Caracterización bioquimica y molecular de bacterias ...

Caracterización bioquímica y molecular de bacterias fijadoras de

nitrógeno aisladas de caña de azúcar .

Jenniffer Roa Lozano

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Palmira, Colombia

2017

Caracterización bioquímica y molecular de bacterias fijadoras de

nitrógeno aisladas de caña de azúcar

Jenniffer Roa Lozano

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de:

Magister en Ciencias Biológicas

Director (a):

Ph.D., Fitopatología. Carlos Ariel Ángel Calle

Codirector (a):

Ph.D., Biotecnología. Karina López López

Línea de Investigación:

Biotecnología Vegetal

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Palmira, Colombia

2017

(Dedicatoria )

A mi hermanito, quien es y será mi energía

y mi motivación.

A mis padres, por su paciencia y

dedicación.

A mis amigos, por su comprensión.

A todos mil gracias, por sus expresiones

de amor.

Agradecimientos

A todo el personal directivo, técnico, administrativo y de apoyo del Centro de Investigación

de la Caña de Azúcar de Colombia – CENICAÑA, y a los ingenios y cultivadores de caña

por su apoyo para investigar sobre estos temas.

Agradezco enormemente a Marcela Cadavid Ordóñez (Bióloga M.Sc.), coordinadora en su

momento del laboratorio de Fitopatología en Cenicaña, por la gran oportunidad de

permitirme trabajar con bacterias fijadoras de nitrógeno y de unirme a su grupo de trabajo.

A los Dres. Fernando Muñoz y Javier A. Carbonell, del Programa de Agronomía de

Cenicaña, por su apoyo y respaldo para poder realizar esta investigación, y al práctico

agrícola Gustavo A. Segura por su colaboración. De igual forma a COLCIENCIAS, al incluir

este proyecto dentro del sistema de beneficios tributarios otorgados a Cenicaña.

Mi inmenso agradecimiento a la Química Melissa Andrea Espinosa, del Programa de

Procesos de Fábrica de Cenicaña, no solo por brindarme sus consejos sobre temas

cromatográficos, sino por sus inmensos consejos de vida; y mi más sincero y especial

agradecimiento a mi amiga y colega Carolina Cardozo B., Ing. Agrónoma Fitopatóloga, por

escucharme, entenderme y ser la persona que se necesita cuanto una más la necesita.

Además, agradezco al Ing. Agrónomo Estadístico Héctor Alberto Chica, por todas su

colaboración y asesoría en este proceso. A los profesionales y estudiantes del Área de

Fitopatología del Programa de Variedades y a los profesionales del Programa de

Agronomía de Cenicaña. Al personal del laboratorio de estudios ambientales del CIAT por

su colaboración en las etapas preliminares de esta investigación.

Y finalmente, agradezco enormemente a mis directores de tesis Dres. Carlos Ariel Ángel

Calle, Ing. Agrónomo Ph.D. Fitopatólogo y Karina López López, Ph.D. Biotecnologa, por

guiarme, confiar en mi intuición y motivarme a hacer de esta investigación una actividad

con todo el rigor.

Resumen y Abstract IX

Resumen

La caña de azúcar es un cultivo importante en Colombia, intensivamente cultivado en el

valle del río Cauca en cerca de 237.070 hectáreas. Para alcanzar altas productividades,

se aplican altas y algunos casos excesivas dosis de fertilizantes nitrogenados,

incrementando los costos de producción y agudizando los efectos ambientales. En la

búsqueda de estrategias para reducir las aplicaciones de N dentro de un manejo integrado

del cultivo, el uso de bacterias fijadoras de N está siendo explorado. Así entonces, el

objetivo de este estudio fue aislar y caracterizar bacterias nativas fijadoras de N y

promotoras de crecimiento pertenecientes a los géneros Azospirillum, Azotobacter y

Gluconoacetobater en cuatro variedades comerciales sembradas en el valle del río Cauca

(CC85-92, CC84-75, CC93-4418 y CC01-1940), en 108 lotes o suertes seleccionados para

este estudio. Las muestras fueron compuestas a partir de 20 plantas (tallos, hojas, raíces

y suelo rizosférico) por sitio, seleccionadas aleatoriamente, para un total de 2.160 plantas,

las cuales se transportaron y procesaron en el Laboratorio de Fitopatología de CENICAÑA.

De los extractos vegetales se inocularon los medios de cultivo selectivos LGI-P, Ashby y

NFB para realizar el aislamiento y caracterización para cada género. Se obtuvieron 111

aislamientos caracterizados morfológica y bioquímicamente agrupados con base en

pruebas por triplicado para α and β-proteobacterias, incluyendo

aerobiosis/microaerofílicos, motilidad, tinción de Gram, metabolismo oxidativo-

fermentativo y metabolismo de diferentes carbohidratos y sales orgánicas. De los 111

aislamientos, se identificaron molecularmente 15 aislamientos bacterianos del género

Azospirillum spp., 32 aislamientos del género Gluconacetobacter spp. y 20 aislamientos

del género Azotobacter spp. mediante secuenciación del gen 16S del ADN ribosomal. La

cuantificación de ácido 3-indol acético y reducción de acetileno mostró diferencias

significativas en producción de fitohormonas y en la eficiencia de la fijación de nitrógeno,

obteniendo cinco cepas bacterianas (Números 2, 14, 16, 21 y 24) que presentaron una

alta capacidad fijadora de nitrógeno y producción de compuestos indólicos con respecto a

las cepas de referencia de Azotobacter chroococcum NCBIM 8002, Azospirillum brasilense

X Caracterización bioquímica y molecular de bacterias fijadoras de nitrógeno aisladas de caña de azúcar

NCBIM 11860, Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985. La secuenciación y

alineamiento del gen nifH para muestras contrastantes de algunos de estos aislamientos

no presentó variantes genéticas entre los aislamientos con mayor fijación biológica de

nitrógeno, indicando una alta conservación de este gen. Se identificaron 14 aislamientos

de los tres géneros como candidatos promisorios para trabajos y estudios futuros.

Palabras clave: (Caña de azúcar, Fijación de nitróg eno, promoción de crecimiento

en plantas, bacteria, pruebas bioquímicas, ácido in dol acético (IAA), gen nifH)

Contenido XI

Abstract

Sugarcane is an important crop in Colombia, intensively planted in nearly 237,070 hectares

along the Cauca’s river valley. To reach profitable yields, high and in some cases excessive

nitrogen (N) fertilizers are applied, increasing production costs and risks for environmental

and water contamination. Looking for strategies to reduce N applications within a

sustainable and integrated crop management, the use of N-fixing bacteria is being

explored. The objective of this study is to isolate and characterize native cultures of three

recognized N-fixing bacteria and plant growth promoter genera such as Azospirillum,

Azotobacter, and Gluconoacetobater, associated to CC 85-92, CC 84-75, CC 93-4418, and

CC 01-1940 varieties, which are widely planted in this region. To cover most environments

along the valley, 108 fields were selected to take composed samples from roots, stems,

leaves, and rhizospheric soil from 20 plants randomly selected per field, for a total of 2,160

plants in this study. Samples were processed at CENICAÑA’s Plant Pathology Lab, plating

on selective culture media LGI-P, Ashby, and NFB, among others for each bacteria genus.

111 isolates were morphologically and biochemically characterized based on triplicated

tests for α and β-proteobacteria, including aerobic/microaerophilic, motility- helical-shaped

rods and cocci, Gram stain, and oxidative-fermentative metabolism of different

carbohydrates and organic salts. Out of 111 isolates, were identified 15 isolates for

Azospirillum spp., 32 for Gluconacetobacter spp. y 20 isolates for Azotobacter spp. by

sequencing of 16S ribosomal DNA. Quantitation of Indole-3 Acetic Acid as growth

promoting substance and acetylene reduction as nitrogen fixation indicator, showed

significant differences between genera and isolates, obtaining five isolates (Numbers. 2,

14, 16, 21 and 24) with high N- fixing and indolic compounds producing capability and

efficiency in comparison to reference published isolates type cultures of Azotobacter

chroococcum NCBIM 8002, Azospirillum brasilense NCBIM 11860, Gluconacetobacter

diazotrophicus NCBIM 12985, among other bacteria. Sequencing and alignment of nifH

gene region for contrasting samples of several of these isolates did not show genetic

differences between isolates with higher nitrogen fixation efficiency, indicated high

conservation of this gene. Fourteen isolates from the three genera were identified as

promising candidates for further studies.

XII Caracterización bioquímica y molecular de bacterias fijadoras de nitrógeno aisladas de caña de azúcar

Keywords: (Sugarcane, Nitrogen Fixation, Plant-Grow th Promoting, Bacteria,

Biochemical tests, Indole-3 Acetic Acid (IAA), nifH gene.)

Contenido XIII

Contenido

Pág.

1. Resumen ........................................... ...................................................................... IX

2. Abstract .......................................... ........................................................................ XI

3. Lista de figuras .................................. .................................................................... XV

4. Lista de tablas ................................... .................................................................. XVII

5. Introducción ...................................... ....................................................................... 1

6. Justificación ..................................... ........................................................................ 5

7. Planteamiento del problema ........................ ............................................................ 9

8. Objetivos ......................................... ........................................................................ 11

8.1 Objetivo general ............................................................................................... 11

8.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 11

9. Marco teórico ..................................... ..................................................................... 13

9.1 La fertilización nitrogenada de síntesis química ............................................... 13

9.2 El ciclo del nitrógeno y la FBN .......................................................................... 15

9.3 La fijación biológica de nitrógeno ..................................................................... 17

9.4 La enzima nitrogenasa ..................................................................................... 19

9.5 Las proteobacterias .......................................................................................... 19

9.6 El género Azospirillum spp ............................................................................... 20

9.7 El género Gluconacetobacter spp .................................................................... 22

9.8 El género Azotobacter spp ............................................................................... 22

9.9 Producción de compuestos indólicos................................................................ 22

9.10 Diversidad genética de bacterias fijadoras de nitrógeno. .................................. 25

10. Materiales y métodos .............................. ............................................................... 28

10.1 Selección y ubicación de los sitios de muestreo. .............................................. 28

10.2 Muestreo y toma de muestras en campo .......................................................... 28

10.3 Aislamiento y purificación de colonias bacterianas en medios de cultivos selectivos .................................................................................................................... 29

10.4 Pruebas bioquímicas con diferentes tipos de carbohidratos para determinación del género. .................................................................................................................. 30

10.5 Confirmación del género e identificación de las especies bacterianas por secuenciación estándar (16S r DNA). ......................................................................... 32

XIV Título de la tesis o trabajo de investigación

10.6 Determinación de Compuestos indólicos totales por el reactivo de Salkoski ..... 33

10.7 Cuantificación de la producción de acetileno a etileno por el método Acetilene Reduction Assays (ARA) ............................................................................................. 33

10.8 Selección y secuenciación de los genes involucrados en la fijación de nitrógeno 36

11. Resultados y discusión ............................ ............................................................. 38

11.1 Aislamientos y selección fenotípica de bacterias fijadoras de nitrógeno en medios de cultivo selectivos ........................................................................................ 38

11.2 Identificación bioquímica de los aislamientos de bacterias fijadoras de nitrógeno asociadas a las variedades de caña de azúcar ........................................................... 40

11.3 Identificación genética del género y especie por secuenciación de la región 16S rDNA 44

11.4 Cuantificación de compuestos indólicos y selección de los aislamientos con mayor potencial en la producción de fitohomonas. ...................................................... 50

11.5 Cuantificación de la reducción de Acetileno-Etileno y selección de los aislamientos con mayor potencial en la fijación biológica de nitrógeno. ....................... 58

11.6 Secuenciación del gen nifH en aislamientos con mayor potencial en la fijación biológica de nitrógeno y producción de compuestos indólicos ..................................... 66

12. Conclusiones y recomendaciones .................... ................................................... 73

12.1 Conclusiones .................................................................................................... 73

12.2 Recomendaciones ............................................................................................ 74

13. Anexo: Clasificación de los genes candidatos en la fijación biológica de nitrógeno. ........................................ .............................................................................. 77

14. Bibliografía ...................................... ....................................................................... 80

Contenido XV

Lista de figuras

Pág. Figura 9-1: Árbol Filogenético con base en el ARN ribosomal 16S donde se ilustra la separación y ubicación de las Proteobacteria con respecto a otras subclases . ............. 21

Figura 9-2: Rutas metabólicas encargadas de la síntesis de Acido-3-Indol acético (AIA) en bacteria. .................................................................................................................. 24

Figura 9-3: Interacción patogénica y simbiótica por medio de la producción de AIA en bacteria .................................................................................................................. 25

Figura 10-1: Representación del muestreo sistemático y unidad de muestreo ........... 28

Figura 10-2: Secuencia de nucleótidos de los primers Azp1 y su condición cinética de amplificación de un fragmento de 1076 bp del gen nifH del género Azospirillum spp ..... 36

Figura 10-3: Secuencia de nucleótidos de los primers Gdb1 y su condición cinética de amplificación de un fragmento de 898 bp del gen nifH del género Gluconacetobacter spp. .............................................................................................................. 36

Figura 11-1 Ubicación geográfica de los sitios muestreo, los mapas indican las zonas agroecológicas y sus megabientes. La selección de los sitios se filtró usando información acerca de los ingenios, haciendas, ambientes y variedades (CC 85-92, CC 84-75, CC 01-1940 y CC 93-4418) con el programa ArcGIS® para la consulta geográfica de la ubicación de las suertes que correspondieron a estas características de selección. Los puntos dentro del recuadro marcan los sitios de ubicación de las suertes muestreadas. ...................... 39

Figura 11-2 Grupos o clusters generados a partir del análisis estadístico por conglomerados, el cluster 1 agrupó 13 aislamientos Azospirillum y 35 de Azotobacter con sus respectivos controles positivos de Azospirillum brasilense NCBIM 11860 y Azotobacter chroococcum NCBIM 8002, el cluster 2 agrupó 5 de Azospirillum y 22 de Azotobacter, mientras el cluster 3 homogéneamente agrupó 34 aislamientos dentro del género de Gluconacetobacter incluyendo el control positivo de Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985. ................................................................................................................ 43

Figura 11-3 AIA promedio de los aislamientos del Género Azospirillum spp. Aislamientos que comparten una letra no pueden considerarse estadísticamente diferentes .............. 52

Figura 11-4 AIA promedio de los aislamientos del Género Azotobacter spp. Aislamientos que comparten una letra no pueden considerarse estadísticamente diferentes .............. 56

Figura 11-5 AIA promedio de los aislamientos del Género Gluconacetobacter spp. Aislamientos que comparten una letra no pueden considerarse estadísticamente diferentes ....................................................................................................................................... 57

Figura 11-6 Curva estándar de Etileno con un R2=1 ....................................................... 58

XVI Título de la tesis o trabajo de investigación

Figura 11-7 Curva estándar de acetileno con un R2=0.9788 ........................................... 58

Figura 11-8 Comparación entre aislamientos por prueba de Bonferroni (α= 0,05) dentro del género Azospirillum spp . No existieron diferencias significativas ................................... 62

Figura 11-9 Comparación entre aislamientos por prueba de Bonferroni (alpha=0.05) dentro del género Gluconacetobacter.spp. Entre las proporciones de reducción de acetileno existieron diferencias significativas. ................................................................................ 64

Figura 11-10 Alineamientos de las secuencias de nucleótidos de los aislamientos bacterianos pertenecientes a género y especie de Azospirillum brasilense. Secuencia de accesión de referencia en el NCBI Genbank X51500.1 ................................................... 68

Figura 11-11 Alineamientos de las secuencias de nucleótidos de los aislamientos bacterianos pertenecientes a género y especie de Gluconacetobacter diazotrophicus. Secuencia de accesión de referencia en el NCBI Genbank U78044.1 ............................ 69

Figura 11-12 Alineamientos de las secuencias proteicas de los aislamientos bacterianos pertenecientes a género y especie de Azospirillum brasilense. Secuencia de accesión de referencia en el NCBI Genbank CAA35860.1 ................................................................. 71

Figura 11-13 Alineamientos de las secuencias proteicas de los aislamientos bacterianos pertenecientes a género y especie de Gluconacetobacter diazotrophicus. Secuencia de referencia accesión en NCBI Genbank AAD00271.1 ...................................................... 71

Contenido XVII

Lista de tablas

Pág.

Tabla 10-1: Pruebas bioquímicas para identificación de los géneros de Azospirillumspp., Azotobacter spp. y Gluconacetobacter spp. según (Holt, et al., 1984) (Casas & Perez, 2005) (Mehnaz, Weselowski, & Lazarovito, 2006) ............................... 31

Tabla 10-2: Condiciones Cromatográficas para la detección de Acetileno- Etileno. .. 34

Tabla 11-1: Grupos o clusters generados a partir del metabolismo bioquímico de los aislamientos bacterianos obtenidos ................................................................................ 40

Tabla 11-2: Cluster de pruebas bioquímicas de los aislamientos aglomerados dentro de los géneros Azospirillum spp, Azotobacter spp y Gluconacetobacter spp .................. 42

Tabla 11-3: Base de datos de aislamientos, procedencia e identificación taxonómica del género y especie por amplificación del gen 16S r DNA ............................................ 44

Tabla 11-4: Base de datos de aislamientos, procedencia e identificación taxonómica del género y especie por amplificación del gen 16S r DNA. ........................................... 46

Tabla 11-5: Base de datos de aislamientos, procedencia e identificación taxonómica del género y especie por amplificación del gen 16S r DNA ............................................ 48

Tabla 11-6: Ácido-3-Indol acético (AIA) promedio por género de bacteria ................ 50

Tabla 11-7: Promedios de eficiencia enzimática con base en la prueba de reducción de Acetileno – Etileno entre Género ............................................................................... 60

Tabla 11-8: Resultados de la caracterización de los aislamientos bacterianos de con mayor capacidad en fijación biológica de nitrógeno y producción de compuestos indólicos .............................................................................................................. 67

Contenido XVIII

Introducción

El cultivo de la caña de azúcar es de gran importancia comercial por ser la principal materia

prima para la producción de energía a través del azúcar, etanol y la cogeneración de

bioelectricidad. (Asocaña, 2015). La agroindustria azucarera colombiana se desarrolló con

mayor intensidad en el valle geográfico del río Cauca, con aproximadamente 237.070

hectáreas (ha) en el 2015-2016, que generaron una producción superior a los 24 millones

de toneladas de caña, para producir 2’354.723 de toneladas de azúcar, 456.403 litros de

etanol, y 5 millones de toneladas anuales de bagazo para la cogeneración de 215MW de

energía para uso propio y/o entregados a la interconexión del país (Asocaña, 2015)

Con cerca de 2.750 proveedores de caña de azúcar, Colombia ha sobresalido en el ámbito

internacional por su capacidad en producir caña durante todos los meses del año, con

productividades consideradas las más altas del mundo. Por las características de su clima,

suelos, y sistema de producción, la fertilización, especialmente la nitrogenada se convirtió

en pieza clave, pero a su vez en una tarea colosal hacia la búsqueda de la optimización

de la producción y el rendimiento de biomasa de dicho cultivo, manteniendo la rentabilidad

y en lo posible la sostenibilidad ambiental.

Sin embargo, las pérdidas en la fertilización nitrogenada por factores bióticos y abióticos,

causan dos efectos colaterales importantes como son la contaminación ambiental por

lixiviación de nitrógeno a aguas subterráneas y las pérdidas por volatilización a la

atmósfera en forma de N2O; generando a su vez pérdidas económicas cuantiosas.

Así entonces, ante la búsqueda de estrategias que permitan disminuir la fertilización

nitrogenada de síntesis en los campos cultivados con caña de azúcar sin perder su

productividad, el aprovechamiento y utilización de microorganismos fijadores de nitrógeno

y productores de compuestos indólicos (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) surgen

como alternativa para la nutrición de las plantas de caña de azúcar, reduciría las altas dosis

2 Introducción

en la fertilización nitrogenada, y disminuiría los efectos económicos y ambientales

causados por la sobre fertilización con productos de síntesis química.

Por consiguiente, el propósito de esta investigación se centró en incrementar el

conocimiento acerca del proceso de la Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN) que ocurre

naturalmente en los cultivos de caña de azúcar en el valle del río Cauca donde se

concentra la agroindustria de la caña, mediante el aislamiento y caracterización de

bacterias de los géneros Azospirillum spp., Azotobacter spp. y Gluconacetobacter spp.;

géneros bacterianos que son de gran interés para la agricultura en el mundo, y en nuestro

caso, para la agroindustria azucarera colombiana. Especies de estos géneros son

ampliamente conocidos por el proceso de fijación biológica de nitrógeno y producción de

compuestos indólicos o fitohormonas, que permiten mejorar el crecimiento radicular, por

su producción de sideróforos y solubilización de fósforo; además, de ejercer biocontrol de

su nicho contra agentes patógenos.

La asociación de estos géneros bacterianos con las variedades de caña de azúcar más

representativas del sector agroindustrial colombiano como lo son: CC 85-92 (Variedad más

sembrada) CC 84-75, CC 93-4418 y CC 01-1940; sembradas a lo largo del valle geográfico

del rio Cauca.

El aislamiento bacteriano fue caracterizado bioquímicamente usando las pruebas

bioquímicas diferenciales de bacterias Gram negativas, móviles, aeróbicas,

microaerofílicas, bacilos curvos, bacilos cortos y cocos (α-proteobacteria y β-

proteobacteria) según manual de Bergey´s, la confirmación e identificación del género y

especie de cada aislamiento, se realizó mediante la amplificación y secuenciación de la

región 16S del ADN ribosomal, lo cual también permitió conocer sobre la diversidad

genética de este tipo de bacterias asociadas a las plantas de caña de azúcar. La

cuantificación de la actividad enzimática de la nitrogenasa, se realizó por el método de

reducción de Acetileno (Assay Reduction Acetilene- ARA), y la producción de compuestos

indólicos se cuantifico por espectrofotometría.

Finalmente, para una muestra contrastante de aislamientos, se usaron primers o

cebadores específicos para la amplificación de la región conservada del ADN del gen nifH

que codifica para la subunidad de nitrogenasa reductasa de la enzima, que hace parte de

Introducción 3

la región coenzimática responsable de la actividad reductora involucrada en la fijación

biológica de N. El uso de este gen permitió contribuir al conocimiento de las características

genéticas y moleculares de estos aislamientos, y la comparación funcional asociada con

los índices de fijación biológica de Nitrógeno. (Gaby & Buckley, 2012)

Justificación

Conforme crece la población mundial de personas en el mundo, se convierte en un deber

el incrementar la producción de biomasa de los cultivos comerciales que son sus fuentes

de alimento, fibra y energía; entre ellos se ubica el cultivo de caña de azúcar cuyos

procesos productivos originan principalmente azúcar, etanol, co-generación de energía,

producción de fibra, entre muchos otros subproductos y derivados.

