Carazo, A; Alejandre, M.J.; Perales, S.; Vigil, A.; Castillo, M.; Linares, A.
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Carazo, A; Alejandre, M.J.; Perales, S.; Vigil, A.; Castillo, M.; Linares, A. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Granada INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 3-Hidroxi-3-Metil-Glutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa) (EC 1.1.1.34) es una enzima de la membrana del retículo endoplásmico que cataliza la conversión de HMG-CoA a mevalonato, reacción limitante de la velocidad de biosíntesis del colesterol, además juega un papel importante en la división celular mostrando una activación justo antes de la fase S (1). En cultivo de células la actividad HMG-CoA reductasa experimenta un gran incremento tras el cambio de medio (2). Este incremento de actividad se produce en cultivos no sincronizados por lo que es independiente del ciclo celular (3). En nuestro laboratorio hemos comprobado recientemente que tras el cambio de medio en cultivos de células de músculo liso (SMC) de aorta de pollo no sincronizados se produce un incremento de la concentración de mRNA de la HMG- CoA reductasa (4). Uno de los niveles de regulación de la concentración de mRNA de la HMG-CoA reductasa se produce a través del control de la vida media del mensajero. En el trabajo que presentamos hemos realizado experimentos paralelos en los que se han determinado la actividad enzimática y la concentración de mRNA de la HMG-CoA reductasa en cultivos de SMC en distintos tiempos tras el cambio de medio y durante un periodo de 45 h, con el objetivo de comprobar la estabilidad del mRNA y su relación con la actividad enzimática. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 TIE M PO (horas) AC T IV ID AD H M G -C oA REDUCTASA (pm oles·m inuto -1 ·m g proteina -1 ) Fig.3.- Oscilaciones de la actividad HMG-CoA reductasa medida a distintos tiempos tras el cambio de medio de cultivo SMC de aorta de pollo. Los resultados son media ± SEM de dos experimentos. MÉTODOS MÉTODOS Las células de músculo liso (SMC) de aorta de pollo se han aislado y cultivado como describe Carazo y col. (5). Se aisló RNA citoplasmático de cultivos SMC y se cuantificó el mRNA de la reductasa mediante RT-PCR competitivo utilizando Tth polimerasa (Gene Craft) (7). Los cebadores homólogos fueron diseñados a partir de un fragmento de cDNA de HMG-CoA reductasa de pollo clonado y secuenciado por Carazo y col. (4). La construcción del estándar competitivo fue realizada mediante cebadores compuestos según Carazo y col. (4). La actividad HMG-CoA reductasa se determinó según Goldstein y col. (8) con ligeras modificaciones. RESULTADOS RESULTADOS Se prepararon cultivos SMC con tres pases . A tiempo 0, con 60-70 % de confluencia, se cambió el medio de cultivo y en cada tiempo se recogieron las células para determinar mRNA de HMG-CoA reductasa y actividad enzimática. La figura 1 muestra el resultado de una técnica RT- PCR no radiactiva, muy sensible y reproducible para determinar las concentraciones, generalmente muy bajas, de mRNA de la HMG-CoA reductasa de cultivos de SMC. Esta técnica combina las ventajas de un RT a elevadas temperaturas y la cuantificación de DNA usando bromuro de etidio, los ensayos hechos en la zona lineal de la densitometría de la tinción del DNA dan un R 2 > 0.98. La figura 2 muestra el incremento en la concentración de mRNA tras el cambio de medio, siendo el número de moléculas de mRNA hasta 10 veces superior 2h después, bajando de forma lineal hasta valores basales a las 32 h, lo que parece indicar una tasa de degradación constante con una vida media de 12h. La figura 3 representa los valores de actividad HMG-CoA reductasa determinados en cultivos SMC de experimentos paralelos en los que podemos observar oscilaciones independientemente de la cantidad de mRNA. Ya que la estabilidad del mRNA de la HMG-CoA reductasa no puede explicar las oscilaciones en la actividad de esta enzima debemos pensar en una regulación a nivel post-transcripcional en estas células para cuya determinación serán necesarios nuevos estudios. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 [m R N A -reductasa] (m olc./ng R NA) T iem po (horas) Fig.2.- Incremento del mRNA de la HMG-CoA reductasa tras el cambio de medio en cultivos de SMC de aorta de pollo de tres pases y degradación hasta niveles basales. Los resultados son media ± SEM de dos experimentos. BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 1.