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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria

68 Editorial Científica Universitaria – Secretaría de Ciencia y Tecnología

Universidad Nacional de Catamarca ISBN: 978-987-661-125-1

3.1.- Introducción

Se cree que los antioxidantes son esencialmente importantes por la capacidad que tienen

de proteger a las macromoléculas biológicas contra el daño oxidativo. Entre los más

conocidos figuran los tocoferoles, el ácido ascórbico, los flavonoides, antocioaninas,

carotenoides y ácidos fenólicos [1]

.

Uno de los procedimientos más aplicados por la comunidad científica para evaluar la

actividad antioxidante, es el método del DPPH. Este es un método espectrofotométrico

en el que se utiliza el radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo, que tiene un

fuerte color violeta y una intensa banda de absorción a 515 nm. Cuando una solución de

DPPH se mezcla con una sustancia que puede donar átomos de hidrógeno, capaz de

estabilizarlo, el color violeta intenso decae a un color residual amarillo pálido del grupo

picril aún presente, con la consecuente disminución de la absorbancia [2]

.

Estudios recientes vinculados a la capacidad antirradicalaria de extractos simples de

hoja y madera de olivo señalan a los extractos de madera con acetato de etilo y etanol,

en ese orden, como los responsables de la mejor capacidad de captura del RL DPPH. En

tanto, para la hoja, el etanol fue el solvente que generó el extracto de mayor actividad

antioxidante [3].

La presente investigación pretende evaluar la actividad antirradicalaria de extractos de

hoja y madera de olivo de la variedad Arbequina, procedente del Valle Central de

Catamarca, a través del método basado en la determinación del porcentaje de inhibición

de radicales libres, usando como radical modelo el compuesto 2,2-difenil-1-picril-

hidracilo (DPPH).

3.2.- Objetivos del presente capítulo

Determinar la capacidad de captura de radicales libres de los extractos de hojas y

madera derivados de la poda de olivos de la variedad Arbequina, aplicando el

método del DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo).

Comparar la capacidad de captura de radicales libres de los extractos obtenidos

según el material vegetal, el solvente empleado y la concentración de los

extractos entre sí y con otros antioxidantes.




3.3.- Materiales y métodos

3.3.1.- Preparación de las muestras

Método modificado de reducción del radical 2,2-difenil-1-picrihidracilo (DPPH), según

Brand-Willians W. et al (1995) [4].

Reactivos:

2,2-difenil-1-picrihidracilo (DPPH)

Metanol absoluto

Agua bidestilada

Solución de etanol acuoso al 50%

Acetato de etilo

Extractos hoja- etanol 50% (EHE)

Extractos hoja- acetato de etilo (EHAc)

Extractos madera- etanol 50% (EME)

Extracto madera- acetato de etilo (EMAc)

I. Preparación de solución stock de DPPH

Se pesan con precisión de 0,1 mg una masa de 0,05 g de DPPH en vaso de precipitado

previamente tarado. Se disuelve en metanol grado analítico, se trasvasa a matraz aforado

de 25 ml y se enrasa para conseguir una solución de 5,07 x 10-3

M. La solución se

almacena en recipiente ámbar, recubierto en papel aluminio a 0 ºC [5]

.

II. Preparación de solución estándar de DPPH

A partir de la solución stock de DPPH se prepara una solución de 7,4 x 10-5

M [3]

en

metanol grado analítico. La solución se coloca en recipiente ámbar, recubierto en papel

aluminio a 0 ºC. La solución estándar de DPPH debe ser preparada en momentos

previos de su utilización y no ser sometida a un almacenamiento superior a las seis

horas, debido a que se produce una disminución en la absorbancia de la disolución,

hecho que esta relacionado con la reducción de las moléculas de radical libre [5]

.

III. Preparación de las disoluciones de extracto fenólico

Se preparan, por quintuplicado, soluciones de 100, 300 y 600 ppm en extracto a partir

de los extractos de hoja y madera por separado.

Se obtienen las soluciones de 600 ppm en extracto, diluyendo y enrasando con etanol

acuoso al 50%. Para la preparación de las soluciones de 300 y 100 ppm en extracto se

diluye la solución de 600 ppm enrasando con etanol acuoso al 50%.

Para obtener las soluciones con acetato de etilo absoluto se sigue la misma metodología

enrasando con este solvente (Anexo 4; Fotos A.4.33 a A.4.36).




3.3.2.- Determinación de la capacidad antirradicalaria

Para cada extracto de hoja y madera de olivo se sigue la metodología que se detalla a

continuación, siendo la misma una modificación del procedimiento descripto por von

Gadow et al., (1997) [6]

.

Se coloca en celda de vidrio la disolución estándar de DPPH y se mide inmediatamente

su absorbancia en espectrofotómetro a una longitud de onda de 515 nm. Respetando una

relación extracto: DPPH 1,6:1, se miden 0,187 ml de la disolución de extracto

concentrado (soluciones de extracto a 100, 300 o 600 ppm según corresponda), se

coloca en vaso de precipitado de 50 ml y se adicionan sobre el mismo 4 ml de

disolución estándar de DPPH. Se homogeniza la mezcla y se coloca rápidamente en

celda de vidrio. Finalmente se sigue la cinética de reacción de la mezcla durante 30

minutos leyendo las absorbancias en un espectrofotómetro a 515 nm (Anexo 4; Fotos

A.4.37 a A.4.42).

Se calcula el porcentaje de inhibición de radicales libres (PI) de cada uno de lo extractos

según la siguiente expresión:

Cálculo: PI = [(At = 0 min - At =15 min) / At = 0 min] x 100

Donde: PI: Porcentaje de inhibición.

At = 0 min: Absorbacia inicial del DPPH.

At =15min: Absorbacia a los 15 minutos de producida la mezcla de extracto:DPPH.

3.4.- Resultados y discusión

3.4.1.- Comportamiento de los extractos de hojas

En la tabla 3.1 se exponen los resultados de los máximos, mínimos, medianas,

promedios, desviaciones estándar y los coeficientes de variación de cinco repeticiones

de los PI de radicales libres DPPH, de los dos extractos de hojas de olivo evaluados.

Medidas

descriptivas

Concentración en extracto (ppm)

100 300 600

Extractos

HE HAc HE HAc HE HAc

Máximo 92,34 51,84 94,19 95,03 93,42 95,12

Mínimo 88,90 44,99 91,48 92,64 92,02 91,63

Mediana 91,55 50,27 92,61 94,16 92,54 91,86

Media 91,21 49,00 92,70 93,96 92,68 92,82

DE 1,36 2,73 0,93 0,87 0,53 1,56

CV % 1,49 5,57 1,00 0,93 0,57 1,68

Tabla 3.1. Medidas descriptivas de los PI de extractos etanólicos y con acetato de etilo de hojas de

olivo para 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH = 1,6:1; 15 min.).