Para suplir sus demandas la agroindustria azucarera en Colombia presenta una extensión

de tierra dedicada al cultivo intensivo tecnificado de caña de azúcar de aproximadamente

237.070 hectáreas trabajada por 15 ingenios azucareros con cerca de 2.750 cultivadores

en el valle geográfico del río Cauca, ubicada entre los departamentos del Caldas,

Risaralda, Quindío, Valle del Cauca y Cauca, donde el departamento del Valle del Cauca

cuenta con el 77,3% de esta extensión (Asocaña, 2015)

La fertilización se convirtió en un pilar fundamental para incrementar la productividad en el

cultivo de caña, usando fuentes nitrogenadas como principal suplemento exógeno, al ser

uno de los nutrimentos de mayor absorción por las plantas de caña después del potasio

(K), pero de igual forma, es el nutrimento con mayores pérdidas y deficiencias en la

producción del cultivo. Por tal razón, los fertilizantes de síntesis química son usados como

suplemento nutricional para reforzar las cantidades de nitrógeno presentes y disponibles

en el suelo cuando este se encuentre en bajas concentraciones o que en definitiva no se

encuentre disponible para las plantas (Tecnicaña, 2009)

Sin embargo, fertilizar con Nitrógeno se convierte en una tarea compleja debido a que solo

un porcentaje del 10-50% de éste es absorbido por las plantas (Sands, et al., 2011)

(Menendez, et al., 2008). El porcentaje restante, para el caso específico del cultivo de caña

de azúcar fertilizada con urea se pierde por volatilización o lixiviación; la primera por la

actividad hidrolítica de la cual se encargan complejos enzimáticos de los microorganismos,

y la segunda a causa de la nitrificación del amonio, causando contaminación en las fuentes

6 Caracterización bioquímica y molecular de bacterias fijadoras de nitrógeno

asociadas a caña de azúcar

de aguas subterráneas y superficiales. Además, de emisiones gaseosas a la atmósfera de

sustancias como el amoniaco (NH3), dióxido de nitrógeno (NO2) y por último, óxido nitroso

(N2O), siendo la agricultura un contribuyente significativo con el 40% de las emisiones

globales por estos gases que influyen sobre el calentamiento global. (Tecnicaña, 2009)

(Instituto para la diversificacion y ahorro de energia , 2007)

Otro importante aspecto a resaltar es que de acuerdo con la Asociación internacional de

la Industria de los Fertilizantes (IFA), reportó que las pérdidas de Nitrógeno alcanzan un

estimado de $ 90 mil millones de dólares anuales (Subbarao, y otros, 2013), que se reflejan

en la pérdida de la eficiencia en el uso del fertilizante a causa de la heterogeneidad de

dispersión de las dosis en el campo, lo cual conlleva a obtener sitios sobre-dosificados y

otros sub-dosificados, resultando en una pérdida de fertilizante y pérdida de producción en

sitios donde se sub-aplicó. (Tecnicaña, 2009)

No obstante, el consumo de fertilizantes en el mundo ha registrado una tendencia al

incremento en las aplicaciones en los campos (176,1 millones de toneladas), siendo el

61% de dicho volumen para los fertilizantes nitrogenados (Gaucin, 2013). Lo anterior

indica que los cultivadores, a pesar de las implicaciones ambientales y económicas

mencionadas anteriormente, continúan aumentando las dosificaciones de fertilizante para

no permitir el decrecimiento de la productividad en sus cultivos, y les falta mayor

conocimiento respecto a otras estrategias que permitan reducir las dosificaciones de

Nitrógeno sin perder su competitividad en la producción.

En Brasil, la caña de azúcar es un cultivo capaz de responder positivamente a bajas dosis

de fertilización nitrogenada, con cerca de 50 a 100 Kg/ha/año de Nitrógeno (Oliverira,

Urquiaga, Dobereiner, & Baldani, 2002), lo cual evidencia que existe una contribución

significativa a partir del proceso de Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN). Este es un

proceso biológico limitado solo a los microorganismos, en especial bacterias y arqueas,

que logran bioquímicamente producir una interface entre el Nitrógeno atmosférico y la

biósfera, apoyando el ingreso de dicho elemento dentro de los sistemas ecológicos

marinos y terrestres en todo el planeta tierra (Gaby & Buckley, 2014).

Existen numerosos tipos de bacterias diazotróficas cuyos nichos ecológicos se distribuyen

ampliamente en la mayoría de ambientes en el mundo, y se asocian también con diversos

cultivos de interés agrícola, siendo el caso más conocido en el cultivo de leguminosas

Capítulo 1 7

como soya (Glycine max) y Alfalfa (Medicago sativa); pero también ocurre en gramíneas

como el arroz (Oryza sativa) y el maíz (Zea mays), y la caña de azúcar (Saccharum spp.),

entre otros, (Mendeiros, Polidoro, & Reis, 2006). El aporte de Nitrógeno a dichos cultivos

ha sido extensamente documentado indicándose que algunas variedades de caña de

azúcar brasileñas obtienen más de 150 Kg N/ha por año de FBN (Boddey, Polidoro,

Resende, Alves, & Urquiaga, 2001). Sin embargo, la contribución de Nitrógeno

especialmente al cultivo de caña de azúcar es altamente variable (Urquiaga., 2009), en

primer lugar por ser un proceso biológico en el cual participan grupos heterogéneos de

microorganismos con una sensibilidad alta a cambios en el ambiente, donde

principalmente las plantas y su genética pueden o no favorecer la reorganización de nichos

para las bacterias por sus diferentes producciones de biomasa, y la composición química

de sus exudados radicales. Factores físicos-químicos del suelo, como el pH y el contenido

de agua, y la biomasa de Carbono y la de Nitrógeno han sido identificados como

conductores de diversidad genética. (Hinsinger, Bengough, Vetterlein, & Young, 2009)

Gaby and Buckley (2014) identificaron que la alta abundancia del gen nifH (codifica para

la subunidad nitrogenasa reductasa) está altamente asociada al proceso de fijación

biológica de Nitrógeno, y en los últimos años se ha convertido en una importante línea de

investigación para el estudio de la ecología y evolución funcional de las bacterias fijadoras

de Nitrógeno.

Actualmente, el uso de microorganismos para el campo agrícola ha logrado ser de

importante utilidad, por sus procesos de FBN y producción de compuestos indólicos como

auxinas, citoquininas y giberilinas que promueven el crecimiento radicular de las plantas,

logrando acercarse al propósito de reducir la contaminación de los suelos y de las aguas

freáticas, disminución de los costos de producción y mejorar la competitividad de los

sistemas agrícolas (Garrido M. , 2007)

Por lo anterior, se planteó aislar y caracterizar bacterias de los géneros Azospirillum spp.,

Azotobacter spp. y Gluconacetobacter spp. asociadas a diferentes variedades comerciales

de caña de azúcar de importancia histórica y actual para el sector azucarero, para

seleccionar aquellas con mayor actividad en la fijación biológica de Nitrógeno y en la

producción de compuestos indólicos. Con ello, se busca identificar las poblaciones

bacterianas dentro de estos géneros que presenten los más eficientes roles metabólicos

asociados a la caña de azúcar, generando conocimiento acerca de su diversidad genética



y potencial. Se tiene en cuenta que son poblaciones acondicionadas a su vegetación

“nativa”, lo que puede resultar en diferentes respuestas en cuanto a la contribución de

fijación biológica de Nitrógeno obtenida por cada microorganismo en cada variedad y

dependiendo del ambiente y del manejo agronómico (Garrido M. , 2007)

Estos trabajos podrán contribuir en el futuro en la búsqueda de sostenibilidad y

competitividad del Sector Azucarero Colombiano como una solución que contribuya a

reducir el impacto ambiental y económico a partir del mejoramiento de los procesos en el

campo. El aislamiento y caracterización inicial de estas bacterias es el punto de partida,

pero en ningún momento garantiza que éstas funcionen eficientemente y sean exitosas

dentro de programas de bionutrición o que puedan ser usadas como insumos biológicos

comerciales sin la rigurosa investigación y validación.

Capítulo 1 9

Planteamiento del problema

El cultivo de caña de azúcar es una de las gramíneas con mayor importancia en el mundo

por su producción y acumulación de sacarosa, e históricamente la caña de azúcar ha sido

uno de los productos de consumo interno que ha influido positivamente sobre la economía

del País. Actualmente, los cultivos con caña de azúcar ocupan aproximadamente 237.070

hectáreas de tierra a lo largo del valle geográfico del rio Cauca (Asocaña, 2015). Ante la

magnitud de extensión de tierra sembrada con este cultivo, la fertilización se convierte en

la principal actividad agrícola exógena que suple los requerimientos básicos nutricionales

del cultivo de caña de azúcar, siendo el Nitrógeno el principal nutriente que incide

directamente sobre la producción y el rendimiento.

Sin embargo, ante la intensión de optimizar la productividad y el rendimiento de biomasa y

azúcares de la caña, se hace necesario mejorar la nutrición, intensificar el uso del

fertilizante, y reducir las pérdidas de Nitrógeno por lixiviación y por volatilización a la

atmósfera, que pueden llegar al 90% de lo aplicado. Además, se deben considerar el

aumento de los costos de producción debidos a las pérdidas de fertilizante y los

incrementos de precios ligados a las alzas en el precio del petróleo. (Menendez, et al.,

2008)

Así entonces, Cenicaña como ente de investigación y desarrollo tecnológico asociado al

Sector Azucarero Colombiano, ha enfocado esfuerzos significativos en la búsqueda de

posibles estrategias que permitan un manejo integral del cultivo, donde se tenga una alta

productividad, pero a su vez con la reducción de la contaminación ambiental y de los costos

de producción del cultivo. Acciones para el desarrollo de variedades con uso más eficiente

del Nitrógeno, la caracterización de los suelos y zonas agroecológicas, las

recomendaciones de fertilización y manejo según los análisis de suelos, los estudios sobre

1

0

Caracterización bioquímica y molecular de bacterias fijadoras de nitrógeno


manejo de aguas, entre otras, apuntan a mejorar este manejo del cultivo. Recientemente,

el uso de microorganismos fijadores de Nitrógeno y productores de compuestos indólicos

(fitohormonas), se ha convertido en una opción tecnológica para mejorar la competitividad

y sostenibilidad del cultivo de la caña en Colombia, y Cenicaña viene trabajando en ese

sentido, considerando que ya han sido explorados y usados en otros sistemas agrícolas y

ganaderos (Garrido M. , 2007) , incluso en países cultivadores de caña como Brasil.

Dependiendo de los resultados obtenidos, y de futuras investigaciones y desarrollos

tecnológicos, se podría llegar a la generación de bio-inoculantes que contengan cepas

bacterianas nativas eficientes ya adaptadas, que logren suplir parcialmente la necesidad

de Nitrógeno en los cultivos de caña de azúcar en el valle del río Cauca

Capítulo 1 11

Objetivos

1.1 Objetivo general

Contribuir al conocimiento del proceso de Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN) a partir

del estudio de los diferentes aislamientos bacterianos asociados a las principales

variedades de caña de azúcar cultivadas en el valle del río Cauca, y obtener especies

bacterianas promisorias en FBN y producción de compuestos indólicos.

1.2 Objetivos específicos

� Aislar bacterias fijadoras de Nitrógeno (FBN) de los géneros Azospirillum spp.,

Azotobacter spp. y Gluconacetobacter spp. asociadas a variedades comerciales de

caña de azúcar.

� Identificar bioquímica y molecularmente los aislamientos de bacterias fijadoras de

Nitrógeno asociadas a las variedades de caña de azúcar

� Seleccionar los aislamientos bacterianos con mayor actividad de Fijación Biológica de

Nitrógeno (FBN) y producción de compuestos indólicos.

� Estudiar la diversidad genética de las especies bacterianas que integran los géneros

Azospirillum spp., Azotobacter spp., Gluconacetobacter spp. a partir del estudio del

ADN ribosomal y del gen nifH involucrado en la Fijación Biológica de Nitrógeno

Marco teórico

Las plantas de caña de azúcar o el género Saccharum spp., se clasifican dentro de la

familia Poaceae en la subclase Monocotiledonea. Como cultivo la caña de azúcar presenta

una amplia distribución en las regiones tropicales y subtropicales en cinco diferentes

continentes siendo América y Asia los mayores cultivadores con el 90% del total mundial,

estas variedades de caña de azúcar son provenientes de complejos híbridos

interespecíficos derivados de cruzamientos entre las especies S. officinarum y S.

spontaneum (Amaya Estevez, Cock, Hernandez, & Irvine, 1995)

La caña de azúcar es una planta de metabolismo C4 cuyos procesos fotosintéticos y

bioquímicos convierten la luz solar, el agua y el CO2 en biomasa con mayor eficiencia, de

acuerdo con Amaya et al., (1995) la variedad, la edad, el clima, riego y fertilización son

factores determinantes en la producción del 50-80% de la biomasa total que se compone

entre un 70- 85% de agua, 12-14 % de fibra y 50-65% de sacarosa en plantas maduras.

Las densidades poblacionales de este cultivo generan de 100 a 180 ton/ha/año de caña,

que dependen en mayor proporción de la disponibilidad de nutrientes en el suelo, siendo

el N, K y el P los mayores elementos que la caña extrae seguido en su orden por Ca, Mg,

y S, además de la absorción de elementos menores como Fe, Zn, Mn, B y Cu. En este

orden, el nitrógeno es uno de los elementos de mayor influencia sobre el cultivo, debido a

que incrementa la altura y el diámetro de los tallos, aumenta el número de hojas y el

contenido de clorofila para el proceso de respiración y fotosíntesis, aumenta la producción

y concentración de azúcares y finalmente incrementa la acumulación de materia seca.

(Muñoz, 2013)

1.3 La fertilización nitrogenada de síntesis química

El Nitrógeno es un elemento que juega un papel esencial por ser una de las bases de todo

el conjunto de compuestos estructurales de la vida como los ácidos nucleicos, los


aisladas de caña de azúcar

aminoácidos, las proteínas y las hormonas, entre muchos otros. De esta manera, el

Nitrógeno es uno del conjunto de nutrientes que las plantas requieren en mayor cantidad,

(Frionii, 1999).

Quintero (1998) indicó que la distribución del nitrógeno en los suelos del valle geográfico

del rio Cauca es muy heterogénea, encontrándose desde altas concentraciones a muy

bajas, lo cual indica que las disposiciones de las fuentes de Nitrógeno en los campos

cultivados con caña de azúcar dependen de las características del suelo principalmente

disposición de materia orgánica, las condiciones climáticas y la microbiota presente, siendo

lo anterior un limitante para la fertilidad del suelo.

La deficiencia en Nitrógeno en el cultivo de caña de azúcar se observa en la pérdida de su

coloración verde en las hojas inferiores, cuando la deficiencia de Nitrógeno es muy severa

se expresa en la planta con el secamiento de las puntas de las hojas avanzando hacia su

parte media hasta alcanzar la nervadura central; además, el desarrollo de la planta es

escaso y se observa disminución en el número de tallos o pobre macollamiento. (Quintero,

1998)

Con lo anterior, las altas o bajas producciones de biomasa en el cultivo de caña de azúcar

dependen en buena medida de la fertilización. Los fertilizantes nitrogenados se obtienen

por la reacción química conocida como Haber-Bosh; este proceso industrial con costos

altamente energéticos de temperatura y presión, permiten la reacción entre el Nitrógeno

gaseoso (N2) y el Hidrógeno (H2) presentes en la atmósfera para producir dos moléculas

de amoniaco (NH3) gaseoso:

Este proceso simplificado en la anterior ecuación estequiométrica, se convirtió en el más

importante avance tecnológico para la agricultura y dio paso a la revolución verde a

mediados del Siglo XX. En la modernidad se ha hecho de la fertilización de síntesis un

paquete tecnológico que persigue ajustarse a las necesidades de las plantas y su uso se

hace necesario para incrementar la producción del cultivo y es uno de los medios más

N2 (g) + H2 (g) NH3 (g)

Marco teórico 15

eficaces de los que se dispone para aumentar productividad (Instituto para la

diversificacion y ahorro de energia , 2007)

Actualmente, el Sector Azucarero Colombiano utiliza diversas fuentes nitrogenadas como

la Urea en solución UAN (Urea- Nitrato de Amonio) al 32% de Nitrógeno, y subproductos

o residuos de la industria como la vinaza cuya composición presenta altas concentraciones

de potasio. La vinaza es actualmente aplicada en solución con Urea como opción de

fertilización; sin embargo, a pesar de la disminución de las pérdidas de Nitrógeno por

acción de la vinaza, los fertilizantes de síntesis no solucionan todos los problemas cuando

se presenta baja productividad de caña de azúcar (Tecnicaña., 2009) (Muñoz, 2013)

1.4 El ciclo del nitrógeno y la FBN

El nitrógeno es el quinto elemento más abundante en el sistema solar y el segundo

elemento esencial en la estructura de múltiples moléculas como los ácidos nucleicos y

proteínas, los más importantes polímeros de las formas orgánicas. (Canfield, Glazer &

Falkowski, 2010)

Este elemento en su estado más elemental N2 presenta una estructura molecular con tres

(3) enlaces covalentes entre sus átomos, y se encuentra en altas concentraciones en la

atmosfera. Debido a su estado molecular el nitrógeno ingresa a la biosfera por medio de

multiplex procesos biogeoquímicos que dan lugar al ciclo del nitrógeno. (M.B Hoffman,

2009)

El ciclo del nitrógeno biológicamente es el proceso más diverso en rutas metabólicas

dependientes del tipo de respiración - anaerobia o aerobia- de los Procariotas, Arqueas y

Eubacterias, que oxidan o reducen el nitrógeno catalizado por diversas enzimas reguladas

por una amplia transcripción de genes involucrados dentro de todo el proceso biológico del

nitrógeno.

El gas de N2 inicialmente es fijado por un grupo específico de enzimas llamadas

Nitrogenasas u oxidoreductasas, cuya estructura está asociada a un cofactor que presenta

un grupo metálico como Molibdeno – Hierro o Mo-Fe, este grupo liga N2 quien es

protonado hasta ser reducido a amonio (NH3+), compuesto que posteriormente es oxidado

a amoniaco (NH4+) convirtiéndose en sustrato e iniciando el proceso de asimilación por



enzima Glutamina sintetasa que cataliza la proteólisis de aminoácidos para la producción

de proteínas y compuestos heterocíclicos de Nitrógeno.

Paralelamente al proceso de fijación biológica del nitrógeno, la desnitrificación y la

nitrificación, son dos procesos metabólicos que inician con el nitrato NO3- y amonio (NH3

-)

como sustratos para la acción enzimática. Estos procesos divergen en dos rutas

metabólicas que dependen del tipo de respiración celular, por ello el proceso de

desnitrificación es una ruta metabólica anaerobia facultativa, (utiliza el flujo de electrones

del oxígeno) con la intervención de enzimas oxidoreductasas que obtienen los electrones

del nitrógeno para ingresarlos al sistema transportador de electrones a partir de la

reducción secuencial de los productos: Nitrito, Óxido de nitrógeno II, Óxido de nitrógeno,

Nitrógeno. Los productos de una enzima son el sustrato para la siguiente. (Zehr & Montoya,

2007)

Por otro lado, el proceso de nitrificación estrictamente aerobio que inicia con el oxidación

del Nitrógeno a partir del amonio (NH3-) como proveedor de electrones para la cadena

transportadora, produciéndose nitrito (NO2-) que secuencialmente por acción de la enzima

monooxigenasa que forma parte de los dominios de bacterias y arquea, y la cual es

codificada por el gen amoA conservado en dos importantes divisiones del phylum

Proteobacterias: Gammaproteobacterias (AOG) y Betaproteobacterias (AOB) y Arqueas

(AOA), distribuidas en muchos ambientes y claves dentro del ciclo del nitrógeno. (Zehr &

Montoya, 2007)

Otros dos procesos integran el ciclo del nitrógeno como: la oxidación anaerobia del

amoniaco (NH4+) o Anammox, y la asimilación del nitrato (NO3

-). Anammox es el proceso

de oxidación del amonio a Nitrógeno (N2), usando como aceptor de electrones el nitrito

(NO2-) catalizado por enzimas de los plantomycetos.

Finalmente, la asimilación es llevado a cabo por todos los organismos, desde hongos,

algas, plantas incluyendo muchas bacterias, los cuales usan el nitrato (NO3-) reducido a

NH4+, por vía del Nitrito (NO2-) catalizado por las enzimas nitrito reductasa (NIR) o vía del

Nitrato (NO3-) catalizado por las enzimas nitrato reductasas (NR), así debido a la reducción

del nitrito y nitrato, el amonio es incorporado al esqueleto de carbono y sintetizado por la

enzima Glutamina sintetasa. (Zehr & Montoya, 2007)

Marco teórico 17

1.5 La fijación biológica de nitrógeno

La FBN es el proceso por el cual poblaciones de procariotas como bacterias, arqueas y

eubacterias toman el dinitrógeno (N2) gaseoso de la atmósfera atado por un complejo

enzimático denominado nitrogenasa. Esta enzima se compone de un cofactor central de

Molibdeno-Hierro o Mo-Fe que estrictamente hidroliza 8 equivalentes de MgATP por N2

reducido a NH3, este costoso proceso es representado por la reacción kinética de

Thorneley que en condiciones óptimas se comporta según la siguiente reacción: (Hoffman,

Dean, & Seefeldt, 2009)

Con lo anterior, la fijación biológica de Nitrógeno se convirtió en un proceso de interés

agrícola principalmente para la agroindustria azucarera de Brasil, ante las evidencias

obtenidas con la experimentación de diferentes variedades de caña que respondieron a

bajas dosis de fertilización nitrogenada, sin perder su productividad (Oliveira, Urquiaga,

Dobereiner, & Baldani, 2000)

En 1950s se inició el estudio de la FBN, bajo la hipótesis de la existencia de contribución

de Nitrógeno extrínseca a las plantas de caña de azúcar. Con el desarrollo de un medio

de cultivo sintético sin fuentes Nitrógeno, fueron aisladas de la rizosfera de caña de azúcar

altas poblaciones de dos especies bacterianas fijadoras de Nitrógeno como Beijerinckia

fluminensis y Beijerinckia indica (Dobereiner & Ruschel, 1958) (Reis, Lee, & Kennedy,

2007). Posteriormente fue aislada una gran diversidad de bacterias asimbióticas

rizosféricas integrantes de los géneros Bacillus spp., Azotobacter spp., Derxia spp. y

Enterobacter spp., de las cuales el género Azotobacter spp. Sobresale por su producción

de alginatos, fijación de Nitrógeno y solubilización de fosfatos, entre otras propiedades.

