Castellanos Sanchez Maria Elena

Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008

REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS

MAESTRIA EN MICROBIOLOGÍA

INCIDENCIA DE ADENOVIRUS Y CALICIVIRUS EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS DE LA COMUNIDAD DE NAZARETH DEL MUNICIPIO

MARA- ESTADO ZULIA.

Trabajo de Grado presentado ante la División de Estudios para Graduados

para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología

Autor: María Elena Castellanos Sánchez C.I: 14.134.762

Tutora: MgSc. Luciana Costa de León

Co-Tutora: MgSc. Leticia Porto

Maracaibo, Febrero 2008


INCIDENCIA DE ADENOVIRUS, CALICIVIRUS Y ENTEROVIRUS EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS DE LA COMUNIDAD DE NAZARETH

DEL MUNICIPIO MARA- ESTADO ZULIA.

Autor: Lic. Castellanos Sánchez María Elena ___________________________

C.I: V-14.134.762 Firma

Dirección: Urbanización San Francisco calle 160

sector 6 casa Nº 01

Teléfono: 0261-7612135 / 0414-0702991

Correo electrónico: [email protected]

____________________

MgSc. Luciana Costa de León.

C.I. 4..517.843

Tutor


El jurado nombrado por el Comité Académico de la Maestría en Microbiología, para evaluar el Proyecto de Trabajo de Grado, titulado:” INCIDENCIA DE ADENOVIRUS, CALICIVIRUS Y ENTEROVIRUS EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS DE LA COMUNIDAD DE NAZARETH DEL MUNICIPIO MARA- ESTADO ZULIA”, presentado por la Lic. María Elena Castellanos Sánchez., C.I: 14.134.762, ante la División de Estudios para Graduados como requisito para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología

Maracaibo, Enero 2007.

Jurado Evaluador

____________________________ ______________________ MgSc. Luciana Costa de León MgSc. Francisca Monsalve C.I: 4.517.843 C.I: 13.624.773 ____________________________ MgSc. Deynis Leon C.I: 10.405.136


INDICE GENERAL

Resumen

Abstract

Dedicatoria

Índice de Tablas

Índice de Anexos

Introducción………………………………………………………………………………………6

Objetivo General..............................................................................................................14

Objetivos Específicos......................................................................................................14

Materiales y Métodos

1-Población…………………………………………………………………..…………..…15

2- Recolección de la información………………………………………….……………..15

3- Recolección de la muestra…………………::……………….………………………..16

4- Métodos…………………………………………………………………………...……..16

4.1- Determinación de Adenovirus mediante la técnica de ELISA ……………..16

- Preparación de las muestras fecales para la

determinación de Adenovirus…………………………………………………16

- Procedimiento para la determinación de Adenovirus…………………….17

- Resultados para la determinación de Adenovirus…………………..........18

4.2- Determinación de Calicivirus y Enterovirus…..……...……………………..19

- Muestras fecales para la determinación de

Calivirus y Enterovirus…………………………………………………..…..19

- Extracción del RNA para Calicivirus y Enterovirus……………………….19

- Trascripción reversa para la obtención de ADN complementario


para la determinación de Calicivirus y Enterovirus………………..……..20

- PCR para la determinación de Calicivirus……………………………….20

- Electroforesis………………………………………………………………...21

4.3- Determinación de Enterovirus…………………………………...…………..22

5- Consideraciones éticas………….……………………………………………………..…22

6- Metodología estadística aplicada………………………………………..........................23

Resultados………………………………………………………………………………………24

Discusión………………………………………………………………………………………..30

Conclusiones……………………………………………………………………………………35

Recomendaciones….………………………………………………………………………….36

Referencias Bibliográficas...............................................................................................37

Anexos…………………………………………………………………………………………..41


Castellanos, María. INCIDENCIA DE ADENOVIRUS Y CALICIVIRUS EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS DE LA COMUNIDAD DE NAZARETH DEL MUNICIPIO MARA- ESTADO ZULIA. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. División de Estudio para Graduados, Maestría de Microbiología. Maracaibo, Venezuela. 2008

RESUMEN

Las diarreas virales, constituyen una de las principales causas de morbi-mortalidad en niños de los países subdesarrollados. Objetivo: Determinar la incidencia de Adenovirus, Calicivirus y Enterovirus en niños menores de 5 años de la comunidad de Nazareth del Municipio Mara Estado Zulia. Metodología: Fueron tomadas 46 muestras de heces de niños menores de 5 años, a los padres se les realizó una encuesta. La determinación de Adenovirus fue realizada por la técnica de ELISA y para la determinación de Calicivirus y Enterovirus fue usada PCR. Resultados: Ausencia de infección por los virus Adenovirus y Calicivirus y 47,63% de positividad para Enterovirus. Conclusiones: La lactancia materna y la adquisición de anticuerpos de la madre, pueden ser factores de protección en el caso de Calicivirus. Para Adenovirus, posiblemente la recolección de muestras al azar disminuyó la posibilidad de detectar el virus, el mismo ha sido detectado principalmente en muestras con diarreas. El elevado porcentaje de incidencia de Enterovirus, indica su presencia en la zona Palabra Clave: Adenovirus, Calicivirus, Enterovirus, diarreas, niños, PCR.


Castellanos, María. INCIDENCE OF ADENOVIRUSES AND CALICIVIRUSES IN CHLIDRENS MINO OF 5 YEAR IN THE COMUNITI OF NAZAREHT- MUNICIPIO MARA- ZULIA. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. División de Estudio para Graduados, Maestría de Microbiología. Maracaibo, Venezuela. 2007.

ABSTRACT

The viral diarrheas constitute one of the principal reasons of morbimortality in the infantile population of sub developed countries. Objective: Determine the incidence of Adenoviruses, Caliciviruses and Enteroviruses in the 5 year old minor children’s of Nazareth’s community, Municipality Mara, Zulia. Methodology: There took 46 dregs samples of children’s of 5 year old minor, to the parents was realized a survey. The determination of Adenoviruses was realized by the ELISA technique and for determination of Caliciviruses and Enteroviruses, was used PCR. Results: Absence of positives samples for Adenoviruses and Caliciviruses and a 47,82% of positives samples of Enteroviruses. Conclusions: The mother’s nourishment and the acquisition of mother antibodies can be protection factors in case of Caliciviruses. For Adenoviruses possibly the capture of sample at random diminishes the possibility of detecting the virus since the same one has been detected principally in samples with diarrheas. The high value of Enteroviruses incidence, indicate the presence in the zone.

Key words: Calicioviruses, Adenoviruses, Enteroviruses, PC


DEDICATORIA

En esta oportunidad me he rodeado de personas invalorables que de una u otra forma

se convirtieron en pilares sólidos para la culminación de una de mis metas

profesionales.

Dios, por su luz que ilumina mis pasos aun en la oscuridad, por guiarme y llevarme de

la mano durante todos estos años de vida.

Papi, el mejor papá del mundo, que aunque no este a mi lado ahora, me acompaña

todos los días desde ese lugar maravilloso a donde seguro Dios lo guió, si no fuera por

ti que me incentivaste hoy no viera cristalizado este sueño.

