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CAPÍTULO 4

RADICALES LIBRES

Y ANTIOXIDANTES

CAPÍTULO 4 RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES

Como se mencionó anteriormente, todos los organismos aeróbicos, como producto de su metabolismo, originan la formación de moléculas oxidantes. Las reacciones de oxidación-reducción (redox) son biológicamente esenciales para la generación de compuestos de alta energía. Éstos se utilizan como fuente para los procesos del metabolismo celular e involucran la transferencia de electrones.1-3 En la actualidad, se acepta la propuesta respecto a que la tasa metabólica de las especies determina la esperanza de vida, es decir, a mayor gasto metabólico por consumo de oxígeno, menor tiempo de vida.4 Esta aseveración apoya la teoría de que el envejecimiento es producido por el incremento en el número de radicales de oxígeno endógeno generados en las células y cuya acumulación produce un daño irreversible a las biomoléculas. Esta teoría llamada de los radicales libres (RL) del envejecimiento fue propuesta por Denham Harman en 19565 y es la más plausible, hasta el momento, para explicar este proceso, además de una serie de enfermedades crónico-degenerativas como: diabetes mellitus, ateroesclerosis, enfermedad de Alzheimer, cataratas, artritis reumatoide y cáncer, entre otras.1, 3,6,7

En este capítulo revisaremos brevemente los aspectos bioquímicos generales de la formación de RL y los mecanismos antioxidantes que contrarrestan su efecto.

4.1. RADICALES LIBRES Y ESTRÉS OXIDATIVO

Los radicales libres (RL) son especies químicas que poseen en el último orbital un electrón no apareado, por lo que, son capaces de extraer un electrón de las moléculas vecinas para completar su orbital, convirtiéndose en componentes altamente reactivos y oxidantes. Una de las moléculas más susceptibles de ser transformada es el oxígeno molecular (O2), su reducción involucra cuatro electrones y genera tres especies reactivas de oxígeno (ERO2): anión superóxido (O2 ). peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (OH*) (Figura 4.1).1-3,6,7

Figura 4.1. Los cuatro pasos de la reducción del oxígeno molecular a agua con la generación de tres especies reactivas de oxígeno (EROs).

El H2O2 no es un radical libre, pero cae en la categoría de EROs por ser un compuesto intermediario e importante en la bioquímica de los RL, ya que, se descompone fácilmente en presencia de metales de transición, para producir el más reactivo y dañino RL de oxígeno, el radical hidroxilo (OH·).3-7 Varios metales de transición reaccionan con el H2O2, pero al que se le ha puesto más atención es al hierro. En el mecanismo mediado por hierro, las sales ferrosas reaccionan con H2O2 para formar

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60 RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES OH· por medio de una reacción llamada de Fenton. (Figura 4.2)6,7

Fe (II) + H2O2 OH·+OH- + Fe(III)

Figura 4.2. Reacción de Fenton que involucra la presencia de sales ferrosas. Por su parte, el O2

-· puede reducir ciertos quelatos férricos, interviniendo en la reacción de formación de OH·. La reacción condensada, sin los intermediarios del hierro, entre O2

-' y H2O2 se conoce como reacción de Haber-Weiss (Figura 4.3).6,7

O2- +H2O2 OH·+OH- + O2

Figura 4.3. Reacción de Haber-Weiss catalizada por hierro.

Los RL son generalmente producidos por reacciones de transferencia de electrones, las cuales pueden ser mediadas por acciones enzimáticas que involucran a la cadena respiratoria, la fagocitosis, el sistema citocromo P450, reacciones del retículo endoplasmico, la acción enzimática de xantina oxidasa y la síntesis de prostaglandinas; además de reacciones no enzimáticas del oxígeno con compuestos orgánicos o iniciadas por radiaciones ionizantes. Principalmente, son formados a través de reacciones de oxidación-reducción (redox).6-8

Se considera a la mitocondria como la principal fuente de RL, debido a que en este organelo es donde se produce la mayor parte de energía para la célula.4,6-8 La producción de O2

_* mitocondrial ocurre en dos puntos de la cadena de transporte de electrones (cadena respiratoria), en el llamado complejo I (NADH deshidrogenasa) y en el complejo III (ubiquinona-citocromo creductasa). Bajo condiciones normales, el complejo III es el principal centro de producción de EROs. Los electrones de las deshidrogenasas de los complejos I y II son transferidos a la coenzima Q o ubiquinona (Q), produciéndose la reducción de la coenzima (QH2) que subsecuentemente sufre dos reducciones consecutivas de un electrón, en el llamado ciclo Q, usando formas oxidada y reducida de los citocromos b y c. Se forma un radical de la coenzima Q (Q-) que es inestable y lleva a la producción de O2

_· por la transferencia de electrones directamente del oxígeno molecular (Figura 4.4).4

Figura 4.4. Ciclo Q para la producción de O

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Otra especie reactiva de oxígeno es el llamado oxígeno singulete (1O2) que no es propiamente un radical libre porque no contiene un electrón impar, ya que, los dos electrones de la última órbita ocupan el mismo orbital y tienen los spin paralelos, es decir están apareados. Es una molécula muy reactiva y capaz de oxidar rápidamente muchas otras, incluyendo ácidos grasos poli-insaturados. Se forma principalmente por reacciones fotoquímicas y en los eosinófilos.8-10

Además del O2, el nitrógeno también es capaz de formar RL dos óxidos: óxido nítrico (NO*) y dióxido nítrico (NO2*), conformando las llamadas especies reactivas del nitrógeno (ERNs). El NO* es un RL gaseoso derivado de la oxidación del nitrógeno guanído-terminal del aminoácido L-arginina, en una reacción oxidativa que consume oxígeno molecular y reduce equivalentes en la forma reducida de la coenzima nicotina-adenina-dinucleótido fosfato (NADPH) para formar L-citrulina, esta reacción es catalizada por la enzima óxido nítrico sintetasa (NOS) (Figura 4.5).9-12

NOS L-arginina + O2 +NADPH NO· + L-citrulina

Figura 4.5. Formación del radical de óxido nítrico a partir de arginina, oxígeno y NADPH. Los radicales OH*, O2

-* y NO* son capaces de reaccionar con las biomoléculas produciendo RL orgánicos menos reactivos. El OH* reacciona con los carbonos centrales de las moléculas en forma RH, tales como proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucléicos, convirtiéndolas en radicales (R*), este radical libre carbono-central reacciona rápidamente con el oxígeno para formar un radical más estable llamado peroxílo (ROO*) que a su vez puede tomar parte en otras reacciones para producir radicales alcoxilos (RO'). Así mismo, los átomos de azufre en forma de compuestos sulfhidrilo (RSH) también pueden ser convertidos en RL formando los radicales tiol (RS*).10 Por otro lado, el O2

_· reacciona con el NO* para formar peroxinitrilo (ONOO-).6-10 El peroxinitrilo es un poderoso oxidante que daña muchas moléculas biológicas y que a pH ácido se puede descomponer liberando pequeñas cantidades de OH* independientemente de la catálisis de metales. También, bajo ciertas condiciones, puede reaccionar con residuos de aminoácidos produciendo nitrotirosina, compuesto que lleva a la inactivación enzimática (Figura 4.6).9,10