El género Azospirillum spp. es un género compuesto por especies que infectan y se

multiplican internamente en los tejidos de la caña sin la inducción de elicitores o respuestas

sistémicas de defensa y sin síntomas de enfermedad observables, lo que causó un

importante interés hacia la búsqueda de bacterias asociadas a las partes aéreas de la

planta especialmente en el tallo. De esta manera, se obtuvieron nuevos aislamientos como

Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae, Herbaspirillum

rubisulbalbicans y bacterias del género Burkholderia spp., que son modelos de

N2 + 8e- + 16 MgATP + 8H+ 2NH3 + H2 + 16MgADP + 16P Nitrogenasa



endosimbiosis y contribuyentes significativos de Nitrógeno para la nutrición del cultivo de

la caña de azúcar. (Schloter & Hartmann, 1998)) (Reis, Lee, & Kennedy, 2007)

Actualmente, Gluconacetobacter diazotrophicus, especies de los géneros Azospirillum

spp. y Herbaspirillum spp., se convirtieron en las endófitas de mayor importancia e interés

agronómico por su contribución de Nitrógeno y producción de fitohormonas internamente

en los tejidos de caña, con poblaciones bacterianas de 102 a 103 UFC/g de

hojas/tallo/raíces de caña de azúcar, y con un promedio de reducción de acetileno- etileno

de 416,93 nmol C2H4/h-1 (Anitha & Thangaraju, 2010). Estos hallazgos representan un

aporte significativo en Nitrógeno asociado a las variedades de caña brasileñas; el

Nitrógeno que es producido por consorcios microbianos que reducen más de 150 Kg N/ha

por año de FBN sustentan el cultivo, mientras las aplicaciones de fertilizantes de síntesis

química no superan los 60Kg de Nitrógeno/ ha. Esto explica por qué en Brasil las tasas de

fijación biológica de Nitrógeno son comercialmente significativas para el cultivo de la caña

de azúcar (Boddey, Polidoro, Resende, Alves, & Urquiaga, 2001) (Reis, Lee, & Kennedy,

2007). Por lo tanto, la producción de inoculantes con base en mezclas de microrganismos

fijadores de Nitrógeno son aplicados a los cultivos de caña comercialmente, apoyando a

los cultivadores brasileros en reducir y recomendar cerca de 50kg N/ha/año hasta un

máximo de 100 Kg N/ha/año para los ciclos de cultivo posteriores (Oliveira, Urquiaga,

Dobereiner, & Baldani, 2002)

Adicionalmente, los micropropagados vegetativos de caña de azúcar a partir de cultivo in-

vitro se han convertido en una opción tecnológica que asegura abundante material vegetal

libre de patógenos, pero también reducción en la diversidad de bacterias benéficas

endófitas para el cultivo. Por ende, se realizan actualmente inoculaciones in-vitro masivas

de bacterias fijadoras de Nitrógeno a partir de inóculos normalizados a 109 células de

aislamientos bacterianos caracterizados con alta capacidad de colonización como son

Azospirillum amazonense, Herbaspirillum spp., Burkholderia tropica y Gluconacetobater

diazotrophicus, que promueven la estimulación de las raíces por el desarrollo de

fitohormonas, la acumulación del Nitrógeno en los tejidos de caña por la fijación, y

finalmente, permite la interacción de múltiples bacterias promotoras de crecimiento e

inductoras de resistencia mejorando sustancialmente la producción agrícola. (Oliveira, et

al., 2009)

Marco teórico 19

1.6 La enzima nitrogenasa

La nitrogenasa es la enzima responsable del proceso de FBN; esta enzima ha

evolucionado con varios linajes, entre ellos las bacterias y la arqueas, y se encuentra en

gran variedad de contextos metabólicos tanto anaerobios como aerobios. Aunque la

nitrogenasa es irreversiblemente inactivada por el Oxígeno, existen diversas estrategias

de protección para esta enzima dentro de las bacterias aerobias fijadoras de Nitrógeno.

Bioquímicamente la nitrogenasa presenta una estructura compuesta por dos subunidades

proteicas: -dinitrogenasa α2β2 heterotetrámero y la dinitrogenasa reductasa γ2

homodímero. La subunidad α contiene el sitio activo para la reducción del N2, el MoFe7S9

clúster metálico o FeMoco. Genéticamente, la nitrogenasa es transcrita por 19 genes

involucrados en la estructura (nifHDK), catálisis (NifUSMWZ), Sintesis del cofactor

(nifHQBVEN), transporte de electrones (nifF) y finalmente en la regulación transcripcional

los genes (nifAL). Los genes nifHDK son los genes más conservados dentro de este grupo,

lo cual hace referencia a la homología con otros géneros bacterianos mediado por

transferencia horizontal. El gen nifH, es el gen más conservado, e implicado en dos

funciones esenciales para la transcripción enzimática, y por ende uno de los con mayor

importancia en el proceso de FBN. (Schmehl, y otros, 1993)

En algunos grupos bacterianos se encuentran nitrogenasas alternas en las cuales el

Molibdeno es reemplazado por el Vanadio, y es importante resaltar que estas enzimas son

emergentes cuando el Molibdeno no se encuentra en el ambiente y no solo están ligadas

a un grupo de procariotas en particular. Sin embargo, el cofactor Mo-Fe es el más eficiente

ligando al N2 reduciéndolo a amoniaco con respecto a las enzimas alternas. (Raymond J.

, Siefert, Staples, & Blankenship, 2004)

1.7 Las proteobacterias

Dentro del dominio de las bacterias, se originó una gran diversidad de grupos bacterianos,

que actualmente integran taxonómicamente el Phylum más grande y representativo de la

filogenia bacteriana, las Proteobacterias, conformado por las subclases Alfaproteobacteria,

Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria y Epsilonproteobacteria.

Dentro de estas clases, el morfotipo más predominante son las bacterias Gram negativas,



cuya variabilidad de formas y fisiología les confieren una extrema diversidad metabólica

para la obtención de energía. Esta interesante característica ha permitido catalogarlas

como representantes claves en las dinámicas ecológicas por su variedad de roles en los

ciclos biogeoquímicos, especialmente del Nitrógeno, en la cual participa activamente la

enzima nitrogenasa (Kersters, et al., 2006). Además, se resalta la producción de ácido-3-

indol acético, hormona responsable de la diferenciación y crecimiento de tejidos en plantas,

secreción de exopolisacáridos, la formación de agregados de suelo y sidéroforos en la

rizosfera, y finalmente por ser agentes que logran ejercer bio-control de su nicho por medio

de la inhibición de agentes patógenos (Dobereiner & Calvacante, 1988)

Dentro de este diverso grupo de las Proteobacterias, especialmente en la subclase α-

Proteobacteria, grupo definido y separado por las secuencias de nucleótidos del 16S rRNA,

se obtienen tres grupos claramente separados de otras clases de Proteobacterias: las α-

Proteobacteria contienen actualmente 140 géneros y 425 especies, es el grupo más

diverso morfológicamente al encontrarse gran variedad de bacilos, bacilos curvos, cocos,

espiroquetas e incluso las formas más antiguas como phostecas. Su metabolismo

distingue gran variedad de bacterias desde bacterias púrpuras no-sulfurosas fototróficas

(PNS) y otros quimiolitótrofos y quimioorganótrofos. Este es uno de los grupos conformado

por bacterias de los géneros Azospirilllum spp., Gluconacetobacter spp. e incluso

Rhizobiales formadores de nódulos fijadores de Nitrógeno de alta frecuencia en plantas

leguminosas. El grupo o subclase de las β-Proteobacterias se compone de 75 géneros y

220 especies, claramente es un grupo monofilético, su morfología, ecología y metabolismo

es muy heterogéneo, destacándose bacterias púrpuras no-sulfurosas (PNS), varios

quimiolitótrofos, algunos metilótrofos, un gran número de quimioorganótrofos, y algunos

fijadores de Nitrógeno. Su morfología es menos diversa, encontrándose formas de bacilos

a cocos y algunos espirales; miembros de este grupo son del género de los Azotobacter

spp., de gran interés agrícola y biotecnológico. (Kersters, et al., 2006)

1.8 El género Azospirillum spp

Las bacterias diazotróficas pertenecientes al género Azospirillum spp. está compuesto por

seis principales especies: A. lipoferum, A. brasilense, A. amazonense, A. halopraeferans,

Marco teórico 21

A. largomobile, A. irakense, y por último se ha propuesto A. doebereinerae. (Casas &

Perez, 2005) (Figura 9-1)

Figura 0-1: Árbol Filogenético con base en el ARN ribosomal 16S donde se ilustra la

separación y ubicación de las Proteobacteria con respecto a otras subclases .

(Raymond J. , Siefert, Staples, & Blankenship, 2004) Son bacterias morfológicamente clasificadas dentro de las Gram negativas, presentan

formas bacilares con un flagelo polar que le confieren una movilidad en espiral

característica de este grupo, son aerobias facultativas logrando establecerse en

condiciones microaerobias (Baldani & Hartmann, 2006). Tienen la capacidad de oxidar

diversos carbohidratos al ser bacterias quimio-organotróficas que pueden utilizar como

fuente de Carbono azúcares, alcoholes, sales de ácidos orgánicos y como fuente de

Nitrógeno pueden disponer de nitratos, sales de amonio y ciertos aminoácidos (Holt & Krieg

, 1994). Forman quistes o gránulos de poli-beta-hidroxibutirato (PHB) que han sido

consideradas por diversos autores como fuentes de reservas de Carbono y energía

durante periodos de inanición o periodos desfavorables (Casas & Perez, 2005)

Este género particularmente presenta bacterias de vida libre; sin embargo, pueden

generarse un estado plantónico al asociarse a los tejidos internos de las plantas y

establecer relaciones simbióticas entre ellas, produciendo moléculas de señalamiento



como acido-3-indol acético, hormona que puede estimular el crecimiento de las plantas

asociadas a esta bacteria. (Stenberg & Wong, 1979)

1.9 El género Gluconacetobacter spp

El género Gluconacetobacter spp., es un género recientemente formado con cerca de 24

especies, donde se destacan las especies G. diazotrophicus, G. azotocaptans, G.

oxydans, G. entanii, G. europaeus, G. hansenii, G. intermedius, G. johannae, G.

liquefaciens, G. oboediens, G. sachari y G. xylinus.

Este género está formado por bacterias ácido-acéticas que aeróbicamente oxidan el etanol

a ácido acético. Son bacterias Gram negativas y bacilos perítricos móviles o no móviles,

aerobios obligados, oxidasa negativa, y metabólicamente este género lograr usar el etanol,

la glucosa y el glicerol como fuente de Carbono para su crecimiento. (Kersters, et al., 2006)

1.10 El género Azotobacter spp

De la clase de las γ-proteobacterias, son células Gram-negativas que tienen una doble

pared celular que consiste de una membrana externa y una capa interna denominadas

entina y exina, compuestas de peptidoglicano. Son células ovoides y grandes de 1.5 a 2.0

μm de diámetro, son pleomórficas, variando su morfología desde bacilos hasta células en

forma de cocos, con flagelos perítricos con movilidad en su forma bacilar, perdiéndose al

tomar la forma de coco, son aerobios obligados. Las bacterias de este género son

productoras de pigmentos que permiten la identificación de especies dentro del género. De

las 9 especies descritas se destacan A vinelandii, A. beijerinckii y A. chroococcum. Son

quimioorganotróficas, utilizan azúcares, alcoholes y sales inorgánicas para crecer,

producen compuestos de alta importancia agroindustrial como acido-3-indol acético,

alginatos y polihídroxibutirato (PHB) (Jimenez, 2007).

1.11 Producción de compuestos indólicos

El descubrimiento de ácido indol 3- acético (AIA) como regulador del crecimiento en plantas

coincidió con la primera indicación del mecanismo molecular involucrado en tumorogénesis

inducida por Agrobacterium spp, más tarde se reconoció que no solo las plantas sino

Marco teórico 23

también los microorganismos como bacterias y hongos sintetizan AIA. (Spaepen,

Vanderleyden, & Remans, 2007). El rol del AIA en bacterias ha sido investigado en detalle,

conociéndose que esta molécula está involucrada en varios aspectos de la interacción

entre la planta y la bacteria.

La endófita Gluconacetobacter diazotrophicus, se caracteriza principalmente por su

asociación simbiótica en plantas de caña de azúcar sin inducir síntomas de enfermedad

en su hospedante. La producción de compuestos indólicos como acido-3-indolacetico y

citoquininas son esenciales para la virulencia de la bacteria en las plantas hospedantes

por medio de las enzimas tryptophan 2-monooxygenasa e indolacetamide hydrolase.

Como respuesta a esta interacción la planta es regulada por un complejo proceso

denominado “cross-talking signaling and transduction pathway” produciéndose la proteína

de receptor-like Kinase (RLK) llamada SHR5, participando en el establecimiento de

bacteria endófita dentro del hospedante, estas proteínas participan en un rango de

procesos que van desde el desarrollo a resistencia a enfermedades, por su dominio rico

en leucinas (LRRs), que están involucrados en la formación de la interacción proteína-

proteína. (Vinagre, et al., 2006)

Tanto las bacterias como las plantas presentan un alto grado de similitud entre sus rutas

bio- sintéticas de AIA, que incluyen los productos intermedios, y se presentan cinco

diferentes rutas (Figura 9-2): Indol-3-acetamide (IAM) la ruta mejor caracterizada de todas

en bacterias; Indol-3-piruvato (IPyA) es la ruta más importante en plantas; la ruta del

Tryptamine pathway (TAM) identificada en Bacillus cereus, Tryptophan side-chain oxidasa

(TSO) ruta solo observada en Pseudomonas, Indol-3- acetonitrilo (IAN) reportada

recientemente en plantas, y por último, Triptófano- independiente en la cual no ha sido

identificada la enzima encargada de su síntesis (Spaepen, Vanderleyden, & Remans,

2007)



Figura 0-2: Rutas metabólicas encargadas de la síntesis de Acido-3-Indol acético (AIA)

en bacteria.

(Spaepen, Vanderleyden, & Remans, 2007)

Con el estudio de la producción de AIA, cerca del 80% de las comunidades bacterianas

tanto patógenas como no patógenas producen AIA, el rol del AIA en la interacción

microorganismo- planta es fundamental, debido a que en la planta el AIA controla diversos

procesos fisiológicos importantes que incluyen el alargamiento de las células y su división,

la diferenciación de tejidos, las respuestas a la luz y a la gravedad, entre otros.

Por tal razón, al producirse AIA por bacterias, éstas interactúan potencialmente

interfiriendo con muchos de estos procesos; aunque para el caso de las bacterias endófitas

la concentración de AIA es viable para la planta y su función es la de establecer la relación

físico-química entre los dos organismos (Figura 9-3). De allí que se denominen

Rizobacterias Promotoras de Crecimiento en plantas (PGPR), se asocian y colonizan sus

tejidos e incrementan el número de AIA producido que promueve el crecimiento al excretar

AIA como forma de enmascararse en los tejidos de las plantas sin ser detectadas por las

respuestas inmunes de éstas (Spaepen, Vanderleyden, & Remans, 2007)

Marco teórico 25

Figura 0-3: Interacción patogénica y simbiótica por medio de la producción de AIA en

bacteria

(Spaepen, Vanderleyden, & Remans, 2007)

1.12 Diversidad genética de bacterias fijadoras de nitrógeno.

La genética de las bacterias fijadoras de Nitrógeno presenta una alta diversidad. La enzima

nitrogenasa es codificada por un grupo de genes llamados nif, y las subunidades de la

enzima están codificadas por genes altamente conservados entre bacterias y arqueas,

como los genes nifH, nifD y nifK. De los tres genes, el gen nifH es el más importante

para muchos, el cual codifica para la subunidad nitrogenasa-reductasa, siendo el gen más

estudiado y secuenciado. Se ha relacionado con la filogenia, diversidad y abundancia de

microorganismos fijadores de Nitrógeno de diversos ambientes (terrestres y acuáticos), y

por ello se usa como marcador genético para caracterizar aspectos relevantes en cuanto

a diversidad y ecología de microorganismos diazótrofos; además, de asociarse con el

índice del proceso de FBN con su abundancia en las distintas especies y poblaciones.

(Gaby & Buckley, 2012)

Con lo anterior, la caracterización de bacterias fijadoras de Nitrógeno en los últimos años

se ha estructurado en Colombia como una línea de investigación en la cual se estudia la



diversidad de estas bacterias, como lo realizado por Borda, García Montaña y Martínez

(2011) al aislar bacterias del género Azotobacter spp. para su uso como bioinoculante en

plantaciones de Estevia (Stevia rebaudiana), especialmente de Azotobacter nigricans, en

diferentes muestras de suelo en el departamento de Boyacá. La selección de los

aislamientos más promisorios fue realizada al evaluar su crecimiento en medios

modificados Ashby-sucrosa y la caracterización molecular del 16S rRNA. De igual forma,

Garrido (2007), aisló de suelos sembrados con pastos para la ganadería diferentes

bacterias fijadoras de Nitrógeno, incluyendo enterobacterias, a partir de pruebas

moleculares para la identificación del género y la especie, y posteriormente caracterizó su

fijación biológica y producción de compuestos indólicos con la finalidad de reducir los

costos económicos y ambientales que se genera con la fertilización nitrogenada de síntesis

en los sistemas ganaderos. Adicionalmente, Valderrama (2014) aisló y caracterizó cepas

de nativas de Azotobacter spp en suelos rizosféricos de caña de azúcar (Saccharum

officinarum L. variedad CC 85-92 sembrada en el sur del Valle del Cauca, con el propósito

de usarlo como agente reductor de Urea para reducir la fertilización nitrogenada de síntesis

en el cultivo.

Por esta razón, en esa misma línea de desarrollo científico y tecnológico, actualmente

CENICAÑA dentro de su Área de Nutrición y Fertilización y con el apoyo del Área de

Fitopatología ejecutan un proyecto cuyo objetivo general es incrementar la eficiencia del

uso del Nitrógeno en el sistema de producción de la caña de azúcar en el valle del río

Cauca, y buscan cuantificar la FBN como el aporte de estas bacterias asociadas al cultivo

de la caña de azúcar. De acuerdo con la experiencia brasilera en el manejo de cultivos de

caña de azúcar inoculados con estas bacterias, han indicado que se obtiene un efecto

benéfico al otorgarle más de 150kg N/ha anual a partir de la FBN, resaltando que ha sido

ésta una estrategia clave para disminuir significativamente los costos de producción,

aumentar su área sembrada en caña de azúcar y reducir la contaminación ambiental

(Boddey, Polidoro, Resende, Alves, & Urquiaga, 2001)

Finalmente, la presente propuesta de investigación se ha desarrollado como trabajo en

conjunto entre las áreas (Fertilización y Nutrición, y de Fitopatología), se centró en el

conjunto de cepas bacterianas de los géneros de mayor importancia e impacto económico

como son Azospirillum spp., Azotobacter spp. y Gluconacetobacter spp., aisladas en

Marco teórico 27

diferentes variedades de caña de azúcar (CC 85-92, CC 84-75, CC 93-4418, y CC 01-

1940) que son representativas y de alta importancia para la agroindustria de la región. Los

aislamientos fueron evaluados in vitro en su capacidad de fijación de nitrógeno y

producción de compuestos indolicos., además se determinó la relación entre las tasas de

eficiencia de fijación de nitrógeno. Posteriormente, se amplificaron y secuenciaron los

genes 16S del ADN ribosomal para la identificación a nivel de especie y estudio de la

diversidad, y una región del gen nifH, cuya finalidad fue conocer e hipotéticamente hallar

diferencias genéticas que posiblemente justifiquen los atributos bioquímicos en cuanto a

su eficiencia de fijación de nitrógeno de los mejores aislamientos con respecto a las cepas

de referencia tipo publicadas internacionalmente y usadas en esta investigación.



Materiales y métodos

1.13 Selección y ubicación de los sitios de muestre o.

Este trabajo se desarrolló en la estación experimental del Centro de Investigación de la

Caña de Azúcar de Colombia (CENICAÑA), ubicado en el corregimiento de San Antonio

de los Caballeros (Municipio de Florida, Valle del Cauca), localizado a 3° 21' de latitud

norte, 76° 18' de longitud oeste y 1024 metros sobre el nivel del mar. La temperatura media

promedio anual es de 23,3 °C, precipitación promedio anual de 1141 mm y la humedad

relativa promedio de 80% (Cenicaña, 2014)

Las tierras dedicadas al cultivo de caña de azúcar se encuentran ubicadas a lo largo del

valle geográfico del río Cauca entre 3° y 5° latitud Norte y entre 76° 35’ y 75° 49’ de longitud

Oeste, en altitudes de 900 metros y 1150 metros sobre el nivel del mar. Desde el sur-

occidente del Departamento de Caldas, Risaralda, Quindío, Valle del Cauca, hasta el norte

del Cauca (Carbonell et al., 2011). El área total sembrada con caña corresponde a cerca

de 232.070 has. La selección y ubicación de los lotes o suertes para el muestreo se realizó

a través de una consulta geográfica con el software ArcGIS®. 108 suertes o lotes

comerciales fueron seleccionados cuyas características solicitadas correspondieron a las

variedades CC 85-92, CC 84-75, CC 01-1940 y CC 93-4418, sembradas en los mega-

ambientes Húmedo, Seco y Piedemonte (Carbonell et al., 2011), entre edades de 2 a 3

meses, 6 a 8 meses y 10 a 12 meses.

1.14 Muestreo y toma de muestras en campo

Los muestreos se realizaron sistemáticamente en suertes o lotes de cinco hectáreas,

teniendo en cuenta las instrucciones de recolección de muestras en campo de Cenicaña.

En cada suerte muestreada se tomaron 20 plantas de caña de azúcar (Ilustración 4). Las

hojas, los tallos, las raíces y el suelo rizosférico se trasladaron al laboratorio de

Fitopatología, donde se homogenizaron para obtener una muestra compuesta de cada

extracto de la planta

Figura 0-1: Representación del muestreo sistemático y unidad de muestreo

Marco teórico 29

1.15 Aislamiento y purificación de colonias bacteri anas en medios de cultivos selectivos

La siembra, cultivo y propagación de las colonias bacterianas, se realizó de acuerdo con

el método de aislamiento de bacterias simbióticas descrito por Holguin, Bashan y Ferreira-

Cerrato (1996) en hojas, tallos, raíces y suelo rizosférico. Los medios de cultivo usados

fueron el NFB para el aislamiento de Azospirillum spp., medio Ashby para Azotobacter

spp., incubados a 28°C, y el LGI-P para Gluconacetobacter spp., incubado a 30°C, durante

5 días. (Bashan , Holguin, & De-Basham, 2004) (Aquilanti, Flavilli, & Clementi, 2004) (Holt,

et al., 1984)

Al observarse la formación de películas bacterianas en los anteriores medios de cultivo,

una porción de estas películas fue sembrada nuevamente por agotamiento. La toma y

aislamiento de las colonias se realizó de acuerdo con las descripciones de Tarrand et al

(1978) y Wong-Stenberg (1979) para el género Azospirilllum spp que en medio Rojo Congo

presentaron colonias cóncavas con bordes enteros de color rojo escarlata, muy

característico de este género por su capacidad de absorber el colorante Rojo Congo.



Para la selección de las colonias típicas de Azotobacter spp, la descripción fenotípica

realizada por Aquilanti et al (2004) y Holt., (2000) permitió el aislamiento de colonias

mucosas, con bordes irregulares y pigmentadas. Jiménez et al., (1997) y Mehnaz et al.,

(2006) expusieron características coloniales para la identificación del género

Gluconacetobacter spp., a partir de colonias cóncavas, con centro amarillo-naranja por

absorción del colorante Azul de bromotimol, con bordes traslucidos y enteros.