Mami, por ser mi apoyo en todo sentido, por ayudarme a rectificar en tantas ocasiones,

por haberse convertido desde hace casi 2 años en Mamá y Papá, gracias por estar

siempre conmigo.

Eugenia, mi hermana, mi amiga, mi confidente, con la que comparto casi todas mis

experiencias en esta vida, gracias hemanita por estar siempre a mi lado.

Antonio, mi hermano al que a pesar de todo quiero como al mejor hermano que pude

haber tenido, si no fuera por ti muchas sonrisas no existirían.

Mi tutora MgSc. Luciana Costa, no pude haber tenido mejor tutora, a lo largo de

aproximadamente 3 años, se ha convertido en mi ejemplo a seguir como profesional.

Mi cotutora MgSc. Leticia Porto, en mejores manos no pude estar, merece todo mi

respecto como profesional dedicada a su insigne labor.

MgSc Mariangela Bracho, sin su invaluable colaboración mi tesis no estaría completa.


MgSc. Francisca Monsalve y Dr. Jesús Estevez, gracias por aportar su granito de

arena.

Yenddy y Raimy, si no fuera por Uds. Los días en el laboratorio seria algo monótono,

definitivamente son el toque divertido, sin dejar a un lado su profesionalismo.

Marina, Yaritza, Lourdes, Ricardo, y a todos los integrantes del Laboratorio Regional de

Referencias Virológicas que formaron parte de mis días durante este largo recorrido.

Angela, porque a pesar de los años seguimos siendo amigas, siempre he contado con

tu apoyo incondicional.

Jessica, compañera de esta historia, con la que compartí muchos momentos y que a lo

largo de los días se sumo a i lista de amigos verdaderos.

Angel, que desde hace 1 año te has convertido en quien me da ánimos, en quien borra

mis lagrimas, en quien siempre esta conmigo a pesar de la distancia, te has convertido

en alguien con un significado único para mi.

A todos muchas gracias, sin la presencia de cada uno de ustedes mi vida no seria igual.

Maria Elena Castellanos S.


INDICE DE TABLAS

Pag.

Tabla 1

Distribución de los niños menores de 5 años de la

comunidad de Nazareth por sexo y grupo etario…………………………………26

Tabla 2

Distribución de los factores de riesgo relacionados con

el estilo de vida de los niños menores de 5 años de la

comunidad de Nazareth……………………………………………………………..27

Tabla 3

Resultados para la determinación de Enterovirus según el sexo…………….28

Tabla 4

Resultados por edad realizado en 46 muestras de niños

menores de 5 años de la comunidad de Nazareth para

determinar la presencia de Enterovirus……………………………………………28

Tabla 5

Distribución de casos positivos para Enterovirus según los

factores involucrados en su aparición……………………………………………...29


INTRODUCCION


INTRODUCCION

Las enfermedades diarreicas en niños menores de 5 años, constituyen una de las

principales causas de morbi - mortalidad en países en vías de desarrollo, reportándose

un elevado número de episodios al año 1- 3

La Organización Mundial de la Salud (OMS) asocia las enfermedades diarreicas

frecuentemente al consumo de agua o alimentos contaminados 2. Los factores

ambientales y sanitarios son considerados importantes, en la aparición de estas

enfermedades y su propagación en poblaciones de bajo nivel socioeconómico.

Constituyéndose estas comunidades en reservorio considerable de las enfermedades

virales 3.

Múltiples episodios de diarrea en el primer año de vida pueden deteriorar el estado

nutricional y causar graves secuelas. Se ha estimado que, en Asia, África y América

Latina, cada año mueren alrededor de 3,3 millones de niños menores de 5 años por

diarrea y ocurren más de mil millones de episodios 3-5.

En Venezuela, la diarrea aguda representa uno de los principales problemas de salud

pública. Constituye el 60% de la morbi - mortalidad de las enfermedades de notificación

semanal del país 3,5. Su incidencia es considerablemente elevada en la edad pediátrica,

especialmente en los niños menores de 1 año en quienes la letalidad alcanza el 0,95%;

seguido de el grupo de 1 a 5 años con una letalidad de 0,28% 5,6.

Para el año 2000, la mortalidad por diarrea en Venezuela ocupó el 12º lugar de las 25

primeras causas de mortalidad general y la 3° en las causas de mortalidad infantil, lo

que demuestra la importancia de esta patología principalmente en la población menor

de 5 años 6.

Para la semana epidemiológica Nº 52 (25 de al 31 del Diciembre del año 2005), en

Venezuela fueron diagnosticados 37.843 casos de diarreas, con 3 defunciones


registradas, encontrándose el mayor número de casos en menores de 15 años, con

24.225 (64%). Los estados con la más alta incidencia son: Zulia, Carabobo, Bolívar,

Anzoátegui, Miranda, Aragua, Falcón y Monagas, en los cuales se concentró el 69,08%

de los casos reportados 7.

Según el anuario de mortalidad del 2006, publicado por el Ministerio del Poder Popular

para la Salud; en Venezuela se registraron 1329 muertes producidas por diarreas de

tipo infecciosas en niños menores de 5 años, de las cuales 231 fueron reportadas en el

estado Zulia, para el grupo etario antes mencionado 8.

De acuerdo con las estadísticas venezolanas en el 2007, se reportaron más de

1.815.385 casos de diarrea en todo el país, de estos 5640, ocurrieron en el Zulia,

siendo este el Estado que presentó el mayor número de casos de síndrome diarreico

durante todo el año 9.

La existencia de partículas víricas en muestras de heces de pacientes que sufrían de

enfermedades diarreicas agudas fue demostrada en la década del año 1970, con la

microscopía electrónica. Los principales virus productores de gastroenteritis en humano

son los Rotavirus, Calicivirus, Astrovirus y Adenovirus. Otros virus con menor

trascendencia epidemiológica son: Coronavirus,y Torovirus 10.

Rowe et al., (1953) describieron por primera vez el Adenovirus; reconocieron que un

agente transmisible estaba destruyendo a las células epiteliales mientras intentaban

establecer cultivos celulares de amígdalas y tejido adenoideo, de allí deriva su

nombre11.

Adenovirus pertenece a la familia Adenoviridae y comprende los géneros

Mastadenovirus y Avianadenovirus que afectan respectivamente, a mamíferos y aves.

Describiéndose hasta 49 serotipos relacionados con la infección en los humanos10.


Adenovirus es un virus de ADN, sin envoltura. La partícula vírica presenta un tamaño

de 70 nm de diámetro (12). La cápside, de naturaleza proteica, se compone de 252

capsómeros que conforman una estructura icosaédrica. Dichos capsómeros pueden ser

de 3 tipos morfológicos: hexones, pentones y unas estructuras que se proyectan al

exterior, llamadas fibras que presentan un nódulo terminal. La longitud de las fibras

difiere de unos subgéneros a otros 13.

Los serotipos 40 y 41, constituyen el 59 % de los Adenovirus encontrados en las heces

causando un 7% de casos de diarrea en niños (2). Las infecciones producidas por

Adenovirus no han demostrado estar asociadas a ciertas épocas del año, no obstante

se ha descrito una disminución de los casos de gastroenteritis por Adenovirus en el

verano (14,15). La adquisición de anticuerpos sucede a temprana edad, de los 4 a 5 años

el 50% de los niños han adquirido anticuerpos contra adenovirus entéricos.

