Coordinación

Dra. Irene Madrigal Bajo

Edición Esther Fernández Galán

Casos Clínicos Interdisciplinarios Servicio de Bioquímica y

Genética Molecular

Centre deDiagnòsticBiomèdic

Secuenciación del exoma:

nueva herramienta

diagnóstica en

la enfermedad mitocondrial

12 Diciembre 2017

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Dr. Joan Anton Puig-Butillé

Especialista Sénior

Sección Genética Molecular Core Biologia Molecular

Laura Gort Mas

Especialista Sénior

Sección de Errores Congénitos del Metabolismo

Dra. Judith Garcia Villoria

Jefa de Sección

Sección de Errores Congénitos del Metabolismo

INTRODUCCIÓN DEFINICIÓN

Las enfermedades mitocondriales son un grupo heterogéneo de trastornos, caracterizados por defectos de

origen genético en el sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS), y que por tanto, tienen en común una

deficiencia en la producción de energía.

MANIFESTACIONES CLÍNICAS

Las mitocondrias están en todos los órganos y tejidos

y por tanto, las enfermedades mitocondriales tienen

manifestaciones multisistémicas muy variables. Se

verán afectados especialmente aquellos órganos con

necesidades energéticas elevadas como: cerebro,

musculo esquelético, corazón, hígado, riñón y retina.

La gran variabilidad en la presentación de la

enfermedad en los recién nacidos, juntamente con la

rápida evolución en algunos casos dificulta mucho su

diagnóstico.

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CASO CLÍNICO

Tercera hija de padres no consanguíneos

Debut neonatal con acidosis láctica, hipoglucemia, cardiomiopatía, hipotonía y dificultad respiratoria

Exitus al los 13 días de vida por insuficiencia respiratoria

HISTORIA CLÍNICA

ANTECEDENTES FAMILIARES

1ª Hija: Retraso psicomotor, exitus por sepsis a los 15 meses . Sin diagnóstico

2ª Hija: Acidosis láctica, hiperamonemia, cardiomiopatía hipertrófica e hipertensión pulmonar, exitus a los 8 días y diagnosticada post-mortem de glucogenosis

NORMAL ELEVADA

Relación Lactato/Piruvato

-Hiperamonemia -Hipoglucémia -Hipocetosis

Piruvato

Piruvato

ACETIL-CoA

Ciclo de Krebs

Cadena respiratoria

H2O

O2

ATP

ADP

CO2

PDH

OXALACETATO

Lactato Alanina

Cuerpos cetónicos

Ureagénesis

Gluconeogénesis

Glucosa

Cuerpos cetónicos

NH4

Piruvato

ACETIL-CoA

Piruvato

Ciclo de Krebs

Cadena respiratoria

H2O

O2

ATP

ADP

CO2

Cuerpos cetónicos

Hipoglucémia

Cetosis

PDH

OXALACETATO

Lactato

Glucosa

Alanina

Deficiencia de cadena respiratoria mitocondrial

- Hipoglucèmia - Cetosis

Deficiencia de Piruvato Deshidrogenasa

Determinación de ácido láctico y piruvato en sangre

La alteración más común es la elevación del ácido láctico aunque es muy poco específica y no siempre aparece

↑ Relación lactato/piruvato

↑ Cuerpos cetónicos

RESULTADOS DE LABORATORIO

ESTUDIO METABÓLICO INICIAL

↑Lactato elevado

ESTUDIOS BIOQUÍMICOS

• Plasma para valorar aminoácidos

• Orina para análisis de ácidos orgánicos

• Biopsia de músculo para estudio de la actividad de los complejos de la cadena respiratoria

mitocondrial.

AMINOÁCIDOS EN PLASMA

Perfil 46 aminoácidos. Diagnóstico de aminoacidopatias, más de 30 enfermedades.

RESULTADOS DE LABORATORIO

ÁCIDOS ORGÁNICOS EN ORINA

Estándar interno

3-Me-glutárico

3-Me-glutacónico cis y trans

Láctico

Paciente

Control

100 metabolitos en 43 minutos

Lactato + Alanina + 3-Metilglutárico + 3-Metilglutacónico:

ACIDURIA 3-METILGLUTACÓNICA

El estudio del perfil de ácidos orgánicos en orina se realiza mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC/MS). Este perfil puede estar alterado en más de 50 enfermedades, pero no todas son acidurias orgánicas. Los ácidos orgánicos son metabolitos clave en muchas vías metabólicas del metabolismo intermediario y por tanto su análisis nos aporta información sobre el estado de estas vías.

