CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA COLECCION NACIONAL DE CAMOTE (Ipomoea spp.) DEL BANCO NACIONAL DE...

CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA COLECCION NACIONAL DE CAMOTE (Ipomoea spp.)

DEL BANCO NACIONAL DE GERMOPLASMA DEL INIAP MEDIANTE MARCADORES MICROSATELITES

Realizado por: GABRIELA BASANTES LASSO

SANGOLQUI, Enero del 2012

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDAINGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA

Previa a la obtención de Título de:INGENIERA EN BIOTECNOLOGIA

CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN

2. OBJETIVOS

3. MATERIALES Y MÉTODOS

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5. CONCLUSIONES

6. RECOMENDACIONES

Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.

Fuente: Google

El Camote (Ipomoea batatas (L.) Lamarck)

Raiz reservante comestible. Importante elemento de la seguridad alimentaria. Séptimo cultivo de importancia mundial Ploidía: Hexaploide (2n = 6X = 90) Autoincompatible (alógama) o estéril. Emparentado con 13 especies silvestres.


Fuente: Google

Diversidad genética del camote cultivado

Centros primarios de diversidad (Zhang et al., 1998).

Centros secundarios de diversidad(Zhang et al., 1998).

Ecuador: Perdida de 81 Ha de camote. (MAGAP, 2008)

Recursos genéticos del género Ipomoea: 48 especies nativas (Jorgensen & León,1999).


Fuente: Google


Estudios moleculares en camote cultivado

(Buteler, 1999): Caracterización molecular de camote y especies silvestres de Ipomoea trífida con SSRs.

(Zhang, 2000): Análisis de la diversidad genética de variedades de camote de Latinoamérica con SSRs

(Chávez, 2001): Caracterización molecular de variedades de camote del la costa del Pacifico sur de Sudamérica con SSRs

(Veasey, 2008): Análisis de la diversidad de camote en comunidades de São Paulo, Brasil utilizando SSRs.

(Karuri, 2010): Análisis de la diversidad de genotipos de camote provenientes de Kenia con SSRs.

SSRs Altamente polimórficos

Usados en la caracterización de germoplasma de

camote

Son más polimórficosque RAPDs, RFLPs y AFLPs.

Marcadores moleculares microsatélites

(A)n (AT)n (GA)n (GAA)n


Fuente: Google

Fuente: Google

Estudios morfo-agronómicos

Materiales promisorios

Proyectos de mejoramiento genéticoConservación de materiales locales y tradicionalesMejoramiento de tecnologías de cultivo

Agricultores y consumidores

Caracterización molecular Diferencias genéticas entre el material en estudio Relación entre materiales y estructura de la población. Evaluar la utilidad del set de marcadores SSRS de camote. Identificación de duplicados

Importancia del proyecto


Fuente: Google

1. INTRODUCCIÓN

2. OBJETIVOS



5. CONCLUSIONES

6. RECOMENDACIONES

CONTENIDO

Fuente: Google


Caracterizar molecularmente la colección nacional de camote así como especies silvestres del Banco Nacional de Germoplasma del INIAP mediante marcadores SSRs.

1. Caracterizar molecularmente 59 accesiones de la colección de camote y 36 accesiones de especies silvestres del B.N.G del INIAP, utilizando 12 marcadores microsatélites . 2. Comparar las diferencias genéticas presentes a nivel de polimorfismo y heterocigosidad en los genotipos de camote y especies silvestres.3. Determinar duplicados en los genotipos de camote4. Determinar las relaciones genéticas existentes en el germoplasma en estudio.