El diagnóstico de las infecciones por adenovirus entéricos se establece habitualmente

por ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), aglutinación de látex o inmunocromatografía.

Otros métodos de caracterización de Adenovirus entéricos son el análisis de

polimorfismo de fragmentos de restricción (RFLPs), Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR) y la hibridación en dot-blot 10,13.

Las infecciones por Adenovirus presentan una elevada morbilidad que se acompaña de

una baja mortalidad. Aparecen de forma epidémica por brotes a lo largo de todo el año,

y estos afectan a numerosos y variados sistemas de nuestro organismo. Los síndromes

más frecuentes son producidos a nivel respiratorio y gastrointestinal 16.

Giordano et al. (2001) señalan que los serotipos de Adenovirus productores de diarreas,

son responsables del 4 al 10% de las diarreas nosocomiales al igual que de las

extrahospitalarias a nivel mundial 17.

Según Gutierrez et al. (2005) la mayoría de los estudios epidemiológicos sobre las

diarreas agudas en infantes se han realizado en países en los que a lo largo del año se


observan las 4 estaciones pero no en países en los que solo se dan periodos, como lo

es el caso de Colombia y Venezuela, donde las enfermedades diarreicas agudas son

endémicas con repuntes de epidemias 18.

Los Calicivirus humanos pertenecen a la familia de virus ARN denominado Caliciviridae.

Tras la secuenciación del genoma del virus Norwalk o Norovirus 19 y de otros virus de la

familia 18, el Comité Internacional sobre Taxonomía de Virus estableció la existencia de

4 géneros dentro de la familia Caliciviridae, dos de ellos de Calicivirus de animales

(Lagovirus y Vesivirus) y dos de Calicivirus humanos, los virus tipo Norwalk (Norwalk

like viruses = NLVs) y virus tipo Sapporo (Sapporo like viruses = SLVs) 15.

Hoy en día Calicivirus es considerado uno de los principales agentes virales asociados

a brotes de diarrea no-bacteriana, brotes estos que usualmente ocurren en

comunidades cerradas 20.

Morales et al. (2007) señalan que los Norovirus representan una de las principales

causas de diarreas endémicas en todos los grupos etarios, a diferencia de los

Saporovirus, los cuales han sido principalmente asociados a diarreas endémicas en

niños 21. Los Calicivirus son virus altamente resistentes al ambiente y son trasmitidos

por vía la fecal- oral a través del contacto directo entre personas, así como también a

través del agua y alimentos contaminados 21. En Venezuela, existen reportes de

circulación de Calicivirus entre adultos y niños señalándolo como causa importante de

diarrea, tal vez la segunda en importancia después de Rotavirus 22,23.

Los viriones se componen de una única proteína estructural de la cápside. Las técnicas

de criomicroscopía electrónica revelan la estructura de simetría icosaédrica de la

cápside 24. La proteína estructural, constituida por 180 moléculas, se pliega en 90

dímeros formando una cubierta continua con protusiones en forma de arco. Una

característica clave es la existencia de 32 depresiones en forma de copa, situadas en

los ejes del icosaedro, de cuya denominación latina, calix, deriva su nombre 25.


El genoma de los Calicivirus humanos consiste en una cadena sencilla de ARN de

polaridad positiva. El genoma de los NLVs se organiza en tres secuencias de lectura

abierta (ORF). La ORF1 codifica una poliproteína precursora de las proteínas no

estructurales, la ORF2 codifica la proteína de la cápside y la ORF3 codifica una proteína

pequeña cuya función no se conoce 25. Estudios recientes indican que se trata de una

proteína estructural menor 26.

El genoma de los SLVs difiere del anterior, de manera que la ORF1 codifica las

proteínas no estructurales y, además, la proteína estructural de la cápside. La ORF2

codifica una proteína pequeña de función desconocida similar a la ORF3 del virus

Norwalk. En los SLVs se ha visto también un ORF3 de significado incierto todavía. Los

estudios sobre las diferencias entre ambos genomas han llevado a la subdivisión en

géneros dentro de los genogrupos 27,28.

El virus Norwalk es el prototipo de los Calicivirus humanos, durante mucho tiempo

también denominados "pequeños virus redondos estructurados" (small round-structured

viruses, SRSV), y actualmente considerado un miembro del género "virus Norwalk-like"

(NLV). Otro género lo constituyen los "virus Sapporo-like" (SLV). Los NLV se dividen en

tres genogrupos, GGI, GGII y GGIII. Los genogrupos GGI y GGII infectan a los

humanos, e incluyen 5 y 10 clusters genéticos, respectivamente. Los virus del GGIII se

han detectado en ganado bovino y porcino. Al genogrupo GGI pertenecen, por ejemplo,

los virus Norwalk, Southampton y Desert Shield, mientras que en el GGII se incluyen los

virus Hawaii, México, Lordsdale y Grimsby, entre otros. Los Calicivirus humanos no se

han conseguido propagar en cultivos celulares, lo que ha supuesto una importante

limitación para su estudio. Sin embargo, la expresión de la proteína de la cápside vírica

en células de insecto mediante el sistema de baculovirus recombinantes ha permitido

producir partículas pseudovíricas (virus-like particles o VLP) que se han utilizado como

fuente de antígeno para obtener sueros y anticuerpos monoclonales. El diagnóstico de

las infecciones gastrointestinales por Calicivirus humanos se realiza actualmente

mediante la detección del ácido nucleico por técnica de RT-PCR, utilizando distintos

pares de oligonucleótidos 10,21.


Aunque determinados enterovirus se asocian con frecuencia a brotes epidémicos,

dando lugar a un síndrome específico, los mismos serotipos pueden, en otras

ocasiones, ser responsables de infecciones esporádicas, con distintas manifestaciones

clínicas, incluso asintomáticas. Por otro lado, diferentes virus pueden producir el mismo

síndrome. Por estas razones, las manifestaciones clínicas no son una base satisfactoria

para el diagnóstico 29.

Los Enterovirus pertenecen a la familia Picornaviridae, que consta de cuatro género, a

su vez los Enterovitrus se clasifican en: Poliovirus tipos 1, 2, 3; Coxsackievirus A: 23

tipos, A1-A24 (el Coxsackie 23 es conocido como Echovirus 9); Coxsackievirus B: tipos

B1-B6; Echovirus (Enteric Cytopathogenic Human Orphan): 31 tipos; Enterovirus tipos

68-71: previamente clasificados como Echovirus o Coxsackievirus. Los Enterovirus

presentan una cápside de simetría icosaédrica, sin envoltura; tienen un tamaño

pequeño (20-30 nm), poseen ARN de cadena única y polaridad positiva. Su genoma se

divide en 4 regiones que codifican proteínas estructurales y 2 regiones no codificadoras,

reguladoras. Sus cuatro proteínas estructurales: VP1, VP2, VP3 y VP4 se sintetizan

como una poliproteína en la que el extremo 5´ está unido covalentemente a una

pequeña proteína VPg. Dentro de cada grupo, existe un número de serotipos definidos

por los epítopos de la cápside que se deben a modificaciones estructurales de la

superficie del virión. Los epítopos antigénicos, que definen a cada serotipo, estimulan la

formación de anticuerpos específicos que se comportan como neutralizantes de la

infección, ya que no permiten su unión al receptor celular. La evolución de los serotipos

sigue un proceso de deriva antigénica, en el que durante el proceso de copia del

genoma se producen errores que introducen mutaciones puntuales. Estas mutaciones

son acumulativas y modifican progresivamente la estructura de la cápside 29.