De todas las biomoléculas que pueden ser atacadas por RL, los lípidos son probablemente los más susceptibles. Las membranas celulares son ricas en ácidos grasos poli-insaturados que son fácilmente oxidables por un proceso conocido como lipoperoxidación o peroxidación lipídica. Este proceso daña directamente la estructura de la membrana celular indirectamente a otros componentes celulares por la producción de aldehidos reactivos. La lipoperoxidación se lleva a cabo por medio de una serie de reacciones en cadena de tres pasos: iniciación, propagación y terminación. En la iniciación un ácido graso poliinsaturado es atacado por un RL (OH·, RO· o ROO·) que abstrae un átomo de hidrógeno (H*) de un grupo metileno (—CH—) que tenga un doble enlace adyacente, esta abstracción deja un carbono central desapareado (—*CH—). El radical carbono-central sufre un rearreglo molecular para formar un dieno conjugado que, posteriormente, se combina con O2 para formar un ROO*; este nuevo RL puede a su vez abstraer un átomo de hidrógeno de otro ácido graso y así se propaga la reacción. La peroxidación continúa hasta que el sustrato se termina o se presenta un antioxidante para romper la secuencia de la propagación (Figura 4.7).9,10

62 RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES

Figura 4.6. Formación da radlcalea orgánicot aacundarioa a partir da EROa y NO*.

Figura 4.7. Reacciones da inicio y propagación da la lipoparoxidaclón.

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También existen sistemas enzimáticos que llevan a cabo reacciones de lipoperoxidación como parte de su acción catalítica, tal es el caso de las ciclo-oxigenasas y lipoxigenasas que utilizan RL como intermediarios en las reacciones de formación de endoperóxidos e hidroperóxidos, respectivamente. En estos casos, el RL se localiza en los sitios activos de las proteínas.9

La extensa lipoperoxidación en las membranas biológicas causa pérdida de la fluidez, caída del potencial de membrana, incremento de la permeabilidad a H * y otros iones y, eventualmente, liberación del contenido celular y de los organelos causando la muerte celular.9

En las proteínas los RL producen carboxilación, pérdida de sulfhidrilos, fragmentación de moléculas, nitración, enrollamientos erróneos de las estructuras secundarias o pérdida de la conformación de estructuras terciarias y cuaternarias, reacciones espontáneas con glucosa (glucosilación) y entrecruzamíentos de tipo covalente.13-16 Todos los residuos de aminoácidos de las proteínas son sujetos de ataque por parte del OH*, siendo los de preferencia: tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina, metionina y cisterna.13,14 Las proteínas oxidadas son fácilmente degradadas por enzimas proteolíticas debido a la carboxilación, creación de nuevos grupo N-termmales o cambios conformacionales. Se ha demostrado que el ONOO- oxida a las proteínas de membrana y cítoplasmáticas afectando su naturaleza física y química.14-16

La glucosilación envuelve la interacción no enzimática entre los azúcares reductores, principalmente glucosa, con los grupos amino de las proteínas para formar bases de Schiff que sufren un rearreglo molecular para formar cetoaminas o compuestos de Amadori (Capítulo 3). Es un proceso que ocurre en varias semanas, por lo que, afecta proteínas de larga vida. Estos productos glucosilados en presencia de O2.· y Fe(ll) forman productos de fragmentación que posteriormente se condensan conformando los llamados productos finales de glucosilación avanzada (AGEs, Advenced Glucosyiation End-products) o productos avanzados de Maíllard. Hay suficiente evidencia que muestra que estos productos se incrementan con la edad, por lo que, se relacionan con el envejecimiento.13,17

Con respecto a los carbohidratos, el efecto de los RL parece centrarse en las reacciones de glucosilación con proteínas, otros efectos son poco conocidos.16

El ADN no está exento del proceso oxidativo, tanto el nuclear como el mitocondrial.10 Al respecto Ames estimó que una célula de rata recibe 100 000 golpes oxidativos en el ADN/día producidos por OH*,18 es decir, de cada 1012 moléculas de oxígeno que entran a la célula/día, es posible que 1 en 200 dañen al ADN.19 Las EROs pueden causar entrecruza miento de proteínas-ADN, intercambio de cromátides hermanas, daño a la estructura de desoxirribosa-fosfato y oxidación de las cuatro bases nitrogenadas.19-21 Las modificaciones oxidativas en las bases producen mutaciones, mientras que la oxidación de la desoxirribosa puede inducir liberación de bases y rompimiento en cadena sencilla de las hebras de ADN.16,21 Por lo general, los OH* producen múltiples productos de oxidación de las bases como 8-hidroxiadenina y timidina glicol; el 1O2 preferentemente modifica la guanina por 8-hidroxilación formando los compuestos 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (80HdG) y su base libre 8-hidroxiguanina (80HG).21 La reactividad del OH' hacia la desoxirribosa varía considerablemente, siendo los carbonos 4 y 5 los más susceptibles,16 la lesión predominantemente observada es el rompimiento de la hebra mediado por hierro y H2O2.22


Adicionalmente a lo expresado con anterioridad, se sugiere que el incremento de EROs puede representar una común, pero no universal, señal de estrés celular. Cuando el estrés es severo, la supervivencia es dependiente de la habilidad de la célula para adaptarse o resistir el estrés y de reparar o reemplazar las moléculas dañadas. Se han encontrado varios mecanismos de respuesta al estrés en las células a través de caminos de señalización transcripcional y post-transcripcional que actúan sobre genes específicos.4 De éstos, el sistema transcripcional del factor nuclear kappa B (NF-KB) se activa con concentraciones micromolares de H2O2 en varios tipos celulares, así como, por la acción moderada pro-oxidante en el sistema redox del glutatión. Un gran cuerpo de evidencia experimental ha sugerido que las EROs co-modulan la activación de NF-KB en ciertos tipos celulares y bajo ciertas condiciones, así mismo, se ha descrito que este factor está relacionado con la expresión de la óxido nítrico sintetasa (NOS).11

Para prevenir la formación de moléculas oxidantes y para reparar el daño oxidativo a los tejidos y biomoléculas, todos los organismos aeróbicos poseen un complejo armónico de defensas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos. El balance entre la producción de RL y las defensas antioxidantes determina el grado de estrés oxidativo,4 de tal manera que se puede decir que el estrés oxidativo (EOx) es el desequilibrio bioquímico propiciado por la producción excesiva de RL que provocan daño oxidativo a las biomoléculas y no puede ser contrarrestado por los sistemas antioxidantes.2

4.2. SISTEMAS ANTIOXIDANTES

Se define como antioxidante a aquella "sustancia que, presente en bajas concentraciones comparada con los sustratos oxidables, retarda o previene significativamente la oxidación de esos sustratos".9,33 Esta definición enfatiza la importancia de la fuente de estrés oxidativo y el blanco medido (el sustrato oxidable), aunque hay algunas moléculas que no cumplen exactamente con los requerimientos de la definición, como es el caso de la albúmina.23

Los antioxidantes pueden actuar en diferentes etapas en una secuencia oxidativa, de ahí que su sitio de acción puede ser intracelular, en la membrana celular o extracelular.