RESULTADOS DE LABORATORIO

Estándar interno Láctico 3-Me-glutárico

3-Me-glutacónico cis y trans

ACTIVIDAD CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL EN MÚSCULO

PACIENTE VALORES REFERÉNCIA (nmol/min/mg prot)

Complejo I + II 32 12-56

Complejo II 7 4-10

Complejo II + III 9 7-24

Complejo III 146 55-259

Complejo IV 208 59-170

Citrato sintasa 150 71-200

Se puede cuantificar mediante métodos espectrofotométricos que miden la actividad de los enzimas por separado y se puede estudiar en linfocitos o a partir de células en cultivo (fibroblastos). Estas pruebas pueden resultar muy útiles y guiar en el diagnóstico del paciente, pero muchas veces, como en este caso clínico, el resultado es normal, no se puede descartar una enfermedad mitocondrial y se debe continuar con estudios moleculares.

RESULTADOS DE LABORATORIO

ACIDURIAS 3-METILGLUTACÓNICAS

Grupo heterogeneo de alteraciones caracterizadas por la excreción de 3-metilglutacónico.

Primarias

Clínica Tipo Gen Alteración

Leucoencefalopatía, atrofia óptica, ataxia, espasticidad

I AUH

La aciduria 3-metilglutacónica de tipo I se produce por un error congénito en el catabolismo de la leucina (enzima implicado: 3-metilglutaconil-CoA hidratasa)

Cardiomiopatía , neutropenia II TAZ Proteína de membrana mitocondrial externa, importante para la fisión de las mitocondrias y la apoptosis

Atrofia óptica, ataxia, espasticidad

III OPA3 Proteína de membrana mitocondrial interna necesaria para el funcionamiento de complejos de la cadena respiratoria mitocondrial

Cardiomiopatía , encefalopatía, miopatía IV

TMEM70, ATP5E, ATP12

RYR1, SERAC1

Translocasa mitocondrial-sistema de chaperonas, entrada y salida de proteínas mitocondriales

Cardiomiopatía y ataxia V DNAJC19 Proteína de la membrana mitocondrial interna necesaria para el funcionamiento de complejos de la cadena respiratoria mitocondrial

Secundarias

Deficiencias de la beta-oxidación mitocondrial

Defectos de la cadena respiratoria mitocondrial

Smith-Lemli-Opitz (SLO)

Defectos del ciclo de la urea Otras acidurias orgánicas

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

Única posición Único gen Múltiples Genes

>5 Múltiples Genes

>100 Exoma

Genoma Completo

NGS NGS

NGS

NGS

NGS

(Exome Sequencing)

NGS

(Whole-Genome Secuencing)

qPCR/Sanger Sequencing

Sanger Sequencing

Alto

Bajo

Nú

mer

o d

e m

ues

tras

Screening de Variantes "Descubrimiento"

ESTUDIO MOLECULAR

Exoma Clínico: 4800 genes asociados a enfermedades

(12 Mb)

En este caso clínico el estudio molecular engloba más de 50 genes y se realiza mediante Next Generation Sequencing (NGS)

Decidir cuando se debe utilizar la PCR, secuenciación Sanger o estrategias de NGS, como la secuenciación del exoma o la secuenciación total del genoma, depende de una combinación de factores.

Sanger y la PCR son estrategias adecuadas cuando el numero de regiones diana es bajo (1-20), y los objetivos del estudio se limitan a la identificación de variantes conocidas. La secuenciación exómica y WGS son métodos excelentes para un análisis genético integral y el descubrimiento de variantes. La NGS dirigida ofrece una opción equilibrada entre estas dos estrategias.

Gráfico adaptado de Illumina Co.

RESULTADOS DE LABORATORIO

FRAGMENTACIÓN DNA (TAGMENTACIÓN)

PCR AMPLIFICACIÓN

gDNA

Muestra A (P1/N1)

P1 N1 P1 N2

Muestra B (P1/N2)

P1 N1

P1 N1

P1 N1

P1 N1 P1 N2

P1 N2

P1

N2

P1/N1 P1/N2

HIBRIDACIÓN

CAPTURA

SECUENCIACIÓN DE NUEVA GENERACIÓN (NGS)

GENERACIÓN DE LA LIBRERIA TRUSIGHT ONE (EXOMA CLÍNICO)

13 Metzker ML et al. Nature Reviews Genetics 11(1):31-46 (2010).

AMPLIFICACIÓN EN SUPERFICIE SÓLIDA

SECUENCIACIÓN POR SÍNTESIS TERMINACIÓN REVERSIBLE CÍCLICA (CRT)

Obtención de miles de copias del mismo fragmento localizadas en un área definida

La NGS requiere equipos de secuenciación masiva en paralelo más sofisticados que los utilizados para la secuenciación Sanger

SECUENCIACIÓN DE NUEVA GENERACIÓN (NGS)

FASTQ: lecturas NGS crudas + parámetros de

calidad

SAM/BAM: lecturas NGS alineadas al

genoma de referencia

VCF: variantes genómicas detectadas

.SAM: arxivo txt no comprimido

.BAM: arxivo txt no comprimido

ATTCG

T T

T C

C C

g.XX; C>T

BWA Bowtie2.