Debido al ciclo biológico de los Enterovirus, estos virus penetran por vía oral, donde

pueden ser detectados durante largos períodos, y se excretan de forma muy prolongada

en heces. Por este motivo, los aislamientos realizados en estas muestras clínicas son

muy difíciles de valorar en cuanto a su significación clínica, en el caso de los poliovirus,

puede tratarse de un virus vacunal si el paciente ha sido vacunado hace poco o ha

tenido contacto con alguna persona vacunada 30- 32.


Según Cinek et al. (2006), las infecciones por Enterovirus son comunes en la infancia,

causando numerosas infecciones asintomáticas, sin embargo esas infecciones

asintomáticas pueden ser asociadas con el desarrollo de enfermedades crónicas no

infecciosas(33).

La población de Nazareth ha sido considerada una de las mas pobres del Municipio

Mara, la misma se encuentra ubicada a orillas del Lago de Maracaibo del Estado Zulia,

cabe resaltar el estado de contaminación en que se encuentra el lago, debido a los

múltiples desechos que son vertidos cada día por las industrias y las poblaciones

cercanas, haciéndolo reservorio de diferentes agentes productores de diarreas, entre

ellos los virus. Las viviendas se caracterizan por ser de 2 tipos, una corresponde a las

construcciones en tierra construidas con diferentes materiales (bloques, zinc, cartón) y

la otra construida sobre el agua, denominadas palafitos, lo que implica un contacto

directo con aguas contaminadas. No poseen red de aguas negras, el agua de consumo

la obtienen de camiones cisternas o de una tubería común. Se observa falta de

asfaltado y cúmulos de basura. Todas estas características hacen a esta comunidad

propicia para la aparición, propagación y circulación de numerosos agentes virales ente

ellos Adenovirus, Calicivirus y Enterovirus, que pueden atentar contra la salud de los

niños menores de 5 años, por ser este grupo etario el de mayor susceptibilidad a

padecer enfermedades virales.

OBJETIVO GENERAL

Determinar la incidencia de Adenovirus, Calicivirus (Sapporo y Normovirus) y

Enterovirus en niños menores de 5 años en la población de Nazareth del Municipio

Mara del Estado Zulia.


OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar la presencia de Calicivus y Enterovirus mediante la técnica de: PT-

PCR en niños menores de 5 años de la población de Nazareth del Municipio Mara del

Estado Zulia.

Determinar la presencia de Adenovirus mediante la técnica de ELISA en

muestras de niños menores de 5 años de la población de Nazareth del Municipio Mara

del Estado Zulia.

Determinar los factores de riesgo en la aparición de Calicivirus, Adenovirus y

Enterovirus en niños menores de 5 años de la población de Nazareth del Municipio

Mara del Estado Zulia.

Correlacionar de la incidencia de Calicivirus, Adenovirus y Enterovirus con los

factores de riesgo en niños menores de 5 años de la población de Nazareth del

Municipio Mara del Estado Zulia.


MATERIALES Y METODOS


MATERIALES Y METODOS 1- Población: La población objeto de estudio estuvo constituida por 46 niños menores de 5 años de la

comunidad de Nazareth, del Municipio Mara del Estado Zulia; para el año 2005 la

comunidad estimada era de 276 niños menores de 5 años 34.

2- Recolección de la información: Se realizó una encuesta a cada representante, la cual incluyó: datos personales,

familiares, económicos y sociales, entre otros, se consideraron además datos

relacionados con la alimentación, el agua de consumo, los depósitos de basura, y otros

aspectos relacionados con la vivienda. (Anexo1)

3- Recolección de las Muestras: Se recolectaron muestras de heces, de los niños seleccionados previamente al azar; las

muestras fueron trasladadas en refrigeración mediante un medio de transporte

adecuado al laboratorio de Referencias Virológicas de la Facultad de Medicina de La

Universidad del Zulia.

4- Métodos: Para el diagnóstico de Adenovirus se realizó un Inmunoensayo Enzimático (ELISA),

cuya sensibilidad es de 95%

Para el diagnóstico de Calicivirus y Enterovirus, las muestras fueron sometidas a una

RT-PCR, para determinar los principales serotipos circulantes, que atacan a los niños

de esta comunidad.

4.1- Determinación de Adenovirus mediante la técnica de ELISA El ensayo IDEIATM Adenovirus es un enzimoinmunoenzayo enzimático cualitativo para

la detección de Adenovirus en heces humanas o en cultivos celulares infectados.


- Preparación de las muestras fecales para la determinación de Adenovirus Se añadió 1ml de diluyente de muestra a un recipiente, para preparar una suspensión

de 10% de la muestra fecal añadiendo aproximadamente 0,1 g de heces sólidas o

aproximadamente 100ul de heces líquidas. Mezclar y dejar reposar 10 minutos.

Las suspensiones fecales anteriormente preservadas en formalina deben diluirse, en

diluyente de muestras IDEIATM Adenovirus, para preparar una suspensión al 10% antes

de hacer el ensayo.

El ensayo IDEIATM Adenovirus utiliza un anticuerpo monoclonal en un inmunoensayo

enzimático tipo “sándwich” de fase sólida para detectar un epítopo hexon específicoal

género de Adenovirus. Los micropocillos separables se revisten de un anticuerpo

monoclonal específico para el Adenovirus. Se añade una suspensión fecal o líquido

puro de cultivo celular al micropocillo y se incuba simultáneamente con un anticuerpo

monoclonal específico para el Adenovirus conjugado con peroxidasa de rábano. El

antígeno de Adenovirus que existe en la muestra es capturado entre el anticuerpo en la

fase sólida y el anticuerpo conjugado con la enzima. Después de una incubación de 60

minutos a temperatura ambiente, se lavan los micropocillos con tampón de lavado

diluido para quitar el exceso de la muestra y cualquier anticuerpo libre que no esté

conjugado con enzima. Se añade un cromógeno a los pocillos y se incuba durante 10

minutos a temperatura ambiente.

- Procedimiento para la determinación de Adenovirus Se utilizaron suficientes pocillos para muestras y controles. Añadiéndole 2 gotas (100ul)

de cada muestra fecal diluida, control negativo o control positivo a los micropocillos

individuales.

Se añadió 2 gotas de conjugado a cada pocillo y se mezcló suavemente.


Se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora.

Se aspiró el contenido de los pocillos y se lavaron con solución tampón, mínimo 5

ciclos.

Se añadió 1 gota de sustrato parte A seguida de 1 gota de sustrato parte B y se mezcló.

Se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos.

La reacción del sustrato fué bloqueada añadiendo 1 gota de solución de parada a cada

pocillo. Se mezcló y se procedió a la lectura de los resultados.

- Resultados para la determinación de Adenovirus Control negativo: Visualmente este control presenta una ausencia de color y en la

determinación fotométrica su valor debe ser inferior a 0,150 unidades de absorbancia.

