CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA...
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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyN-INTI
Materia de Articulación CEBI_E3 Cultivos Celulares
Docente: Erina Petrera
CEBI_E3_5: Métodos de cultivo de células animales
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EVOLUCIÓN DE UN CULTIVO
Semanas en cultivo
Cél
ulas
tota
les
(log
núm
ero
de c
élul
as)
1er subcultivo
Pasajes seriados
transformación
Línea celularCultivo primario
Línea celular Contínua
Envejecimiento y muerte
clonado
Cepa celular contínua
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TRANSFORMACION
Implica un cambio en el fenotipo que depende de la obtención de nuevo material genético.
Los siguientes cambios fenotípicos son:
1 Inmortalización 2 Control de crecimiento aberrante 3 Malignidad
Cuando se realiza artificialmente se denomina TRANSFECCION
La adquisición únicamente de una esperanza de vida infinita se denomina
INMORTALIZACION
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FINITA CONTINUA
POLIPLOIDÍA DIPLOIDE/EUPLOIDE HETEROPLOIDE/ANEUPLOIDETRANSFORMACIÓN NORMAL TRANSFORMADATUMORIGENICIDAD NO SÍ
DEPENDENCIA DE ANCLAJE SÍ NOINHIBICIÓN POR CONTACTO SÍ NO
LIMITACIÓN DE CRECIMIENTO POR DENSIDAD
SÍ NO
MANTENIMIENTO CÍCLICO POSIBILIDAD QUIESCENCIA
REQUERIMIENTOS DE SUERO ELEVADOS BAJOSEFICIENCIA DE CLONAJE BAJA ELEVADAMARCADORES ESPECÍFICOS DE
TEJIDOCROMOSOMALES, ENZIMÁTICOS, ANTIGENICOS
FUNCIONES ESPECIALIZADAS SE MANTIENEN SE SUELEN PERDERTASA DE CRECIMIENTO BAJA (24 – 96 H.) RÁPIDA (12- 24 H.)
RENDIMIENTO EN CULTIVO BAJO (MENOR A 105 CÉLS/CM2)
ALTO (MAYOR A 105 CÉLS/CM2)
CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS DE LOS CULTIVOS CELULARES
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CURVA DE CRECIMIENTO
ALIMENTACIÓN
SUBCULTIVO
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LÍNEA CELULAR CONTINUA O ESTABLE
Línea de células gliales humanas normales
Línea celular contínua de melanoma metastásico
humano
Freq
uenc
yFr
eque
ncy
Diploide: 23 x 2
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• Cultivos primarios. • Líneas diploides: 50-80 generaciones. • Líneas celulares continuas: heteroploides. Con crecimiento sin límite.
TIPOS DE CULTIVOS DE CÉLULAS
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SOPORTE ÁREA DE CRECIMIENTO
N0 DE CÉLS ADHERENTES X 106
VOLUMEN DE MEDIO (ML)
PLACA 90 MM 49 1 10
PLACA 60 MM 21 0,4 5
PLACA 35 MM 8 0,15 3
24 POCILLOS 2 0,04 1
12 POCILLOS 4,5 0,09 2
6 POCILLOS 9,6 0,2 3 - 4
FRASCO 25 CM2 25 0,5 5 - 10
FRASCO 75 CM2 75 1,5 15 - 30
FRASCO 162 CM2 162 3 30 - 50
TABLA DE GUÍA PARA LA SIEMBRA DE CÉLULAS
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Número de células/mL: (L1 + L2 + L3 + L4) x 10000 dilución
HEMOCITOMETRO
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BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel) CHO: Epitelio de ovario de hamster chino VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde africano HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino Etc., etc., etc.
LÍNEAS CELULARES CONTINUAS: ALGUNOS EJEMPLOS
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CRIOPRESERVACIÓN DE CULTIVOS
CONGELACIÓN
Alto número de células
Glicerol, DMSO, SFB
Congelación lenta 1 °C /min
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CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO
TEMPERATURA SUPERVIVENCIA ESTIMADA
Nitrógeno líquido - 196oC Varios años
Nitrógeno gaseoso - 150oC Varios años
Freezer - 80oC Hasta 2 años
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DESCONGELACIÓN
Descongelación rápida a 37°C
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Sigla Nombre u organismo Ciudad, país Nº de cultivos
ATCC American Type Culture Collection
Minassas, USA ≈800
DSMZ Human and Animal Cell Cultures
Braunschweig, Alemania
≈500
ECACC European Collection of Cell Cultures
Salisbury, Wiltshire, UK
≈1000
GEIMM Instituto Giannina Gaslini Genova, Italia ≈2300
COLECCIONES INTERNACIONALES MÁS IMPORTANTES
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EN LA ARGENTINA
• ABAC: Asociación Banco Argentino de Células
– Desde 1987 mantiene y/o administra varias decenas de líneas celulares en distintos centros de investigación.
– Provee células congeladas o en cultivo a cambio de un arancel razonable (U$s 250 + envío por cada botella con una monocapa celular de 75 cm2 de cultivo ).
– Brinda servicios relacionados con los cultivos celulares: detección de Mycoplasma, mantenimiento de células en depósito de nitrógeno líquido, dispone de manuales de la ATCC traducidos que ofrece a la venta, etc.
– www.abac.org.ar
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FUENTES DE CONTAMINACIÓN
1.- Ambiente: superficies, polvo, aerosoles, etc. 2.- Operador 3.- Células 4.- Medios y soluciones 5.- Botellas de cultivo, pipetas, etc. 6.- Estufas
CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES
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CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES CON BACTERIAS Y
HONGOS
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Tipos de contaminación: Bacterias
•Fácil de detectar a microscopía
•Formas motiles (cocos, bacilos..)