OBJETIVOSGeneral

Específicos


Fuente: Google

CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN

2. OBJETIVOS



5. CONCLUSIONES

6. RECOMENDACIONESFuente: Google


Pruebas Mónoplex

METODOLOGIA DEL PROCESO

Material vegetal Extracción de ADN Fresco

Extracción de ADN en seco

Cuantificación de ADN

Amplificación de SSRs

Pruebas PCR

Selección de 11 loci SSRs

PCR con el Método M13-

tailing

Pruebas Dúplex

GENOTIPAJE en el LI-COR Diseño Estadístico


Fuente: Google

Especies cultivadas (59)

Provincia del AzuayProvincia de NapoProvincia de M. Santiago

E.E Portoviejo

Provincia de Orellana E.E. C. Amazonia

Provincia de Manabí

CIPE.E. Sta Catalina (DENAREF)

Especies silvestres (30) S. sexual del B.G. I

(desinfección y germinación)E.E. Sta Catalina (DENAREF)

MATERIAL VEGETAL


Autor Locus Motif SSRs Tamaño (pb)

Tm *(oC)

Huamani (2009)

IbE 27 (GAC)5GA 209 57

Huamani (2009)

IbE 14(GA)9G 200

57

Huamani (2009)

IbE 5 (TA)5TC(TA)3TT (TA)5CA(TA)2T(TA)10

220 60

Huamani (2009) IbY 46 (ATC)5AT 144 55

Hu (2004) IBSSR 27 (TA)6(CA)16(TA)3 180 60

Hu (2004) IBSSR 04 (GA)11 216 60

MICROSATÉLITES


Autor Locus Motif SSRs Tamaño (pb)

Tm * (oC)

Hu (2004) IBSSR 10

(AG)8A2 (AG)7 217 60

Hu (2004) IBSSR 19

(CA)25 181 65

Huamani (2009) IbN34 (CT)8 308 55

Huamani (2009) IbN18 (CT)11 195 59

Huamani (2009) IbN37 (TA)7T 184 55

Hu (2004) IBSSR25 (GT)15T2(TG)9 130 60

MICROSATÉLITES


M-13 tailingSecuencia de nucleótidos

(5´-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3`)

Extremo 5’ del primer Fw SSRs

PCR: Cola de nucleótidos + M13 Primer (700-800nm)

Productos amplificados SSR marcados

Fotodiodos LICOR detectan la IR

11 loci SSRs

METODOLOGIA M13-Tailing

Imágenes del gelS. SAGA

Genotipaje Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.

Matriz Genotípica de datos

Modalidades de análisis

Cultivadas vs silvestresCultivadas vs cultivadas

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

ANÁLISIS

8 LOCI SSRS

Diversidad genética Estructura genética Análisis de duplicados


PROGRAMAS ESTADISTICOS

1. INTRODUCCIÓN

2. OBJETIVOS



5. CONCLUSIONES

6. RECOMENDACIONES

CONTENIDO


Fuente: Google

Cuantificación de ADN en gel de agarosa al 1% utilizando muestra fresca

Cuantificación de ADN en gel de agarosa al 1% utilizando muestra seca

EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN

Altas concentraciones de ADN (rendimiento 8 ug).

Optimización de tiempo y costos en el laboratorio.

Menores concentraciones de ADN (rendimiento 5.5 ug). Mejor calidad de ADN (menor incidencia de impurezas).


GENOTIPAJE DEL CAMOTE Y ESPECIES SILVESTRES

Alelos de camote obtenidos con el locus IbE14 en el LI-COR

Alelos de silvestres obtenidos con el locus IbE14 en el LI-COR

En la mayoría de genotipos existió una pérdida de genotipos por patrones de herencia tetrasómica del camote (Buteler, 1999).

Resultados demuestran que existe un bajo porcentaje de SSRs capaces de amplificar en especies hexaploides (Buteler, 1999; Hu, 2004).


Locus

No

alelos HE HO PIC

IbE 05 7 0,6485 0,6207 0,6138

IBSSR 10 6 0,7853 0,6154 0,7584

IBSSR 27 7 0,6870 0,3158 0,6302

IBSSR 04 6 0,5995 0,3729 0,5372

IbN 18 8 0,7494 0,4310 0,7114

IbN 34 3 0,4999 0,0339 0,4044

IbE 14 17 0,9130 0,6102 0,9063

IbE 27 6 0,6823 0,1356 0,6246

Promedio 7,5 0,6956 0,3919 0,6483

Número de alelos

DIVERSIDAD GENÉTICA DE CAMOTE

HE: Ecuador : Centro secundario de diversidad genética.