Cálculo del cut-off: Se calculó el valor del límite añadiendo 0.100 de una unidad de

absorbancia al valor del control negativo o al valor medio cuando se incluye más de un

valor negativo.

Control positivo: En este caso debe observarse un color azul y en la determinación

fotométrica su valor debe ser superior a 0,500 unidades de aborbancia.

Muestras

Determinación visual

Se debe considerar positiva, cualquier muestra que tenga un color azul de mayor

intensidad que el control positivo.

Determinación fotométrica

Cualquier muestra clínica que tenga un valor superior al cut-off. El valor debe ser

superior a 0.500 unidades de absorbancia.


4.2- Determinación de Calicivirus y Enterovirus - Muestras fecales para la determinación de Calivirus y Enterovirus:

Se realizó una suspensión de las muestras de heces aproximadamente al 10% con

agua libre de nucleasa se mezcló por vorterización y fue clarificada por centrifugación a

10,000 xg por 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante fue guardado a -20ºC hasta su

utilización.

- Extracción del RNA de Calicivirus y Enterovirus. El RNA viral fue extraído mediante la técnica en columna utilizando el kit Q1Aamp Viral

RNA (QIAGEN, Alemania):

Procedimiento en heces para la extracción del ARN de Calicivirus y Enterovirus:

1- Se agregó 560 ul del buffer AVL en un tubo de 1,5 ml.

2- Se vorterizaron y centrifugaron las muestras durante 10 segundo a 6000, se

agregaron 140ul de la muestra al tubo que contenía el buffer AVL y vorterizó

nuevamente 15 segundos.

3- Se Incubaron las muestras a temperatura ambiente (15- 25 ºC) durante 10

minutos.

4- Las muestras fueron centrifugadas brevemente a 6000rpm.

5- Se adicionó 560ul de etanol (96- 100%) y se vorterizó durante 15 segundos,

luego, se centrifugó a 6000rpm.

6- Se agregó 630 ul de la solución del paso 5 por las paredes del tubo, sin tocar la

columna en tubos de 2 ml, luego se centrifugaron a 8000 rpm durante 1, 30

minutos.

7- Repetir el paso 6 hasta pasar toda la muestra por la membrana.

8- Se trasladó cada columna a un tubo limpio de 2 ml y se agregó 500ul de buffer

AW1, se centrifugó a 8000 rpm, durante 1 minuto.


9- Se añadió a la membrana 500 ul de AW2 en un tubo nuevo y se centrifugó

durante 3 minutos a 13000 rpm, se descartó el contenido del tubo y se centrifugó

durante 1 minuto a 13000 rpm para eliminar cualquier resto de AW2

10- Se colocó la columna en un tubo nuevo eppendorf con tapa de 1,5ml,

cuidadosamente se abrió el tubo que contenía la columna y se agregaron 40ul

del buffer AVE a temperatura ambiente, se incubó a temperatura ambiente

durante 1 minuto, se centrifugó a 8000rpm por 1 minuto.

11- Se repite el paso 10.

12- La muestra extraída fue almacenada a -20ºC hasta el momento de su

procesamiento.

- Trascripción reversa para la obtención de ADN complementario para la determinación de Calicivirus y Enterovirus. Fué realizada con el kit de Promega ImProm- II Reverse Transcription System, según el

siguiente protocolo: se utilizó 5 ul de la muestra extraída previamente, la cual fue

mezclada con una solución de reacción constituida por: 0,01ul de Random primer 0,5

ug/ por reacción, 4ul de Improm II buffer 5X, 3ul de MgCl2, 1ul de dNTP, 0,5 ul de

Inhibidor de la RNAsa, 1ul de Improm II transcriptasa reversa, 5,49ul de agua libre de

nucleasa, para un volumen de reacción final de 20ul; luego se procedieron a incubar a

25ºC durante 5 minutos y se llevaron al termociclador para un ciclo de 1 hora a 42ºC,

uno de 5 minutos a 99ºC para finalizar con un enfriamiento inmediato.

- PCR para la determinación de Calicivirus. Se utilizó la mezcla de master mix de Promega, con una concentración final de 1X; a la

cual a 25 ul de mastermix, se le adicionaron, 1ul de los respectivos primer al 10 uM,

18ul de agua libre de nucleasa y 5ul de ADNc, para un total de volumen de reacción de

50 ul, luego fueron llevados al termociclador para llevarse a cabo los siguientes ciclos:

94ºC- 3 minutos

94ºC 30 segundos 35 ciclos




72ºC 7 minutos

4ºC infinito

Para la determinación de Calicivirus, se utilizaron los primers sugeridos por Jiang y

col35. Pimers Localizacion Polaridad Secuencia

P290 (23 mer) 4568–4590 Positiva 5´-GATTACTCCAAGTGGGACTCCAC-3´

P289 (22 mer) 4865–4886 Negativa 5´-TGACAATGTAATCATCACCATA- 3´

Como control interno se utilizó un patrón de peso molecular (durante la visualización)

por limitaciones en la adquisición del control respectivo.

- Electroforesis. El producto de la PCR, fué sometido a electroforesis en gel de agarosa al 2%, con

Bromuro de etidio (EtBr 0,5 ug/ml) por 1 hora, luego se visualizo bajo luz ultravioleta.

- PCR para la determinación de Enterovirus Se utilizo el protocolo descrito anteriormente para Calicivirus a excepción de los ciclos

utilizados para la amplificación, y los primers específicos, en este caso; los ciclos

fueron:

42 ºC- 45 minutos

95ºC- 3 minutos




72ºC 5 minutos

4ºC infinito


Se utilizaron los primers, descritos por Grow y cols 36

Virus Posicion Primer Producto Secuencia

CV B4 (5´NTR) Ent 1 540 5´-CGGTACCTTTGTACGCCTGT-3´

Polio 1 (5´NTR) Ent 2 5´-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3´

Como control positivo se utilizo la vacuna de polio con el virus atenuado, además de un

patrón de peso molecular Wizard (durante la visualización).

5- Consideraciones éticas: Previo a la recolección de la muestra el presente estudio fue aprobado por el

Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia. A todos los

representantes les fue solicitado el consentimiento por escrito para la inclusión en el

estudio según los lineamientos de la declaración de Helsinki (2000)(37) par estudio en

humanos. (Anexo 2)

6- Metodología estadística aplicada Se utilizó el test exacto de Fisher y la prueba del Chi2 (según el caso) para determinar la

significancia de los resultados obtenidos, utilizando como margen de eficacia el 95% y

alfa menor a 0,05, con el paquete estadístico SPSS 10.0.


RESULTADOS

RESULTADOS


Durante el mes de Febrero del año 2007, fueron recolectadas 46 muestras al azar de

niños de 0 a 5 años, de ambos sexos en la comunidad de Nazareth del Municipio Mara

del Estado Zulia, 21 muestras pertenecientes a niños lactantes (2 meses a 2 años), de

las cuales 13 pertenecían al sexo femenino (28,26%) y 8 al sexo masculino (17,39%);

por otro lado en los niños en edad preescolar(3 años a 5 años) fueron estudiadas 25

muestras, 15 (32,60%) representadas por el sexo femenino y 10 (21,73%) por el sexo

masculino (Tabla 1).