4.2.1. Antioxidantes celulares

Las células tienen formidables defensas contra el daño oxidativo, constituido básicamente por enzimas, por lo que, la protección antioxidante ocurre a diferentes niveles:9-24

a) Previniendo la formación de RL. b) Interceptando los radicales cuando son formados. c) Reparando el daño oxidativo causado por los radicales. d) Incrementando la eliminación de las moléculas dañadas por medio de

apoptosis. e) No reparando excesivamente las moléculas dañadas para minimizar la

introducción de mutaciones. f) Induciendo y asistiendo los antioxidantes enzimáticos y agentes

destoxificantes.

CAPITULO 4 65

4.2.2. Antioxidantes de la membrana celular

Debido a la doble característica de la membrana celular, hidrofóbica en el interior e hidrofílica en el exterior, se requiere de diferentes tipos de antioxidantes: moléculas liposolubles en el interior de la membrana e hidresolubles en la parte externa.9

4.2.3. Antioxidantes extracelulares

Se han descrito en los líquidos celulares algunas variantes de enzimas que actúan a este nivel. Diferentes proteínas atrapadoras de iones metálicos y compuestos de bajo peso molecular, y proteínas con actividad de oxidación-reducción (redox).9

Para un mejor entendimiento de la acción de los antioxidantes, se han clasificado de acuerdo a su función, dividiéndolas en tres grupos: primarios, secundarios y terciarios (Cuadro4.1, Figura 4.8).25,26

Sistemas Antioxidantes

Figura 4.8. Clasificación de los sistemas antioxidantes.

Cada uno de estos sistemas antioxidantes, in vivo, tienen diferentes mecanismos de acción, los cuales describiremos brevemente a continuación.

4.3. ANTIOXIDANTES PRIMARIOS

Son los que previenen la formación de RL evitando así el daño oxidativo. Son el primer nivel de protección. Hay tres mecanismos por los cuales se lleva a cabo su acción: a) descomponiendo enzimáticamente, los hidroperóxidos formados y el H202 generado; b) quelando los iones metálicos


Cuadro 4.1. Sistemas de defensa contra el daño oxidativo. (Modificado de Niki, 1999).

Sistema antioxidante Antioxidante

1. Antioxidantes preventivos o primarios. Suprimen la formación de radicales libres:

a. Descomposición no-radical de hidraperóxidos o peróxido de hidrógeno (H2O2).

b. Secuestro de iones metálicos catalíticos por quelación.

Enzimas: - Catalasa (CAT) - Glutatión peroxidasa (GPx)

Proteínas: - Transferrina, ferritina - Ceruloplasmina - Albúmina - Metalotioneínas

c. Remoción o depuración de especies reactivas de oxígeno.

2. Antioxidantes "atrapadores" de radicales o secundarios. Atrapan radicales para inhibirla cadena de iniciación o romper la cadena de propagación.

3. Enzimas reparadoras y de novo o terciarios. Reparan el daño y reconstituyen las biomoléculas.

Enzimas: -Superóxido dismutasa(SOD) a. Hidrofílicos: - Vitamina C - Ácido úrico - Bilirrubina - Albúmina b. Lipofílicos: - Vitamina E - Vitamina A y Carotenoides - Melatonina - Estrógenos

- Reparadoras de lípidos - Reparadoras de proteínas - Reparadoras de ADN

potencialmente oxidantes por medio de proteínas, y c) removiendo o depurando enzimáticamente las EROs que han sido formadas.

4.3.1. Descomposición no radical de hidroperóxidos y peróxido de hidrógeno.

■ CATALASA (CAT) Es una enzima constituida por cuatro subunidades protéicas. Cada una contiene un grupo hemo en el sitio activo, por lo que, es una hemoproteína. Cada subunidad generalmente contiene una molécula de NADPH unida a ella, la cual ayuda a estabilizar a la enzima. Se encuentra en los

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peroxisomas celulares y en el citoplasma, principalmente en el hepatocito y los eritrocitos, aunque también está presente a bajas concentraciones en las células del cerebro, corazón y músculo esquelético.27-28 Cataliza la reacción de descomposición del H2O2 (Figura 4.9).

2H2O2 2H2O + O2

Figura 4.9. Reacción de descomposición del H2O2 catalizada por catalasa.

Es considerada una enzima antioxidante porque regula los niveles de H2O2 que, si se encuentran elevados, pueden producir un exceso de OH* a través de las reacciones de Fenton y Haber-Weiss.28 Si la concentración de H2O2 es fija, la velocidad inicial de remoción será proporcional a la concentración de CAT presente. Esta reacción de descomposición del H2O2 puede ser seguida por la pérdida de la absorción a 240 nm o por la medición de la liberación de O2 utilizando un electrodo de oxígeno.27

- GLUTATIÓN PEROXIDASA (GPx, GSH-Px) Enzima constituida por cuatro subunidades protéicas, cada una de las cuales contiene un átomo de selenio (Se) en su sitio activo. El Se, probablemente, se encuentra en forma de selenio-cisteína, es decir, en el aminoácido cisteína que contiene normalmente un átomo de sulfuro (R-SH) se encuentra un átomo de selenio (R-SeH).27 A nivel celular se encuentra en citoplasma y mitocondria.28

Cataliza la oxidación del glutatión reducido (GSH) a glutatión oxidado (GSSG) a expensas de H2O2

(Figura 4.10).

H2O2 + 2 GSH GSSG + 2 H20

Figura 4.10. Reacción de oxidación del glutatión catalizada por GPx.

La mayoría del glutatión in vivo está presente como GSH. Se ha encontrado alta actividad enzimática en el hígado y eritrocitos, moderada en el corazón, hígado y cerebro, y baja en el músculo.27,28

La enzima es específica para GSH como donador de iones hidrógeno, aunque es capaz de aceptar otros peróxidos, no sólo H2O2. Aparentemente el GSH reduce al Se y la forma reducida de la enzima reacciona con el H2O2, es por ello que los organismos animales requieren de trazas de Se para un buen funcionamiento antioxidante.27

La razón GSH/GSSG en las células normales se mantiene alta, por lo que, el mecanismo para regresar el GSSG a GSH es llevado a cabo por medio de glutatión reductasa (GR), una enzima formada por dos subunidades protéicas (cada una con un flavin-adenin-dinucleótido (FAD) en su sitio activo) que cataliza la reacción a expensas de una molécula de NADPH.27,28


El NADPH requerido es provisto en los tejidos animales, principalmente, por una compleja vía metabólica conocida como vía oxidativa de las pentosas fosfato, en donde la primera reacción es catalizada por la enzima glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH).27