HO: Reproducción alógama del camote.

PIC: IbE 14: Marcador mas informativoGabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.

Valor más cercano a otros estudios (Veasey et al., 2008; Roullier et al., 2011)

Valor mas lejano: (Karuri et al., 2010; Yánez, 2002; Hu et al., 2004; Buteler et al., 1999).

Locus

No

Alelos Ho PIC

IbE 05 5 0,2143 0,6457

IBSSR 10 4 0,1250 0,6357

IBSSR 27 1 0,0000 0,0000

IBSSR 04 1 0,0000 0,0000

IbN 18 2 0,1333 0,1167

IbN 34 7 0,0000 0,7935

IbE 14 8 0,2667 0,7493

IbE 27 4 0,0714 0,5101

Promedio 4 0,1013 0,4314

DIVERSIDAD GENÉTICA DE ESPECIES SILVESTRES

Ho: Mayor parte de materiales son de naturaleza autógama

Alto numero de alelos y PIC: Aptos para estudios de diversidad genética

Bajo numero de alelos y PIC: Utilizar SSRs en estudios de especies de las cuales fueron originalmente aislados (Buteler et al, 1999).


ESTRUCTURA GENÉTICA

No existió formación de grupos específicos de acuerdo a las zonas geográficas de origen. La pérdida de correlación geográfica entre genotipos de camote ha sido también reportado por otros autores (Karuri et al., 2010; Veasey et al., 2008).

UPGMA


ANÁLISIS DE COORDENADAS

PRINCIPALES EN 2D

Grupo cultivado “G1” mayor variabilidad genética Grupo cultivado “G2” base genética menor al grupo “G1”. Compartimiento de bandas (Jarvis & Hodgkin, 1999). Ratificación de resultados mediante asignación genética.



Asignación Genética Cuando K=3

Asignación genética de poblaciones

Status “G2” “G1” “S” Híbridos Total

Cultivado

“G2”

44 44

Cultivado

“G1”

15 15

Silvestre “S” 24 6 30

Total 44 15 24 6 89

Asignación Genética

Flujo genético



Lugares en donde existe una mayor concurrencia de cultivos domesticados con sus parientes silvestres (Lapeña, 2005).

FLUJO GENÉTICO ENTRE “G1” Y “S”

Factores que aseguran la hibridación (Papa et al,2005): Factores humanos-ambientales Factores biológicos


AMOVA

Origen de la

variación genética

gl Suma de

cuadrados

Componentes

de la varianza

% de la variación

genética

Entre poblaciones 2 118,679 1,967 26% *

Dentro de cada

población 86 484,010 5,628 74% *

Mutaciones Sistema de reproducción del camote Intercambio de materiales entre agricultores Influencia de los agricultores por mantener sus variedades dentro de las regiones.



Otros estudios también han mostrado una alta diversidad dentro de las poblaciones (Zhang et al., 2000, 2004), Veasey et al., (2008), Roullier et al., (2011))

DISTANCIA GENÉTICA DE NEI

Status 1 Status 2 Distancia genética (D)

G1 S 0.042

G1 G2 0.20

G2 S 0.081



“G1” y “S” (Flujo genético): misma sincronización en los tiempos de florecimiento y compatibilidad sexual y simpatría existente entre estos dos grupos (Jarvis & Hodgkin, 1999).

“G2” - “S” (Ausencia de flujo genético): Diferencias en la época de cruzamiento a pesar de estar en la misma zona.

