,0

Sacarosa (fermentación) 16,7 50,0 0

Salicina (fermentación) 15,7 40,0 0

* Datos obtenidos de Manual of Clinical Microbiology. Murray et al. 2003

SH2 (SIM) 0 0 0

Producción de indol 80,0 98,0 50,0

ONPG 100 95,0 2,0

Movilidad 0 95,0 0

Rojo de Metilo 100 100 100

Voges-Proskauer 0 0 0

Citrato de Simmons 0 0 0

Citrato de Christensen 26,4 76,4 2,0

Acetato (utilización) 68,6 90,0 2,0

Mucato (fermentación) 10,8 10,8 0

Esculina (hidrólisis) 5,9 35,0 0

Arginina dihidrolasa 33,3 17,0 5,0

Lisina descarboxilasa 39,2 90,0 0

Ornitina descarboxilasa 59,8 65,0 1,0

Arabinosa (fermentación) 96,1 99,0 60,0

Dulcita (fermentación) 14,7 60,0 2,0

Glucosa (ácido) 100 100 100

Glucosa (gas) 100 95,0 2,0

Lactosa (fermentación) 78,4 95,0 30,0

Maltosa (fermentación) 97,0 95,0 50,0

Rafinosa (fermentación) 29,4 50,0 50,0

Ramnosa (fermentación) 72,5 80,0 5,0

Sacarosa (fermentación) 16,7 50,0 0

Salicina (fermentación) 15,7 40,0 0

* Datos obtenidos de Manual of Clinical Microbiology. Murray et al. 2003

El resultado de PCR ipaH fue positivo en las 102 cepas E. coli analizadas.

O28

38%

O124

23%

O143

12%

O136

5%

O112

4%

Otros

8%

ONT

10%

O28

O124

O143

O136

O112

Otros

ONT

Serogrupos EIEC

Otros: O18, O44, O144

Caracterización molecular de aislamientos de Escherichia coli diarreigénico en la

Ciudad de Corrientes

Autores: Patricia Esquivel et al (Cátedra de Microbiología UNNE)

Lugar: Ciudad de Corrientes

Objetivo: Caracterizar por PCR los aislamientos de E.coli diarreigénicos de casos ocurridos en la Ciudad de Corrientes

Metodología: PCR múltiple para ETEC, EPEC, EIEC, EaggEC y STEC (Toma y col J Clin Microbiol 2003)

Resultados: 40/ 104 muestras (61 niños y 43 adultos) positivas

ETEC 10,5% ; EaggEC 8,8 %; STEC 7,0%; EPEC 5,3% y EIEC 3,5% . EaggEC más frecuente en niños (11,3%) y ETEC en adultos (11,6%)

Caracterización molecular de aislamientos de Escherichia coli diarreigénico recuperadas de

fuentes de agua de la provincia del ChacoAutores: Losch et al (Cátedra de Microbiología UNNE)

Lugar: Provincia del Chaco

Objetivo: Determinar la distribución de los aislamientos de E.coli diarreigénicos en ambientes acuáticos (superficiales, subterraneas y diarreigénicos en ambientes acuáticos (superficiales, subterraneas y de red) de la provincia del Chaco

Metodología: PCR múltiple para ETEC, EPEC, EIEC, EaggEC y STEC (Toma y col J Clin Microbiol 2003)

Resultados: 54 muestras de agua

7/ 54 EaggEC 13% (5 de aguas superficiales y 2 de fuentes subterráneas)

1 / 54 EPEC 1,8% (fuentes subterráneas)

2010 - Total país

Diarreas por E. coli: Agentes identificados por SE

80

100

120

140

Núm

ero

de M

uestr

as

Positiv

as

60%

80%

100%

% P

ositiv

os

E. coli enteropatógeno (EPEC)

E. coli enteroinvasivo (EIEC)

E. coli No-O157 productor de toxina Shiga (STEC)

E. coli O157

0

20

40

60

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51

Semana Epidemiológica

Núm

ero

de M

uestr

as

Positiv

as

0%

20%

40%

% P

ositiv

os

E. coli O157

% Positivos bacterianas