La velocidad a la cual la vía de las pentosas fosfato opera está controlada por el suministro de nicotina-adenina-dinucléotido fosfato (NADP+) de la G6PDH. Como la GR actúa y la razón NADPH/ NADP+ disminuye, la vía de las pentosas fosfato acelera el reemplazo a NADPH.27

Se ha descrito que la CAT y la GPx actúan en cooperación para remover el H2O2 formado en las diversas reacciones metabólicas, principalmente la llevada a cabo por la superóxido dismutasa (SOD).27

La acción de la GPx puede ser valorada de diferentes maneras, ya sea midiendo la liberación de GSSG o por acción de la enzima en un hidroperóxido orgánico en presencia de H2O2.27,28

4.3.2. Quejantes de iones metálicos

Son básicamente proteínas séricas, dentro de las cuales se encuentran: trasferrina, ferritina, ceruloplasmina, albúmina, a-lactoalbúmina, β-lactoglobulina,inmunoglobulinas y otras proteínas no identificadas de la leche de vaca pasteurizada. Su principal mecanismo antioxidante incluye la remoción de radicales libres por aminoácidos tales como tirosina y cisteína, y la quelación de metales de transición. También se reporta que las proteínas séricas incrementan los niveles de glutatión, al ser fuentes naturales de cisteína y glutamilcisteína, precursores de la síntesis de glutatión.29

- TRANSFERRINA Y FERRITINA

El hierro ionizado en su forma ferrosa (Fe2*) tiene un efecto tóxico pro-oxidante derivado de la reacción de Fenton, el cual es prevenido por las proteínas enlazantes de hierro: transferrina y ferritina. La tranferrina es una β2-globulina que "atrapa" al Fe2+ para distribuirlo a los sitios de absorción, almacenamiento y utilización, une dos iones por mol de proteína9,30. Se han identificado receptores celulares específicos para el hierro de la transferrina en hígado y placenta, pero los que ofrecen una mayor área de receptores son los reticulocitos y los precursores eritroides de la médula ósea.30

La ferritina representa un grupo heterogéneo de proteínas hidrosolubles, relativamente termoestables, presentes en casi todas las células, principalmente en hígado, bazo y médula ósea, y que almacenan hierro en una forma relativamente inerte, y que además lo pueden liberar cuando se necesita para efectuar procesos metabólicos dependientes de hierro como la síntesis de hemoglobina. Posee un centro de hierro polinuclear rodeado de una cubierta protéica. Incorpora el Fe2* y lo oxida a Fe3+, lo deposita en el interior del núcleo y lo libera cuando se enfrenta con agentes reductores como las flavinas reducidas y el GSH.30,31

La acción antioxidante de ambas proteínas, y demás enlazantes de hierro, se debe a que el hierro unido a ellas no está disponible para estimular reacciones de radicales como la lipoperoxidación o la formación de OH·, convirtiéndose en una parte importante del sistema de defensa antioxidante

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extracelular. Las proteínas no se dañan fácilmente por el H2O2 o los lipoperóxidos y sólo liberan los iones de hierro a pH ácido.27

- CERULOPLASMINA Es una α2-glucoproteína quelante de cobre en un 90% y que contiene 6 átomos de este metal por molécula. También tiene la habilidad de oxidar el Fe2+ a Fe3+ sin liberar radicales de oxígeno intermediarios, por lo que, se le conoce como ferroxidasa,27,31,32 siendo esta característica lo que la hace ser considerada como una proteína antioxidante, ya que, mantiene el metal dentro de su sitio activo.27 Es sintetizada en el hígado y localizada primariamente en el suero.31

La acción de ferroxidasa de la ceruloplasmina permite inhibir la formación de lipoperóxidos u OH·, dependiente de hierro, a partir de H2O2. También tiene una actividad no significativa de "superóxido dismutasa" o "catalasa", ya que, puede reaccionar con O2

_· y HzO2.27 Inhibe la liberación de hierro dependiente de O2

_· de la ferritina, limitando la biodisponibilidad de éste in vivo al reincorporarlo a la enzima cuando es liberado.31

La pequeña cantidad de cobre plasmático no unida a ceruloplasmina se enlaza a histidina, péptidos pequeños y albúmina. Ninguna de estas formas de cobre puede, aparentemente, generar oxidantes reactivos.27

Su actividad puede ser medida mediante su acción de oxidasa utilizando compuestos oxidables que absorben en el espectro de luz visible.32

- ALBÚMINA Es la más abundante de las proteínas séricas circulantes. Dentro de sus variadas funciones se encuentra la de antioxidante tanto de forma primaria como secundaria. Es la responsable de más del 35% de la actividad antioxidante del plasma.33 Esta actividad se basa en su habilidad para unir iones cobre inhibiendo la lipoperoxidación y la formación de OH· cobre-dependientes. Estas reacciones se llevan a cabo en la superficie de la proteína y la dañan, por lo que, es considerada como un "antioxidante sacrificado", pero debido a su alta concentración plasmática y su rápido recambio es que el daño es probablemente insignificante. De esta manera, aunque la unión de cobre a albúmina provoca daño en la molécula bajo ciertas circunstancias, se previenen reacciones de oxidación en blancos más importantes.27

También es un poderoso removedor de ácido hipocloroso (HCIO), un oxidante producido por la enzima mieloperoxidasa (MPO) en las células fagocíticas activadas. La MPO funciona como genuina oxidasa dependiente de O2y no de H2O2 como co-sustrato para la oxidación de compuestos.34 Nuevamente, la albúmina actúa reaccionando con el HCIO y protegiendo de la oxidación a blancos más importantes.27

Dentro de otras de sus funciones se encuentra la unión a compuestos no hidrosolubles como la bilirrubina. Stocker, Glazer y Ames han sugerido que la albúmina unida a bilirrubina actúa como un antioxidante en algunos sistemas lipidícos, aunque la prevención del daño oxidativo a través de los mecanismos de cobre y HCIO son propios de la proteína.27


- METALOTIONEINAS Son proteínas de bajo peso molecular (aproximadamente 6500 daltons) que se encuentran en el citoplasma de las células eucariotes, especialmente en hígado, riñón e intestino. Probablemente también pueden entrar al núcleo. Son ricas en sulfuras (-SH) y poseen la habilidad de unir iones de metales como zinc (Zn2+), cobre (Cu+), cadmio (Cd2+) y mercurio (Hg2+).27 Se han descrito dos isoformas en la mayoría de los vertebrados, metalotioneína I y II.35

Su producción es inducida por estrés oxidativo de diferentes orígenes: físico, químico y por citocinas; por lo que, se considera que son protectoras del estrés oxidativo por diferentes mecanismos.35 La propiedad de secuestrar al Cu+ disminuye la generación de radicales promovidos por este metal, el Zn2+ liberado de la Zn-metalotioneína puede inhibir la peroxidación lipídica y su alto contenido en grupos-SH las hace excelentes removedores de O2 singulete (1O2) y OH·.27,35

4.3.3. Remoción o depuración de especies reactivas de oxígeno.

- SUPERÓXIOO DISMUTASA (SOD) Fue descrita por McCord y Fridovich en 196827 como una enzima que se encarga de la dismutación del ión superóxido (02~') por medio de la reacción que se presenta en la Figura 4.11.