- Quesney-Huneeus, V., Galick, H.A., Siperstein, M.D., Erickson, S.K., Spencer, T.A. and Nelson, J.A. 1983. The dual role of mevalonate in the cell cycle J.Biol.Chem.258.378-385. 2.- Brown, M.S., S.E. Dana and J.L. Goldstein. 1973. Regulation of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl coenzyme A reductase activity in human fibroblasts by lipoproteins Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 70: 2162-2166. 3.- Tavangar, K. and F.B. Kraemer. 1988. The regulation of hydroxymethylglutaryl-CoA reductase in cultured cells. Biochim. Biophys. Acta 970: 251-261. 4.- Carazo, A., Alejandre, M.J., Suarez, M.D. and Linares, A. 2000. Alterations in 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Reductase mRNA concentration in cultured chick aortic Smooth Muscle Cells. Lipids 35, 6,587-593 . 5.- Carazo, A., M.J., Alejandre, R., Díaz, A., Ríos, M. Castillo, and A. Linares. 1998. Changes in cultured Arterial Smooth Muscle Cells Isolated from Chicks upon Cholesterol Feeding. Lipids 33: 181-190 6.- Myers, T.W. and D.H. Geldfand. 1991. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochem. 30: 7661-7666. 7.- Goldstein, J.L., Basu, S.K. and Brown, M.S. 1983. Receptor mediated endocitosis of low-density-lipoprotein in cultured cells. Methods Enzymol 98, 241-260. y = -x + 6,6164 R 2 = 0,9876 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 5,6 5,8 6 6,2 6,4 6,6 6,8 log (N os) log (Nt/Ns) RT-PCR1.- 25 ng de RNA citoplásmico y 875 fg de patrón (aprox. 4∙10 6 moléculas). RT-PCR2.- 25 ng de RNA citoplásmico y 437,5 fg de patrón (aprox. 2∙10 6 moléculas). RT-PCR3.- 25 ng de RNA citoplásmico y 218,7 fg de patrón (aprox. 10 6 moléculas). RT-PCR4.- 25 ng de RNA citoplásmico y 109,3 fg de patrón (aprox. 5∙10 5 moléculas). Fig.1.- Electroforesis de los productos RT- PCR competitivo. Análisis de los datos. Nt: cantidad final de cDNA problema. Ns: cantidad final de DNA patrón. N 0 s: cantidad inicial de DNA patrón POSIBLE REGULACIÓN POST-TRANSCRIPCIONAL POSIBLE REGULACIÓN POST-TRANSCRIPCIONAL EN CÉLULAS DE MÚSCULO LISO DE AORTA DE EN CÉLULAS DE MÚSCULO LISO DE AORTA DE POLLO POLLO
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RT-PCR1. - 25 ng de RNA citoplásmico y 875 fg de patrón (aprox. 4∙10 6 moléculas). RT-PCR2. - 25 ng de RNA citoplásmico y 437,5 fg de patrón (aprox. 2∙10 6 moléculas). RT-PCR3. - 25 ng de RNA citoplásmico y 218,7 fg de patrón (aprox. 10 6 moléculas). - PowerPoint PPT Presentation
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Carazo, A; Alejandre, M.J.; Perales, S.; Vigil, A.; Castillo, M.; Linares, A.Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Granada
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
3-Hidroxi-3-Metil-Glutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa) (EC 1.1.1.34) es una enzima de la membrana del retículo endoplásmico que cataliza la conversión de HMG-CoA a mevalonato, reacción limitante de la velocidad de biosíntesis del colesterol, además juega un papel importante en la división celular mostrando una activación justo antes de la fase S (1). En cultivo de células la actividad HMG-CoA reductasa experimenta un gran incremento tras el cambio de medio (2). Este incremento de actividad se produce en cultivos no sincronizados por lo que es independiente del ciclo celular (3). En nuestro laboratorio hemos comprobado recientemente que tras el cambio de medio en cultivos de células de músculo liso (SMC) de aorta de pollo no sincronizados se produce un incremento de la concentración de mRNA de la HMG-CoA reductasa (4).
Uno de los niveles de regulación de la concentración de mRNA de la HMG-CoA reductasa se produce a través del control de la vida media del mensajero. En el trabajo que presentamos hemos realizado experimentos paralelos en los que se han determinado la actividad enzimática y la concentración de mRNA de la HMG-CoA reductasa en cultivos de SMC en distintos tiempos tras el cambio de medio y durante un periodo de 45 h, con el objetivo de comprobar la estabilidad del mRNA y su relación con la actividad enzimática.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 451000
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Fig.3.- Oscilaciones de la actividad HMG-CoA reductasa medida a distintos tiempos tras el cambio de medio de cultivo SMC de aorta de pollo. Los resultados son media ± SEM de dos experimentos.