Cinco de las seis soluciones de extractos de hoja de olivo de la variedad Arbequina

analizadas (HE 100, 300 y 600 ppm y HAc 600 y 300 ppm), presentan un efecto

inhibitorio del RL DPPH superior al 90% (Tabla 3.1) y en consecuencia predicen una

elevada capacidad antioxidante. Comparados éstos con la capacidad de captura de

radicales libres DPPH de soluciones de 500 ppm de BHA que registra un PI medio de

83,6 % y de BHT que sólo alcanza a inhibir el 50,3% de los radicales libres a los quince

minutos de iniciado el ensayo [7]

, se pone en evidencia la alta capacidad de capturar RL

DPPH de los extractos de hoja en ambos solventes. El extracto con menor rendimiento

es HAc 100 ppm que a los quince minutos de iniciado el ensayo alcanza a inhibir el

50,27% de los radicales libres. Sin embargo, presenta mayor poder de inhibición que el

BHT a 250 ppm [7]

, que manifiesta un PI de 28,6%. Por su parte, el extracto con la

mejor respuesta es HAc 300 ppm con un PI equivalente a 94,16%, seguido por los

extractos HE a la misma concentración, HE 600 ppm, HAc 600 ppm y HE 100 ppm.

Al comparar estadísticamente, mediante la prueba de Kruskal Wallis, las medianas de

los extractos con PI superiores al 90%, se revela que el extracto HE 100 ppm muestra

un PI de RL DPPH significativamente menor que el extracto HAc 300 ppm (p<0,0278)

(Tabla 3.2). Mientras que, entre el resto de los extractos, el análisis no acusa la

influencia del solvente ni las concentraciones ensayadas sobre el comportamiento

antirradicalario de los extractos de hoja de olivo (Anexo 3; Tabla A.3.13).

Evidentemente, a elevadas concentraciones en extracto, los compuestos obtenidos a

partir de los extractos etanólicos y con acetato de etilo de hojas de olivo, presentan

mayor actividad en la matriz metanólica de radicales libres DPPH y por tanto exhiben

mayor capacidad antioxidante.

Tabla 3.2. Medianas de los PI de extractos etanólicos de hojas de olivo a 100, 300 y 600 ppm y

extractos con acetato de etilo de hojas de olivo a 300 y 600 ppm.

En el gráfico 3.1 se presentan los resultados de la mediana de cinco repeticiones de la

capacidad antioxidante, expresada como el PI calculado a los quince minutos de

producirse la mezcla extracto: DPPH, en una proporción 1,6:1, de los dos extractos de

Extractos Medianas*

HE 100 ppm 91, 55 A

HE 300 ppm 92,61 AB

HE 600 ppm 92,54 AB

HAc 300 ppm 94,16 B

HAc 600 ppm 91,86 AB

* Letras distintas indican diferencias significativas al 5%




hojas de olivo a las tres concentraciones evaluadas (100, 300 y 600 ppm). En tanto que,

en el gráfico 3.2 se exponen los valores, pero en relación a los solventes empleados.

91,55%

92,61%

92,54%

50,27%

94,16%

91,86%

100

300

600C

on

cen

tració

n/

pp

m

PI

HAc

HE

Gráfico 3.1. Actividad antioxidante de los extractos de hojas de olivo expresada en términos de

medianas de PI a 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH= 1,6:1; 15 min.).

A 600 y 100 ppm son los extractos etanólicos los que muestran mayor capacidad de

capturar RL de DPPH. A 600 ppm el extracto HE presenta una actividad 0,73% superior

a HAc, mientras que a 100 ppm los extractos etanólicos superan a los extractos de

acetato de etilo en un 45,09%, comportamiento que puede explicarse, si se tiene en

cuenta que estos extractos presentan una proporción superior al 60% en ODF;

estructuras químicas relacionadas, según diferentes fuentes, con la bioactividad de los

compuestos fenólicos [10]. Esto coincide con lo reportado por Pérez Bonilla et al (2003)

[3], quienes concluyen que para las hojas de olivo, el etanol fue el solvente que generó el

extracto de mejor actividad antioxidante. A pesar de esto, a 300 ppm es el extracto con

acetato de etilo el que tiene el mejor PI, con una actividad antirradicalaria de un 1,65%

superior a la del EHE, destacándose por sobre los demás extractos, aunque la diferencia

con el extracto etanólico a igual concentración es despreciable (Tabla 3.2). Puede

notarse, de acuerdo a los porcentajes presentados, que al disminuir las concentraciones

en extracto las diferencias en la capacidad de capturar radicales libres por parte de los

extractos en los distintos solventes se va haciendo más evidente.

Se esperaría observar una actividad antioxidante relativa a las concentraciones de

ensayo, sin embargo, probablemente por causa de la abundante concentración fenólica

de los extractos no puede distinguirse tal comportamiento [8; 9]

. Las disoluciones

etanólicas de 600, 300 y 100 ppm en extracto poseen una cantidad tan elevada de

fenoles que aún a 100 ppm, la capacidad inhibitoria del extracto es próxima a la de las




concentraciones superiores. Mientras tanto, los extractos con acetato de etilo que

presentan una concentración de fenoles importante, pero significativamente inferior a la

de los etanólicos, ponen en evidencia recién a 100 ppm la incidencia de la disminución

de la concentración de los extractos sobre la capacidad inhibitoria de radicales libres

DPPH, ya que el PI disminuye respecto al PI del extracto a 600 ppm, en 1,87 veces.

En el gráfico 3.2, se observa claramente que los extractos etanólicos de hojas de olivo, a

las tres concentraciones evaluadas, manifiestan una respuesta prácticamente idéntica

frente al sistema de prueba radicalaria DPPH, registrándose PI próximos entre sí. Este

hecho confirma, además de lo argumentado anteriormente en cuanto a la concentración

de fenoles y a la influencia de mayor proporción de ortodifenoles de los extractos

etanólicos sobre la actividad antirradicalaria, un comportamiento ligado a la naturaleza

de los CF extraídos. Por su parte, los extractos con acetato de etilo, que presentan menor

contenido en fenoles que los extractos etanólico, exhiben un comportamiento

diferenciado. A 300 y 600 ppm los PI son próximos entre sí y a su vez el extracto HAc

300 ppm resulta ser el mejor de los extractos de hojas evaluados. Mientras que, a 100

ppm se observa una actividad antioxidante notablemente inferior a la de los extractos

más concentrados de acetato de etilo y a los extractos etanólicos (Gráfico 3.1). Es decir,

que en los extractos de acetato de etilo se encuentra el más activo y el menos eficaz de

todos los extractos foliares ensayados, dependiendo de la concentración en extracto

empleada.