202- + 2H+ H2O2 + O2

Figura 4.11. Reacción de dismutación llevada a cabo por SOD.

Se conocen tres formas moleculares (isoenzimas):27,36

- • Cobre-Zinc-superóxido dismutasa (CuZn-SOD) en citoplasma. - • Manganeso-superóxido dismutasa (Mn-SOD), en la matriz mitocondrial. - • Cobre-Zinc-superóxido dismutasa (EC-SOD), de alto peso molecular en líquidos

extracelulares.

Las enzimas citoplasmáticas CuZn-SOD son las más abundantes, tienen un peso molecular aproximado de 32 000 daltons y contienen dos subunidades proteicas, cada una con dos sitios activos uno que contiene un ion cobre y otro con zinc. En la reacción de dismutación, el cobre sufre un proceso alternado de oxidación y reducción, mientras que el Zn na tiene acción catalítica sino que únicamente estabiliza a la molécula. Por su parte, la actividad de las Mn-SOD es dependiente del tejido y la especie, encontrándose que los eritrocitos de mamíferos no contienen esta forma de la enzima.27 La isoenzima extracelular (EC-SOD) es secretora y remueve principalmente el O2-• del espacio extracelular. Las tres isoenzimas tienen la misma actividad catalítica específica y funcionan juntas de manera complementaria como consecuencia a su diferente distribución celular y subcelular.36

Debido a que en la reacción de dismutación se produce H2O2 se observa un incremento de éste en los tejidos. El H2O2 es tóxico, y por la reacción de Fenton mediada por Fe2+ se produce OH•, de

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ahí que la actividad incrementada tanto intra como extracelular de la SOD aumenta la lipoperoxidación y el daño celular.37 Este efecto dañino de la SOD es contrarrestado por las enzimas que se encargan de transformar el H2O2 en compuestos no oxidantes como son la GPx y la CAT, por lo que, el efecto antioxidante es llevado en dos pasos: la dismutación del O2

-• y la conversión del H2O2. El balance entre estos dos pasos antioxidantes enzimáticos pueden ser críticos, ya que, una actividad baja de SOD en relación a GPx y/o CAT puede producir una acumulación de O2-, mientras que un exceso de SOD en relación a GPx y/o CAT incrementa los niveles de H2O2.38

Existen diversas maneras de cuantificar la actividad de la SOD, utilizándose más frecuentemente un método indirecto. En este método se genera O2• con la enzima xantina oxidasa a partir del sustrato xantina y la SOD compite con un colorante indicador (INT) por el O2-•27 Los métodos actuales no distinguen entre la actividad de las tres isoenzimas.36

4.4. ANTIOXIDANTES SECUNDARIOS

Cuando el nivel de antioxidantes primarios ha sido rebasado, el organismo tiene un segundo nivel de protección llamado de antioxidantes secundarios. El papel de los antioxidantes secundarios es "atrapar" a los RL que se han formado, impidiendo así la iniciación de una cadena oxidativa o interrumpiendo su propagación.

4.4.1. Hidrofílicos

- VITAMINA C (ÁCIDO ASCÓRBICO) Es una vitamina soluble en agua requerida in vivo como cofactor de varias enzimas, siendo considerada como el más importante antioxidante en los líquidos extracelulares.27'39 Los humanos no tenemos la capacidad de sintetizar ácido ascórbico al carecer de la enzima L-gulono-y-lactona oxidasa, por lo que, es necesario suplementario exógenamente.29,40,41

Químicamente se encuentra como anión monovalente a pH fisiológico, por lo que, es un donador de electrones específico, funcionando como agente reductor (antioxidante) en muchas reacciones intra y extra celulares.29,41

Funciona en el organismo en forma de ascorbato, siendo su principal propiedad la habilidad de donar dos electrones, ayudando al organismo a destoxificar varios radicales orgánicos derivados del oxígeno, nitrógeno y sulfuras.29,42 La donación de un electrón del ácido ascórbico produce el radical de ácido semideshidroascórbico, que posteriormente es oxidado a ácido deshidroascórbico (Figura 4.12),27,43,44 esta serie de reacciones es rápida, degradando la vitamina.44

El ácido deshidroascórbico es reciclado a ascorbato por medio de la enzima deshidroascorbato reductasa, con la participación del GSH en la reacción (Figura 4.13).27,44

Debido a esta serie de reacciones, el ascorbato ayuda a proteger contra las EROs, en medio acuoso in vivo, ya que, reacciona rápidamente con O2·, OH·, H2O2 y radicales peroxilo (ROO·)> remueve el 1O2, reduce los radicalestiol (RS") y se combina rápidamente con HCIO.27,39,43 También remueve muy


Figura 4.12. Reacciones de transformación de ácido ascórbico en presencia de RL.

Figura 4.13. Reacción de reciclado de ácido ascórbico en presencia de glutatión.

eficientemente ERNs previniendo la nitración de las moléculas44. En el interior de las células, el ascorbato actúa como donante de electrones, formando parte de la interacción entre el hierro y la ferritina; fuera de las células puede evitar la oxidación de la lipoproteína de baja densidad (LDL).45 En varios estudios con lípidos plasmáticos de humanos se ha mostrado que es un inhibidor de la lipoperoxidación más eficiente que otros componentes del plasma como tioles de las proteínas, urato, bilirrubina y a-tocoferol.39

El ascorbato juega un papel muy importante junto con la vitamina E en la protección de la membrana durante el EOx, regenerando el a-tocoferol (vitamina E) presente en la membrana, a partir de

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radicales α-tocoferilos que se forman en la inhibición de la peroxidación lipídica por vitamina E, rompiendo la cadena de lipoperoxidación.27,29,43,44

Recientemente también se ha descrito que el ascorbato tiene una reacción sinérgica antioxidante con los flavonoides, compuestos fenólicos que están presentes en mucho alimentos de la dieta humana46 (ver Capítulo 5).

Por otro lado, existen evidencias de que la vitamina C actúa como pro-oxidante in vivo, ya que, el ascorbato puede reducir el Fe3+ a Fe2+, lo mismo que al Cu2+, en presencia de H2Oz, estimulando la formación de OH• vía reacción de Fenton e iniciando la lipoperoxidación, aunque este efecto es dependiente de la concentración de ascorbato presente, considerándose la posibilidad de que megadosis de vitamina C suplementadas durante largo tiempo pueden causar oxidación en los sistemas vivos,27,29,43 pero su mayor efecto es antioxidante.