•Origina cambios en el pH del medio
•Origina turbidez en el medio
•Control: penicilina/estreptomicina, gentamicina
•No utilizar antibióticos, al menos durante algún tiempo, para su control
•Eliminar los cultivos contaminados
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Tipos de contaminación: Hongos
• Fácilmente observables a microscopía o incluso a simple vista.
• No provocan cambios inmediatos en el pH del medio
• Generalmente no son citotóxicos
• Esporas difíciles de detectar
• Blanquecinos, amarillentos o negros
• Control: Anfotericina B (Fungizone) o Nistatina
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Tipos de contaminación: Levaduras
• Fáciles de detectar a microscopía
• Partículas redondeadas u ovoides formando cadenas
• No causan cambios rápidos en el pH del medio
• El medio se vuelve turbio
• Pueden causar alcalinización del medio
• Olor típico a pan (¿Quién anda oliendo los cultivos?)
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Medio Microorganismo
Temperatura (°C)
Tiempo de observación
(días)
Agar sangre 5% de sangre fresca de conejo desfibrinada
Bacterias y levaduras 37 14
Caldo tioglicolato bacterias 37 14
Caldo tripticasa soja bacterias 37 14
Caldo infusión cerebro corazón
bacterias 37 14
Caldo Sabouraud hongos 37 21
Caldo YM Hongos y levaduras 37 21
Caldo nutritivo con 2% de extracto de levadura
bacterias 37 21
CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES CON BACTERIAS Y
HONGOS
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CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES CON
MYCOPLASMA
HOECHST 33258 o con DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol)
Tratamiento con tilosina y ciprofloxacina
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Virus de la inmunodeficiencia humana Virus de la leucemia L y T humanas Retrovirus endógenos Virus de la Hepatitis B o C Virus Herpes 6 humano Virus Epstein-Barr Hantavirus Virus de la Coriomeningitis linfocítica Hepatitis murina Virus Simianos Virus de la Diarrea Bovina Virus del papiloma Cytomegalovirus
CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES
CON VIRUS
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•Observación de ECP •Inoculación de animales •Hemoadsorción •Co-cultivo •PCR •Hibridización de ácidos nucleicos • Fluorescencia •Ultraestructura por ME
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE VIRUS EN CULTIVOS CELULARES
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Efecto citopático
Hemoadsorción
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CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES CON OTRAS CÉLULAS EUCARIOTAS
1) INTERESPECÍFICA: por manipulación de células de distintos orígenes
2) INTRAESPECÍFICA: por manipulación de células provenientes de distintos tejidos pero todas del mismo origen
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HeLa contamina fibroblastos humanos
Co-cultivo de queratinocitos y fibroblastos
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Contaminación cruzada
Precauciones
• Obtener líneas celulares de bancos autorizados o fuentes fiables
• No tener frascos abiertos con más de una línea celular al mismo tiempo.
• Manipular las líneas de crecimiento rápido en solitario y tras otros cultivos.
• No utilizar la misma pipeta o las mismas soluciones para líneas celulares diferentes • Manipular cada línea celular por separado
• No compartir medios de cultivo entre diferentes líneas
• Manipular las líneas celulares con mayor capacidad de proliferación las últimas
• Verificar periódicamente las propiedades del cultivo
• Usar un programa adecuado de almacenamiento
• No aceptar cultivos no seguros, poco caracterizados o sin referencia...
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Ya conocemos al enemigo…
¡¡SE PUEDE PREVENIR SI APRENDEMOS A TRABAJAR ADECUADAMENTE!!
Prevención: Manejo de la cabina
Antes de utilizar la cabina
▫ Prender lámpara UV 10 minutos
▫ Apagar la lámpara UV
▫ Encender la luz
▫ Desinfectar las superficies con el desinfectante apropiado
▫ Desinfectar y colocar el material necesario dentro de la cabina
▫ Dejar funcionar el ventilador durante 5-10 min. antes de empezar a trabar
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Prevención: Manejo de la cabina
Durante el uso
▫ Colocar el material en la parte posterior
▫ No bloquear rejillas de entrada y salida de aire
▫ Usar técnicas que reduzcan salpicaduras y aerosoles
▫ Las pipetas estériles solo deben tocar el interior de frascos. Ante la duda retirar el material de trabajo estéril.
▫ No realizar movimientos bruscos que rompan el flujo de aire
▫ Uso de mecheros controvertido
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Mantenimiento
▫ Diario –Limpiar la superficie de trabajo
▫ Mensual –Limpiar las superficies verticales
▫ Anual –Verificar intensidad de lámpara UV
▫ Descontaminación con formaldehído (gas)
Verificar funcionamiento filtro HEPA y ventilador
Al terminar el trabajo
▫ Mantener encendido el ventilador 5 min
▫ Sacar y descontaminar equipo y materiales
▫ Desinfectar superficies de la cabina
▫ Apagar ventilador y luz
▫ Encender lámpara UV
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Encuentre las diferencias!??
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PRECAUCIONES
1.- Controlar regularmente los cultivos celulares para la detección precoz de contaminación;
2.- No mantener los cultivos celulares en medios con antibióticos, de rutina;
3.- No intentar la decontaminación;
4.- Poner en cuarentena las líneas celulares nuevas hasta estar seguro de que no están contaminadas;
5.-No compartir medios o soluciones entre distintas líneas celulares y operadores.