91,55%

50,27%

92,61%

94,16%

92,54%

91,86%

HE

HAc

Extr

acto

s

PI

600 ppm

300 ppm

100 ppm

Gráfico 3.2. Actividad antioxidante de los extractos de hojas de olivo en función de los solventes de

extracción, expresada en términos de medianas de PI a 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH= 1,6:1;

15 min.).




Para ambos solventes, los mayores PI se registran a 300 ppm, lo que permite suponer

que para la relación estequiométrica extracto:DPPH utilizada esta concentración resulta

ser la más apropiada y permite que los antioxidantes presentes en los extractos

manifiestan de mejor forma su poder inhibitorio. A pesar de ello no se encuentran

diferencias con los extractos de 600 ppm.

Por lo expuesto, se puede señalar que las concentraciones en extracto aplicadas tienen

incidencia en la evaluación de la capacidad antioxidante, pero no sería este factor el

responsable absoluto de la actividad inhibitoria de los extractos. Los resultados

obtenidos evidencian además que la naturaleza química de tales extractos tiene una

marcada influencia en la actividad antiradicalaria, si se considera que los solventes

empleados, de polaridades distintas, extraen de acuerdo al fenómeno de partición,

compuestos activos con diferentes capacidades de inhibir la actividad radicalaria.

En los gráficos 3.3 y 3.4 se presentan la disminución de las medianas de la absorbancia

a través del tiempo de las mezclas de DPPH con los extractos en etanol: agua y en

acetato de etilo a 100, 300 y 600 ppm. Mientras que, en las tablas 3.3 y 3.4 se detallan

las lecturas de las mediciones de absorbancia (A) efectuadas cada 36 segundos durante

los treinta minutos que dura el ensayo y los valores de PI correspondientes a dichas A.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

0 500 1000 1500 2000

Tiempo/s

Ab

so

rban

cia

515 n

m

HE 600 ppm

HE 300 ppm

HE 100 ppm

Gráfico 3.3. Medianas de las absorbancias, en función del tiempo, de las mezclas extracto:DPPH =

1,6:1 de las soluciones de 100, 300 y 600 ppm en extracto de hojas de olivo con etanol al 50%.

En el gráfico 3.3 puede notarse el comportamiento instantáneo del extracto etanólico de

600 ppm, que a los 5 segundos de iniciada la reacción pasa de tener una absorbancia de

0,727 a 0,080, inhibiendo casi un 90% (89,15%) del DPPH. Si bien la capacidad




antioxidante de los extractos de 300 y 100 ppm, evaluada para el mismo tiempo, es

inferior a la del extracto de 600 ppm, éstos son excelentes inhibidores de RL DPPH.

Tabla 3.3. Absorbancia y PI de los tres extractos etanólicos de hojas de olivo a lo largo de 30’.

Tiempo (segundos) Mediana A Mediana PI

600 ppm 300 ppm 100 ppm 600 ppm 300 ppm 100 ppm

0 0,727 0,731 0,739 0,00 0,00 0,00 5 0,080 0,233 0,383 89,15 68,13 48,89

41 0,059 0,102 0,297 91,99 86,05 60,77

77 0,057 0,067 0,238 92,27 90,83 68,16

113 0,056 0,063 0,196 92,40 91,38 73,48 149 0,055 0,060 0,168 92,54 91,76 77,27

185 0,056 0,058 0,148 92,54 92,03 79,97 221 0,055 0,056 0,132 92,54 92,31 82,14

257 0,055 0,056 0,120 92,54 92,31 83,57

293 0,055 0,055 0,111 92,54 92,45 84,82 329 0,055 0,055 0,103 92,56 92,48 85,93

365 0,055 0,055 0,097 92,56 92,48 86,78 401 0,055 0,054 0,091 92,56 92,58 87,60

437 0,055 0,054 0,086 92,56 92,58 88,28 473 0,055 0,054 0,082 92,56 92,58 88,83

509 0,055 0,054 0,078 92,56 92,61 89,37

545 0,055 0,054 0,075 92,56 92,61 89,78 581 0,055 0,054 0,073 92,56 92,61 90,12

617 0,055 0,054 0,072 92,54 92,61 90,26 653 0,055 0,055 0,071 92,54 92,48 90,60

689 0,055 0,054 0,069 92,54 92,61 90,87

725 0,055 0,054 0,066 92,54 92,61 91,01 761 0,055 0,054 0,065 92,56 92,61 91,14

797 0,056 0,054 0,064 92,56 92,61 91,28 833 0,055 0,054 0,063 92,54 92,61 91,42

869 0,056 0,054 0,063 92,42 92,61 91,42 905 0,055 0,054 0,062 92,54 92,61 91,55

941 0,056 0,054 0,061 92,42 92,61 91,69

977 0,056 0,054 0,061 92,42 92,61 91,69 1013 0,056 0,054 0,060 92,42 92,61 91,83

1049 0,056 0,054 0,060 92,42 92,61 91,83 1085 0,056 0,054 0,060 92,42 92,58 91,83

1121 0,056 0,055 0,060 92,42 92,48 91,83

1157 0,056 0,054 0,059 92,42 92,61 91,96 1193 0,056 0,054 0,059 92,42 92,61 91,96

1229 0,056 0,054 0,059 92,42 92,61 91,96 1265 0,056 0,054 0,059 92,42 92,61 91,96

1301 0,056 0,055 0,059 92,42 92,48 91,96 1337 0,057 0,054 0,058 92,42 92,61 92,10

1373 0,057 0,056 0,058 92,42 92,34 92,10

1409 0,057 0,053 0,058 92,42 92,72 92,10 1445 0,056 0,054 0,058 92,40 92,61 92,10

1481 0,056 0,054 0,058 92,42 92,61 92,10 1517 0,056 0,054 0,058 92,42 92,61 92,10

1553 0,056 0,054 0,058 92,40 92,61 92,10

1589 0,056 0,055 0,058 92,42 92,48 92,10 1625 0,056 0,055 0,058 92,42 92,48 92,10