1.16 Pruebas bioquímicas con diferentes tipos de carbohidratos para determinación del género.

De acuerdo con el Bergey’s® manual of determinate bacteriology editado por Holt et al.,

(1994), se consideraron una serie de pruebas bioquímicas para determinación de los

géneros con características de aeróbicas/microaerofílicas, motilidad, bacterias helicales,

Gram negativas para los géneros Azospirillum spp. y Gluconacetobacter spp. integrantes

de phylum de las α-Proteobacterias, y para el género Azotobacter spp., las características

de Gram negativas, aeróbicas/microaerofílicas, forma de bastones y cocos, integrante del

phylum de las β- Proteobacterias.

Las pruebas bioquímicas se realizaron conforme lo descrito por Hugh & Leifson (1953)

para la determinación del metabolismo oxidativo- fermentativo en bacterias Gram

negativas. Como controles o testigos positivos se utilizaron las cepas certificadas de

Azotobacter chroococcum NCBIM 8002, Azospirillum brasilense NCBIM 11860 y

Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985; además las cepas certificadas de

Escherichia coli como indicador de fermentador de glucosa, Pseudomonas aeuroginosa

como indicador de oxidación de glucosa y Burkholderia glumae control negativo o no

sacalítico. Estos indicadores se dispusieron como controles de calidad de la prueba de

metabolismo oxidativo - fermentativo.

La selección de los diferentes carbohidratos para la caracterización bioquímica de

aislamientos bacterianos (Tabla 10-1), se realizó usando las pruebas validadas por Holt

(1994) para bacterias del género Azotobacter spp., para el género Azospirillum spp. las

pruebas bioquímicas validadas por Pérez y Casas (2005), y por último, para el género

Gluconacetobacter spp. las pruebas bioquímicas validadas por Merhanz et al (2006).

Marco teórico 31

Tabla 0-1 : Pruebas bioquímicas para identificación de los géneros de Azospirillumspp.,

Azotobacter spp. y Gluconacetobacter spp. según (Holt, et al., 1984) (Casas & Perez,

2005) (Mehnaz, Weselowski, & Lazarovito, 2006)

Características diferenciales de bacterias Gram negati vas, móviles, aeróbicas, microaerofílicas , bacilos curvos, bacilos cortos y cocos ( α-proteobacteria y β-proteobacteria) según Bergey´s

Características Azospirillum Gluconacetobacter Azotobacter

bacilar curvado en un plano + - -

bacilar corto - + -

bacilos o cocobacilos - - +

diámetro celular (micras) 0.9-1.2µm 0.6-0.8µm 1.5-2.0µm

Bacteria Gram negativa + + +

gránulos intracelulares de PBH + - -

Formación de quistes - - +

Movilidad + + +/-

conformación flagelar polar peritricos peritricos

Aeróbicas + + +

Productoras de indol + + +

Actividad nitrogenasa en condiciones microaerofílicas + + +

Carbohidratos metabolizados

D-fructosa + - + D- glucosa + + +

D-manitol - - +

D- sucrosa - - +

D- maltosa - + +

D-lactosa + - +

D- arabinosa + - -

D- sorbitol - + -

D- xylosa - - -

sales orgánicas

Succinato + - -

Malato + - -

Citrato + - -

Oxidación Enzimática

Etanol a Ácido acético - + -

Oxidasa + + +

Catalasa + - +



El medio de cultivo O/F para la prueba de Oxidación/Fermentación se usó al 0,7% de agar,

se sirvió en tubos de 2cm de diámetro para incrementar la superficie, sin formación de pico

de flauta y sin burbujas. Una modificación que se consideró pertinente para la prueba de

Oxidación/Fermentación para el género Gluconacetobacter spp., fue usar como medio

base el LGI-P reemplazando la sacarosa por los diferentes carbohidratos.

Las soluciones stock de los diferentes carbohidratos se prepararon a una concentración

del 10% (p/v). Filtrado por membrana de 0.22µm. Al mezclarse el medio O/F y la solución

stock del carbohidrato en relación volumen-volumen la concentración final fue de 1% (p/v).

Finalmente, el cultivo se realizó sembrando soluciones bacterianas normalizadas con el

tubo 1 de la escala de MacFarland. Se adicionó aceite mineral estéril para el tubo cerrado

(prueba de fermentación), y tapa de algodón para el tubo abierto (prueba de oxidación)

(Hugh & Leifson, 1953).

1.17 Confirmación del género e identificación de la s especies bacterianas por secuenciación estándar (16S r DNA).

La confirmación molecular de los géneros y la identificación de las especies bacterianas

que se agruparon bioquímicamente, se realizó secuenciando la región ribosomal 16S

rDNA, debido a su alto nivel de conservación entre distintas especies de arquea y bacterias

y su amplio uso para los estudios filogenéticos. A partir de cultivos bacterianos purificados

y caracterizados morfológica y bioquímicamente, se realizó la amplificación, purificación y

secuenciación de este gen por la compañía Macrogen® (www.macrogenusa.com), que usó

cuatro pares de primers u oligonucleótidos universales externo (1492R

TACGGYTACCTTGTTACGACTT) y (27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG), seguido de la

amplificación con los oligonucleotidos (518F CCAGCAGCCGCGGTAATACG) y (800R

TACCAGGGTATCTAATCC) como primers internos.

Finalmente, Las secuencias obtenidas fueron analizadas en el programa Blast-n

empleando la base de datos mundial del GenBank del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

) (Altschul, Gish, Miller, Myers, & Lipman, 1990) y otras bases para el 16S rRNA como

Marco teórico 33

EzTaxon (http://www.ezbiocloud.net/eztaxon) y Ribosomal Database Project

(http://rdp.cme.msu.edu/) de Michigan State University en los Estados Unidos, y se logró

la identificación del género y la especie bacteriana para cada aislamiento secuenciado.

1.18 Determinación de Compuestos indólicos totales por el reactivo de Salkoski

Los aislamientos bacterianos se sembraron en caldo de enriquecimiento Dyg’s, para

Azospirillum spp y Gluconacetobacter spp, y el medio Burk´s para Azotobacter spp.

(Mehnaz, Weselowski, & Lazarovito, 2006) (Holguin & Ferrera-Cerato, 1996) El L-triptófano

como aminoácido precursor de las rutas metabólicas para la producción de Ácido-3-Indol

acético, se filtró por membrana de poro de 0,22µm y se añadió a los medios de cultivos

para conseguir una concentración final de 25µMol.L-1. Las siembras se realizaron por

triplicado, y se incubaron a 30°C toda la noche a 120 rpm, en oscuridad. Los tubos con

crecimiento bacteriano se transfirieron a tubos Eppendorf®, se centrifugaron a 10.000 rpm

refrigerados a 4°C. El sobrenadante se transfirió cuidadosamente a tubos de ensayo de

vidrio, adicionándose 2 volúmenes del reactivo de Salkoski (Pilet et al., 1970). Los tubos

se incubaron durante 30 minutos, pasado el tiempo se observó la coloración rosada o

fucsia que indicó la oxidación de la molécula de Ácido-3-Indolacético (AIA) (Garrido, 2007).

La cuantificación del AIA se realizó en el espectrofotómetro UV-VIS-1800 Shimadzu a una

longitud de onda de 535 nm. La curva estándar de AIA se compuso de 6 niveles de Ácido-

3-Indolacético con concentraciones de 250µMol; 200µMol; 150µMol; 100µMol; 50µMol;

25µMol. Cada una de las concentraciones y lecturas se realizó por triplicado, obteniéndose

un R2=0,99970.

1.19 Cuantificación de la producción de acetileno a etileno por el método Acetilene Reduction Assays (ARA)

La cuantificación de la reducción del acetileno y producción de etileno se realizó por medio

de la metodología ARA (Assays Reduction Acetylene) (Hardy, Holsten, Jackson, & Burns,

1968), usando cromatografía de gases para la cuantificación del etileno (C2H4). Como



primer paso hacia la cuantificación del etileno fue necesario la creación de un método

cromatográfico. Este método permitió que el cromatógrafo de gases Shimatzu GC-2010,

empleando la columna capilar alúmina con recubrimiento de Na2SO4, resultara sensible a

la detección de las señales del acetileno (C2H2) y etileno (C2H4) dentro de la compleja

matriz de metabolitos secundarios presentes en la respiración bacteriana.

Así entonces, el primer paso fue encontrar las condiciones cromatográficas de detección

que se describen en la siguiente Tabla 10-2.

Tabla 0-2 : Condiciones Cromatográficas para la detección de Acetileno- Etileno.

Condiciones Cromatográficas

Equipo Cromatógrafo de gases GC 2010 Marca Shimadzu

Puerto de inyección 200 °C Tipo de inyección Inyección manual splitless (inyectando 50 ul) Gas de arrastre Helio (flujo: 50 ml/minuto)

Columna Alumina Na2SO4 (Restek)

Rampa de temperatura

Inicia a 75 °C y permanece durante 1 minuto

Incrementos de 50 °C hasta llegar a 120 °C y permanece durante 1 minuto

Incrementos de 40 °C hasta llegar a 180 °C y permanece durante 1 minuto

Detector FID (Flame Ionization Detector) a 200 °C Tiempo de lectura por inyección 7 minutos

Una vez creadas las condiciones cromatográficas, el siguiente paso fue la elaboración de

la curva estándar de etileno-acetileno compuesta por 6 niveles de entre 500 ppm, 400 ppm,

250 ppm, 125 ppm, 62,5 ppm y 0 ppm para el etileno y de acetileno de 250 ppm, 200 ppm,

125 ppm, 62,5 ppm, 31.25 ppm y 0 ppm. Cada nivel de la curva se realizó diluyendo las

concentraciones iniciales del etileno 1000 ppm y de acetileno 500 ppm a partir de una

solución 1:1 de etileno-acetileno obteniendo 500 ppm de etileno y 250 de acetileno. Con la

anterior mezcla se realizaron las diluciones estándar y para alcanzar el valor de la dilución

se usó nitrógeno (N2) de alta pureza.

Marco teórico 35

La curva estándar se elaboró y se leyó por triplicado, obteniéndose para el etileno un R2=1,

con un límite de detección en áreas mayores a 59,17 ppm y el límite de cuantificación en

áreas mayores de 149,90 ppm. Para el acetileno se obtuvo un R2=0,97883, con un límite

de detección en área mayores a 41,683 ppm y un límite de cuantificación en áreas mayores

a 107,650 ppm.

Una vez validadas las curvas estándar se procedió a la preparación de los aislamientos

bacterianos y sus respectivos controles positivos Azotobacter chroococcum NCBIM 8002,

Azospirillum brasilense NCBIM 11860 y Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985

según lo descrito por Garrido. (2007).

Los inóculos iniciales con sus respectivos controles se crecieron toda la noche en medios

de enriquecimiento Dygs para Azospirillum y Gluconacetobacter y en medio enriquecido

No.14 para Azotobacter. (Garrido M. , 2007) (Mehnaz, Weselowski, & Lazarovito, 2006)

Al observarse la turbidez en los medios de cultivo se tomó 1mL del inoculo, se centrifugó

y resuspendió en solución de buffer fosfatos y normalizado a una concentración de 0,092

de absorbancia del patrón de 0,5 de la escala de Macfarland, que correspondió a una

suspensión homogénea de 1,5x108 células /mL aproximadamente. Se tomaron 100 µL de

las suspensiones bacterianas y se inocularon los medios de cultivo NFB, LGI-P y medio

Ashby semisólidos al 0,7% p/v, contenidos en los viales Headspace de Restek®. Las

inoculaciones se realizaron por triplicado.

Los viales se sellaron con tapas de Aluminio Septa de silicona de Restek®, Posteriormente

se inyectaron con 1 mL de gas de acetileno con una concentración v/v de 300 ppm de

acetileno de alta pureza (Garrido M. F., 2007).

Finalmente, los viales se incubaron durante 72 horas a 30°C con sus respectivos controles

positivos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación se dispuso a tomar 50 µL de las

tres repeticiones con jeringa de cromatografía SGE®. La inyección se realizó por cada

repetición dos veces y se inyectó manualmente en el cromatógrafo de gases GC-2010

ajustando y manteniendo constante el flujo para evitar variabilidad.



1.20 Selección y secuenciación de los genes involuc rados

en la fijación de nitrógeno

La selección de los genes que conforman el clúster nif se basó en la caracterización

realizada Joerge and Bishop (1988) en la bacteria fijadora de Nitrógeno Azotobacter

vinelandii (modelo bacteriano). Las secuencias de estos genes se encontraron

almacenadas en la base de datos www.expasy.com . Las secuencias proteicas y genéticas

de la enzima nitrogenasa se descargaron de la base de datos, posteriormente se realizó

el agrupamiento de genes nif para el género Azospirillum spp., Azotobacter spp. y

Gluconacetobacter spp. Las secuencias de nucleotidos se alinearon por Blast-n de la base

de datos de NCBI. Los genes con menores valores de (E-value) fueron los que presentaron

homología entre los géneros bacterianos. Una vez seleccionados los genes con mayor

homología, se diseñaron los oligonucleótidos o primers in-silico usando las bases de datos

del NCBI. Obteniéndose para el género Azospirillum los primers Azp1.

Figura 0-2: Secuencia de nucleótidos de los primers Azp1 y su condición cinética de

amplificación de un fragmento de 1076 bp del gen nifH del género Azospirillum spp

Para el género Gluconacetobacter spp los primers obtenidos fueron:

Figura 0-3: Secuencia de nucleótidos de los primers Gdb1 y su condición cinética de

amplificación de un fragmento de 898 bp del gen nifH del género Gluconacetobacter spp.

Marco teórico 37

La extracción del ADN genómico, la síntesis y condiciones de amplificación, la

amplificación por PCR convencional, la purificación del producto de PCR y su posterior la

secuenciación fueron realizados por la compañía Macrogen® (www.macrogenusa.com).

Las secuencias obtenidas fueron editadas en el programa Geneious®, creando los

ensamblajes a partir de cada secuencia de sentido 5’ – 3’ (Forward) y antisentido 3’ – 5’

(Reverse). (Altschul, Gish, Miller, Myers, & Lipman, 1990) (Kumar, Stecher, & Tamura,

2015)

Para la traducción a proteína, las secuencias fueron traducidas usando la herramienta en

línea de www.bioinformatic.org, ubicando los marcos de lectura de cada secuencia, usando

el código genético bacteriano. Una vez obtenidas las secuencias proteicas estas fueron

alienadas usando ClustalW con matriz BLOSUM 62, el alineamiento se realizó usando la

accesión CAA35868.1 del gen nifH de Azospirillum brasilense y para para los

alineamientos de Gluconacetobacter se usó la accesión AAD00271.1 gen nifH

Gluconacetobacter diazotrophicus..

Las secuencias obtenidas del gen nifH se alinearon con secuencias representativas de

este gen presentes en otros organismos aislados de plantas depositadas en las bases de

datos del NCBI GenBank y en otras bases como la nifH gene Database

(http://www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm Gaby and Buckley, 2014) entre otras

publicaciones.



Resultados y discusión

1.21 Aislamientos y selección fenotípica de bacteri as fijadoras de nitrógeno en medios de cultivo selecti vos

A partir de las 108 suertes o lotes muestreados a lo largo del Valle geográfico del rio Cauca

(Figura 11-1), se obtuvieron presuntivamente 111 aislamientos purificados y seleccionados

por su crecimiento en los medios de cultivo selectivos sin fuente de nitrógeno, teniendo en

cuenta su morfología de colonia descrita por Tarrand et al (1978), Wong y Stenberg (1979)

para el género Azospirillum spp, Aquilanti et al (2004) y Holt (2000) para el género de

Azotobacter spp y finalmente, Jimenez y Mehnaz et al (2006) para el género de

Gluconacetobacter spp. Estos 111 aislamientos provinieron de hojas, tallos, raíces y suelo

rizosférico de las variedades CC 85-92, CC 84-75, CC 01-1940 y CC 93-4418 sembradas

en lotes comerciales ubicados en diferentes mega-ambientes Húmedo, Semiseco y de

Piedemonte (Carbonell et al., 2011), y que actualmente conforman el cepario de bacterias

fijadoras de nitrógeno del Centro de Investigación de la Caña de Azúcar de Colombia

(CENICAÑA).

Marco teórico 39

Figura 0-1 Ubicación geográfica de los sitios muestreo, los mapas indican las zonas agroecológicas y sus megabientes. La selección de los sitios se filtró usando información acerca de los ingenios, haciendas, ambientes y variedades (CC 85-92, CC 84-75, CC 01-1940 y CC 93-4418) con el programa ArcGIS® para la consulta geográfica de la ubicación de las suertes que correspondieron a estas características de selección. Los puntos dentro del recuadro marcan los sitios de ubicación de las suertes muestreadas.



1.22 Identificación bioquímica de los aislamientos de

bacterias fijadoras de nitrógeno asociadas a las variedades de caña de azúcar

La selección morfológica de los 111 aislamientos permitió un primer acercamiento hacia la

obtención de un robusto grupo basado en caracteres visuales descritos por Tarrand et al

(1978), Wong y Stenberg (1979) para el género Azospirillum spp, Aquilanti et al (2004) y

Holt (2000) para el género de Azotobacter spp y finalmente, Jimenez y Mehnaz et al (2006)

para el género de Gluconacetobacter spp. comunes de las colonias de las bacterias. El

agrupamiento bioquímico generó tres agrupaciones que estadísticamente explicó el 91%

de la variabilidad bioquímica entre los aislamientos y los carbohidratos metabolizados (ver

Tabla 10-1) (Tabla 11-1)

Tabla 0-1 : Grupos o clusters generados a partir del metabolismo bioquímico de los

aislamientos bacterianos obtenidos.

AGRUPAMIENTO POR PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Grupo

Frecuencia

R²

3 CL4 Azot-105 48 91% 2 CL5 CL23 63 81% 1 CL3 CL2 111 0%

En cuanto a la caracterización con base en pruebas bioquímicas para cada uno de los

géneros de estudio, se obtuvieron tres grupos o clusters mayores, como se presentan en

la Figura 11-2. El primer grupo se compuso de 13 aislamientos dentro del género

Azospirillum spp y 35 aislamientos dentro del género Azotobacter spp con sus respectivas

cepas de referencia o controles como Azospirillum brasilense NCBIM 11860 y Azotobacter

chroococcum NCBIM 8002. A pesar que dentro de esta agrupación se exhibieron

pequeñas sub-agrupaciones o clados entre los géneros, la conformación de este grupo

Marco teórico 41

índicó que estadísticamente se presentaron características metabólicas comunes entre

ambos géneros, y esta conexión se explicó biológicamente a través de la variabilidad

generada por la especie, produciendo una alta variabilidad en la respuesta metabólica de

los aislamientos con respecto a los diferentes azúcares, obteniéndose una serie de

combinaciones bioquímicas. (Ahmed et al., 2015)

El resto de aislamientos que presentaron otras combinaciones bioquímicas, se agruparon

dentro del grupo 2, este grupo se integró estadísticamente por 5 aislamientos del género

Azospirillum spp y 22 aislamientos del género Azotobacter spp, sin la presencia de los

controles positivos de referencia.

El tercer grupo estadísticamente se compuso por 34 aislamientos dentro del género

Gluconacetobacter spp, este grupo se caracterizó por ser un grupo homogéneo, debido a

su respuesta bioquímica, lo que permitió mayor reproducibilidad en las combinaciones con

su control positivo Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985. Para este grupo

bioquímico Menhaz et al (2006) indicó que este género es metabólicamente homogéneo

por integrar pocas especies.

Ante la formación de los grupos o clusters bioquímicos dentro de los cuales tanto el grupo

1 y 2 presentaron ser conglomerados mezclados de ambos géneros bacterianos de

Azospirillum spp y Azotobacter spp, a causa de las alteraciones en los patrones

metabólicos creado por la presencia de la especie. Lo anterior indicó que la complejidad

en la diversidad fisiológica de las comunidades microbianas depende de su nicho, donde

éstos ecotipos o poblaciones ecológicas bacterianas usan el mismo o nichos ecológicos

similares, lo cual induce a que se presenten niveles modestos de similitud tanto en su

respuesta fisiológica como en sus secuencias genéticas. (Spratt.B.G, Staley.J.T,



Fisher.M.C., 2016) por esta razón, dada la variabilidad metabólica se procedió a realizar la

identificación molecular de cada aislamiento. (Tabla 11-2)

Tabla 0-2 : Grupos o clusters de pruebas bioquímicas de los aislamientos aglomerados

dentro de los géneros Azospirillum spp, Azotobacter spp y Gluconacetobacter spp

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA AGRUPAMIENTO

GENERO 1

2

3 Total Azospirillum spp 13

5

0 18

Azotobacter spp 35

24

0 59 Gluconacetobacter spp 0

0

34 34

Total 48

29

34 111 43,24% 26,13% 30,63% 100

Marco teórico 43

Figura 0-2 Grupos o clusters generados a partir del análisis estadístico por conglomerados, el cluster 1 agrupó 13 aislamientos Azospirillum y 35 de Azotobacter con sus respectivos controles positivos de Azospirillum brasilense NCBIM 11860 y Azotobacter chroococcum NCBIM 8002, el cluster 2 agrupó 5 de Azospirillum y 22 de Azotobacter, mientras el cluster 3 homogéneamente agrupó 34 aislamientos dentro del género de Gluconacetobacter incluyendo el control positivo de Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985.

3 2 1

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

8002

11

860

1298

5



1.23 Identificación genética del género y especie p or secuenciación de la región 16S rDNA

La identificación para el grupo de los 111 aislamientos bacterianos, por medio de la

amplificación y posterior secuenciación de un fragmento de 1300pb de la región

conservada del gen 16S rDNA, se obtuvo usando Blast-n (Local Aligment and Search tool)

empleando la base de datos mundial del GenBank del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

con lo cual se logró confirmar el género bacteriano e identificar la especie.

De los 111 aislamientos, se obtuvieron 15 aislamientos confirmados dentro del género

Azospirillum spp, identificándose 13 de especie A. brasilense y dos aislamientos de las

especies A. lipoferum y A. formosense (Tabla 11-3); pero también se identificaron dos

aislamientos de grupos taxonómicos diferentes como Rhizobium spp y Stenotrophomonas

spp.