En la Tabla Nº 2 se muestran los diferentes factores (leche materna, disposición de

excretas, agua de consumo, vacunación, hacinamiento, presencia de animales

domésticos) que pudieran estar relacionados con la aparición de Adenovirus,

Calicivirus y Enterovirus.

Se observó ausencia de infección por Adenovirus y Calicivirus, en niños menores de 5

años de la comunidad de Nazareth.

En la tabla 3, se observa el número de casos positivos para Enterovirus relacionados

los casos con las variables sexo y edad; en los niños de 2 meses a 2 años, se muestra

un mayor numero de casos positivos para el sexo femenino, con 7 casos (31,81%), y el

sexo masculino 4 casos (18,18%); en relación al los niños de 3 años a 5 años,

igualmente se muestras que para el sexo femenino la incidencia fue mayor con 8

muestras positivas (36,36%) y en el sexo masculino 3 muestras positivas (13,63%). No

encontrándose diferencia significativa (p>0,05) en las variables estudiadas.

En la tabla 4 se muestran los factores involucrados en la aparición de Enterovirus.

Según los resultados obtenidos en la presente investigación, se observa que en niños

con esquema de vacunación completa, se encontraron 15/46 muestras positivas

(32,60%) y en aquellos niños con vacunación incompleta 7/46 fueron positivas

(15,21%). A los niños en lactancia materna para el momento de la recolección de las

muestras, 9 (19,46%) resultaron positivas para Enterovirus, mientras que a los niños


que no se les suministraba lactancia materna 13 (28,26%) arrojaron resultados positivos

para la determinación del antígeno viral.

Otros factores involucrados en la aparición de Enterovirus, se muestran en la tabla 4:

de 22 casos positivos, 17 (36,95%) viven en condiciones de hacinamiento, los 5

(10,89%) restantes no están en estas condiciones. En 12 (26,08%) de los casos, los

representantes refirieron, presencia de animales domestico en sus viviendas, los 10

restantes no poseen animales domésticos, encontrándose una diferencia significativa

(p<0,05). Al relacionar la disposición del agua de consumo con el número de muestras

positivas, se encontró que en 19 (41,30%) el agua es obtenida a partir de tanques y 3

(6,52%) provenía de camiones cisterna. Según el tipo de excretas utilizadas, se

observa que la letrina es la más frecuente con 14 (30,43%) casos positivos, seguido

por las heces lanzadas al agua 4 (8,69%); los pozos séptico 3 (6,52%) y por ultimo las

cloacas 1 (2,17%).

Tabla 1

Distribución por edad y sexo de los niños menores de 5 años de la comunidad de

Nazareth Municipio Mara Estado Zulia.

Edad n Sexo Frecuencia (%) 2 meses a 2 años 21 Femenino 13 (28,26) Masculino 8 (17,39)

3 años a 5 años 25 Femenino 15 (32,60) Masculino 10 (21,73)


Tabla 2

Distribución de los factores de riesgo relacionados con el estilo de vida de los niños

menores de 5 años de la comunidad de Nazareth

Factores de riesgo

n (%)

46 (100) Leche materna Si No

0 (0)

Si 46 (100) Leche formulada No

80 (0)

Completa 36 (78,26) Inmunización Incompleta 10 (21,74) Si

34 (73,91)

Hacinamiento No 12 (26,09)

Si

46 (100)

Presencia de vectores No 0 (0)

Si

32 (69,57)

Animales domésticos

No 14 (30,43) Cloacas

2 (4,35)

Disposición de excretas

Pozos sépticos Letrina Directo al agua Monte

9 (19,56) 26 (56,53) 6 (13,04) 3 (6,52)

Tanque 40 (86,97) Calle 6 (13,04)

Agua de consumo Depósitos de basura

Quemada 46 (100)


Tabla 3

Determinación de Enterovirus en niños menores de 5 años de la comunidad de

Nazareth Municipio Mara Estado Zulia según sexo y edad

Casos Edad n Sexo positivos (%) 2 meses a 2 años 21 Femenino 7 (15,21) Masculino 4 (8,51) 3 años a 5 años 51 Femenino 8 (17,39) Masculino 3 (6,52)

Total 46 22 (47,63)

No se observó diferencia significativa


Tabla 4

Distribución de casos positivos para Enterovirus según los factores involucrados en su

aparición

Casos Factores involucrados positivos (%) Vacunación

Completa Incompleta

15 (32,60) 7 (15,21)

Lactancia materna

Si No

9 (19,56) 13 (28,26)

Hacinamiento

Si No

17 (36,95) 5 (10,89)

Animales domésticos

*Si No

12 (26,08) 10 (21,73)

Agua de consumo

Tanque Camion cisterna

19 (41,30) 3 (6,52)

Tipo de excretas

Cloacas Pozos sépticos Letrinas Al agua

1 (2,17) 3 (6,52) 14 (6,52) 4 (8,69)

* Diferente significativamente (p<0,05) entre los que tenían animales domésticos con

respecto a los que no tenían


DISCUSION

DISCUSION

Las diarreas virales, representan una de las principales causas de muertes en niños,

especialmente en Asia, África y América Latina, en donde anualmente causan millones

de muertes, principalmente en niños menores de 5 años. Algunos de los principales


factores de riesgo son: consumo de agua contaminada, un inadecuado saneamiento

ambiental, y una nutrición inadecuada1-3.

Los serotipos 40 y 41 de Adenovirus, son comúnmente encontrados en las muestras de

heces de niños con gastroenteritis, ubicándose a nivel mundial en el 4 º lugar entre los

virus productores de diarreas, con una distribución global del 10 % 31,32.

Al comparar los resultados obtenidos en el presente estudio, en relación a la presencia

de Adenovirus con otras investigaciones realizadas con anterioridad, se observa

claramente la diferencia existente, que aunque en porcentajes relativamente bajos,

indican la presencia de Adenovirus, entre los que se encuentran países de

Latinoamerica, Europa y África en donde los niveles de incidencia se ubican entre

1,26% y 14% 17,18,38-40, hecho este que difiere de los resultados obtenidos en nuestro

estudio, en el que no se detectó la presencia del antígeno de Adenovirus.

El hecho de haber seleccionado las muestras al azar de niños con y sin sintomatología,

pudo contribuir a la ausencia de casos positivos para Adenovirus, ya que estudios

previos reportan la presencia del virus en muestras diarreicas. La diarrea y el vómito

son los síntomas predominantes en infecciones entéricas por Adenovirus, y sucede en

el 97% y 79% de los niños respectivamente, con una duración promedio de 9 a 12 días.

La diarrea persistente se puede encontrar en el 33% de los niños infectados por el

serotipo 40. La adquisición de anticuerpos en suero sucede a edades temprana de la

vida, a los 4-5 años el 50% de los niños han adquirido anticuerpos contra Adenovirus

entéricos, dado a su mecanismos de transmisión (vía oral- fecal y aguas estancadas) 21.

En la presente investigación no se tomó como parámetro de exclusión la

sintomatología, a fin de conocer la posible existencia de estos virus en pacientes

asintomáticos.

La presencia de Calicivirus, no fue detectada en este estudio, resultados que coinciden

con los reportados en el año 2004 en la maternidad Concepción Palacios en Venezuela


por Morales y cols.; sin embargo, otras investigaciones indican incidencia entre 2,3% y

14% 21, 41,42.