1661 0,056 0,055 0,058 92,42 92,48 92,10 1697 0,056 0,054 0,057 92,42 92,61 92,23

1733 0,056 0,054 0,057 92,42 92,61 92,23 1769 0,056 0,054 0,057 92,42 92,61 92,23

1805 0,056 0,054 0,057 92,42 92,61 92,23




Los extractos HE 300 ppm, alcanzan un poder inhibitorio del DPPH próximo al 90%

(90,83%) a los 77 segundos (1,28 min) de iniciada la reacción extracto:DPPH, con una

absorbancia de 0,057, mientras que los extractos HE de 100 ppm consiguen un PI

similar (90,87%) a los 689 segundos (11,48 minutos), consiguiendo una absorbancia de

0,069. A los 1373 segundos (22,88 minutos) las tres curvas se ven prácticamente

solapadas y los extractos etanólicos inhiben al radical libre DPPH en un 92,42%,

92,34% y 92,10% respectivamente. El PI máximo de los extractos HE de 100 ppm se

alcanza a los 1697 segundos (28,28 minutos) con un valor equivalente a 92,23% y una

absorbancia de 0,057, valores que se mantienen constantes hasta la última medición

efectuada a los treinta minutos.

Por su parte, las pendientes de las curvas presentadas en el gráfico 3.4 muestran que los

extractos HAc de 300 y 600 ppm presentan una cinética de reacción semejante entre sí,

a diferencia de la solución de 100 ppm que exhibe una velocidad de reacción

sensiblemente más lenta.

Los extractos de 600 ppm presentan la mejor capacidad de captura del RL DPPH, al

principio de la reacción. A los 77 segundos la mezcla pasa de tener una absorbancia de

0,729 a 0,059, alcanzando en este momento un PI del 91,86%, valor que permanece casi

constante durante el transcurso de treinta minutos. Para este mismo lapso de tiempo la

solución de 300 ppm inhibe en un 84,39% al radical libre DPPH y la de 100 ppm sólo

alcanza a capturar el 40,13% de los radicales libres, pasando de tener una absorbancia

de 0,747 a 0,116 y 0,455 respectivamente.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

0 500 1000 1500 2000

Tiempo/s

Ab

so

rban

cia

515 n

m

HAc 600 ppm

HAc 300 ppm

HAc 100 ppm


1,6:1 de las soluciones de 100, 300 y 600 ppm en extracto de hojas de olivo con acetato de etilo.




Tabla 3.4. Absorbancia y PI de los tres extractos con acetato de etilo de hojas de olivo

a lo largo de 30’.

Tiempo (segundos) Medianas A

Medianas PI


0 0,729 0,747 0,747 0,00 0,00 0,00 5 0,218 0,358 0,520 70,10 51,88 29,59

41 0,078 0,210 0,466 89,30 71,77 37,77 77 0,059 0,116 0,455 91,86 84,39 40,13

113 0,059 0,087 0,448 91,86 87,98 41,05

149 0,059 0,065 0,443 91,86 91,37 41,71 185 0,059 0,056 0,439 91,86 92,56 42,24

221 0,059 0,050 0,435 91,86 93,28 42,76 257 0,059 0,047 0,431 91,86 93,68 43,29

293 0,059 0,047 0,426 91,86 93,76 43,95 329 0,059 0,046 0,422 91,86 93,89 44,47

365 0,059 0,046 0,418 91,86 93,89 45,00

401 0,060 0,046 0,415 91,72 93,89 45,39 437 0,060 0,046 0,411 91,72 93,89 45,92

473 0,060 0,046 0,407 91,85 93,89 46,33 509 0,060 0,045 0,404 91,72 94,02 46,74

545 0,060 0,045 0,400 91,72 94,02 47,01

581 0,059 0,045 0,396 91,86 94,02 47,42 617 0,059 0,046 0,393 91,86 93,89 47,69

653 0,059 0,046 0,390 91,86 93,89 48,10 689 0,059 0,045 0,386 91,86 94,02 48,37

725 0,059 0,045 0,382 91,86 94,02 48,64

761 0,059 0,045 0,379 91,86 94,02 49,05 797 0,059 0,045 0,376 91,86 94,02 49,32

833 0,059 0,044 0,373 91,86 94,16 49,59 869 0,059 0,044 0,370 91,86 94,16 50,00

905 0,059 0,044 0,369 91,86 94,16 50,27 941 0,059 0,044 0,368 91,86 94,16 50,54

977 0,059 0,044 0,366 91,86 94,16 50,81

1013 0,059 0,045 0,364 91,86 94,02 51,08 1049 0,059 0,045 0,363 91,86 94,02 51,21

1085 0,059 0,044 0,361 91,86 94,16 51,48 1121 0,059 0,045 0,360 91,86 94,02 51,61

1157 0,059 0,044 0,359 91,86 94,16 51,75

1193 0,059 0,045 0,357 91,86 94,02 52,02 1229 0,059 0,044 0,356 91,86 94,16 52,15

1265 0,058 0,044 0,355 92,00 94,16 52,28 1301 0,059 0,044 0,353 91,86 94,16 52,55

1337 0,059 0,044 0,352 91,86 94,16 52,69 1373 0,059 0,045 0,350 91,86 94,02 52,96

1409 0,059 0,045 0,349 91,86 94,02 53,09

1445 0,059 0,044 0,347 91,86 94,16 53,36 1481 0,059 0,044 0,346 91,86 94,16 53,49

1517 0,059 0,044 0,345 91,86 94,16 53,63 1553 0,059 0,044 0,343 91,86 94,16 53,90

1589 0,059 0,044 0,342 91,86 94,16 54,03

1625 0,059 0,044 0,341 91,86 94,16 54,17 1661 0,059 0,044 0,340 91,86 94,16 54,30

1697 0,059 0,043 0,339 91,86 94,29 54,44 1733 0,059 0,043 0,338 91,86 94,29 54,57

1769 0,059 0,043 0,336 91,86 94,29 54,84 1805 0,059 0,043 0,335 91,86 94,29 54,97

A pesar de la elevada capacidad antirradicalaria puesta de manifiesto por el extracto de

600 ppm, se observa que a los quince minutos de puestos en contacto los reactivos, la




solución de 300 ppm, con una velocided de reacción evidentemente mas lenta, iguala el

PI de este extracto e incluso lo supera, alcanzando un PI de 94,16%. A los 185 segundos

(3,08 minutos) cruza a la curva de 600 ppm y sigue disminuyendo su valor de

absorbancia, consiguiendo un PI máximo de 94,29% a los 1697 segundos (28,28

minutos), valor que permanece hasta el final.