Se han desarrollado varios métodos para la cuantificación del ácido ascórbico en muestras biológicas, alimentos y productos farmacéuticos. Los sistemas de detección suelen basarse en una de las reacciones siguientes: oxidación del ascorbato a ácido deshidroascorbico, reducción del ácido deshidroascorbico a ascorbato o absorción ultravioleta (UV) del ascorbato o ácido deshidroascorbico; siendo el método de elección la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) por ser más preciso y exacto.44-45

- ÁCIDO ÚRICO Tradicionalmente se consideraba que el ácido úrico era un desecho metabólico y biológicamente inactivo, ya que, es el producto final del metabolismo de las purinas en los humanos, sin embargo, actualmente se sabe que, debido a su estructura cíclica insaturada con un par de electrones no compartidos, puede recibir hasta 6 electrones de radicales libres, por lo que, tiene una función antioxidante in vivo.27,47 Al recibir estos electrones, se produce una deslocalización del electrón impar sobre el anillo purinico dando origen a un radical de ácido úrico intermediario y menos reactivo que puede ser reducido por otra molécula antioxidante (Figura 4.14).47,48

El ácido úrico es un poderoso removedor de 1O2, OH•, ROO•, ozono (O3) y HCIO, el cual por un mecanismo no enzimático de oxidación se transforma a alantoína;27,47 remueve ERNs y quela iones metálicos.46 También protege a los eritrocitos de la lipoperoxidación y es el responsable de una acción antioxidante atrapadora del 15% respecto a otros componentes, atenuando la autoxidación lipídica de ácidos grasos insaturados y LDL-colesterol; además, hay evidencias de que tiene una cierta acción protectora de la oxidación del ADN celular.46,47

Figura 4.14. Conversión de urato a radical urilo.


Los electrones que recibe son en forma transitoria y después los cede al ácido ascórbico, reduciéndose nuevamente, por lo que, se plantea una acción sinérgica entre ambos antioxidantes.47,48

Los estudios iniciales de Ames y cols, indican que el ácido úrico puede reemplazar algunas de las funciones antioxidantes del ascorbato en humanos, preservando de esta manera a la vitamina.48

El ácido úrico puede ser degradado por la acción de iones metálicos como el cobre, acción que puede ser protegida por algunos flavonoides. El mecanismo de protección puede ser por la intercepción de especies reactivas, quelando los metales de transición y/o por la regeneración del urato de su forma radical, incrementando así la capacidad antioxidante del plasma. Este mecanismo puede ser idéntico a la habilidad del ascorbato para reciclar urato de su forma radical.46

Al igual que el ácido ascórbico, bajo ciertas circunstancias, y en bajas concentraciones, el radical de ácido úrico puede participar en reacciones de propagación de lipoperoxidación vía reacción de Fenton.47 Filipe y cols. (2001 )48 demostraron que el ácido úrico actúa como antioxidante in vitro a concentraciones superiores a 20 µ.M, pero es pro-oxidante a concentraciones entre 5-10 µ.M.

El efecto antioxidante del ácido úrico puede seguirse en el laboratorio por la aparición de alantoína en las muestras biológicas a 220 nm, este compuesto es un marcador biológico importante, ya que, sólo se forma y se acumula bajo condiciones de estrés oxidativo.27

- BlLIRRUBINA Es un pigmento biliar producido por el catabolismo del grupo hemo por medio de la vía hemo oxigenasa. La forma libre o no conjugada es insoluble en agua y soluble en compuestos no polares, por lo que, para ser transportada en el plasma necesita unirse a albúmina.

Desde los inicios de 1990 se ha descrito su papel fisiológico como un potente antioxidante, considerándose que la forma unida a albúmina es antioxidante en los fluidos extracelulares humanos, su actividad antioxidante es predominantemente debida a su habilidad para remover especies reactivas como el O2-• y radicales ROO, además de que in vitro previene eficientemente la oxidación de los lípidos de las membranas.49,50 La forma no conjugada rompe las cadenas de lipoperóxidos y remueve el H2O2, ONOO- y ROO• in vitro, e in vivo remueve sustancias reactivas de oxígeno.49

Se han propuesto varios mecanismos por los cuales la bilirrubina actúa como antioxidante: por su estructura, su vía de producción a través de la hemo oxigenasa y por su acción sinérgica con la vitamina E.

Con respecto a su estructura se ha reportado que la bilirrubina, especialmente a bajas concentraciones, reacciona con los radicales ROO' de las cadenas de lipoperóxidos donando un átomo de hidrógeno de su anillo tetrapirrólico, tanto en su forma libre como en la unida a albúmina.51

El papel protector contra EOx de la hemo oxigenasa y la bilirrubina ha sido demostrado en numerosos estudios in vitro e in vivo, debido a que la liberación del hierro de las fuentes endógenas del hemo produce un incremento de ferritina y de la capacidad celular para secuestrar al metal, aumentando la resistencia al EOx. También se ha observado que la producción de EROs rápidamente disminuye el glutatión reducido (GSH) e induce la actividad de hemo oxigenasa, esta

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inducción ocurre una vez que las sustancias reactivas de oxígeno se han incrementado y el sistema de defensa antioxidantes (GSH, SOD, CAT y GPx) ha disminuido.49

Con respecto a su papel sinérgico con la vitamina E, se ha descrito que tanto la forma libre de la bilirrubina como la unida a albúmina, pueden asociarse a la LDL, protegiendo eficientemente a los lípidos de la peroxidación por un mecanismo de interacción entre éstas y el radical tocoferilo, muy semejante al del ascorbato, convirtiéndose en la tercera línea de defensa antioxidante; es más, bajo condiciones en donde la bilirrubina se incrementa y el ascorbato disminuye, la importancia relativa del pigmento como antioxidante fisiológico se incrementa.52

Al igual que otros antioxidantes, también se ha reportado que tiene un efecto pro-oxidante, sobretodo en presencia de cobre (Cu2+), ya que, tiene la capacidad de generar radicales libres especialmente OH', provocando la degradación de ADN. El modelo propuesto para tal acción involucra la formación de un complejo entre dos moléculas de bilirrubina y de dos iones Cu2+ en los nitrógenos de los anillos pirrólicos terminales, que provocan oxidación del ADN.50

4.4.2. Lipofílicos

- VITAMINA E (Α-TOCOFEROL) El término genérico Vitamina E agrupa al menos ocho diferentes compuestos, tocoferoles y tocotrienoles, siendo cuatro los más abundantes: α, β γ y δ -tocoferoles, clasificados según el número y posición de los grupos metilo en el anillo cromanol.

El más importante para los humanos es el α -tocoferol. Ninguno de los compuestos es sintetizado por los animales. Una de sus principales funciones bioquímicas es su reactividad antioxidante, la cual está asociada con las propiedades redox del anillo de su estructura (Figura 4.15).39,44,53

Debido a la característica de ser una molécula lipofílica, actúa en las membranas celulares y en las partículas de lipoproteínas, especialmente la LDL; inhibe la lipoperoxidación al remover radicales peroxilo lipidicos (LOO·) formando hidroperóxidos lipidíeos y un radical a-tocoferilo, el cual es menos reactivo con los ácidos grasos poli-ínsaturados vecinos, rompiendo así la propagación. También atrapa al 1O2 y reacciona con ONOO-. Por ello, comparado con otros antioxidantes lipofílicos, el β-tocoferol es probablemente el más eficiente de los antioxidantes en la fase lípídica.27,39,43

Figura 4.15. Conversión de «-tocoferol en el radical a-tocoferilo.