Se considera que la leche materna es importante en la alimentación del recién nacido y

el niño en edad preescolar. Existen estudios que señalan que la leche materna posee

oligosacáridos protectores contra la infección causada por virus43. La inmunidad

lactogénica, se define como la protección conferida por la continua presencia de

anticuerpos en el intestino y que dicha protección es proporcionada por la continua

secreción de inmunoglobulina A (IgA) en la leche materna, así como la inmunoglobulina

G (IgG) 4, La leche materna también contiene otros factores capaces de proveer

protección a nuevas infecciones, tales como: lactoferrina, lisozimas, complementos,

factores bifidus, peroxidasa, antitripsina e inerferon. La presencia de los inhibidores de

la tripsina presentes en la leche materna y en el intestino, podrían ser responsables, de

desencadenar la replicación viral, y su ausencia implicaría la inhibición de este proceso.

Además linfocitos y macrófagos podrían jugar papel importante en la proporción de la

inmunidad 44. En el presente estudio las muestras provenían de niños los cuales fueron

alimentados con leche materna.

Morrow y cols.(2004), determinó la asociación de el contenido de 2-linked fucosylated

oligosacarido en la leche materna y las diarreas producidas por Campilobacter y

Calicivirus, encontrando que los niños cuya leche materna contenía altos niveles de

lacto-N-difucohexaose (LDFH-I), y 2-linked fucosyloligosaccharide, la infección por

Calicivirus era baja, esto evidencia que los oligosacaridos presentes en la leche

materna son clínicamente relevantes para la protección del infante contra este agente45.

La alimentación con leche materna contribuye a la disminución de las diarreas

producidas por Calicivirus, bien sea por el paso de anticuerpos de la madre al hijo, o por

la relevancia de los oligosacaridos contenidos en la misma.

La ausencia de Adenovirus y Calicivirus en la presente investigación, pudo ser

consecuencia del desarrollo de tolerancia inmunitaria (proceso activo, dependiente del


reconocimiento antigénico), en la cual se produce una ausencia de respuesta

inmunitaria en condiciones normales 46. Múltiples factores pueden influir la respuesta

inmune tras el primer contacto con el antígeno para el desarrollo de la tolerancia

inmunológica 47.

Los factores genéticos influyen considerablemente en la tolerancia inmunologiaca,

sobre todo en lo que respecta a los niveles de IL-4 y síntesis de IgE. Otros factores

también importantes como la edad a la que se produce la primera exposición del

antígeno, naturaleza del mismo, dosis, frecuencia y vía de exposición 47.

En la presente investigación se obtuvo un 47,80% de positividad para Enterovirus,

hecho que concuerda con los resultados obtenidos por diferentes investigadores en

estudios realizados a nivel mundial, quienes indican una incidencia de 7,4% a 56% 33,48-

50, sin embargo en su mayoría. En América Latina, Enterovirus representa uno de los

principales géneros que afecta la población infantil, con una mayor incidencia en niños

menores de 5 años, produciendo diferentes patologías y en algunos casos cursando

asintomáticamente. En cualquier caso resulta de suma importancia determinar los

factores que pudieran estar relacionados con la presencia de Enterovirus.

En el presente estudio, se podría inferir que muchos de los casos positivos para

Enterovirus, podrían ser el resultado de la excreción de antígenos vacunales en las

heces, ya que estos son excretados durante varias semanas (4 a 6 semanas). La

vacuna (virus atenuado de la polio) en un inicio se dirige a los ganglios linfáticos y llega

luego a la corriente sanguínea, provocando así una doble respuesta anticuerpos locales

y circulantes en el 98-100% de los vacunados. El antígeno vacunal excretado en heces

interfiere con el poliovirus salvaje y crea barreras epidemiológicas, evitando su

diseminación. Por otra parte inmuniza a los contactos no vacunados, esta capacidad de

recirculación de las cepas atenuadas contribuye a que la cobertura de inmunización sea

mucho mayor que el número de individuos realmente vacunados 51.

La replicación intestinal del virus de la vacuna genera, con mucha frecuencia, mutantes

con capacidad de transmisión y neurovirulencia, la excreción de los poliovirus vacunales


en heces en los pacientes con deficiencias de células B puede prolongarse muchos

meses o años. Los programas de vacunación plantean el problema de la circulación de

los poliovirus vacunales, que pueden dificultar la erradicación global de la poliomielitis.

La aparición de casos por contacto con personas que excretan el virus o por exposición

ambiental, puede ser un peligro cuando se decida detener totalmente la vacunación

frente a la poliomielitis. Algunos brotes de poliomielitis por poliovirus derivados de la

vacuna ilustran el problema de la circulación de los virus, así como su capacidad de

transmisión y neurovirulencia. Entre 1988 y 1993 se produjeron en Egipto 32 casos de

poliomielitis por un poliovirus vacunal, no obstante, el problema de la circulación de los

poliovirus vacunales va más allá de su excreción por las heces de las personas

vacunadas, el contagio por exposición ambiental es teóricamente posible, ya que se

han aislado poliovirus del agua de los ríos 52.

Los factores anteriormente descritos, pueden estar influyendo en la aparición de

Enterovirus en la comunidad de Nazareth, bien sea que los antígenos detectados sean

vacunales o por contaminación del agua que bordea la zona; por lo que se hace

necesario realizar nuevas investigaciones que permitan determinar el o los géneros de

Enterovirus presentes, para tomar las medidas necesarias en el mejoramiento de la

calidad de vida de esta población.


CONCLUSIONES

CONCLUSIONES


- Ausencia de Adenovirus y Calicivirus en niños menores de 5 años de la comunidad de

Nazareth Municipio Mara Estado Zulia.

-La lactancia materna es un factor protector contra Calicivirus, tanto por sus

componentes como por el paso de anticuerpos de la madre al hijo.

-Se encontró un porcentaje de positividad de 47,63 para el diagnostico de Enterovirus.


RECOMENDACIONES

RECOMENDACIONES


- Realizar charlas dirigidas a explicar como prevenir la aparición, propagación y

recirculación de los agentes virales.

- Crear conciencia en la comunidad sobre la importancia de las normas higiénicas y el

saneamiento ambiental.

- Realizar investigaciones dirigidas a determinar el género de Enterovirus circulante en

la población de Nazareth.