En comparación con el resto de los extractos ensayados, los extractos de HAc 100 ppm

resultan ser los menos eficientes; sin embargo alcanzan una actividad inhibitoria

superior al 50%, con un valor de 54,97% y una absorbancia de 0,335 en la última

medición. A los treinta minutos del ensayo la curva no llega a estabilizarse, continúa la

disminución de la absorbancia. Probablemente, no se alcanza el equilibrio, se cree que

los extractos necesitarían más tiempo de reacción o que en la mezcla hay mayor

concentración de RL que de compuestos antioxidantes, es decir, que la relación

estequiométrica 1,6:1 para este extracto a esta concentración, no sería la adecuada para

reflejar la inhibición radicalaria por parte de los extractos probados.

En síntesis, los extractos evaluados de hoja de olivo, tanto etanólicos como en acetato

de etilo, muestran elevados PI del radical libre DPPH dejando prever la excelente

capacidad antioxidante de los mismos. En cuanto a las cinéticas de reacción de las

mezclas extracto: DPPH, éstas presentan velocidades moderadamente diferenciadas, en

función del solvente y las concentraciones ensayadas.

En función de lo expuesto, se puede concluir que los extractos de hojas de olivo de la

variedad Arbequina procedentes del Valle Central de la provincia de Catamarca

constituyen una importante fuente natural de polifenoles con una elevada actividad

antioxidante, medida como la capacidad de capturar radicales libres DPPH, para la

relación estequiométrica extracto:DPPH 1,6:1. Sin embargo, considerando que la

actividad antioxidante depende no sólo de la concentración y naturaleza de los

extractos, sino también de las características del sustrato sobre el que se aplican, en el

capítulo 4 se evalúa la bioactividad de estos extractos sobre un sistema de prueba

biológico real.

3.4.2. - Comportamiento de los extractos de madera

Los resultados de los máximos, mínimos, medianas, promedios, desviaciones estándar y

los coeficientes de variación, de cinco repeticiones de los porcentajes de inhibición (PI)

de radicales libres DPPH de los extracto de madera de olivo se exhiben en la tabla 3.5.




Medida

descriptiva

Concentración (ppm)

100 300 600

Extractos

ME MAc ME MAc ME MAc

Máximo 75,03 33,38 94,45 71,39 93,30 96,61

Mínimo 49,54 27,76 91,48 53,89 91,79 91,21

Mediana 58,77 27,73 92,37 64,44 92,52 95,14

Media 61,30 27,55 92,84 62,75 92,45 94,80

DE 1,62 4,09 0,57 7,19 0,52 2,16

CV% 2,64 14,84 0,61 11,46 0,56 2,28

Tabla.3.5. Medidas descriptivas de los PI de extractos etanólicos y con acetato de etilo de madera de

olivo para 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH = 1,6:1; 15 min.).

Como se observa en la tabla 3.5 y el gráfico 3.5, las medianas de los PI calculados

oscilan entre un máximo de 95,14% (MAc 600 ppm) y un mínimo de 27,73% (MAc 100

ppm). A excepción del tratamiento MAc 100 ppm, todos los extractos de madera

presentan PI superiores al 50% a los quince minutos de producirse la mezcla extracto:

DPPH, valor registrado para el BHT a 500 ppm [7]

.

En el gráfico 3.5 se representan las medianas de los PI de las disoluciones de los

extractos de madera en etanol 50% y en acetato de etilo a 100, 300 y 600 ppm,

calculados a los quince minutos de producirse la mezcla de cada extracto con DPPH en

una proporción en peso de 1,6:1. En este gráfico se observa además, que a 600 ppm la

mayor capacidad de captura de RL la presenta el extracto en acetato de etilo, mientras

que para 300 y 100 ppm los extractos etanólicos muestran mejor actividad

antirradicalaria.

58,77%

92,37%

92,52%

27,73%

64,44%

95,14%

100

300

600

Co

ncen

tració

n/

pp

m

PI

MAc

ME

Gráfico 3.5. Actividad antioxidante de los extractos de madera de olivo expresada en términos de

medianas de PI a 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH= 1,6:1; 15 min.).




De los seis extractos de madera de olivo de la variedad Arbequina analizados, los más

activos resultan ser MAc 600 ppm y ME 600 ppm en ese orden respectivamente,

coincidiendo con estudios recientes que reportaron excelente actividad antirradicalaria

de los extractos de madera de olivo en estos mismos solventes [3]

.

Por otra parte, se observa que, a 600 ppm existe menor diferencia en el comportamiento

de los extractos en etanol:acuoso 50% y en acetato de etilo, que en el resto de las

concentraciones ensayadas. Así, continuando con el mismo análisis, se verifica que a

600 ppm el extracto MAc tiene una actividad 2,75% superior a ME. Sin embargo, a 300

ppm el extracto ME tiene una actividad antirradicalaria un 30,23% por encima de MAc.

Al seguir disminuyendo la concentración de ambos extractos de madera, se observa que

el poder inhibitorio se reduce de manera acentuada, registrándose que, a 100 ppm, ME

presenta una capacidad de captura superior al extracto MAc en un 52,82%

92,52%

95,14%

92,37%

64,44%

58,77%

27,73%

ME

MA

c

Extr

acto

s

PI

100 ppm

300 ppm

600 ppm

Gráfico 3.6. Actividad antioxidante de los extractos de madera de olivo en función de los solventes

de extracción, expresada en términos de medianas de PI a 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH=

1,6:1; 15 min.).

En el gráfico 3.6 se muestran las medianas de los PI de los extractos de madera,

calculados a los quince minutos de iniciada la reacción en función del solvente de

extracción empleado. Se observa que, a contenidos elevados en CF, los compuestos

extraídos de la madera presentan mayor actividad antirradicalaria en el sustrato DPPH-

metanol y por lo tanto, muestran mejores propiedades antioxidantes. Debido a que el

etanol 50% es el mejor de los solventes ensayados, en lo que se refiere a la capacidad

extractiva de CF en la madera (Ver sección 2.4.2), las actividades antirradicalarias de

las soluciones etanólicas de 600 y 300 ppm se ven solapadas por la alta cantidad de CF

antioxidantes presentes en las mismas. Es decir, en el solvente etanol-agua 50% la




incidencia de la concentración del extracto en la capacidad de captura del radical libre

no es muy marcada. Sólo el tratamiento ME 100 ppm exhibe una actividad

significativamente menor, sin embargo, está por encima del 50% de inhibición, valor

registrado para el BHT a 500 ppm [7]

.