MÉTODOS MÉTODOS
Las células de músculo liso (SMC) de aorta de pollo se han aislado y cultivado como describe Carazo y col. (5). Se aisló RNA citoplasmático de cultivos SMC y se cuantificó el mRNA de la reductasa mediante RT-PCR competitivo utilizando Tth polimerasa (Gene Craft) (7). Los cebadores homólogos fueron diseñados a partir de un fragmento de cDNA de HMG-CoA reductasa de pollo clonado y secuenciado por Carazo y col. (4). La construcción del estándar competitivo fue realizada mediante cebadores compuestos según Carazo y col. (4). La actividad HMG-CoA reductasa se determinó según Goldstein y col. (8) con ligeras modificaciones.
RESULTADOS RESULTADOS
Se prepararon cultivos SMC con tres pases . A tiempo 0, con 60-70 % de confluencia, se cambió el medio de cultivo y en cada tiempo se recogieron las células para determinar mRNA de HMG-CoA reductasa y actividad enzimática. La figura 1 muestra el resultado de una técnica RT-PCR no radiactiva, muy sensible y reproducible para determinar las concentraciones, generalmente muy bajas, de mRNA de la HMG-CoA reductasa de cultivos de SMC. Esta técnica combina las ventajas de un RT a elevadas temperaturas y la cuantificación de DNA usando bromuro de etidio, los ensayos hechos en la zona lineal de la densitometría de la tinción del DNA dan un R2 > 0.98. La figura 2 muestra el incremento en la concentración de mRNA tras el cambio de medio, siendo el número de moléculas de mRNA hasta 10 veces superior 2h después, bajando de forma lineal hasta valores basales a las 32 h, lo que parece indicar una tasa de degradación constante con una vida media de 12h. La figura 3 representa los valores de actividad HMG-CoA reductasa determinados en cultivos SMC de experimentos paralelos en los que podemos observar oscilaciones independientemente de la cantidad de mRNA. Ya que la estabilidad del mRNA de la HMG-CoA reductasa no puede explicar las oscilaciones en la actividad de esta enzima debemos pensar en una regulación a nivel post-transcripcional en estas células para cuya determinación serán necesarios nuevos estudios.
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Fig.2.- Incremento del mRNA de la HMG-CoA reductasa tras el cambio de medio en cultivos de SMC de aorta de pollo de tres pases y degradación hasta niveles basales. Los resultados son media ± SEM de dos experimentos.
BIBLIOGRAFÍABIBLIOGRAFÍA
1.- Quesney-Huneeus, V., Galick, H.A., Siperstein, M.D., Erickson, S.K., Spencer, T.A. and Nelson, J.A. 1983. The dual role of mevalonate in the cell cycle J.Biol.Chem.258.378-385.
2.- Brown, M.S., S.E. Dana and J.L. Goldstein. 1973. Regulation of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl coenzyme A reductase activity in human fibroblasts by lipoproteins Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 70: 2162-2166.
3.- Tavangar, K. and F.B. Kraemer. 1988. The regulation of hydroxymethylglutaryl-CoA reductase in cultured cells. Biochim. Biophys. Acta 970: 251-261.
4.- Carazo, A., Alejandre, M.J., Suarez, M.D. and Linares, A. 2000. Alterations in 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Reductase mRNA concentration in cultured chick aortic Smooth Muscle Cells. Lipids 35, 6,587-593 .
5.- Carazo, A., M.J., Alejandre, R., Díaz, A., Ríos, M. Castillo, and A. Linares. 1998. Changes in cultured Arterial Smooth Muscle Cells Isolated from Chicks upon Cholesterol Feeding. Lipids 33: 181-190
6.- Myers, T.W. and D.H. Geldfand. 1991. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochem. 30: 7661-7666.
7.- Goldstein, J.L., Basu, S.K. and Brown, M.S. 1983. Receptor mediated endocitosis of low-density-lipoprotein in cultured cells. Methods Enzymol 98, 241-260.
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RT-PCR1.- 25 ng de RNA citoplásmico y 875 fg de patrón (aprox. 4∙106 moléculas).
RT-PCR2.- 25 ng de RNA citoplásmico y 437,5 fg de patrón (aprox. 2∙106 moléculas).
RT-PCR3.- 25 ng de RNA citoplásmico y 218,7 fg de patrón (aprox. 106 moléculas).
RT-PCR4.- 25 ng de RNA citoplásmico y 109,3 fg de patrón (aprox. 5∙105 moléculas).
Fig.1.- Electroforesis de los productos RT-PCR competitivo. Análisis de los datos. Nt: cantidad final de cDNA problema. Ns: cantidad final de DNA patrón. N0s: cantidad inicial de DNA patrón
POSIBLE REGULACIÓN POST-TRANSCRIPCIONAL POSIBLE REGULACIÓN POST-TRANSCRIPCIONAL EN CÉLULAS DE MÚSCULO LISO DE AORTA DE EN CÉLULAS DE MÚSCULO LISO DE AORTA DE
POLLOPOLLO
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