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45- Morrow, A.; Ruiz, G.; Altaye, M.; X, Jiang.; Guerrero, M.; Meinzen, J.; Farkas, T.; Chaturvedi, P.; Pickering, L.; Newburg, D. 2004. The Journal of Pediatrics. 145 (3) pp 297-303. 46- Garavito, E.; Rojas, A.; Mendez, P.; Iglesias, A. 2002. Tolerancia inmunológica. Revista colombiana de reumatología. 9(2): pp124-129

47- Lorente, F.; Lanffond, E.; Davila, Moreno, E. 2001. Mecanismos de tolerancia imunológica. Prevención primaria de La alergia a alimentos. Alergol Inmunol Clin. 16(2);pp 58-75


48- Abbott, M.; Cloonan, M.; Montgomery, J.; Smith, D. 1984. Pathogens detected in the faeces of children with diarrhoea in a Sydney hospital. Arch. Virol. 141 (1) pp 26-8. www.pubmed.gov 49- Liste, M.; Natera, I.; Suarez, J.; Pujol, F.; Liprandi, F.; Ludert, J. 2000. Enteric virus infections and diarrhea in healthy and human immunodeficiency virus-infected children. J. Clin. Virol. 38 (8) pp2873-7. www.pubmed.gov

50- Phan, T.; Nguyen, T.; Yan, H.; Okitsu, S.; Ushijima, H. 2005 A novel RT-multiplex PCR for enteroviruses, hepatitis A and E viruses and influenza A virus among infants and children with diarrhea in Vietnam. Arch Virol. 150 (6) pp1175-85. www.pubmed.gov

51- Marcó, J. 2002, Poliomelitis: que tipo de vacunas debemos utilizar? Arch. Argent. Pediatr. 100(1): pp 3-8

52- Ruiz, J.; Hernandez, M. 2003. Vacunas antipoliomeliticas: VPI frente a VPO. Anales de pediatria. 58(5): pp12-17


ANEXOS


ANEXO1


DATOS PERSONALES:

Nombre________________________________ Edad:_______ Fecha de nac._________ Lugar de naciminento:______________

INMUNIZACIONES: BCG:__________ Triple:___________ Polio:__________ Sarampión:_________ ALIMENTACION: Leche materna:_______ Leche de formula:________ Hasta que edad tomó leche materna?_________________

VIVIENDA Rancho:

__________

____

Casa:

__________

_____

Vecindad:

__________

__

TENENCIA DE LA VIVIENDA

Propia:

__________

_____

Alquilada:

__________

_____

Cedida:

__________

_____

Compra a

crédito:

__________

HACINAMIENTO:

Total de ambiente:

__________ Ventilación:

B R M

Para dormir: ___________

Iluminación: B R M

No. de Camas: _________

Baño: ___________

y/o hamacas: __________

Cocina: _______ Leña:

________

Tipo de cocina: Kerosene

____ Gas- Planta _____

Patio: _____________

ANIMALES: Perros________

Gatos_________

Otros____________________

_

ABASTECIMIENTO DE AGUA. IntradomiciliarioBotellón

Pozo:

__________

Pública:

____________

__

Camión

Cisterna:

__________


ALMACENAMIENTO

DE AGUA PARA TOMAR.

Pipas: _________________ Otras: __________________ Especificar. Tapada: _______ Limpia: _______ Frecuencia del lavado: _____ Consumo de agua Directa filtrada o hervida ANTECEDENTES FAMILIARES Cáncer:_______ Cardiopatías:_______ Diabetes:______ Hipertensión:_______ Otras:____________________________

DISPOSICIÓN DE EXCRETAS:

Cloacas: _______________ Letrina: ________________ Pozo séptico: ____________ Se mantiene limpio: ________ Con que lo limpia: _________ suelo Red de aguas blancas:______ Red de aguas negras:_________

RECOLECCIÓN DE BASURA. Recipiente con tapa: ______________ Aseo Urbano: __________ Recipiente sin tapa: _______________ Frecuencia: _____________ Otros: _________________________ Campo raso: ________________ Especificar ANIMALES DOMESTICOS Insectos: ____________________ Roedores: ___________________ Animales domésticos: Perros: _____________ Gatos:_______________ Otros: _______________________________________

ESTADO NUTRICIONAL OBSERVABLE: ____________________ OBSERVACIONES:_


ANEXO 2


CONSENTIMIENTO PREVIA INFORMACION.

En el Laboratorio Regional de Referencias Virológicas de la Escuela de Bioanálisis de la Facultad de Medicina de La Universidad del Zulia ubicado en el Instituto de Investigaciones Clínicas, se esta realizando el proyecto de investigación titulado “Incidencia de Adenovirus y Calicivirus en niños menores de 5 años de la población de Nazareth del Municipio Mara del Estado Zulia” con el objeto de determinar la presencia de Adenovirus, Rotavirus, Calicivirus, y Hepatitis A en los niños menores de 5 años, utilizando las técnicas de ELISA y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), respectivamente, además de la realización de exámenes parasicológicos (directo y concentrado) y hematología completa. Yo, C.I:____________________ Nacionalidad:________________EstadoCivil:______________________Domiciliado en: ______________________________ siendo mayor de 18 años en USO pleno mis facultades mentales y sin que medie coacción ni violencia alguna en completo conocimiento de la naturaleza, forma, duración, propósito, inconveniente y riesgos relacionados con el estudio que mas abajo indico, en calidad de padre o representante legal del paciente___________________________, edad: _________, declaro mediante la presente: 1.- Haber sido informado de manera clara y sencilla, por parte del grupo de investigadores del Laboratorio Regional de Referencias Virológicas, coordinados por la Magíster Lic. Luciana Costa de todos los aspectos relacionados al proyecto de Investigación titulado “Incidencia de Adenovirus y Calicivirus en niños menores de 5 años de la población de Nazareth del Municipio Mara del Estado Zulia” y los exámenes parasicológicos y hematológicos. 2.- Tener conocimiento claro de que el objetivo fundamental del trabajo antes señalado es: “Determinar la incidencia de Enterovirus, Adenovirus y Calicivirus en niños menores de 5 años de la población de Nazareth del Municipio Mara del Estado Zulia” 3.- Haber sido informado de que mi participación en el proyecto consiste en facilitar de manera voluntaria al Laboratorio Regional de Referencias Virológicas una muestra de heces. 4.- Que la muestra de heces facilitar así como la información que suministre al equipo de investigadores será utilizada para determinar: la incidencia de Adenovirus, Rotavirus y Calicivirus. 5.- Que el equipo de investigadores me ha garantizado absoluta confidencialidad relacionada tanto a mi identidad como de cualquier información relativa a mi persona a la que tenga acceso por concepto de mi participación en el proyecto antes mencionado. 6.- Que estoy de acuerdo en el USO, para fines de investigación, de los resultados obtenidos en el presente estudio. 7.- Que mi participación en dicho estudio no implica riesgo ni inconveniente alguno para mi salud. 8.- Que la participación en la investigación no agravara ni causara efectos colaterales en la patología ya existente, si no por el contrario esta investigación ayudara a dilucidar mi diagnostico permitiendo una mejor terapéutica. Que cualquier pregunta o duda que yo tenga en relación con este estudio, me será respondida y aclarada oportunamente por parte del equipo de investigadores antes mencionado con quienes me puedo comunicar por el teléfono (Laboratorio Regional de


Referencia Virológica): 02617597273 con la Lic: Luciana Costa en el horario de 7:30 a.m. a 5:00 p.m. 9.- Que bajo ningún concepto se me ha ofrecido ni pretendo recibir algún beneficio de tipo económico producto de los hallazgos que puedan producirse en el referido proyecto de investigación. 10.- Que los resultados de las pruebas me serán entregados oportunamente DECLARACION DEL VOLUNTARIO: Luego de haber leído, comprendido y recibido las respuestas a mis preguntas con respecto a este formato de consentimiento y por cuanto mi participación en este estudio es totalmente voluntaria acuerdo: A.- Aceptar las condiciones estipuladas en el mismo y a la vez autorizar

__________________________ Firma

Castellanos Sanchez Maria Elena

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