Por su parte, los extractos en acetato de etilo presentan una relación directa entre la

concentración de los extractos y la capacidad de captura del radical libre DPPH. Así, el

mayor poder inhibitorio (95,14%) del RL es revelado por el extracto a 600 ppm. A 300

y 100 ppm los extractos exhiben una actividad antioxidante inferior (64,44% y 27,73%).

Observando los valores de las medianas expuestos en el gráfico anterior, se puede

corroborar que los tratamientos con acetato de etilo de 600 ppm y etanólicos de 300 y

600 ppm presentan PI superiores al 90%. Al realizar la prueba de Kruskal Wallis con

los PI de estos tratamientos, no se encuentran diferencias significativas al 5% (Tabla

3.6), permitiendo suponer que poseen capacidades de capturar el radical DPPH

semejantes (Anexo 3; Tabla. A.3.14)

La acción inhibitoria de los extractos de madera a 600 ppm para ambos solventes,

coincide con los resultados expuestos por Pérez Bonilla et al. (2003)[3]

, ya que el

tratamiento que alcanza el PI más alto a los 15 minutos es el de MAc.

En los gráficos 3.7 y 3.8 se exponen los comportamientos de las medianas de las

absorbancias de las mezclas de los extractos de madera de olivo, a las tres

concentraciones ensayadas, con el RL DPPH en función del tiempo. Mientras que, en

las tablas 3.7 y 3.8 se detallan las lecturas de las mediciones de absorbancia (A)

efectuadas cada 36 segundos, durante los treinta minutos que dura el ensayo y los

valores de PI correspondientes a dichas A.

En el gráfico 3.7 se observa que los extractos de MAc, a tres concentraciones distintas,

presentan cinéticas de reacción diferentes frente al RL DPPH.

A los 41 segundos de iniciado el ensayo, el extracto MAc 600 ppm pasa de tener una

absorbancia de 0,728 a 0,317, alcanzado este tiempo el PI supera el 50% de captura de

RL con un 56,46% de efectividad. Este valor continúa disminuyendo y a los 905

Extractos Medianas de PI*

MAc 600 ppm 95,14 A

ME 300 ppm 92,37 A

ME 600 ppm 92,52 A

* Letras distintas indican diferencias significativas al 5%

Tabla 3.6. Medianas de los PI de extractos etanólicos de madera de olivo a 300 y 600 ppm y del

extracto con acetato de etilo de madera de olivo a 600 ppm.




segundos (15 minutos) registra una absorbancia de 0,035 y un PI de 95,14%, porcentaje

que no es superado por ninguno de los extractos con acetato de etilo en el periodo de los

30 minutos de reacción. Llegado los 1445 segundos la curva de la absorbancia cae hasta

un valor mínimo de 0,032 y luego comienza a establecerse el equilibrio de la reacción

hasta estabilizarse finalmente en 0,033 de absorbancia con un PI de 95,42%; esta

actividad permanece casi constante hasta completar los treinta minutos de medición.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

0 500 1000 1500 2000Tiempo/s

Ab

so

rba

nc

ia 5

15

nm

MAc 600 ppm

MAc 300 ppm

MAc 100 ppm


1,6:1 de las soluciones de 100, 300 y 600 ppm en extracto de madera de olivo con acetato de etilo.

Por su parte, MAc 300 ppm logra registrar un 51,23% de inhibición de RL a los 113

segundos, con una absorbancia de 0,358. A los 15 minutos este porcentaje aumenta a un

valor de 64,44%. No obstante, a comparación con MAc 600 ppm, la velocidad de

inhibición de RL de MAc 300 ppm es más lenta. Este hecho se pone de manifiesto en la

menor pendiente de la curva correspondiente. Al finalizar los 30 minutos de lectura, los

valores de absorbancia siguen disminuyendo y la actividad antioxidante de MAc 300

ppm continua revelándose sin alcanzar el equilibrio.

En el caso de MAc 100 ppm se observa que la estequiometría extracto:DPPH ensayada

(1,6:1) no es la apropiada para inhibir al RL. A los 545 segundos, con una absorbancia

de 0,560, este extracto alcanza un de PI 25,01%. Luego, a los 905 segundos, el PI

calculado muestra que se inhibe sólo un 27,73%. Las lecturas finales de absorbancias

revelan que la curva esta llegando a un equilibrio con porcentajes de captura del 31,73%

y 31,75%. Comparados los PI de este extracto, con los de los extractos de 600 y 300

ppm, la actividad antirradicalaria mostrada a 100 ppm es cuantitativamente inferior.




Tabla 3.7. Absorbancia y PI de los tres extractos con acetato de etilo de madera de olivo

a lo largo de 30’.