Tabla 0-3 : Base de datos de aislamientos obtenidos dentro del grupo de Azospirillum

con su procedencia e identificación taxonómica del género y especie por amplificación del

gen 16S r DNA

Aislamiento Zona Geográfica Ambiente Variedad Edad Identificación Molecular Identidad

(%) E-

value Accesión Genbank

1 Sur Húmedo CC 93-4418 12 Azospirillum brasilense 99 0 KP676402.1

2 Sur Seco CC 85-92 12 Azospirillum brasilense 99 0 KT374217.1

3 Centro Húmedo CC 93-4418 11 Azospirillum brasilense 99 0 KT374217.1

4 Centro Seco CC 85-92 3 Azospirillum brasilense 99 0 CP012914.1

5 Centro Seco CC 85-92 3 Azospirillum formosense 99 0 CP007797.1

6 Norte Seco CC 93-4418 6 Azospirillum brasilense 99 0 CP007797.1

7 Norte Semiseco CC 93-4418 4 Azospirillum brasilense 99 0 CP007797.1

8 Sur Seco CC 93-4418 6 Azospirillum brasilense 100 0 KT374217.1

9 Centro Piedemonte CC 85-92 12 Azospirillum lipoferum 99 0 EF100149.1

10 Centro Piedemonte CC 85-92 6 Rhizobium cellulosilyticum 98 0 NR043985.1

11 Sur Piedemonte CC 01-1940 6 Stenotrophomonas maltophilia 99 0 CP011010.1


Marco teórico 45


(%) E-


13 Sur Piedemonte CC 93-4418 3 Azospirillum brasilense 99 0 CP007797.1


15 Centro Húmedo CC 85-92 6 Azospirillum brasilense 99 0 KT374217.1

16 Sur Húmedo CC 01-1940 3 Azospirillum brasilense 99 0 CP007797.1|

17 Centro Semiseco CC 84-75 10 Azospirillum brasilense 99 0 KP676402.1

Los resultados de aislamiento e identificación molecular de este género, coinciden con lo

hallado por Garrido (2007) con el aislamiento e identificación de bacterias diazotróficas

asociadas a cultivos de pastos (Panicum máximum, Dichantium aristatum y Brachiaria sp)

en el Cesar, obteniendo dentro de sus aislamientos cuatro (4) cepas bacterianas fenotípica

y molecularmente dentro del género Azospirillum spp con predominancia de las especies

A. lipoferum y A. brasilense,

Los anteriores hallazgos confirman la presencia de A. lipoferum y A. brasilense como las

especies más comunes y asociadas a las gramíneas, de acuerdo con Caballero-Mellado.,

(2006) estas dos especies presentan una amplia distribución geográfica y abundancia en

regiones tropicales y su presencia indica la buena condición de humedad, porcentaje de

arcillas, contenido de materia orgánica y contenido positivo de nitrógeno en los suelos. .

(Ver tabla 11-3 arriba)

Para los aislamientos agrupados bioquímicamente dentro del género bacteriano

Gluconacetobacter spp, se confirmó dicho genero genéticamente. Este grupo bacteriano

se conformó de dos especies G. diazotrophicus como la especie predominante

obteniéndose 32 biotipos, y dos aislamientos bacterianos identificados como G. sacchari;

además se identificó la presencia de Leunoconostoc mesenteroides aislamiento que hizo

presencia en los medios de cultivo como flora acompañante (Tabla 11-4).

G. diazotrophicus ha sido reportado en plantas de caña de azúcar (Saccharum spp) como

uno de los hospedantes más comunes en estas gramíneas, además de ser una de las tres

especies dentro de la familia Acetobacteraceae con la capacidad de fijación de nitrógeno

(G. azotocaptan y G. johannae), y la única especie que fija nitrógeno en caña de azúcar y

otras gramíneas (Franke. I.H, Fegan. M, Hayward.C, Leonard.G, Sly. L.I., 2000)



Tabla 0-4 : Base de datos de aislamientos dentro del grupo de Gluconacetobacter, con su procedencia e identificación taxonómica del género y especie por amplificación del gen 16S r DNA.

Aislamiento Zona Geografía Ambiente Variedad Edad Identificación Molecular Identidad

(%) E-


20 centro Semiseco CC 93-4418 6 Leuconostoc mesentereoides 99 0 KR816162.1

21 Centro Piedemonte CC 93-4418 10 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074292.1

22 Sur Semiseco CC 01-1940 4 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 KP974662.1

23 Norte Piedemonte CC 85-92 12 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074292.1

24 Centro Húmedo CC 93-4418 7 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074292.1

25 Sur Húmedo CC 01-1940 12 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074292.1

26 sur Húmedo CC 01-1940 12 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 KP969074.1

27 Sur Piedemonte CC 01-1940 6 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074292.1

29 Norte Semiseco CC 85-92 7.8 Gluconacetobacter diazotrophicus 98 0 NR074292.1

30 sur Piedemonte CC 01-1940 10 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 KP969074.1



33 Norte Piedemonte CC 93-4418 10 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 KP969074.1

34 Sur Piedemonte CC 01-1940 6 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074284.1

35 sur Húmedo CC 01-1940 8 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 KP974662.1

36 Norte Seco CC 85-92 9 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074284.1

37 Norte Húmeda CC 93-4418 5 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074292.1

38 Sur Húmeda CC 93-4418 12 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 KP974662.1

39 Sur Semiseco CC 01-1940 11 Gluconacetobacter diazotrophicus 92 0 NR074292.1

40 Norte Seco CC 93-4418 6 Gluconacetobacter diazotrophicus 96 0 KP969074.1

41 Sur Piedemonte CC 93-4418 10 Gluconacetobacter diazotrophicus 97 0 KP969074.1


43 Centro Semiseco CC 85-92 11 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074292.1


45 Sur Semiseco CC 85-92 12 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074284.1

46 Sur Húmeda V 71-51 12 Gluconacetobacter diazotrophicus 96 0 NR074284.1

47 Norte Seco CC 85-92 12 Gluconacetobacter sacchari 99 0 KP969074.1

48 Sur Semiseco V 71-51 12 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 LC108744.1

49 Norte Húmedo CC 85-92 3 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 KP969074.1

50 Sur Húmeda V 71-51 12 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074292.1


52 Norte Seco CC 85-92 12 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074292.1

53 Norte Húmedo CC 84-75 6 Gluconacetobacter diazotrophicus 99 0 NR074284.1

Marco teórico 47

El clúster bioquímico identificado como Azotobacter spp, presentó aislamientos dentro del

grupo 1 y 2, sin embargo, molecularmente se identificaron 20 aislamientos en el género

Azotobacter spp., compuesto por 10 aislamientos de la especie A. chroococcum, seis de

A. tropicalis, tres de A. vinelandii y uno de A. salinestris (Tabla 11-5).

Los 35 aislamientos restantes se identificaron dentro otros grupos taxonómicos

bacterianos: uno de Filimonas lacunae,uno de Agrobacterium fabrum, uno de A.

tumefaciens, dos de Rhizobium borbori, dos de R. daejeonense, dos de R. etli, uno de

Kosakonia arachidis, cuatro de K. oryzae, cuatro de Lactobacillus plantarum, cinco de L.

paraplantarum, dos de Stenotrophomonas maltophilia, dos de Chyseobacterium jootei, uno

de Paenibacillus graminis, uno de Shiphonobacter aquaeclarae, uno de Pseudomonas

hibiscicola, uno de Sphingomonas sp, tres de Flavobacterium sp. y dos aislamiento no

identificados o nunca cultivados “Unculture o Unidenfied bacterium” (Tabla 11-5)

Según Jiménez et al., (2011) las especies de A. chroococcum, A. tropicalis, A. vinelandii y

A. salinestris, son cuatro de las siete especies que componen al género Azotobacter spp,

estas especies presentan una amplia distribución en suelos, aguas y sedimentos.

En Colombia se encuentran asociadas a los suelos cultivados con brócoli orgánico

(Brassica oleracea var. itálica), calabacín (Curcubita pepo), coliflor (B. oleracea var.

botrytis), espinaca (Spinacia oleracea), tomate (Solanum lycopersicon) y zanahoria

(Daucus carota), siendo A. nigricans la especie más frecuentemente aislada y asociada a

dichos cultivos. Actualmente sus aislamientos se usan como inoculantes para cultivos de

papa (Solanum tuberosum), en cultivos de Dendranthema grandiflora, Stevia rebaudiana,

vegetales y algodón. (Jiménez , Salvador Montaña, & Mercedes Martínez, 2011)

54 Norte Seco CC 85-92 12 Gluconacetobacter sacchari 99 0 NR074284.1



Tabla 0-5 : Base de datos de aislamientos obtenidos dentro del grupo de Azotobacter,

con su procedencia e identificación taxonómica del género y especie por amplificación del

gen 16S r DNA


(%) E-

value accesión Genbank

55 Centro Semiseco CC 84-75 10 Azotobacter chroococcum 96 0 KP099933.2

56 Centro Semiseco CC 84-75 10 Lactobacillus paraplantarum 99 0 KR153313.1

57 Norte Semiseco CC 93-4418 4 Filimonas lacunae 98 0 AP017422.1

58 Sur Piedemonte CC 93-4418 10 Azotobacter tropicalis 99 0 AB236160.1

59 Centro Semiseco CC 84-75 10 Azotobacter tropicalis 99 0 CP004406.1

60 Norte Semiseco CC 85-92 8 Filimonas lacunae 98 0 AP017422.1

61 centro Semiseco CC 93-4418 6 Azotobacter chroococcum 98 0 CP010415.1

62 Norte Húmedo CC 01-1940 12 Agrobacterium fabrum 98 0 KX504322.1

63 Sur Húmedo CC 85-92 12 Rhizobium daejeonense 99 0 JQ659582.1

64 Centro Húmedo CC 85-92 10 Rhizobium daejeonense 99 0 JQ659582.1

65 Centro Semiseco CC 01-1940 2 Azotobacter vinelandii 99 0 EF620447.1

66 Sur Húmedo CC 85-92 12 Unidentified bacterium 99 0 AY345544.1

67 Centro Húmedo CC 93-4418 7 Azotobacter chroococcum 99 0 KP099933.2

68 centro Piedemonte CC 01-1940 3 Kosakonia orysae 99 0 CP014007.1

69 Centro Húmedo CC 85-92 8 Agrobacterium tumefaciens 99 0 DQ267109.1

71 Sur Semiseco CC 01-1940 11 Unculture bacterium 95 0 CP010415.1

73 centro Semiseco CC 93-4418 6 Azotobacter chroococcum 99 0 EF620440.1

74 Centro Húmedo CC 93-4418 7 Azotobacter chroococcum 99 0 CP014007.1

75 Centro Húmedo CC 85-92 10 Kosakonia orysae 99 0 DQ207361.1

76 centro Piedemonte CC 01-1940 7 Sphingomonas sp. 99 0 AB560596

77 Centro Húmedo CC 93-4418 7 Flavobacterium sp 99 0 KR816164.1

78 centro Semiseco CC 93-4418 6 Lactobacillus plantarum 99 0 JQ291601.1

79 Centro Semiseco CC 01-1940 2 Shiphonobacter aquaeclarae 80 0 EU074830.1

79-2 Centro Semiseco CC 01-1940 2 Lactobacillus plantarum 94 0 CP014007.1

80 Centro Húmedo CC 93-4418 11 Kosakonia orysae 100 0 CP010415.1

81 centro Piedemonte CC 01-1940 7 Azotobacter chroococcum 99 0 CP005095.1

82 Centro Semiseco CC 01-1940 2 Azotobacter vinelandii 99 0 KX430836.1

83 Norte Semiseco CC 85-92 8 Lactobacillus paraplantarum 99 0 AB236160.1

84 Sur Humeda CC 93-4418 12 Azotobacter tropicalis 99 0 KP099933.2

85 centro Piedemonte CC 01-1940 7 Azotobacter chroococcum 94 0 GU356639.1

86 Centro Semiseco CC 01-1940 12 Rhizobium borbori 99 0 KC136825.1

87 Norte Semiseco CC 85-92 7.8 Stenotrophomonas maltophilia 97 0 JF772477.1

88 Norte Semiseco CC 01-1940 6 Flavobacterium sp 99 0 CP014007.1

Marco teórico 49


(%) E-

value accesión Genbank

89 Centro Húmedo CC 85-92 10 Kosakonia orysae 99 0 KU707913.1

90 sur Piedemonte CC 01-1940 10 Stenotrophomonas maltophilia 94 0 NR114166.1

91 Centro Semiseco CC 85-92 11 Azotobacter vinelandii 99 0 AB560596

92 Centro Húmedo CC 93-4418 7 Flavobacterium sp 99 0 CP009287.1

93 centro Piedemonte CC 01-1940 7 Paenibacillus graminis 90 0 KP345894.1

94 Sur Semiseco CC 01-1940 11 Lactobacillus plantarum 99 0 AB236160.1

95 Sur Húmeda CC 93-4418 12 Azotobacter tropicalis 99 0 KC550299.1

96 Norte Húmedo CC 01-1940 12 Lactobacillus plantarum 99 0 KU058436.1

97 Norte Húmedo CC 01-1940 12 Chryseobacterium joostei 94 0 CP010415.1

99 Norte Húmedo CC 01-1940 12 Chryseobacterium joostei 94 0 KU058436.1

100 Sur Húmeda CC 93-4418 12 Lactobacillus paraplantarum 99 0 KX430836.1

101 centro Piedemonte CC 01-1940 7 Azotobacter chroococcum 99 0 CP010415.1


103 Norte Piedemonte CC 85-92 12 Kosakonia arachidis 99 0 KM401872.1


105 Centro Semiseco CC 84-75 3 Rizobium etli 81 0 EF506199.1

106 Centro Piedemonte CC 93-4418 10 Rhizobium borbori 99 0 GU356639.1

107 Centro Húmedo CC 93-4418 11 Pseudomonas hibiscicola 93 0 KF836437.1

108 Centro Húmedo CC 85-92 4 Kosakonia orysae 99 0 CP014007.1

109 centro Semiseco CC 93-4418 6 Azotobacter chroococcum 99 0 KP099933.2

110 Centro Húmedo CC 93-4418 7 Azotobacter chroococcum 100 0 KP099933.2

111 Norte Semiseco CC 85-92 8 Azotobacter salinestris 100 0 JN641802.1

Finalmente, la selección taxonómica de los aislamientos dentro de los géneros se confirmó

por medio de la identificación polifásica (Rodicio & Mendoza, 2004), con lo cual se

consideró utilizar nuevamente los criterios fenotípicos descritos por Tarrand et al (1978),

Wong y Stenberg (1979) para el género Azospirillum spp, Aquilanti et al (2004) y Holt

(1994) para el género de Azotobacter spp y finalmente, Jimenez y Mehnaz et al (2006)

para el género de Gluconacetobacter spp., en conjunto con los datos obtenidos de la

secuenciación.



1.24 Cuantificación de compuestos indólicos y selec ción

de los aislamientos con mayor potencial en la producción de fitohomonas.

Los tres grupos identificados bioquímicamente dentro de los géneros Azospirilllum spp,

Azotobacter spp y Gluconacetobacter spp fueron evaluados al cuantificase su producción

de compuestos indólicos (Ácido Indol-3-Acético) como bacterias PGPR (Plant Growth

Promoting Rhizobacteria). Para determinar las diferencias en la producción de AIA entre

los aislamientos agrupados en los géneros y entre los tres géneros bacterianos, se ajustó

el modelo cuyos factores fueron el género y el aislamiento anidado en el género. Como

resultado se obtuvo conforme el análisis de varianza (Test tipo III) diferencias

estadísticamente significativas de producción de AIA entre los géneros (F=1285,29, P

<0,0001) y entre los aislamientos dentro de los géneros (F=138,17; P<0,0001). Por lo

anterior, la prueba de Bonferroni al 5% determinó que entre los géneros bioquímicos de

Azospirilllum spp, Azotobacter spp y Gluconacetobacter spp se presentaron diferencias

significativas (Tabla 11-6).

Tabla 0-6 : Ácido-3-Indol acético (AIA) promedio por género de bacteria

Género AIA promedio (µg. ml-1) Error Std Bonferroni 5%

Azospirillum spp 42,3 0,69 A

Azotobacter spp 41,8 0,38 A

Gluconacetobacter spp 19,9 0,25 B

Letra diferente indica diferencias significativas al 5%

Se determinó que el género Azospirillum spp tuvo el mayor promedio de prodicción de AIA

con 42,3 µg. ml-1 , seguido del género Azotobacter spp con un promedio muy cercano de

41,8 µg. ml-1 de producción de compuestos indólicos, sin ser estadísticamente diferentes

dada la variabilidad entre aislamientos, y siendo mayores y estadísticamente diferentes al

Marco teórico 51

género Gluconacetobacter spp, que presentó un promedio de 19,9 µg. ml-1 , siendo el

promedio más bajo de producción de AIA entre géneros.

Los resultados obtenidos son comparables con lo publicado por Bashan et al. (2004) y

Cardenas. (2007), quienes al caracterizar aislamientos del género Azospirillum spp,

concluyeron que este género, en cuanto a la producción de Ácido-3-Indol acético y otros

compuestos como el ácido giberélico (GA3) y ácido abscísico (ABA) presentó un alto

potencial en producción de hormonas con respecto a otros géneros pertenecientes a las

familias Rhizobiaceae, Pseudomonadaceae (incluye el género Azotobacter spp),

Enterobacteriaceae, entre otros, produciendo un promedio de 40,17 µg. ml-1 de AIA con

Azospirilllum brasilense cepa SP7, destacándose dicho género como un promotor de

crecimiento radical PGPR.

Otro género con potencial en la producción del AIA fue el género Azotobacter spp que

produjo un promedio de 41,8 µg. ml-1. Con respecto a la literatura, este género tuvo una

producción mayor de AIA a lo publicado por Borda-Molina et al., (2009) a partir del

aislamiento de Azotobacter nigricans obtenido en cultivos de Stevia rebaudiana sembrada

en regiones de Antioquia, Valle del Cauca y Llanos orientales, para su posterior uso como

biofertilizante. Estas cepas reportaron un promedio de 38,4 µg. ml-1. ingresando al rango

de promedio entre 3 µg ml-1 y 65 µg ml-1 dado por diferentes autores acerca de la

producción de AIA en este género (Anwar G., 2000).

El género Gluconacetobacter spp obtuvo la más baja producción de AIA con respecto a los

géneros mencionados anteriormente con un promedio de 19,9 µg. ml-1. Patil. B et al. (2011)

y Muthukumarasamy et al. (2002) publicaron promedios cercanos al obtenido de AIA en

Gluconacetobacter diazotrophicus cepa PA1-5 de 15,0 y 12,5 µg. ml-1, y Fuentes –

Ramírez et al., (1993) citado por Reis, Lee and Kennedy (2007), registraron un rango de

promedios para este género entre 0,14 µg. ml-1 y 2,42 µg. ml-1, permitiendo considerar que

los aislamientos obtenidos por la presente investigación son de alto potencial en la

producción de AIA al compararse con lo registrado en la literatura.

De igual manera, se hizo la prueba de comparación de promedios de Bonferroni (α= 0,05)

para los aislamientos dentro de cada género, y se obtuvieron aislamientos bacterianos con

producciones de Ácido-3-Indol acético estadísticamente diferentes.



Así entonces, para el grupo de bacterias dentro del género Azospirillum spp se obtuvieron

aislamientos con producciones mayores al control positivo de referencia Azospirillum

brasilense NCBIM 11860 que produjo un promedio de AIA de 26,58 µg. ml-1. . De los 17

aislamientos, 12 superaron estadísticamente al control de referencia; el aislamiento

identificado como No. 14, proveniente de la variedad CC 84-75 del mega-ambiente

Húmedo, superó estadísticamente a los demás aislamientos dentro de este género al

producir un promedio de 84,91 µg. ml-1. La Figura 11-3 presenta al aislamiento No. 14

como el mayor productor de AIA que el resto de aislamientos con respecto al control

positivo identificado como No. 18.

Figura 0-3 AIA promedio de los aislamientos del Género Azospirillum spp.

Aislamientos que comparten una letra no pueden considerarse estadísticamente diferentes

Marco teórico 53

Este aislamiento No. 14 es seguido en producción de AIA por los aislamientos No.11 con

promedio de AIA de 56,75 µg. ml-1 obtenido de la variedad CC 93-4418 de ambiente de

Piedemonte, el aislamiento No.6 con 55,61 µg. ml-1. de la variedad CC 93-4418 sembrada

en zona Seca y el aislamiento No. 12 con 55,44 µg. ml-1. de la variedad CC 93-4418

sembrada en mega-ambiente Húmedo.

Así mismo, los aislamientos que reportaron diferencias estadísticas con respecto al control

fueron No.16 con 50,38 µg. ml-1 de la variedad CC 01-1940 de ambiente Húmedo , No. 17

con 49,76 µg. ml-1 de la variedad CC 84-75 de Zona Seca, No. 3 con 47,20 µg. ml-1 de la

variedad CC 93-441de zona Húmeda , No. 5 con 45,88 µg. ml-1 de la variedad CC 85-92

de zona Seca, No. 13 con 45,15 µg. ml-1 variedad CC 93-4418 de Piedemonte, No. 9 con

44,95 µg. ml-1 de CC 85-9 2 de Piedemonte, No. 4 con 43,13 µg. ml-1 la variedad CC 85-92

de zona Seca, No. 10 con 38,35 µg. ml-1 la variedad CC 85-92 de Piedemonte. Finalmente,

el aislamiento No. 7 reportó un promedio de 23,97 µg. ml-1 siendo estadísticamente menor

al control positivo (No. 18).

De esta manera los aislamientos identificados molecularmente como A. brasilense (No.

14), Stenotrophomonas maltophilia (No.11), A. brasilense (No. 6) y A. brasilense (No. 12)

se establecieron como los mayores productores de Ácido- 3-Indolácetico dentro del grupo

Azospirillum spp., y son seleccionados como candidatos para usarse en futuros trabajos.

Estos resultados al ser comparados con lo reportado en la literatura indicaron que estos

aislamientos presentaron un significativo potencial en producción de AIA con respecto a

aislamientos reportados por Cárdenas., (2007) quienes publicaron aislamientos de

Azospirillum spp en pasto Guinea (Panicum máximum) con promedios de 45,18 µg. ml-1 y

43,27 µg. ml-1 y Mascarua – Esparsa et al., (1988) reportaron aislamientos del mismo

género aislados de plantas cetáceas con un rango máximo de 77,0 µg. ml-1.

Dentro del grupo bioquímicamente identificado como Azotobacter spp. se ubicaron cuatro

aislamientos estadísticamente mayores al control positivo de Azotobacter chroococcum

NCBIM 8002 que registró un promedio de producción de AIA de 66,5 µg. ml-1, mientras

que los aislamiento más altos en producción de AIA ante el control positivo y entre los

aislamientos del género Azotobacter spp, fueron los aislamientos identificados

molecularmente como Agrobacterium tumefaciens (No. 69) de la variedad CC 85-92 con



un promedio de 202,8 µg. ml-1, seguido de los aislamiento Kosakonia oryzsae (No. 89) de

la variedad CC 85-92 con 139,8 µg. ml-1, , Azotobacter tropicalis (No. 85) de la variedad CC

93-4418 de con 114,0 µg. ml-1 y finalmente el aislamiento Lactobacillus plantarum (No. 96)

con 109 µg. ml-1 (Figura 11-4). Todas estas variedades se encontraron en zonas del mega-

ambiente húmedo (Tabla 11-4 arriba).

Además, se obtuvieron 16 aislamientos con promedios estadísticamente mayores al

control positivo como el aislamiento Azotobacter tropicalis (No. 106) de la variedad CC 93-

4418 con 100,8 µg. ml-1, Rhizobium daejeonense (No. 64) de la variedad CC 85-92 con

98,3 µg. ml-1, Kosakonia orysae (No. 108) de la variedad CC 85-92 con 96,7 µg. ml-1,

Rhizobium etli (No. 105) de la variedad CC 84-75 con 93,6 µg. ml-1, Flavobacterium sp (No.