Alelos compartidos entre camote y especies silvestres

Status de la Población Cultivado 1

(G1)

Cultivado 2

(G2)

Silvestre

(S)Número total de Alelos en la Población Freq. >= 5%

31 49 48

No alelos privados 2 8 14

Alelos privados entre camote y especies silvestres

Poblaciones Numero de alelos compartidos

G1- G2- S 3

G2 –S 12

G1-S 8 alelos

DIVERSIDAD GENÉTICA


Materiales cultivados con un 99% de similitud genética

MTCG 007 Guayaco (código 39) = MTCG 008 Guayaco (código 40)

ECU 17597 (código 54 ) = ECU 17598 (código 55)

IDENTIDAD GENETICA EN MATERIALES CULTIVADOS DE

CAMOTE


ESTRUCTURA GENÉTICAANALISIS CON 11 LOCI SSRs


1. INTRODUCCIÓN

2. OBJETIVOS



5. CONCLUSIONES

6. RECOMENDACIONES

CONTENIDO

Fuente: Google


CONCLUSIONES Con el protocolo utilizado para muestras frescas, se obtuvo altas concentraciones de ADN mientras que con la metodología empleada para muestras secas se obtuvo menores concentraciones. Este ultimo no afectó a nuestro estudio, ya que los marcadores SSRs no requieren de altas concentraciones de ADN.

Se aportó al conocimiento de los beneficios de otra técnica basada en muestra seca que pueda ser utilizada en muestreos in situ.

La caracterización de materiales de camote con ocho loci SSRs, determinó niveles elevados de riqueza alélica (7.5 alelos /locus) y de PIC (0.648), demostrando una alta variabilidad genética y PIC en los materiales analizados.


CONCLUSIONES

El análisis de especies silvestres con 8 loci SSRs detectó una baja riqueza alélica (4 alelos /locus) y PIC (0.4314), debido a que estos loci no fueron originalmente aislados del genoma de especies silvestres.

El locus IbE14 en camote (17 alelos) y los loci IbE14 e IbN34 (8 alelos y 7 alelos respectivamente) en el caso de materiales silvestres proporcionaron el mayor número de alelos.

El valor de Ho para materiales cultivados fue de 0.3919, reflejando su naturaleza alógama.


Los análisis estadísticos permitieron distinguir 3 grupos genéticos, 2 grupos cultivados de camote (“G1” y “G2”) y 1 grupo silvestre (“S”).

Se confirmó la existencia de flujo genético entre la población “G1” y silvestre “S”, posiblemente al intercambio genético producido en los lotes de siembra de estos cultivos.

Los grupos “G1” y “G2” se diferencia por el tipo de zona geografica a la que pertenecen sus materiales.

Se encontraron 2 parejas de materiales con identidad genética.

CONCLUSIONES


1. INTRODUCCIÓN2. OBJETIVOS3. MATERIALES Y MÉTODOS4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN5. CONCLUSIONES6. RECOMENDACIONES

CONTENIDO

Fuente: Google


El presente estudio constituye el primer reporte de caracterización molecular del germoplasma de camote y especies silvestres en el INIAP, contribuyéndose al conocimiento de una parte de la diversidad genética de estas especies en un centro de origen y diversificación, como es el Ecuador.

Al final de este estudio se espera el establecimiento de un set representativo de materiales silvestres para trabajos de uso y mejoramiento de germoplasma de camote beneficiando al sector productivo agrícola.

RECOMENDACIONES


Proyecto “Innovaciones para emprendimiento de yuca y camote en la seguridad, soberanía alimentaria y oportunidades de mercado en el Ecuador”(SENESCYT Código 2407).

Departamento Nacional de Biotecnología . Departamento Nacional de Recursos Fitogenéticos

(DENAREF). ESPE- Departamento de Ciencias de la Vida-

Ingeniería en Biotecnología.

AGRADECIMIENTOS


CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA COLECCION NACIONAL DE CAMOTE (Ipomoea spp.) DEL BANCO NACIONAL DE...

Documents

Transcript of CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA COLECCION NACIONAL DE CAMOTE (Ipomoea spp.) DEL BANCO NACIONAL DE...