0 0,728 0,733 0,725 0,00 0,00 0,00

5 0,419 0,481 0,603 40,99 34,47 19,60

41 0,317 0,408 0,586 56,46 44,41 19,73

77 0,242 0,374 0,580 66,80 49,05 20,55

113 0,190 0,358 0,577 74,25 51,23 20,96

149 0,150 0,348 0,575 79,67 52,59 21,23

185 0,123 0,340 0,573 83,33 53,68 21,60

221 0,103 0,335 0,572 86,04 54,36 22,00

257 0,088 0,329 0,571 88,08 55,18 22,27

293 0,076 0,324 0,569 89,70 55,86 22,80

329 0,067 0,319 0,568 90,92 56,54 23,07

365 0,060 0,315 0,566 91,87 57,08 23,47

401 0,053 0,311 0,565 92,82 57,63 23,87

437 0,048 0,307 0,564 93,50 58,17 24,13

473 0,044 0,303 0,562 94,04 58,72 24,53

509 0,042 0,299 0,561 94,29 59,26 24,80

545 0,041 0,295 0,560 94,43 59,81 25,07

581 0,041 0,291 0,559 94,43 60,35 25,47

617 0,041 0,288 0,557 94,43 60,76 25,73

653 0,040 0,284 0,555 94,57 61,31 26,00

689 0,039 0,281 0,553 94,58 61,72 26,27

725 0,038 0,277 0,551 94,72 62,26 26,53

761 0,037 0,274 0,549 94,86 62,67 26,80

797 0,037 0,271 0,547 94,86 63,08 27,07

833 0,036 0,267 0,545 95,00 63,62 27,33

869 0,035 0,264 0,544 95,14 64,03 27,47

905 0,035 0,261 0,542 95,14 64,44 27,73

941 0,035 0,257 0,540 95,14 64,99 28,00

977 0,035 0,254 0,539 95,14 65,40 28,13

1013 0,035 0,251 0,537 95,14 65,80 28,40

1049 0,034 0,248 0,536 95,28 66,21 28,53

1085 0,034 0,245 0,534 95,28 66,62 28,80

1121 0,033 0,242 0,533 95,42 67,03 28,93

1157 0,033 0,240 0,531 95,42 67,30 29,20

1193 0,033 0,237 0,530 95,42 67,71 29,33

1229 0,033 0,234 0,529 95,42 68,12 29,47

1265 0,033 0,231 0,527 95,42 68,53 29,73

1301 0,033 0,228 0,526 95,42 68,94 29,87

1337 0,033 0,225 0,525 95,42 69,35 30,00

1373 0,033 0,223 0,524 95,42 69,62 30,13

1409 0,033 0,220 0,522 95,42 70,03 30,40

1445 0,032 0,218 0,521 95,56 70,30 30,53

1481 0,033 0,215 0,520 95,42 70,71 30,67

1517 0,032 0,213 0,519 95,56 70,98 30,80

1553 0,033 0,210 0,518 95,42 71,39 30,93

1589 0,033 0,208 0,517 95,42 71,66 31,07

1625 0,033 0,205 0,516 95,42 72,07 31,20

1661 0,033 0,203 0,515 95,42 72,34 31,33

1697 0,033 0,201 0,514 95,42 72,62 31,47

1733 0,033 0,198 0,513 95,42 73,02 31,60

1769 0,033 0,196 0,512 95,42 73,30 31,73

1805 0,033 0,194 0,511 95,42 73,57 31,75




A diferencia de los extractos con acetato de etilo, los extractos etanólicos a 600, 300

100 ppm ensayados resultan ser intensamente activos, alcanzando valores de PI

superiores al 50% a los 15 minutos de producirse la mezcla. Sin embargo, se observa

también una marcada diferencia en el comportamiento antirradicalario de la solución

más diluida del extracto.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

0 500 1000 1500 2000

Tiempo/s

Ab

so

rban

cia

515 n

m

ME 600 ppm

ME 300 ppm

ME 100 ppm


1,6:1 de las soluciones de 100, 300 y 600 ppm en extracto de madera de olivo con etanol al 50%.

Se puede observar que a los 77 segundos de realizada la mezcla extracto: DPPH, con

una absorbancia registrada de 0,072, ME 600 ppm inhibe al RL en un 90,32%. La

reacción se encamina rápidamente al equilibrio hasta alanzarlo con una absorbancia de

0,055 y un PI de 95,52%, valores que permanecen constantes desde los 1373 segundos y

hasta finalizar los treinta minutos de lecturas.

ME 300 ppm, por su parte, exhibe también una excelente actividad atrapadora de RL,

pero a diferencia de ME 600 ppm, la rapidez de la reacción es menor. A los 257

segundos, es decir 3 minutos después que la solución de 600 ppm, ME 300 ppm captura

poco más del 90% de RL y recién a los 365 segundos la curva de absorbancia se solapa

con la curva de absorbancia del extracto de mayor concentración. Este solapamiento es

transitorio ya que ME 600 ppm logra disminuir aún más su absorbancia, y ME 300 ppm

se estabiliza en 0,057 de A y PI de 92,37%.

Finalmente, se evidencia que ME 100 ppm reacciona más lentamente que los extractos

más concentrados. A los treinta minutos del ensayo, la curva no llega a estabilizarse, no

alcanza el equilibrio y continúa la disminución de la absorbancia, necesitando en este

caso más tiempo de reacción.




Tabla 3.8. Absorbancia y PI de los tres extractos etanólicos de madera de olivo a lo largo de 30’.



0 0,735 0,750 0,747 0,00 0,00 0,00

5 0,214 0,329 0,523 70,40 56,71 30,66

41 0,107 0,237 0,480 85,20 68,82 36,45

77 0,072 0,174 0,448 90,32 77,11 40,66

113 0,064 0,135 0,426 91,42 82,24 43,16

149 0,060 0,108 0,409 91,84 85,66 45,25

185 0,058 0,089 0,397 92,12 88,13 46,85

221 0,057 0,076 0,387 92,38 89,87 48,19

257 0,057 0,069 0,379 92,39 90,75 49,26

293 0,057 0,063 0,373 92,53 91,68 50,07

329 0,057 0,058 0,366 92,53 92,17 51,00

365 0,057 0,057 0,361 92,53 92,17 51,67

401 0,057 0,057 0,356 92,53 92,17 52,34

437 0,057 0,057 0,352 92,53 92,17 52,88

473 0,057 0,057 0,347 92,65 92,17 53,55

509 0,057 0,057 0,343 92,65 92,17 54,08

545 0,057 0,056 0,339 92,53 92,31 54,62

581 0,057 0,057 0,336 92,53 92,17 55,02

617 0,057 0,057 0,332 92,53 92,17 55,56

653 0,057 0,057 0,329 92,52 92,24 55,96

689 0,057 0,057 0,326 92,53 92,24 56,36

725 0,057 0,057 0,322 92,52 92,24 56,89

761 0,057 0,057 0,319 92,52 92,24 57,30

797 0,057 0,056 0,316 92,39 92,37 57,70

833 0,057 0,056 0,313 92,39 92,37 58,10

869 0,057 0,057 0,311 92,53 92,37 58,37

905 0,057 0,057 0,308 92,52 92,37 58,77

941 0,057 0,056 0,305 92,52 92,37 59,17

977 0,057 0,056 0,303 92,52 92,37 59,44

1013 0,057 0,057 0,300 92,52 92,37 59,84

1049 0,057 0,057 0,298 92,52 92,37 60,11

1085 0,057 0,057 0,295 92,52 92,37 60,51

1121 0,057 0,057 0,293 92,52 92,37 60,78

1157 0,057 0,057 0,291 92,52 92,37 61,04

1193 0,057 0,057 0,288 92,52 92,37 61,45

1229 0,057 0,057 0,286 92,52 92,37 61,71

1265 0,057 0,057 0,284 92,52 92,37 61,98

1301 0,057 0,057 0,282 92,52 92,37 62,25

1337 0,056 0,057 0,279 92,52 92,37 62,65

1373 0,055 0,057 0,277 92,52 92,37 62,92

1409 0,055 0,057 0,275 92,52 92,37 63,19

1445 0,055 0,058 0,273 92,52 92,37 63,45

1481 0,055 0,057 0,271 92,52 92,37 63,72

1517 0,055 0,058 0,269 92,52 92,37 63,99

1553 0,055 0,057 0,267 92,52 92,50 64,26

1589 0,055 0,058 0,265 92,52 92,37 64,52

1625 0,055 0,057 0,263 92,52 92,37 64,79

1661 0,055 0,057 0,261 92,52 92,37 65,06

1697 0,055 0,057 0,260 92,52 92,37 65,19

1733 0,055 0,057 0,257 92,52 92,37 65,60

1769 0,055 0,057 0,256 92,52 92,37 65,73

1805 0,055 0,057 0,254 92,52 92,37 66,00

Antecedentes señalan que la bioactividad reportada en los extractos vegetales se debe no

