ADN y RNA

caracterización y métodos de estudio

Separación por centrifugación

de equilibrio en gradiente de densidad de en CsCl

2 DNAs, uno lineal y otro circular, de igual composicion, tienen

distinta densidad??

Separación por centrifugación

de equilibrio en gradiente de densidad de en CsCl

δ

Concentración: 0.7% a 2%.

0.7% DNA grandes (5–10kb)

2% fragmentos pequeños (0.2–1kb).

Para muy pequenos = polyacrylamide gel

Buffer: TBE = Tris Borate EDTA o TAE tris Acetato

Electroforesis en gel de agarosa

Revelado

Estimación PM con uso de patrones

Superenrrollamiento (ADN circular)

Superenrrollamiento (ADN circular)

Lk (numero de enlace) = Tw + Wr

Tw = número de vueltas de la hélice

Wr = grado de retorcimiento o

superenrrollamiento

Lk define la topología del ADN.

Para acomodar del desenrrollamiento,

el DNA se retuerce -2 vueltas.

El superenrrollamiento (-) (o right-

handed) introduce una tensión que

favorece el desenrrollamiento

Lk solo cambia por ruptura de un

enlace fosfodiester (topoisomerasas)

Tw= 12 vueltas

Wr= 0 vueltas

Lk=12 vueltas

Tw= 14 vueltas

Wr= -2 vueltas

Lk=12 vueltas

desenrollo

Los agentes intercalantes (bromuro de etidio) desenrollan el ADN

introducen superenrrollamientos (+)

El grado de

superenrrollamiento

afecta la densidad

del ADN

expuestos diferentes

tiempos a

topoisomerasas

Ni la sedimentación con ClCs ni la electroforesis en gel de

agarosa puede discernir entre ADN superenrollado (+) o (-)

ADN genómico:

lineal (o circular)

gran tamaño

lenta renaturalizacion

menor estabilidad

ADN plasmídico:

generalmente

circular(superenrrollado)

pequeño tamaño

facil renaturalizacion

mayor estabilidad

Obtención de DNA plasmídico

ADN genómico:

adherido a la membrana

esencial para la

supervivencia y normal

funcionamiento

ADN plasmídico:

libre

resistencia a antibióticos,

producción de toxinas,

etc.

Obtención de DNA plasmídico

Lisis alcalina:

buffer + EDTA (quelante de Ca+2 y Mg+2)

0.2M NaOH + SDS 1% (pH 12.0-12.5)

Ruptura de membrana celular

Desnaturalización selectiva de DNA genómico y proteínas

Lisis de RNA

Neutralización con alta [sales]:

AcK 3M

Renaturalización y agregado insoluble de DNA genómico

Precipitación de complejos SDS-proteínas K-SDS-membrana y

RNA de alto peso molecular:

Los 3 mayores contaminantes macromoleculares co-precipitan y pueden ser removidos

por ultracentrifugación

Obtención de DNA plasmídico

EDTA

quelante de iones y desestabilizante de membrana

Concentrado del DNA plasmídico:

Precipitación con alcohol y bajas temperaturas

Eliminación de sales y electrolitos pequeños:

Lavado con etanol

Electroforesis en gel de agarosa

Detección con bromuro de etidio

Obtención de DNA plasmídico

Técnicas basadas en la renaturalización

del DNA

Southern blot (DNA)

Se usan enzimas de restricción para cortar el ADN en pequeños

fragmentos.

Se realiza una electroforesis en gel de agarosa para separar por tamaño.

Si algunos de los fragmentos quedaron grandes (> 15 kb), se trata ton HCl

para despurinizar y romperlo en pedazos mas chicos para que sea mas

eficiente la transferencia del gel a la membrana.

Se trata el gel con NaOH para desnaturalizar el dsADN, esto favorece la

unión a la membrana y destruye cualquier ARN residual

Southern blot (DNA)

Se coloca una hoja de nitrocelulosa o nylon sobre el gel, presionando. El ADN

con carga (-) se une a la membrana con carga (+)

Calentar la membrana a 80 °C por 2 horas o exponerla a UV para fijar el ADN.

Exponer la membrana a la sonda radiactiva o fluorescente para hibridizar.

Para asegurar la union específica de la sonda, se usa ADN de salmon para

bloquear la superficie de la membrana.

Se lava la sonda con buffer y se revela la membrana

Southern blot (DNA)

Northen blot (RNA)

Hibridización de ADN

Secuenciación: Método de Sanger (1975)

Secuenciación automática