Como se describió anteriormente, se ha reportado una reacción sinérgica entre el ácido ascórbico y el α-tocoferol, ya que, la vitamina C reduce los radicales α-tocoferilos restaurando la actividad removedora del α-tocoferol, reacción que se lleva a cabo en la superficie de las membranas y las lipoproteínas, convirtiéndose el ácido ascórbico en el radical ascorbilo, mucho menos reactivo (Figura 4.16).27,39

Figura 4.16. Reacción sinérgica entre α -tocoferol y ácido ascórbico.

La medición de los niveles de vitamina E en líquidos biológicos se puede llevar a cabo, simultáneamente con el retinol y otros carotenoides, por HPLC utilizando un detector de absorción ultravioleta-visible, permitiendo un análisis rápido y fácil.53,54

- VITAMINA A Y CAROTENOIDES La vitamina A o retinol, químicamente es un alcohol con una estructura primaria base para una serie de compuestos llamados carotenoides. El retinol puede ser reversiblemente convertido a retinal en varios tejidos y posteriormente, por una reacción irreversible, a ácido retinoico, ambos compuestos considerados como las formas activas de la vitamina (Figura 4.17).55,56

En general, los carotenoides son compuestos naturales coloridos (pigmentos), no sintetizados por los animales, con propiedades lipofílicas. Se han descrito más de 600 compuestos diferentes, siendo cerca de 50 con actividad de pro-vitamina A.44,55 Los principales carotenoides del plasma humano son α y β-carotenos, licopeno, criptoxantina y luteína, pero el β-caroteno es el que tiene mayor actividad antioxidante, ya que, produce dos moléculas de retinol al romperse.29

Figura 4.17. Estructura del retinol, forma alcohol-libre de la vitamina A.

CAPITULO 4 77 La vitamina A funciona como antioxidante rompiendo cadenas por una combinación con ROO·, antes que estos radicales puedan propagar la peroxidación en la fase lipídica de la célula, generando hidroperóxidos.27,55 Utilizando un sistema de peroxidación in vitro, la actividad antioxidante de los retinoides es: retinol > retinal » palmitato de retinil > ácido retinóico.57

Al igual que la vitamina A, la mayoría de los carotenoides tienen múltiples actividades antioxidantes, incluyendo la habilidad para remover al 1O2 y ROO-, muy probablemente debido a su estructura que contiene un sistema extendido de dobles enlaces conjugados.39,43,44,54 Los mecanismos mejor descritos son los relacionados con el 1O2, que es una forma de oxígeno muy inestable por encontrarse en estado excitado, proponiéndose dos formas de acción:43,55

• Física: que implica la transferencia de energía de las especies excitadas de oxígeno al carotenoide, produciendo un carotenoide con un triplete excitado. La energía del carotenoíde excitado es disipada a través de interacciones vibracionales con el solvente para recuperar el estado basal y generando calor. Con este mecanismo, el carotenoide permanece intacto, pudiendo sufrir varios ciclos de desactivación. Es el mecanismo más importante.

• Química: Se sugiere que hay una reacción con los ROO" formando un radical caroteno intermediarioque posteriormente es destruido. Este mecanismo contribuye a la extinción de 1O2 en menos del 0.05%.

La habilidad química de los carotenoides para remover radicales ROO· aún siguen en discusión, sin embargo, se plantea la posibilidad de que los carotenoides se combinen con ROO· para formar grandes radicales de resonancia estabilizados, por un mecanismo de auto-oxidación.55

Los métodos tradicionales para medir carotenoides en muestras biológicas no permiten la separación de los diferentes carotenoides de otros compuestos como la bilirrubina, y en los alimentos se involucra la cuantificación de estos compuestos como potenciales precursores de vitamina A, por lo que, los resultados son reportados como equivalentes de unidades de retinol. Por lo anterior, el método de elección es el HPLC.44

- MELATONINA Es una hormona producida por la glándula pineal, en la obscuridad de la noche, cuya función principal es la inducción del sueño, el control de la función reproductiva y los ritmos circadianos, por lo que, es considerada "el reloj biológico", aunque también se ha descrito que tiene una actividad antioxidante importante.58-61 Químicamente es una indolamina derivada del triptofano, cuya producción en el humano disminuye con la edad.58-60 Se ha sugerido que su estructura de indol le confiere propiedades antioxidantes, siendo el metabolito N-acetil-5-metoxitriptamina el metabolito más activo.59

La melatonina parece funcionar como intermediario entre el individuo y el ambiente a nivel neuroendocrino controlando la hipersecreción de glucocorticoides provocada por una inflamación o estrés; a su vez, proporciona a la célula NADPH2 para regenerar GSSG a partir de GSH por inducción de glutatión reductasa (GR) y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) del ciclo de las pentosas, reduciendo la habilidad de la conversión de H2O2 a OH·.59 Pero existe controversia en


cuanto a su capacidad de remover EROs. Por un lado, Reiter y cols. (1996) indican que la melatonina previene la lipoperoxidación de las membranas atrapando OH" convirtiéndose en el radical catión indolil (Figura 4.18), que es menos tóxico, que a su vez puede remover con O2-· produciendo un compuesto mucho menos reactivo (N1-acetil-N2-formil-5-metoxicinuramina) que es excretado en orina,61 y Mahal y cols. (1999)62 confirman esta observación in vitro, agregando que la molécula puede ser regenerada por iones ascorbato y urato, además de que, al encontrarse en la membrana, citosol y el núcleo celular, no sólo remueve EROs, sino que también actúa como un agente reparador.

Figura 4.18. Estructura del radical indolil de melatonina.

Por otro lado, recientemente Antunes y cols. (1999)63 han descrito que la melatonina no puede funcionar como un atrapador de los ROO· generados durante la lipoperoxidación, ya que, en su estructura no contiene un átomo de hidrógeno abstraible como el α-tocoferol, pero sí actúa como una molécula que retarda los sistemas de auto-oxidación de iones metálicos libres; además, su acción antioxidante se lleva a cabo en concentraciones mucho más altas que las encontradas en el plasma y tejidos humanos, por lo que, in vivo es muy probable que su función antioxidante sea muy débil.

La cantidad de melatonina es medida a través de sus metabolitos urinarios como la 6-sulfatoximelatonina (6-SMT) por el ensayo inmunoenzimático (ELISA).61

- ESTRÓGENOS Muchos compuestos de gran variedad estructural pueden tener actividad estrogénica. Las sustancias estrogénicas pueden contener un sistema de anillos esteroideos, como las hormonas ováricas 17- β estradiol (E2) y estrona (E,), o ser compuestos fenólicos no esteroideos como los estrógenos sintéticos y las isoflavonas (fitoestrógenos) (Figura 4.19).64

Figura 4.19. Estructuras de un estrógeno natural y un fitoestrógeno.