88) de la variedad CC 01-1940 con 93,2 µg. ml-1, Kosakonia arachidis (No.103) de la

variedad CC 85-92 con 92 µg. ml-1, Azotobacter tropicalis (No. 102) de la variedad CC 01-

1940 con 89,6 µg. ml-1, Lactobacillus paraplantarum (No. 83) de la variedad CC 85-92 con

87,7 µg. ml-1, Azotobacter tropicalis (No. 84) de la variedad CC 01-1440 con 85,7 µg. ml-1,

Azotobacter chroococum (No. 55) de la variedad CC 84-75 con 84,9 µg. ml-1,

Flavobacterium sp (No. 77) de la variedad CC 93-4418 con 81,1 µg. ml-1, Azotobacter

vinenlandii (No. 65) de la variedad CC 85-92 con 78,6 µg. ml-1, Shiphonobacter

aquaeclarae (No. 79) de la variedad CC 01-1940 con 77,4 µg. ml-1, Azotobacter vinenlandii

(No. 91) de la variedad CC 85-92 con 75,4 µg. ml-1, Rhizobium borbori (No. 86) de la

variedad CC 01-1940 con 72,6 µg. ml-1 y finalmente, el aislamiento Strenotrophomonas

maltophilia (No. 90) de la variedad CC 01-1940 con 69,1 µg. ml-1 (Figura 11-4)

Los resultados de los aislamientos identificados molecularmente dentro del género

Azotobacter spp fueron mayores en concentración de producción de AIA a lo publicado por

Valderrama., (2015) al aislar bacterias del género Azotobacter spp (cepas 4 y 19) de la

variedad de caña de azúcar CC 85-92, obteniendo promedios de 0,90 µg. ml-1 y 0,98 µg.

ml-1 de producción de AIA. Mrkovacki-Mili´c., (2001) publicaron promedios de AIA en cepas

identificadas como Azotobacter chrooccocum de 9,6 µg. ml-1 y 19,8 µg. ml-1, y las

evaluaciones realizadas por Batista-Gallardo., (2008) en la cepa Azotobacter vinelandii

(ATCC 12518) evaluadas en la producción de AIA obtuvieron promedios de concentración

de 60 µg. ml-1, cercano a el control positivo Azotobacter chroococcum NCBIM 8002 que

obtuvo un promedio de 66,5 µg. ml-1, pero los aislamientos evaluados en producción de

Marco teórico 55

AIA de este género presentaron promedios de cuantificación de AIA superiores a lo

publicado e incluso superiores a los controles positivos.



Figura 0-4 AIA promedio de los aislamientos del Género Azotobacter spp.


Finalmente, el grupo de bacterias identificado bioquímicamente como Gluconacetobacter

spp., registró diferencias significativas entre los aislamientos, y con respecto al control

positivo de Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985 que produjo un promedio de

AIA de 33,1 µg. ml-1.

Estadísticamente se seleccionaron siete de los nueve aislamientos con los mejores

promedios de concentración de AIA (Figura 11-5), que correspondieron a

Gluconacetobacter diazotrophicus: No. 50 con 71, µg. ml-1 aislado de la variedad V71-51

de raíz, seguido de No. 53 de CC 84-75 de tallo con 69,6 µg. ml-1, No. 23 de CC 85-92 con

58,4 µg. ml-1, No. 21 de CC 93-4418 con 54,5 µg. ml-1, No. 25 de CC 01-1940 con 53,0 µg.

ml-1, No. 51 de CC 85-92 con 52,6 µg. ml-1 y No. 43 de CC 85-92 con 51,1 µg. ml-1. .

Además, se resaltan dos aislamientos que presentaron producciones mayores al control

de referencia, que fueron el aislamiento No. 48 proveniente de la variedad V71-51 y No.

Marco teórico 57

41 de la variedad CC 93-4418 con promedios de 39,7 µg. ml-1 y 33,5 µg. ml-1, valores que

son significativamente mayores a los obtenidos por Mathukumarasamy et al., (2002),

logrando cuantificar aislamientos del género Gluconacetobacter spp provenientes de

diferentes variedades de caña en la India, registrando promedios de AIA de 6 µg. ml-1 y 14

µg. ml-1.

Figura 0-5 AIA promedio de los aislamientos del Género Gluconacetobacter spp.


Lo anterior denotó que los aislamientos evaluados dentro de los tres géneros bacterianos

de Azospirillum spp, Azotobacter spp y Gluconacetobacter spp, para la presente

investigación en Colombia, presentaron una mayor producción de Ácido-3-Indol acético

con respecto a lo citado en la literatura nacional e internacional, e incluso con respecto a

los controles positivos de referencia usados para la validación de estas pruebas

bioquímicas y de cuantificación. Por lo anterior, se obtuvieron aislamientos promisorios

como bacterias PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria).



1.25 Cuantificación de la reducción de Acetileno-Et ileno y

selección de los aislamientos con mayor potencial e n la fijación biológica de nitrógeno.

Como resultado, se obtuvieron las curvas estándar de Etileno (Figura 11-6) y Acetileno

(Figura 11-7), que permitieron la estandarización de la metodología de la cuantificación de

la reducción de Acetileno y posterior producción de Etileno, bajo las condiciones propias

del laboratorio de cromatografía del Programa de Procesos de Fábrica de Cenicaña.

Figura 0-6 Curva estándar de Etileno con un R2=1

Figura 0-7 Curva estándar de acetileno con un R2=0.9788

Marco teórico 59

Para la selección de los aislamientos con mayor capacidad reductora de acetileno,

únicamente se usaron los aislamientos bacterianos que presentaron dos (2) o más

repeticiones, debido a las pérdidas de acetileno. Estas pérdidas, hicieron que a partir de

los promedios de cuantificación de etileno producido y los promedios de acetileno restante,

se calculará la proporción inicial (%) de acetileno como los partes por millón (ppm) que no

se perdieron, tomándolos como el 100% del analito. Así entonces se calculó:

[��ó� �� ][��ó� �� + ��ó� �� ]

Con lo anterior, se logró considerar las proporciones de eficiencia enzimática de los

aislamientos. Estos porcentajes expresaron el rendimiento del proceso de reducción

acetileno y producción de etileno. Además, se ajustaron los datos a un modelo lineal con

dos factores (género y aislamientos dentro del género), equivalente a un modelo lineal con

clasificación jerárquica. (F1= Género., F2= Aislamiento dentro del género).

Como resultado se obtuvo conforme el análisis de varianza (Test tipo III) diferencias

estadísticamente significativas de producción de etileno entre los géneros de Azospirillum

spp y Gluconacetobacter spp (F= 257,0 ; P <0,0001) y entre los aislamientos dentro de

estos estos géneros (F=5,02 ; P <0,0001)

Se realizó la prueba de Bonferroni al 5% de tasa de error y se determinó si la proporción

de etileno cambió entre los géneros de Azospirilllum spp y Gluconacetobacter spp y si se

dieron cambios entre los aislamientos dentro de cada género (Tabla 11-7).

Por lo anterior, el modelo fue de tipo lineal generalizado con variable de respuesta Beta

(β). La proporción del etileno no sale de casos favorables sobre casos posibles, sino de un

cociente entre volúmenes; en otras palabras, es una proporción en el rango de 0-1

calculada como una probabilidad.

Entonces: sea π= la proporción de etileno

��=µ + Gi + AGj(i) + eijk

Por lo anterior, se confirmó que si se presentó un cambio en la proporción de etileno entre

los géneros, observándose que el género Azospirillum spp mostró una mayor proporción

de reducción de acetileno, mientras que para el género Gluconacetobacter spp, la



proporción en reducción de acetileno fue menor al igual que su equivalente de reducción

de acetileno, determinando que existieron diferencias estadísticamente significativas entre

ambos géneros.

Tabla 0-7 : Promedios de eficiencia enzimática con base en la prueba de reducción de

Acetileno – Etileno entre Géneros Azospirillum spp y Gluconacetobacter spp.

Letra diferente indica diferencias significativas según Bonferroni al 5%

El género Azospirillum spp se destacó con un rendimiento promedio de reducción de

acetileno del 70%. Diferentes trabajos sobre la fijación de nitrógeno indican a este género

bacteriano como uno de los mayores contribuyentes de fijación de nitrógeno en plantas

inoculadas con estas bacterias (Bashan & Levanovy, 1990). Las mediciones de etileno en

este estudio presentaron valores mínimos de 868,8 nmol C2H4 h-1mL-1 y valores máximos

de 2296 nmol C2H4 h-1mL-1, a pesar de las pérdidas del sustrato enzimático.

Von Bulow and Dobereiner., (1975) cuantificaron la actividad nitrogenasa en un biotipo

bacteriano perteneciente al género Azospirillum spp y registraron un promedio de

reducción de acetileno de 7124 nmol C2H4 h-1mL-1, destacando que este género es uno de

los microorganismos responsables de las altas tasas de fijación tanto en gramíneas y en

cultivos como el Maíz (Zea mays. L) en Brasil.

En el 2007, Garrido encontró que al realizar una selección de microorganismos aislados

de tres cultivos de pastos del valle y sabana del Cesar (Panicum máximum, Dichantium

aristatum y Brachiaria sp), con potencial en la fijación de nitrógeno, destacó que dentro de

sus aislamientos el género Azospirillum spp fue el segundo género con mayor capacidad

reductora de acetileno con un promedio de 143,97 nmol C2H4 h-1mL-1, siendo el primer

Género Medias de proporción

Error estándar

Bonferroni al 5%

Azospirillum spp 0.7372 0.06382 A

Gluconacetobacter spp 0.4042 0.006094 B

Marco teórico 61

lugar para el género de las Enterobacterias, identificando a Klebsiella pneumoniae , que

presentaron un promedio de producción de etileno de 566,7 nmol C2H4 h-1mL-1.

El segundo género bacteriano identificado como Gluconacetobacter spp, presentó

después del género Azospirillum spp, el segundo mejor promedio proporción de reducción

de acetileno con un 40% y un rango de cuantificación de etileno con valor mínimo de 195,2

nmol C2H4 h-1mL-1 y un valor máximo de 956,9 nmol C2H4 h-1mL-1, estando de acuerdo con

lo publicado por Muthukumarasamy et al., (2002), al aislar y caracterizar seis aislamientos

identificados dentro del género Gluconacetobacter spp asociados a variedades de caña de

azúcar de la India, donde presentaron un promedio de reducción de acetileno de 332,4

nmol C2H4 h-1mL-1.

El tercer género evaluado en cuantificación de reducción de acetileno fue Azotobacter spp,

sin embargo, las señales cromatográficas de producción de etileno no lograron ser

cuantificadas debido a que estuvieron por fuera de los límites de detección y de

cuantificación de la curva estándar hacia valores inferiores a ésta. Por ende, no se

presentan datos en la presente investigación sobre producción de etileno para aislamientos

de este género.

Este resultado concuerda por lo publicado por Garrido (2007), quien al evaluar cepas

identificadas dentro del género Azotobacter spp no registró producción de etileno, razón

por la cual no fue incluido dentro de la selección de aislamientos fijadores de nitrógeno de

este estudio. Por lo anterior, se infiere que los aislamientos identificados dentro de este

género exhibieron el efecto conocido como “switching off” o de “apagado” de la actividad

de la nitrogenasa por un exceso de acetileno o una atmósfera muy cargada de oxígeno,

causando una supresión en la actividad enzimática. (Drozd & Postgate, 1970)

Finalmente, los diferentes autores citados registraron cuantificaciones que exhibieron

amplios rangos de eficiencia de reducción de acetileno para ambos géneros. Pese a las

pérdidas indeterminadas del acetileno inicial, fue posible que estos resultados se

presenten dentro de las similitudes de estos rangos de eficiencia. Por lo tanto, se concluyó

que los aislamientos bacterianos pertenecientes a los géneros Azospirillum spp y

Gluconacetobacter spp aislados de las variedades de caña de azúcar CC 84-75, CC 82-

92, CC 93-4418 y CC 01-1940, sembradas lo largo y ancho del valle del rio Cauca donde

se desarrolla la agroindustria intensiva, mostraron ser géneros promisorios por su alta



capacidad reducción de acetileno y producción de etileno in-vitro, proceso homólogo y

debidamente documentado a la fijación biológica de nitrógeno en el campo.

La prueba de comparación de promedios de Bonferroni (α=0,05), al comparar los

aislamientos dentro del género de Azospirillum spp, no mostró diferencias significativas

entre los aislamientos y su control positivo de referencia Azospirillum brasilense NCBIM

11860, el cual presentó un promedio de eficiencia de reducción de acetileno del 73%,

mientras que 12 aislamientos presentaron eficiencias por encima de este control positivo

(Figura 11-8). Los aislamientos A. brasilense No. 14, proveniente de la variedad CC 84-75

del mega-ambiente Húmedo, y A. brasilense No. 6 de la CC 93-4418 de ambiente Seco,

registraron las mayores proporciones de reducción de acetileno con el 83,75% y 82,51%

respectivamente.

Estos aislamientos fueron seguidos de los aislamientos de A. brasilense (No. 16) de CC

01-1940, No. 1 de CC 93-4418, No. 7 de CC 93-4418, No. 3 de CC 93-4418, No. 15 de

CC 85-92, No. 9 de CC 85-92, No. 4 de CC 85-92, No. 17 de la CC 84-75, No. 8 de la CC

93-4418 y finalmente, el aislamiento identificado como Strenotrophomonas maltophilia No.

11 proveniente de la variedad CC 01-1940.

Figura 0-8 Comparación entre aislamientos por prueba de Bonferroni (α= 0,05) dentro del

género Azospirillum spp .

Marco teórico 63

Letras iguales indican que No existieron diferencias estadísticas significativas

De acuerdo con lo publicado, diferentes autores indicaron la variabilidad en la respuesta

de la eficiencia enzimática. Garrido (2007) publicó que cuatro aislamientos bacterianos

obtenidos de pastos (Panicum máximum, Dichantium aristantum y Brachiaria sp) ,dentro

de los cuales obtuvo dos cepas bacterianas de Azospirillum brasilense (SRA4) y

Azospirillum lipoferum (SRA2) con 269,36 nmol C2H4 h-1mL-1 y 519,60 nmol C2H4 h-1mL-1,

por debajo de su control positivo usado Azospirillum brasilense (SP7), que produjo 825,10

nmol C2H4 h-1mL-1. Joachim, Von Bulow and Dobereiner (1975) evaluaron la cepa

bacteriana de Azospirillum lipoferum aislada de varios genotipos de maíz (Zea mays. L),

obteniendo lo que para ellos fue la cepa más promisoria para la fijación de nitrógeno, al

reportar una concentración de 7124 nmol C2H4 h-1mL-1, logrando ser el aislamiento

responsable de las altas tasas de fijación de nitrógeno en las plantas de maíz. Para

Mascarua-Esparza, Villa-González y Caballero-Mellado (1988), al aislar y caracterizar los

aislamientos de Azospirillum brasilense y Azospirillum lipoferum, asociados a plantas

Cactáceas (Opuntia ficus-indica, Stenocereus pruinosus y Stenocereus stellatus),

encontraron que dos cepas de Azospirillum brasilense mostraron una alta actividad

nitrogenasa de 49,6 y 35,2 nmol C2H4 h-1mL-1 seguido de siete cepas de esta misma

especie que produjeron etileno en un rango entre 25 a 32,8 nmol C2H4 h-1mL-1, y cuatro

aislamientos de la misma especie registraron producciones de etileno por debajo de las

anteriores entre 17,6 a 21,2 nmol C2H4 h-1mL-1.

Por lo anterior, es posible confirmar que existe una alta variación entre los diferentes

aislamientos caracterizados de este estudio y lo publicado por otros investigadores. De los

18 aislamientos, se obtuvieron 12 con una capacidad de eficiencia de reducción de

acetileno dentro de los rangos mínimos y máximos publicados en la literatura. De esta

forma, el aislamiento de Azospirillum brasilense No. 14 proveniente de la variedad CC 84-

75 del ambiente Húmedo, se destacó como el mayor fijador de nitrógeno y productor de

compuestos indólicos, seguido por aislamiento No.6 obtenido de la variedad CC 93-4418

del ambiente Seco y finalmente, el aislamiento No.16 proveniente también del ambiente

Húmedo y de la variedad CC 01-1940, que para este estudio se manifestaron como los

mayores representantes en la producción de compuestos indólicos y fijación biológica de

nitrógeno, indicando su alto potencial para estudios posteriores.



Finalmente, en la selección de los aislamientos con mayor potencial en la reducción de

acetileno dentro del género Gluconacetobacter spp, se determinó que por medio de la

prueba de comparación de Bonferroni existieron diferencias estadísticas significativas

entre los aislamientos bacterianos y su control positivo de referencia Gluconacetobacter

diazotrophicus NCBIM 12985 (Figura 11-9), el cual registró una reducción de acetileno con

eficiencia del 12%, mientras que se encontraron 14 aislamientos con eficiencias por encima

de este control positivo. Se destacaron dos aislamientos bacterianos identificados

molecularmente como Gluconacetobacter diazotropicus No.24 obtenido de la variedad 93-

4418 con 65% de eficiencia y el No.43 de la variedad CC 85-92 con 62% de eficiencia en

la reducción de acetileno. Entre las proporciones de reducción de acetileno existieron

diferencias significativas entre los aislamientos obtenidos y evaluados.

Figura 0-9 Comparación entre aislamientos por prueba de Bonferroni (alpha=0.05) dentro del género Gluconacetobacter spp.


Estos aislamientos fueron seguidos de aislamientos de G. diazotrophicus No. 21 de la CC

93-4418, No.33 de la CC 93-4418, No. 44 de la CC 01-1940, No. 26 de la CC 01-1940,

Marco teórico 65

No.34 de la CC 01-1940, Gluconacetobacter sacchari No. 47 de la variedad CC 85-92, G.

diazotrophicus No.31 de la CC 93-4418, No. 38 de la CC 93-4418, No.27 de la CC 01-

1940, No. 37 de la CC 93-4418, No. 42 de la variedad CC 85-92, No.30 de la CC 01-1940

y finalmente G. diazotrophicus No. 36 de la variedad CC 85-92.

Por lo anterior, de 34 aislamientos iniciales de este género bacteriano, 14 presentaron una

mayor capacidad de reducción de acetileno por encima del control positivo de referencia

No. 28. Ante lo publicado Anitha K.G y Thangaraju. M (2010), los resultados de la

cuantificación de acetileno en este estudio mostraron un rango de cuantificación de etileno

con valor mínimo de 195,2 nmol C2H4 h-1mL-1 y un valor máximo de 956,9 nmol C2H4 h-1mL-

1, cercano a lo registrado por la cepa bacteriana R3 de Gluconacetobacter diazotrophicus

usada por estos autores para la inoculación de semillas de arroz en cultivo in-vitro, donde

la cepa R3 mostró una capacidad reductora de acetileno de 416,93 nmol C2H4 h-1mL-1,

presentando lo que los investigadores indicaron como la cepa con mayores niveles de

actividad nitrogenasa. Similarmente, para Muthukumarasamy R, Revathi G, Seshadri S y

Lakshminarasimham (2002), al caracterizar cinco cepas bacterianas (TR1, MR4, Mg, T8 y

LM6) de Gluconacetobacter diazotrophicus, encontraron que la cepa T8 presentó valores

superiores a los demás aislamientos, presentándose como la mayor reductora de acetileno

con valores de 648,0 nmol C2H4 h-1mL-1.

En síntesis, para este género se encontraron tres aislamientos que no solo fueron

superiores al control positivo de referencia de Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM

12985 en cuanto a su capacidad de fijación biológica, sino que también fueron

seleccionados por presentar una alta y promisoria producción de compuestos indólicos,

como son los aislamientos de Gluconacetobacter diazotrophicus No. 24 de la variedad CC

93-4418 del mega-ambiente Húmedo, el No. 43 de la variedad CC 85-92 del ambiente

Seco, y finalmente el No. 21 de la CC 93-4418, considerándose como las más destacadas

cepas bacterianas con potencial para estudios posteriores y de investigación sobre

inoculación en caña de azúcar.



1.26 Secuenciación del gen nifH en aislamientos con

mayor potencial en la fijación biológica de nitróge no y producción de compuestos indólicos

De los 111 aislamientos bacterianos obtenidos en este estudio, 14 pertenecientes al

género Azospirillum spp fueron los mejores productores de ácido-3-indol acético, 11

aislamientos presentaron alta eficiencia de reducción de acetileno con respecto a su control

positivo o de referencia Azospirillum brasilense NCBIM 11860, y tres asilamientos

bacterianos (Nos. 14, 6 y 16) presentaron ambas habilidades enzimáticas, potenciales para

la promoción del crecimiento vegetal como bacterias PGPR.

Así mismo, para el género Gluconacetobacter spp, se obtuvieron 19 aislamientos con las

mayores cuantificaciones de ácido-3-indol acético y 16 aislamientos con alta eficiencia de

reducción de acetileno con respecto a su control positivo de referencia Gluconacetobacter

diazotrophicus NCBIM 12985, dentro de este grupo se seleccionaron las cepas bacterianas

No. 24 y 21 por su alto potencial en ambas pruebas enzimáticas y finalmente la cepa

control.

En la Tabla 11-8, se ubicaron los datos obtenidos de la caracterización bioquímica entre

las cepas bacterianas No. 2 y el No. 18 (control positivo de referencia) de menor capacidad

enzimática en ambas actividades, y los cinco aislamientos bacterianos de interés (No. 14,

6, 16, 24 y 21) que presentaron las mejores actividades bioquímicas.

Marco teórico 67

Tabla 0-8 : Resultados de la caracterización de los aislamientos bacterianos de con

mayor capacidad en fijación biológica de nitrógeno y producción de compuestos indólicos.

Aislamiento No. Ambiente Variedad

AIA ARA

(µg/ml) (%)

14 Húmedo CC 84-75 84,91 83,75 6 Seco CC 93-4418 55,61 82,51 16 Húmedo CC 01-1940 26,58 79,82 24 Húmedo CC 93-4418 53 65,7 21 Piedemonte CC 93-4418 54,5 58,37 2 Seco CC 85-92 23,97 58,05

18* Control positivo NCBIM 11860 50,38 73,3 28* Control positivo NCBMI 12985 33,1 12,42

El posterior proceso a la selección de los aislamientos bacterianos con mayores valores

de fijación biológica y producción de compuestos indólicos fue la extracción de ADN

genómico, la amplificación y la secuenciación realizada por Macrogen USA, que también

sintetizó los primers específicos diseñados en este estudio para la amplificación del gen

nifH.

Con base en la secuencia consenso se obtuvieron las nuevas secuencias editadas que

fueron alineadas globalmente (global alignment) con las secuencias publicadas en el

Genbank del NCBI para los géneros y especies Azospirillum brasilense (accesión

X51500.1), y Gluconacetobacter diazotrophicus (U78044.1), obteniéndose una identidad

para las secuencias del género Azospirillum del 99% y para las secuencias del género

Gluconacetobacter de un 98%.