SAM tools

BCF tools

Genoma

referencia

Genoma

referencia

La validez de los resultados depende de los parámetros de calidad

La profundidad de Cobertura de un nucleótido es el número de lecturas independientes que contienen el nucleótido.

La gran cantidad de datos generados requiere utilizar herramientas informáticas muy potentes para su correcta interpretación.

FLUJO DE PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS DE DATOS

SECUENCIACIÓN DE NUEVA GENERACIÓN (NGS)

Acceso al Software Nextcloud del CORE de Biología Molecular para acceder a los datos

ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO

Se identifican 19314 variantes en 3969 genes diferentes

Filtramos por genes relacionados con enfermedades metabólicas hereditarias presentes en Trusight One (TSO)

473 genes

Quedan 1408 variantes en 366 genes diferentes

Ya que el paciente presenta ácido 3-metilglutacónico,

podemos analizar los genes que están relacionados con aciduria

3-metilglutacónica primaria

Quedan 8 variantes en 6 genes diferentes

Quedan 3 variantes en 3 genes diferentes: - Una de ellas en homocigosis y afecta a la posición canónica de Splicing - Las otras dos tienen baja probabilidad de ser patogénicas

Las variantes con alta frecuencia poblacional, se pueden clasificar como benignas

Nuestra variante candidata es la c.317-2A>G del gen TMEM70

,

Se trata de una mutación descrita en Human Gene Mutation Database y muy prevalente en otros pacientes afectos.

Gen : TMEM70

Genotip : c.317-2A>G; c.317-2A>G;

DIAGNÓSTICO DEL PACIENTE

Acidúria 3-metilglutacónica por mutacions en TMEM70

ATP12 ATP5E TMEM70

Proteínas implicadas en la biosíntesis y ensamblaje del complejo V de la cadena respiratoria mitocondrial -Cardiomiopatía - Retraso psicomotor -Microcefalia -Hepatomegalia - Dismorfia facial -Hipotonía - Pueden ser exitus durante las primeras semanas de vida - Disfunción de la cadena respiratoria mitocondrial

c.317-2A>G (mutación prevalente)

RESOLUCIÓN DEL CASO CLÍNICO

BN-PAGE y Western blot mostraron una deficiencia en el ensamblaje del complejo V

Complejo II

Complejo V

BN-PAGE Western Blot

Control 1 Paciente Control 2 Paciente Control 1

BN-PAGE Actividad

Complejo II

Complejo V

Control 2

Estudios realizados por el Dr. Frederic Tort, Dra. Núria Bujan y Dra. Xènia Ferrer Proyecto FIS 16/01048

ESTUDIOS FUNCIONALES EN MÚSCULO DEL PACIENTE

RESOLUCIÓN DEL CASO CLÍNICO

Paneles de genes – Trusight One (Illumina)

> 4800 genes

Análisis bioinformático

Diagnóstico definitivo

Mutaciones patogénicas en gen candidato

Tipificación de la familia

Análisis de los padres y los familiares por secuenciación Sanger

Nuevo abordaje diagnóstico de las EMH

Estratificación clínica y bioquímica

Panel de genes – Trusight One Secuenciación Sanger

Diagnóstico definitivo

Mutaciones descritas

Diagnóstico definitivo

Predicciones bases de datos

Funcionalidad

Mutaciones no descritas

Diagnóstico definitivo

No mutaciones

Secuenciación Exoma

Análisis de los padres y familiares por secuenciación Sanger

Tipificación de la familia

Nuevo abordaje diagnóstico de las EMH

1. Los estudios bioquímicos orientan el diagnóstico y los genes que se tienen que estudiar

2 NGS es la tecnología de elección para el diagnóstico molecular de las enfermedades mitocondriales (>250 genes implicados), ya que permiten el estudio de grandes zonas del genoma en un solo análisis

3 La utilización de NGS puede cambiar los protocolos de diagnóstico:

Solo obtener biopsias de tejidos en caso de que las mutaciones sean de significado incierto para realizar estudios funcionales.

4 NGS puede disminuir el tiempo de diagnóstico y evitar pruebas invasivas

5 En ciertos casos la tecnología NGS puede identificar variantes no claramente patogénicas. Se necesitarán estudios complementarios para llegar al diagnóstico definitivo

4 El filtrado de los datos bioinformáticos es clave para obtener un buen resultado

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CONCLUSIONES

Dra. Ribes Dr. Castellano Dr. Tort Dra. Ferrer Dra. Bujan

Patricia Alcalá Montserrat Fernández Ricard Isanta Sonia Moliner Laura Pacheco Sabine Richard Alba Roset