CAPÍTULO 4 79

La actividad antioxidante de los estrógenos y sus metabolitos ha sido demostrada tanto in vivo como in vitro, por medio de la inhibición de la oxidación del colesterol o la peroxidación de ácidos grasos poli-insatura dos o LDL. Este efecto antioxidante está asociado con el grupo OH de la estructura fenol del estrogeno, resultando un radical fenoxi intermediario, el cual puede ser reducido nuevamente a fenol por otros antioxidantes celulares; además, los estrógenos tienen la capacidad de regenerar el tocoferilo a tocoferol más eficientemente que el ascorbato.64,65 Dentro de su actividad antioxidante, el estradiol también promueve la vasodilatación, mostrando ser un cardioprotector.66

En presencia de iones metálicos con actividad redox, los estrógenos pueden actuar también como pro-oxidantes ya que, son convertidos a catecol por acción del sistema citocromo P450. Los estrógenos 4-hidroxilados son oxidados por enzimas microsomales a semiquinonas (SQ) y quinonas (Q), los cuales, a su vez, pueden ser reducidos por citocromo P450 reductasa-dependiente de NADPH. Este ciclo metabólico redox puede generar O2

_ que reduce el Fe3+ a Fe2+ y por medio de la reacción de Fenton produce OH* (Figura 4.20) y es dependiente de la concentración de iones metálicos en el medio.65

Figura 4.20. Mecanismo de acción pro-oxidante de los estrógenos. Teniendo como fundamento esta reacción pro-oxidante, la medición de la acción de los estrógenos se lleva a cabo a través de la formación o inhibición de la 80HdG del ADN al generarse OH· durante el ciclo metabólico redox de los estrógenos.65

4.5. ANTIOXIDANTES TERCIARIOS

Si los otros dos sistemas antioxidantes no han sido eficientes y las biomoléculas son oxidadas, todas las células tienen una serie de enzimas que conforman los llamados sistemas de reparación. Los sistemas de reparación incluyen enzimas encargadas de restaurar directamente las biomoléculas a su conformación nativa, así como, enzimas catabólicas que pueden específicamente degradar las moléculas no funcionales, esta degradación puede servir no sólo para removerlas del citosol, sino para aumentar la cantidad de precursores para resíntesis.67


4.5.1. Reparación de lípidos

Como un mecanismo de defensa antioxidante celular, la reparación de lípidos comienza en la membrana. Las membranas peroxidadas se vuelven rígidas, pierden la permeabilidad selectiva y, bajo condiciones extremas, pueden perder su integridad.67 Se han descrito tres grupos de enzimas reparadoras de lípidos como las principales:27,66

Fosfolipasas: Cortan los segmentos oxidados de la membrana para que otras enzimas puedan reparar los segmentos dañados.

GPx y glutatión transferasas (GT): Reducen los peróxidos de ácidos grasos liberados a alcoholes, sin eliminar grandes segmentos de las membranas.

Acetiltransferasas: Reemplazan los ácidos grasos dañados de los lípidos.

Estos grupos enzimáticos actúan en forma de cascada, uno detrás del otro (Figura 4.21).

En la figura 4.21 se puede observar como los ácidos grasos potiinsaturados de la membrana celular son oxidados a lipoperóxidos por acción de los radicales libres (a), al ser oxidados se convierten en buenos sustratos para enzimas fosfolipasas, de las cuales la fosfolipasa Az, en presencia de iones

...

PLase A: = fosfolipasa A:; GSH-Px = glutatión peroxidasa; GSH = alcohol de ácido graso. FA-CoA = fatit-acii-coenzíma A. Fuente: Halliwell B, Gutteridge JMC. 19S5

glutatión reducido; FAOH

Figura 4.21. Interacción entre las enzimas reparadoras de lípidos en la membrana celular.

CAPÍTULO 4 81

calcio, genera un ácido graso peroxidado y un lisofosfolípido (b); el ácido graso peroxidado liberado al citosol es sustrato para la GPx, que lo reduce a un alcohol de ácido graso (c); finalmente, el lisofosfolípido puede servir de sustrato por reacciones de reacilación con fatil-acil-CoA, restableciendo la membrana (d).27,68

4.5.2. Reparación de proteínas

Las proteínas que han sido oxidativamente modificadas pueden desnaturalizarse, convirtiéndose en hidrofóbicas o llevar a cabo reacciones de entrecruzamíento con la formación de agregados insolubles como los cuerpos de inclusión o la lipofuccina. Las proteínas desnaturalizadas son excelentes sustratos para la degradación por sistemas proteolíticos,15 de ahí que actúen tres tipos de grupos enzimáticos:68

• Proteinasas: Escinden proteínas oxidadas. • Proteasas: Cortan los productos de la actividad de las proteinasas. • Peptidasas: Rompen los productos de la actividad de las proteasas, liberando aminoácidos

que pueden reciclarse para la síntesis de nuevas proteínas.

Pacifici y cois, en 1989, sugirieron que la actividad proteolítica contra las proteínas oxidadas es llevada a cabo por un gran complejo proteolítíco de 670 kDa llamado macroxiproteinasa (MOP), cuya función es la degradación selectiva de proteínas aberrantes previniendo su acumulación y agregación. Posterior a la acción de la MOP, se activan las proteasas y peptidasas, proveyendo así de aminoácidos para la síntesis de novo de nuevas proteínas.15

4.5.3. Reparación del ADN

Como se mencionó anteriormente, los tipos de daño al ADN pueden agruparse en: rompimiento de hebra (sencillo o doble), intercambio de cromátidas hermanas, entrecruzamíento ADN-ADN y ADN-proteína, y modificación de bases. Las cuatro bases del ADN pueden ser oxidadas, pero las pirimidinas parecen serlas más susceptibles,65 de ahí que se encuentren tres grupos de reparación:68

• Exo y endonucleasas: Eliminan los segmentos alterados del ADN. • Glicosilasa y polimerasas: Rellenan los huecos que dejan las exo y endonucleasas. • Ligasas: Sueldan los extremos de la hebra una vez corregidos los desperfectos.

Estos grupos actúan en combinación conformando la vía de reparación de escisión de bases (BER, base excisión repait). Primero, las N-ADN glicosilasas rompen el enlace N-glicosílico entre la base dañada y la desoxirribosa, dejando un sitio abásico (AP), apurínico/apirimidímico, que no son informativos y por lo tanto, deben ser eliminados, asi que el esqueleto del ADN próximo al sitio abásico es escindido por una AP-endonucleasa o unido por una AP-liasa.6S

Se han aislado varias exo y endonucleasas bacterianas, de las cuales la endonucleasa III rompe en el lado 3' de los sitios AP, además de poseer una actividad N-glicosilasa para glicol-timina y residuos de urea; y la exonucleasa III tiene una actividad nucleolítica de 3' a 5' que es responsable de la remoción de los fragmentos de azúcar generados durante la ruptura oxidativa de la hebra. En los


mamíferos se ha aislado también una endonucleasa con una actividad semejante a la endonucleasa III bacteriana. Se utiliza el término de redoxiendonucleasas para las nucleasas que participan en la reparación del daño oxidativo del ADN.15

También el ADN puede sufrir desmetilaciones oxidativas, por lo que, las ADN metilasas juegan un papel importante en la restauración de los patrones de metilación y mantienen el fenómeno epigenético.15

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