Figura 0-10 Alineamientos de las secuencias de nucleótidos de los aislamientos

bacterianos pertenecientes a género y especie de Azospirillum brasilense. Secuencia de

accesión de referencia en el NCBI Genbank X51500.1

Marco teórico 69

Figura 0-11 Alineamientos de las secuencias de nucleótidos de los aislamientos

bacterianos pertenecientes a género y especie de Gluconacetobacter diazotrophicus.

Secuencia de accesión de referencia en el NCBI Genbank U78044.1

Además, las secuencias de nucleótidos se alinearon con la base de datos del gen nifH de

la Universidad de Cornell, integrada por 32.954 secuencias del gen nifH (Gaby & Buckley,

2012) confirmando que los aislamientos bacterianos de las cepas No. 14, 6, 16, 21 y 24 ,

se alinearon dentro del cluster I que agrupa a anaerobios y aerobios, y en mayor proporción



a géneros pertenecientes al phylums Proteobacterias y Cianobacterias, que manifiestan la

enzima nitrogenasa Fe-Mo (Gaby & Buckley, 2012)

Lo anterior indicó que si existe alta identidad entre las secuencias genéticas al compartir

un ancestro común. El porcentaje de similitud entre los alineamientos proteicos del género

y especie Azospirillum brasilense fue del 98.6% y para el género y especie de

Gluconacetobacter diazotrophicus fue del 99.5%. Para Azospirillum brasilense, en las

secuencias No. 16 y 2 en el residuo 201 la secuencia consenso presentó el aminoácido

Ala (Alanina), pero estas secuencias manifestaron una variación en el mismo aminoácido

cambiándolo por una Gly (Glicina). Sin embargo, este reemplazo del aminoácido presenta

igual función físico-química.

Estos resultados reafirman que el gen nifH es un gen altamente conservado

funcionalmente que transcribe para el homodímero o componente II dinitrogenasa

reductasa, este homodímero tiene atado el cluster 4Fe-4S a la subunidad y dominio ATP-

binding domains, supliendo de energía (hidrolisis de ATP) y transfiere electrones (e- )

reducidos desde la ferredoxina o flavodoxina hacia el componente para la reducción del

nitrógeno a amonio. (Beriger & Hirsch, 1984)

Marco teórico 71

Figura 0-12 Alineamientos de las secuencias de aminoácidos de los aislamientos

bacterianos pertenecientes a género y especie de Azospirillum brasilense. Secuencia de

accesión de referencia en el NCBI Genbank CAA35860.1

Figura 0-13 Alineamientos de las secuencias de aminoácidos de los aislamientos bacterianos pertenecientes a género y especie de Gluconacetobacter diazotrophicus. Secuencia de referencia accesión en NCBI Genbank AAD00271.1

En conclusión, fue posible determinar que el gen nifH es un marcador genético altamente

conservado que permitió corroborar la identidad de los aislamientos bacterianos

identificados por 16S rDNA; sin embargo, para este estudio, el uso del gen nifH como

marcador, no permitió asociarse con los resultados bioquímicos registrados por lo biotipos

bacterianos asociados a las variedades de caña de azúcar que presentaron una respuesta



por encima de lo publicado en trabajos con los controles positivos como Azospirillum

brasilense cepa Sp7 y Gluconacetobacter diazotrophicus PA-15.

Así entonces, los anteriores resultados son comparables con lo obtenido por Terakabo-

Tonooka, Shotaro, Ohwari y Yoneyama., (2013), usando este gen, quienes confirmaron la

existencia de diversidad en los diazotrofos asociada al gen nifH, sin lograr correspondencia

con la actividad de la enzima nitrogenasa. (Terakabo-Tonooka, Ando , Ohwari, &

Yoneyama, 2013)

Finalmente, con este aspecto se concluyó que la contribución de Nitrógeno por medio del

proceso de fijación biológica de nitrógeno, especialmente al cultivo de caña de azúcar es

altamente variable (Urquiaga., 2009). En primer lugar, por ser un proceso biológico en el

cual participan grupos heterogéneos de microorganismos con una sensibilidad alta a

cambios en el ambiente, y en segundo lugar donde principalmente las plantas y su genética

pueden o no favorecer la reorganización de nichos bacterianos por sus diferentes

producciones de biomasa y la composición química de sus exudados radicales.(Hinsinger,

Bengough, Vetterlein, & Young, 2009).

Conclusiones y recomendaciones

1.27 Conclusiones

� Se lograron aislar 111 biotipos bacterianos procedentes de cuatro genotipos o

variedades de caña de azúcar, de los cuales se identificaron como candidatos

promisorios a 14 aislamientos de los tres géneros. Estos aislamiento responden a la

heterogeneidad de sus ambientes donde se seleccionaron, y a su vez conducen hacia

la valoración y generación de la diversidad bacteriana que se conserva en el cepario

de bacterias fijadoras de nitrógeno de Cenicaña-Colombia, para trabajos y estudios

futuros.

� Las pruebas bioquímicas permitieron identificar y agrupar los 111 aislamientos

bacterianos en los géneros y especies Azospirillum spp., Azotobacter spp., y

Gluconacetobacter spp., comparándose con sus cepas certificadas de referencia. Sin

embargo, ante la serie de combinaciones bioquímicas que genera la presencia de las

especies dentro del género, la confirmación bioquímica de esta agrupación taxonómica

se convierte en una tarea ambigua, dispendiosa y costosa, que es propensa a errores

de diferente índole y con baja reproducibilidad.

� La secuenciación del gen 16S del ADN ribosomal, permitió la confirmación del género

e identificó la especie bacteriana para la mayoría de los aislamientos, obteniendo 15

aislamientos confirmados dentro del género Azospirillum, identificándose la especie A.

brasilense como especie predominante para este grupo. Al igual que en el género

Gluconacetobacter que registró 31 aislamientos de la especie G. diazotrophicus y solo

un aislamiento de especie G. sacchari. Para el género bioquímicamente identificado

como Azotobacter spp, se confirmaron 20 aislamientos y se identificaron cuatro en

especies como A. chroococcum, A. tropicalis, A. vinelandii y A. salinestris. Además,

este método permitió determinar aislamientos pertenecientes a otros 15 géneros



diferentes a los tres géneros bacterianos prioritarios para este estudio, que entran al

cepario de bacterias fijadoras de nitrógeno, y que también pueden ser de interés

agronómico y microbiológico en futuras investigaciones.

� Como bacterias promotoras de crecimiento radicular (PGPR), la cuantificación de la

producción de ácido-3 indol acético entre los tres géneros, permitió seleccionar 35

aislamientos que exhibieron una mayor capacidad de producción de fitohormonas con

respecto a los controles positivos o de referencia de cada uno de ellos, logrando con

ello contar con un grupo de aislamientos promisorios como bacterias PGPR para

futuras investigaciones.

� La reducción del acetileno y producción de etileno, permitió la obtención de 12

aislamientos del género y especie Azospirillum brasilense, y 14 aislamientos

bacterianos del género y especie de Gluconacetobacter diazotrophicus, con

proporciones de reducción de acetileno por encima de lo registrado para los controles

positivos o de referencia. Por lo anterior, este grupo de bacterias fijadoras de nitrógeno

se consideraron como las cepas bacterianas dentro de este estudio con el mayor

potencial para ser investigadas a futuro en trabajos de inoculación en caña de azúcar.

� El gen nifH es un marcador genético y funcional altamente conservado; sin embargo,

dado el bajo número de secuencias analizadas y la baja variabilidad, no fue posible

asociar los resultados bioquímicos registrado por los aislamientos o biotipos

bacterianos asociados a las variedades de caña de azúcar, que presentaron una

respuesta por encima de lo publicado en trabajos con los controles positivos como

Azospirillum brasilense cepa SP7 y Gluconacetobacter diazotrophicus cepa PA15.

1.28 Recomendaciones

� Nuevamente cuantificar la reducción de acetileno y producción de etileno para

aislamientos del género Azotobacter spp, debido a que este género no presentó

proporción de producción de etileno detectado por el equipo de cromatografía. De ser

¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. apítulo 3 75

posible se recomienda desarrollar y ajustar las concentraciones y los puntos de las

curvas estándar, y ajustar la metodología para la pérdida de los gases de acetileno-

etileno dentro de los viales (Headspace®).

� Profundizar en el estudio de la diversidad genética del gen nifH, usando un número

significativo de secuencias, ojalá el resto de las obtenidas en este estudio, para con

ello concluir si existen variantes genéticas que potencialicen bioquímicamente a las

cepas seleccionadas como las más promisorias en el proceso de fijación biológica de

nitrógeno.

� Estos trabajos podrán contribuir en el futuro en la búsqueda de sostenibilidad y

competitividad del Sector Azucarero Colombiano como una solución que contribuya a

reducir el impacto ambiental y económico a partir del mejoramiento de los procesos en

el campo. El aislamiento y caracterización inicial de estas bacterias es el punto de

partida, pero en ningún momento garantiza que éstas funcionen eficientemente y sean

exitosas dentro de programas de bionutrición, o que puedan ser usadas como insumos

biológicos para aplicaciones comerciales sin la rigurosa investigación y validación

experimental.

Anexo: Clasificación de los genes candidatos en la fijación biológica de nitrógeno.

Estabilidad

cataliticaRegion Tipo de gen Accession Autor

nifU Fe-S cluster protein coding Gene ID: 7759125 Setubal JC, et al . 2009

nif S Cisteine disulfarasa protein coding Gene ID: 7759126 Setubal JC, et al . 2009

nifM cis-trans peptidyl prolyl isomerase protein coding Gene ID: 7759132 Setubal JC, et al . 2009

nifW protein nifW protein coding Gene ID: 7759130 Setubal JC, et al . 2009

nif Z protein nifZ protein coding Gene ID: 7759131 Setubal JC, et al. 2009

Sintesis de Fe-

MocoRegion Tipo de gen Accession Autor

nifH Fe-Protein protein coding Gene ID: 7759103Lee CC, et al. 2009

Setubal JC, et al. 2009

nifQ Cofactor assembly protein protein coding Gene ID: 7763952 Setubal JC, et al. 2009

nifB Cofactor de biosintesis de proteina protein coding Gene ID: 7763949,Wiig JA, et al. 2011Martínez-Noël G, et al. 2011Setubal JC, et al. 2009

nifV Homocitrato sintetasa protein coding Gene ID: 7759127 Setubal JC, et al. 2009

nif E cofactor MoFe biosintesis proteina protein coding Gene ID: 7759110

George SJ, et al. 2012Martínez-Noël G, et al.2011Hu Y, et al. 2009 SetubalJC, et al. 2009

nifN Cofactor Molibdeno biosintesis de proteina protein coding Gene ID: 7759111Martínez-Noël G, et al.2011Hu Y, et al. 2009 SetubalJC, et al. 2009

Transporte de

electronesRegion Tipo de gen Accession Autor

nif F Flavodoxin protein coding Gene ID: 7759134 Setubal JC, et al. 2009

nif J Azotobacter no presenta nifJ Oxidoreductasa

Estructurales Region Tipo de gen Accession Autor

nifH Nitrogenasa proteina - Fe protein coding Gene ID: 7759103Lee CC, et al. 2009

Setubal JC, et al. 2009

nifDNitrogenasa Mo-Fe proteina cadena alfa:componente I

protein coding Gene ID: 7759104Barney BM, et al. 2009Hu Y, et al. 2009 SetubalJC, et al. 2009

nif K Nitrogenasa Mo-Fe subunidad beta protein coding Gene ID: 7759105Hu Y, et al. 2009 Setubal

JC, et al. 2009

Regulacion

transcripcionalRegion Tipo de gen Accession Autor

nifASigma 54 dependiente transcripcional

activador de proteinaprotein coding Gene ID: 7763948 Setubal JC, et al. 2009

nifLRegulador de proteina de la fijacion de nitrogeno

protein coding Gene ID: 7763947Little R, et al . 2012 Little R,et al 2011 Setubal JC, et al.2009

Agrupacion de genes de la enzima nitrogenasa de Azotobacter vinelandii (Modelo)

Ge

ne

sG

en

es

Ge

ne

sG

en

es

Ge

ne

s

78 Caracterización bioquímica y molecular de bacterias fijadoras de nitrógeno aisladas de caña de azúcar

Estabilidad


nifU Fe-S cluster protein coding Gene ID: 13107908 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

nif S Cisteina disulfarasa protein coding Gene ID: 13107907 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

nifW nitrogenase-stabilizing/protective protein protein coding Gene ID: 13107904 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

nif Z nitrogenase P-cluster maturation protein coding Gene ID: 13106306 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

Sintesis de Fe-


nifH Dinitrogenase reductase protein coding Gene ID: 13107912 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

nifQ nifQ proteina protein coding Gene ID: 13106342 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

nif B cofactor MoFe biosintesis proteina protein coding Gene ID: 13107922 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

nifV homocitrate synthase protein coding Gene ID: 13107906 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

nif E Cofactor Mo biosintesis protein coding Gene ID: 13106614 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

nifN nitrogenasa reductasa asociada a ferrodoxin protein coding Gene ID: 13106618 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

Transporte de


nif F azospirillum brasilence no tiene nifF

nif J pyruvate-flavodoxin oxidoreductase protein coding Gene ID: 8795095 Kaneko T, et al. 2010


nifH nitrogenase iron protein; dinitrogenase reductase protein coding Gene ID: 13107912 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

nifD nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain protein coding Gene ID: 13106334 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

nif K nitrogenase molybdenum-iron protein beta chain protein coding Gene ID: 13106612 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

Regulacion

transcripcionalRegion Tipo de gen Accession Autor

nifA pseudo protein coding Gene ID: 13106616 PubMedId : 10518727, 12552819

nifLputative sensor histidine kinase azospirillum lipoferum 4B

protein coding Gene ID: 11556060 Wisniewski-Dyé F, et al . 2011

Agrupacion de genes de la enzima nitrogenasa de Azospirillum brasilense sp245

Ge

ne

sG

en

es

Ge

ne

sG

en

es

Ge

ne

s

Bibliografía 79

Estabilidad


nifU nitrogen fixation protein nifU protein coding Gene ID: 5791427 Bertalan M, et al . 2009

nif S cysteine desulfurase protein coding Gene ID: 5791428 Bertalan M, et al . 2009

nifM NO

nifW nitrogenase stabilizing/protective protein protein coding Gene ID: 5791430 Bertalan M, et al . 2009

nif Z nifZ protein protein coding Gene ID: 5789207 Bertalan M, et al . 2009

Sintesis de Fe-


nifH nitrogenase reductase protein coding Gene ID: 5789210 Bertalan M, et al . 2009

nifQ protein nifQ protein coding Gene ID: 5791425 Bertalan M, et al . 2009

nif B FeMo cofactor biosynthesis protein nifB protein coding Gene ID: 5789204 Bertalan M, et al . 2009

nif V homocitrate synthase protein coding Gene ID: 5791429 Bertalan M, et al . 2009

nif E nitrogenase molybdenum-cofactor biosynthesis protein protein coding Gene ID: 5791419 Bertalan M, et al . 2009

nifN nitrogenase molybdenum-cofactor biosynthesis protein protein coding Gene ID: 5791420 Bertalan M, et al . 2009

Transporte de


nif F NO

nif J NO


nifH nitrogenase reductase protein coding Gene ID: 5789210 Bertalan M, et al . 2009

nifD FeMo protein of nitrogenase alpha subunit protein coding Gene ID: 5791417 Bertalan M, et al . 2009

nif K nitrogenase FeMo beta subunit protein protein coding Gene ID: 5791418 Bertalan M, et al . 2009

Agrupacion de genes de la enzima nitrogenasa de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5

Ge

ne

s

Ge

ne

s

Ge

ne

sG

en

es


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Proceedings of the International Society of Sugar Cane Technologists, volume 29, 1315-1324, 2016

Isolation and preliminary biochemical characterizatio n of nitrogen-fixing bacteria belonging to three genera obtained from sugarcane in Colombia

Jennifer Roa, Marcela Cadavid, Fernando Muñoz, Héct or A Chica and Carlos A Ángel

Colombian Sugarcane Research Center, CENICAÑA, Calle 58 Norte N° 3BN-110, A.A. 9138, Cali, Colombia; [email protected]

Abstract Sugarcane is an important crop in Colombia, intensively planted to about 228,000 ha along the Cauca River Valley. To reach profitable yields, high and in some cases excessive nitrogen (N) fertilizers are applied, increasing production costs and risks for environmental and water contamination. Looking for strategies to reduce N applications within a sustainable and integrated crop management, the role of N-fixing bacteria is being explored. The objective of this study was to isolate and characterize native cultures of three recognized N-fixing bacteria and plant growth promoter genera such as Azospirillum, Azotobacter and Gluconoacetobater, and to determine their association to four of the most important and widely planted CENICAÑA-Colombia (CC) varieties (CC85-92, CC84-75, CC93-4418, and CC01-1940). To cover most environments along the valley, 108 fields were selected using geographical information system ArcGIS®. Individual samples consisted of 20 plants were selected randomly according to a predetermined method, sampling roots, stems, leaves, and rhizospheric soil from each plant and site. Samples were processed at CENICAÑA’s Plant Pathology Lab, plating on selective culture media LGI-P, Ashby, and NFB, among others for each bacteria genus. Morphological and biochemical characterization for α and β-proteobacteria were undertaken by triplicate, including aerobic/microaerophilic, motility- helical-shaped rods and cocci, Gram stain, and oxidative-fermentative metabolism of different carbohydrates and organic salts. In addition, production of growth-promoting substances was also evaluated. Comparisons were undertaken against type cultures of Azotobacter chroococcum NCBIM 8002, Azospirillum brasilense NCBIM 11860, Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985, among other bacteria. Out of 143 obtained isolates, 111 were characterized. Cluster analysis identified three groups that explained 91% of biochemical and metabolized carbohydrates variation. Quantification of indole-3 acetic acid as growth promoting substance showed also high variation with similar contents between Azotobacter spp. and Azospirillum spp. isolates, but significant statistical differences (α=0.05) to Gluconacetobacter spp. with lower production. Sequencing of 16S rDNA to identify species as well as acetylene reduction assays to determine N-fixing performance for these isolates is in progress. Fourteen isolates from the three genera were identified as promising candidates for further studies.

Key words Sugarcane, nitrogen fixation, plant-growth promoting, bacteria, biochemical tests, indole-3 acetic acid

(IAA).

INTRODUCTION

Sugarcane is an important crop in Colombia, being planted to about 500,000 ha in different regions. An intensive agroindustry has been developed along the Cauca River Valley located in the southern-mid-west region, where sugarcane covers about 228,000 ha. This region annually produces 24 Mt of cane, 2.4 Mt of sugar, 406 ML of ethanol, 6 Mt of bagasse, and 215 MWh of cogenerated power (Asocaña 2014 www.asocana.org). However, the Colombian production represents only about 1.3% of the sugar world market that is led by Brazil. Although Brazil’s average sugarcane yield is 79 t/ha, their dominance of the world sugar market is the extensive area

Bibliografía 89

planted to cane (10 Mha) and their relatively low production costs (Wall Bake et al. 2009). In addition, low rates of applied fertilizers (60 kg/ha to plant cane, and 120 kg/ha to ratoons), especially nitrogen (N), have helped maintain a very active natural processes of N fixation (NF) (Reis et al. 2007; Pereira et al. 2015), without apparently affecting productivity.

NF occurs due to several groups of prokaryote microorganisms, including bacteria, archaea and eubacteria that efficiently convert N2 to ammonia (NH3

+), catalyzed by an specific group of nitrogenase enzymes (Hoffman et al. 2009). The NH3

+ is then converted in the soil to ammonium (NH4+). Nitrogen fixation is a very important, if

not essential, process for agriculture. Reports have indicated that this source of N contributes approximately 150 kg N/ha to some Brazilian sugarcane varieties (Boddey et al. 2001 cited by Reis et al. 2007), and 100 kg N/ha in Australia and United States (Pipai 2014). In addition to NF, plant hormones such as indole-3 acetic acid (IAA) produced by some of the so-called Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) can improve substantially the amount and volume of roots, dry matter, early induction of root hairs, better and faster germination of seeds, and stimulation of rhizosphere exudates (Bashan and Levanony 1990). For these reasons, diazotrophic and PGPR bacteria have been identified as one of the best and most useful means for endosymbiosis and resulted in increased attention in different sugarcane-producing regions (Reis et al. 2007; Rodríguez et al. 2005, Valderrama 2015).

Colombia has a record of high productivity with average yield in excess of 100 t/ha/year (Asocaña 2014 www.asocana.org). Conditions in Colombia enable sugarcane to be grown and harvested throughout the year. However, application of chemical fertilizers, mainly N, has increased progressively with time, and reached up to 140 kg N/ha on average (Quintero 1998). This amount has implications from economic, agronomic and environmental perspectives; losses are also a risk to the environment due to processes involving volatilization, denitrification, run-off and leaching (Reis et al. 2007; Rodríguez et al. 2005, Valderrama 2015). To make more efficient, sustainable and environmentally friendly use of N, CENICAÑA is conducting research into strategies to reduce N applications within an integrated crop management approach. The role of NF in sugarcane production in the Cauca River Valley is being explored.

The objective of our study was is to isolate and characterize native cultures of three well recognized N-fixing bacteria and plant growth-promoter genera such as Azospirillum, Azotobacter, and Gluconoacetobater, and to determine their association with four of the most important and widely planted CC varieties in the Cauca River Valley.

MATERIALS AND METHODS

Sampling

We selected 108 fields along the Cauca River Valley (Carbonell et al. 2011) using geographic analysis software ArcGIS® by focusing on four of the most common varieties CC85-92, CC84-75, CC01-1940 and CC93-4418 in three environments (semidry, humid, and foothills), and covering representative agro-ecological zones in the valley (Fig. 1). The sampled commercial crops were between 2 to 3, 6 to 8, and 10 to 12 months of age. Individual samples consisted of 20 plants selected randomly according to a predetermined method. Subsamples of rhizospheric soil, roots, leaves, and stems were collected from each plant and site. Samples were kept refrigerated and transported to CENICAÑA´s Plant Pathology laboratory to be homogenized and processed.


Fig. 1. Cauca River Valley map illustrating north, central and southern regions with the dots indicating the 108 sampled fields with localities determined by ArcGIS® software.

Bacterial isolation on selective culture media

We used methods described by Holguin et al. (1996) to isolate symbiotic bacteria from soil and plant tissue samples using selective culture medium. NFB was used to isolate Azospirillum spp., and Ashby medium to isolate Azotobacter spp., both incubated at 28°C, and LGI-P medium was used to isolate Gluconacetobacter spp., incubated at 30°C for 5 days. Further isolation and purification of candidate Azospirilllum spp. colonies were undertaken according to Tarrand et al. (1978) using Congo red medium, in which curved colonies are observed with defined edges and brilliant red color. For Azotobacter spp further isolation and purification were conducted following Aquilanti et al. (2004) in which descriptions are characterized by mucoid appearance, irregular edges, and pigmented color. Identification of Gluconacetobacter spp. was based on Mehnaz et al. (2006) by the appearance of curved colonies with a yellow to orange centre due to the absorption of bromothymol blue stain from the medium, with defined and translucent edges.

Biochemical tests using different carbohydrates for determination of genus

Most methods and criteria (Table 1) were based on Bergey’s manual of determinate bacteriology (Holt et al. 1994). Morphological and biochemical characterization for α and β-proteobacteria phyla were conducted by triplicate. Determination of oxidative-fermentative metabolism in Gram-negative bacteria was conducted on culture media described by Hugh and Leifson (1953). As positive reference controls for all tests, certified type cultures of Azotobacter chroococcum NCBIM 8002, Azospirillum brasilense NCBIM 11860 and Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985, were obtained and maintained. In addition, internal controls of characterized bacterial species such as Burkholderia glumae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa cultures were established to verify consistency of the tests.

Bibliografía 91

Table 1. Biochemical assays to determine Azospirillum spp., Azotobacter spp. and Gluconacetobacter spp. bacterial genus (Holt et al. 1994; Pérez and Casas 2005; Mehnaz et al. 2006). Characteristics Azospirillum Gluconacetobacter Azotobacter Curved rods + - - Short rods - + - Rods and cocci - - + Cell diameter (µm) 0.9-1.2 0.6-0.8 1.5-2.0 Gram-negative + + + PBH intracellular grains + - - Cists formation - - + Motility + + +/- Flagellum distribution polar peritrical peritrical Aerobic + + + Indolic compounds production

Nitrogenase activity under + + +

microaerophilic conditions + + +

Metabolized carbohydrates

D-fructose + - +

D- glucose + + +

D-mannitol - - +

D- sucrose - - +

D- maltose - + +

D-lactose + - +

D- arabinose + - -

D- sorbitol - + -

D- xylose - - -

Organic salts

Succinate + - -

Malate + - -

Citrate + - -

Enzymatic oxidation

Ethanol to acetic acid - + - Oxidase + + + Catalase + - +

Selection of carbohydrates and organic salts for biochemical tests were based on validations from Holt et al. (1994) for Azotobacter spp., from Pérez and Casas (2005) for Azospirillum spp., and tests from Merhanz et al. (2006) for Gluconacetobacter spp. (Table 1). O/F culture medium was used at 0.7% (w/v) agar in 2 cm diameter tubes to increase uniform growing area without bubbles. For Gluconacetobacter spp., the basic culture medium was LGI-P at pH 6.0, replacing sucrose with different carbohydrates to test for efficacy. Stock solutions for


carbohydrates were prepared at 10% (w/v) and filtered through a 0.22 µm membrane to sterilize. The final concentration of carbohydrates in the O/F culture medium was 1% (w/v). Finally, bacterial culture suspensions normalized at #1 tube for McFarland standards, corresponding approximately to a cell density of 3.0x108 CFU/mL, were seeded on culture tubes. Sterile mineral oil was added on top of the medium in closed tubes for fermentative metabolism tests, and sterile cotton balls were used to cap open tubes for oxidative metabolism tests (Hugh and Leifson 1953)

Quantification of indolic compounds

Bacterial pure isolates were grown in Dyg’s enriched broth for Azospirillum spp. and Gluconacetobacter spp., and Burk’s medium for Azotobacter spp. L-tryptophan amino acid was added as precursors in metabolic routes required to produce indole-3 acetic acid (IAA). Stock solution was sterilized by filtration through a 0.22 µm membrane pore size, and added to a final concentration of 25 µM. Tests were performed by triplicate, incubated overnight at 30°C in the dark and shaken at 120 rpm. Bacterial cultures were transferred to 1.5 mL Eppendorf tubes, centrifuged at 10,000 rpm at 4°C. The supernatants were collected and transferred into glass tubes. Two volumes of Salkowski´s reagent were added (Pilet and Chollet 1970) and then incubated 30 min. Pink to fuchsia color was observed when IAA was oxidized (Garrido 2007). To quantify IAA, absorbance was measured at 535 nm in a UV-VIS-1800 Shimadzu® spectrophotometer. Data plotted against a standard curve specifically developed by triplicate with six intermediate IAA concentrations (250, 200, 150, 100, 50, and 25 µM) resulted in R2=0.9997.

Cluster analyses – isolates and biochemical charact erization

From the 108 sampled fields, we obtained 143 isolates and 111 were characterized based on morphological descriptions for Azospirillum spp., Azotobacter spp., and Gluconacetobacter spp., and the set of biochemical tests described above. A hierarchical cluster analysis using centroids was performed on the group isolates and explained 91% of biochemical and metabolized carbohydrates variation between and within genera and isolates. This variation was represented by and three clusters. The distance method was 1 minus Gower (referred to as DGOWER in the SAS System Distance Procedure) because the variables either present or absent (Gower 1971).

Statistical analyses – indolic compounds quantifica tion

Analysis was performed using a generalized linear model adjusted to a Gamma distribution for IAA production, with the genus and the nested effect of isolates within the genus as factors (LogIAAijk= μ +Genusi + Isolate (Genus)j(i)). ANOVA (type III test) was used to establish significant statistical differences between genera followed by a Bonferroni´s means comparison test.

RESULTS

Isolates and biochemical characterization

Forty-eight isolates were grouped by the first cluster (Table 2), 13 of them were determined as Azospirillum spp. and 35 as Azotobacter spp., including their positive reference controls Azospirillum brasilense NCBIM 11860 and Azotobacter chroococcum NCBIM 8002. There were statistically common metabolic characteristics shared by both genera. This can be explained by relative species variability and evolutionary origin (Ahmed et al. 2015). Within the second cluster with different biochemical responses (Table 2), 5 isolates were determined

Bibliografía 93

as Azospirillum spp. and 24 isolates as Azotobacter spp. Some biochemical similarities between isolates were identified due to species variation, but some showed statistical differences for metabolic characteristics in comparison to the positive reference controls. The third cluster (Table 2) was formed by 34 isolates of Gluconacetobacter spp. only, showing more consistent biochemical responses that were comparable to the positive reference control Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985. For this biochemical cluster there was metabolic homogeneity due to low biochemical combinations (Menhaz et al. 2006), and some variation related to biotypes within species in the same genus. In summary, following morphology and cluster analysis for biochemical, carbohydrates and metabolic tests, there were 18 isolates characterized as Azospirilllum spp., 59 as Azotobacter spp., and 34 as Gluconacetobacter spp. (Table 2).

Table 2. Determination of genus based on biochemical and metabolized carbohydrate assays for 111 bacteria isolates obtained from four CC varieties from the Cauca River Valley. The analysis included the positive reference controls for each genus. The partition into three clusters accounts for 91% of the total variation.

Genus Number of clusters

1 2 3 Total Azospirillum spp. 13 5 0 18 Azotobacter spp. 35 24 0 59 Gluconacetobacter spp. 0 0 34 34 Total 48 29 34 111 % 43.24 26.13 30.63 100

Indolic compounds quantification

Considering that species of Azospirilllum spp., Azotobacter spp. and Gluconacetobacter spp. are well recognized as PGPR, IAA production was estimated for all 111 isolates. ANOVA (type III test) resulted in significant statistical differences between genera (F=1285.29, P<0.0001), and between isolates within the genus (F=138.17, P<0.0001). Bonferroni´s means comparison test also found statistical differences (α=0.05) for IAA production between genera (Table 3), and within each genus. Isolates from Azospirilllum spp. and Azotobacter spp. showed similar IAA contents, and both were higher and statistically different (α=0.05) from Gluconacetobacter spp. isolates (Table 3).

Table 3. IAA production by bacterial isolates from three genera obtained from CC varieties from the Cauca River Valley. Means were compared by Bonferroni´s test. Different letters (A and B) indicate significant statistical differences (α=0.05). The analysis included the positive reference controls for each genus.

Genus IAA mean (µg/mL)

Standard Error

Bonferroni (α= 0.05)

Azospirillum spp. 42.3 0.69 A Azotobacter spp. 41.8 0.38 A Gluconacetobacter spp. 19.9 0.25 B

Azospirilllum spp. isolates showed moderate variation in IAA production for 18 isolates (Fig. 2), with a maximum of 84.91 µg/mL, a minimum of 23.97 µg/mL, and an average of 42.3 µg/mL for the genus (Table 3). At least 12 isolates registered higher and statistically different (α=0.05) IAA content than the positive reference control Azospirillum brasilense NCBIM 11860 culture that produced the second lowest content with 26.58 µg/mL on average (Fig. 2). Five isolates were not statistically different from the control within a range of 26.58 to 37.6 µg/mL.


Fig. 2. Average production of indole-3 acetic acid (IAA µg/mL) for 17 representative Azospirillum spp.

isolates obtained from CC varieties from the Cauca River Valley, and the reference positive control. Isolates that share same letter cannot be considered statistically different (Bonferroni’s test α=0.05).

Azotobacter spp. isolates showed the highest variation for IAA production within the genus as shown in Figure 3 for 20 representative isolates with higher averages than the positive reference control. The maximum average was 202.8 µg/mL, minimum of 3.97 µg/mL, and for the genus the average was 41.83 µg/mL (Table 3). Only four isolates registered higher and statistically different (α=0.05) IAA content than the control Azotobacter chroococcum NCBIM 8002 culture (68.5 µg/mL) (Fig. 3). However, 17 isolates had higher IAA average and were not statistically different from the reference control within the range of 69.1 to 100.8 µg/mL. The other 16 isolates were also not significantly different from the control, but had lower IAA average values within the range of 64.1 to 46.7 µg/mL (data not shown). Only 22 isolates were significantly different with lower averages than the control in a range between 3.97 to 42 µg/mL (data not shown).

Bibliografía 95

Fig. 3. Average production of indole-3 acetic acid (IAA µg/mL for 20 representative Azotobacter spp. isolates

out of 59 isolates obtained from CC varieties grown in the Cauca River Valley, and the positive reference control isolate. Isolates that share same letter cannot be considered statistically different (Bonferroni’s test

α=0.05).

Gluconacetobacter spp. isolates also showed marked variation in IAA production within the genus and between isolates for seven representative isolates (Fig. 4). The maximum average was 71.7 µg/mL, the minimum was 3.02 µg/mL, and the average for the genus was 41.83 µg/mL (Table 3). Out of 34 isolates, six of them registered higher and statistically different (α=0.05) IAA content than the positive reference control Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985 (33.1 µg/mL) (Fig. 4). Nine isolates were not statistically different from the reference control within the range 22.4 to 39.7 µg/mL. Sixteen isolates were different from the reference control with lower IAA production within the range 3.02 to 20.8 µg/mL (data not shown).

Fig. 4. Average production of indole-3 acetic acid (IAA µg/mL for 7 representative Gluconacetobacter spp.

out 34 isolates obtained from CC varieties in the Cauca River Valley, and the positive reference control. Isolates that share same letter cannot be considered statistically different (Bonferroni’s test α=0.05).


DISCUSSION

Average results for Azospirillum spp. are comparable to IAA contents obtained by Bashan et al. (2004) and Cárdenas (2007), with 40.17 µg/mL for A. brasilense strain SP7. In addition there is the advantage of high production of plant hormones gibberellic acid and abscisic acid as mentioned in that study. Twelve Azospirillum spp. isolates were significantly higher than the positive reference control A. brasilense NCBIM 11860 culture: Isolate #14, obtained from sugarcane variety CC84-75 in a humid environment showed an outstanding average IAA production, almost fourfold in comparison to the control, and significantly different from the other isolates. Three isolates obtained from variety CC93-4418 in different environments: #11 (from foothill positions), #6 (from dry-semi dry conditions), and #12 (from humid environments), doubled IAA production in comparison to the positive reference control with a value of 26.58 µg/mL. These values generally exceed those reported by Cárdenas (2007) for isolates obtained from Guinea grass (Panicum maximum) with IAA values from 45.18 to 43.27 µg/mL, and Mascarua-Esparza et al. (1988) who reported 36.5 to 77 µg/mL produced by A. brasilense isolated from roots of Cactaceae species Stenocereus pruinosus and S. stellatus.

Similarly, for Azotobacter spp. isolates that produced average IAA average of 41.8 µg/mL for the entire genus were comparable to those reported by Borda-Molina et al. (2009) for an Azotobacter nigricans isolate obtained from a sugarrich plant Stevia rebaudiana that had an IAA concentration of 38.4 µg/mL. Four Azotobacter spp. isolates produced statistically higher IAA compared with the positive reference control Azotobacter chroococcum NCBIM 8002 that had an average of 66.5 µg/mL: Isolate #69 obtained from variety CC85-92 showed the highest IAA (202.8 µg/mL) and was significantly different (α=0.05) from all isolates, followed by isolate #89 (CC85-92 with 139.8 µg/mL), #95 (CC93-4418 with 114.0 µg/mL), and #96 (CC01-1940 with 109 µg/mL). The range of IAA production in our study was very wide reaching a minimum value of 3.97 µg/mL on average. Valderrama (2015) obtained Azotobacter spp. (isolates #4 and #19) from the same variety (CC85-92) planted in the southern region of the Cauca River Valley, with significantly lower values of 0.90 µg/mL and 0.98

µg/mL, respectively, compared to the A. vinelandii control that produced 0.35 µg/mL. Mrkovacki and Milić (2001) obtained

IAA values of 9.6 to 19.8 µg/mL for A. chrooccocum isolates, and Bautista and Gallardo (2008) reported an average IAA value of 60 µg/mL for A. vinelandii (ATCC 12518), that increase to 80 µg/mL depending on incubation time and culture medium. These values are similar to IAA produced in our study by the positive reference control A. chroococcum NCBIM 8002 with 66.5 µg/mL.

Of the Gluconacetobacter spp. isolates, six were statistically different from the positive reference control G. diazotrophicus NCBIM 12985 (33.1 µg/mL average). These six isolates produced IAA in a range between 69.6 µg/mL (isolate #53 from CC 84-75) to 51.1 µg/mL (isolate #24 from CC 85-92). However, a large variation was evident within the genus, with a range from 3.02 to 71.7 µg/mL. These values are not dissimilar to those published by Mathukumarasamy et al. (2002) for different sugarcane varieties in India, with IAA averages between 6 to 14 µg/mL. Similarly, Rodríguez et al. (2005) characterizing endophytes in sugarcane from Cuba, reported IAA product for G. diazotrophicus positive control PA1-5 of 2.2 µg/mL compared to isolates (genus and species unknown) #305, #30 and #17 with values of 2.5, 2.4, and 1.8 µg/mL, respectively. Despite this, Gluconacetobacter spp. isolates showed low IAA production in our study with an average value of 19.9 µg/mL for the genus, which is comparable to values for isolates belonging to two other genera reported by Patil et al. (2011) and Muthukumarasamy et al. (2002). They, respectively, indicated average IAA values of 15.0 and 12.5 µg/mL for G. diazotrophicus PA1-5. Fuentes–Ramírez et al. (1993) reported an average range in IAA values between 0.14 and 2.42 µg/mL, which is lower than those we obtained (3.02 µg/mL).

Our study confirms that numerous isolates obtained from CC sugarcane varieties grown in the Cauca River Valley in Colombia produced higher or similar IAA values than isolates reported by many others worldwide. This

Bibliografía 97

indicates their potential biodiversity and the probable significance of this study for the future of Colombian sugarcane agroindustry.

CONCLUSIONS

• We obtained 143 bacterial isolates from four of the most common sugarcane varieties planted in three different environments along the Cauca River Valley (dry to semi-dry, humid, and foothills) in Colombia. This region represents an important and valuable area of biological diversity for N-fixing and PGPR bacteria.

• Biochemical assays enabled preliminary characterization of 111 isolates, determining 18 isolates as Azospirilllum spp., 57 as Azotobacter spp., and 34 as Gluconacetobacter spp. This included comparisons with referenced positive controls and well characterized type of cultures.

• Differences and commonalities in biochemical results associated with different species within genera, and between some of the genera could cause ambiguity in taxonomy determinations, and low reproducibility in some specific cases. However, this uncertainty could be addressed with further biochemical and molecular analyses.

• We obtained isolates with higher IAA production and significant statistical differences compared to published referenced controls and isolates reported in several crops worldwide, including sugarcane. A set of 14 isolates from the three genera showed promising results, and are candidates for further studies with sugarcane in Colombia. However, all isolates obtained in this project have resulted in a valuable resource that to be preserved and used for future study.

ACKNOWLEDGMENTS

To scientific, technical, administrative, and support personnel of CENICAÑA, especially to Agronomy, Factory Processes and Varietal Programs, and Plant Pathology Area. To sugar mills and cane farmers for CENICAÑA´s funding, and facilitated samples collection. To CIAT staff for technical support, and to Colombian National Science Development Institute (COLCIENCIAS) for partial funding through tax benefits.

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Isolement et caractérisation biochimique préliminai re des bactéries fixatrices d'azote appartenant à trois genres obtenus de la canne à su cre en Colombie

Résumé. La canne à sucre est une culture importante en Colombie, exploitée de manière intensive sur environ 228,000 ha le long de la vallée de la rivière Cauca. Pour atteindre des rendements profitables, des taux élevés d'azote (N) et, dans certains cas en excès, sont appliqués. Cela engendre une augmentation des coûts de production et des risques de contamination de l'environnement et de l'eau. À la recherche des stratégies visant à réduire les applications de N pour la durabilité de la culture et pour une gestion intégrée, le rôle des bactéries fixatrices d'azote a été exploré. L'objectif de cette

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étude était d'isoler et de caractériser les souches locales de trois bactéries fixatrices d’azote connues pour promouvoir la croissance des plantes des genres Azospirillum, Azotobacter et Gluconoacetobacter, et de déterminer leur association aux quatre variétés les plus importantes et largement cultivées, notamment CENICAÑA-Colombie (CC) CC8592, CC84-75, CC93-4418 et CC01-1940. Pour couvrir la plupart des environnements au long de la vallée, 108 champs ont été sélectionnés à l'aide de Système d’Informations Géographiques ArcGIS®. Les échantillons individuels étaient composés de 20 plantes choisies au hasard selon une méthode prédéterminée, échantillonnant les racines, les tiges, les feuilles et le sol rhizosphérique de chaque plante du site. Les échantillons ont été traités au laboratoire de phytopathologie de CENICAÑA, pour la culture sur des milieux sélectifs LGI-P, Ashby, et de l'BFA, entre autres pour détecter chaque genre de bactéries. Une caractérisation morphologique et biochimique pour les α et ß protéo-bactéries ont été effectuées en trois exemplaires, et comprenaient l’aérobie/la micro-aérophile, la motilité des cellules hélicoïdales et cocci, la coloration de Gram, et le métabolisme oxydatif par fermentation de divers hydrates de carbone et de sels organiques. En outre, la production des substances favorisant la croissance a également été évaluée. Des comparaisons ont été faites avec les cultures type d’Azotobacter chroococcum NCBIM 8002, d’Azospirillum brasilense NCBIM 11860, et d’Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985, entre autres. Sur les 143 isolats obtenus, 111 ont été caractérisés. L'analyse de groupe a identifié trois groupes qui expliquent 91% des variations biochimiques et les glucides métabolisés. La quantification de l'acide indole-3 acétique comme substance favorisant la croissance a également montré une forte variation avec des teneurs similaires entre les isolats des espèces Azotobacter et Azospirillum, mais des différences significatives statistiquement (α = 0,05) avec l’espèce Gluconacetobacter, avec une production plus faible. Le séquençage de l'ADNr 16S pour identifier les espèces, ainsi que des essais de réduction d'acétylène pour déterminer la performance de fixation de N par ces isolats sont en cours. Quatorze isolats des trois genres ont été identifiés comme des candidats prometteurs pour d'autres études. Mots-clés: Canne à sucre, fixation d’azote, croissance des plantes, bactéries, tests biochimiques, acide indole-3 acétique (IAA) Aislamiento y caracterización bioquímica preliminar de bacterias fijadoras de nitrógeno pertenecientes a tres géneros obtenidas de caña de azúcar en Colombia Resumen. La caña de azúcar es un cultivo de alta importancia en Colombia, el cual se desarrolla intensivamente en el valle del río Cauca en cerca de 228.000 ha. Para alcanzar productividades rentables, se aplican altas dosis de fertilizantes nitrogenados que incluso pueden ser excesivas, lo que incrementa los costos de producción al igual que los riesgos ambientales y de contaminación del agua. Con el propósito de buscar estrategias para reducir las aplicaciones de nitrógeno (N) dentro de un manejo del cultivo integral y sostenible, se está explorando el papel de las bacterias fijadoras de N. El objetivo de este estudio fue aislar y caracterizar preliminarmente bacterias fijadoras de N nativas y reconocidas por ser promotoras de crecimiento, pertenecientes a los géneros Azospirillum, Azotobacter y Gluconoacetobater, obtenidas a partir de cuatro de las variedades CENICAÑA-Colombia (CC) más sembradas en el valle del río Cauca (CC85-92, CC84-75, CC93-4418 y CC01-1940). Para cubrir la mayoría de ambientes a lo largo de esta región, se seleccionaron 108 campos usando el sistema de información geográfica ArcGIS®. Muestras individuales compuestas de 20 plantas por campo se seleccionaron aleatoriamente siguiendo un método predeterminado, y se tomaron de cada planta muestras de raíces, tallos, hojas y suelo rizosférico. Las muestras se procesaron en el Laboratorio de Fitopatología de CENICAÑA, y se sembraron en medios de cultivo selectivos LGI-P, Ashby y NFB, entre otros para cada género de bacteria. La caracterización morfológica y bioquímica para α y β-proteobacteria se realizó por triplicado para cada aislamiento, incluyendo pruebas para aeróbicos/microaerófilos, motilidad para helicoides, bacilos y cocos, tinción de Gram, y pruebas de diferentes carbohidratos y sales orgánicas para metabolismo oxidativo fermentativo; adicionalmente, se evaluó la producción de sustancias promotoras de crecimiento. Las comparaciones se realizaron con respecto a cultivos tipo o de referencia de Azotobacter chroococcum NCBIM 8002, Azospirillum brasilense NCBIM 11860, Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985, entre otras especies de bacterias. De los 143 aislamientos obtenidos 111 fueron caracterizados, y los resultados de los análisis de agrupamiento identificaron tres grupos que explicaron el 91% de la variación en las pruebas bioquímicas y de carbohidratos metabolizados. La cuantificación del ácido 3-indol acético como sustancia promotora del crecimiento también mostró una alta variación entre aislamientos de las bacterias, indicando contenidos similares entre aislamientos de Azotobacter spp. y Azospirillum spp., pero estadísticamente diferentes (α=0.05) con respecto a los aislamientos de Gluconacetobacter spp. que registraron más baja producción del ácido. Análisis de las secuencias del gen 16S del ADN ribosomal se están realizando para confirmar especies, al igual que pruebas de reducción de acetileno para determinar la capacidad de fijación de N por estos aislamientos. Catorce aislamientos de los tres géneros de bacterias se seleccionaron como promisorios para estudios adicionales. Palabras clave: Caña de azúcar, fijación de nitrógeno, bacterias promotoras de crecimiento, bacterias, pruebas bioquímicas, ácido 3indol acético (AIA)

Caracterización bioquimica y molecular de bacterias ...

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