sólo a los diferentes mecanismos ejercidos por los CF que posee (flavonoides, taninos,




quinonas), sino además al efecto sinérgico del conjunto de metabolitos secundarios que

pudiera contener la planta (alcaloides, terpenos) y a los cuales también se les reconoce

esta actividad [11]

.

A través del análisis efectuado acerca del poder inhibitorio de RL y la cinética de la

reacción de los extractos de madera de olivo en etanol:agua 50% y en acetato de etilo

sobre el radical DPPH, se confirma que la polaridad del solvente extractor juega un

papel relevante en la capacidad de captura del RL DPPH, comportamiento que está

vinculado a la naturaleza de los compuestos extraídos (Ver Anexo 2) y que podría

explicarse a través del aislamiento e identificación de los compuestos puros presentes en

los extractos y del estudio de su capacidad antioxidante, análisis que excede a los

objetivos de la presente tesis.

En síntesis, independientemente del solvente utilizado, el presente estudio muestra que

los extractos de madera de olivo, con elevado contenido en PFT, son excelentes

captadores de RL y podrían ser considerados una fuente potencial de antioxidantes. No

obstante, todas estas suposiciones debieran ser confirmadas a través de estudios

cualitativos y cinéticos más profundos y especialmente complementarse a través de la

aplicación de estos extractos en sistemas biológicos reales para evaluar la capacidad de

captura efectiva de RL.

En el capítulo 4 se evalúa la actividad antioxidante de los extractos en estudio aplicados

sobre aceite de oliva virgen.

3.4.3.- Análisis comparativo de los residuos de poda de olivo

De acuerdo a los análisis particulares para hoja (Sección 3.4.1) y madera (Sección 3.4.2)

de olivo se deduce que, a excepción del extracto MAc 100 ppm, todos los extractos

(tanto en etanol acuoso como en acetato de etilo) a las distintas concentraciones

ensayadas, muestran una excelente actividad antioxidante, con una capacidad de captura

del radical libre superior al 50 % a los quince minutos de producirse la mezcla extracto:

DPPH en una proporción 1,6:1.

Salvo el extracto MAc 300 ppm, los extractos de 600 y 300 ppm presentan las medianas

de los PI próximas entre sí y superiores al 91%. En cambio, el comportamiento de los

extractos a 100 ppm presentan una marcada diferencia en los PI que van desde el

91,55% (HE) al 27,73% (MAc) (Gráfico 3.9).




91,55%

92,61%

92,54%

50,27%

94,16%

91,86%

58,77%

92,37%

92,52%

27,73%

64,44%

95,14%

100

300

600

Co

ncen

tració

n/

pp

m

PI

MAc

ME

HAc

HE

Gráfico 3.9. Actividad antioxidante de los extractos a 600, 300 y 100 ppm de hoja y madera de olivo

expresada en términos de medianas de PI (Extracto:DPPH= 1,6:1; 15 min.).

Los extractos de hoja más activos son HAc y HE 300 ppm, en ese orden, y los de

madera más activos son MAc y ME 600 ppm. Los PI de estos cuatro extractos, no

muestran diferencias estadísticamente significativas entre sí (para un nivel del 5%)

(Tabla 3.9), de acuerdo a los indicado por las pruebas de Kruskal Wallis (Anexo 3;

Tablas A.3.15 a A.3.18).

Concentración Extractos

Etanólicos Medianas*

Extractos con

Acetato de Etilo Medianas *

100 Hoja 91, 55 C Hoja 50,27 AB

Madera 58,77 BC Madera 27,73 A

300 Hoja 92,61 D Hoja 94,16 D

Madera 92,37 D Madera 64,44 C

600 Hoja 92,54 D Hoja 91,86 D

Madera 92,52 D Madera 95,14D

* Letras distintas indican diferencias significativas, por concentración, al 5%

Tabla 3.9. Medianas de los PI de los extractos de hoja y madera de olivo.

Comparando el PI del BHT con el de los extractos más activos de hoja y madera de

olivo, éstos últimos manifiestan mayor capacidad de captura del radical DPPH que el

alcanzado por el antioxidante sintético que tiene un porcentaje máximo de 78% a 1250

ppm, según Rosales Castro, et al (2006) [7].

El contenido de compuestos fenólicos de diferentes fuentes vegetales ha sido reportado

como el responsable de la activad antioxidante y correlacionado con ella [8], por lo que

un contenido elevado de compuestos fenólicos podría sugerir en primera instancia una

buena capacidad antioxidante [9].




En la tabla 3.10 se presentan la concentración fenólica y ortodifenólica, el % de

ODF/PFT y el PI de cada una de las soluciones de los cuatro extractos ensayados.

Conforme a los datos de rendimiento extractivo obtenidos (Tabla 3.10), todos los

tratamientos exhiben un elevado contenido de fenoles, sin embargo, no todos muestran

una relación directa con la actividad antirradicalaria.

.

Extractos Concentraciones en extracto PFT ODF % ODF/ PFT PI

HE

600 ppm 16369,51 10440,65

63,78

92,54

300 ppm 8184,76 5220,33 92,61

100 ppm 2728,25 1740,11 91,55

HAc

600 ppm 6337,71 3011,28

47,51

91,86

300 ppm 3168,85 1505,64 94,16

100 ppm 1056,28 501,88 50,27

ME

600 ppm 11363,31 4388,31

38,62

92,52

300 ppm 5681,65 2194,16 92,37

100 ppm 1893,88 731,39 58,77

MAc

600 ppm 3237,08 2078,28

64,20

95,14

300 ppm 1618,54 1039,14 64,44

100 ppm 539,51 346,38 27,73

Tabla 3.10. Contenido polifenólico de los extractos etanólicos y con acetato de etilo de hojas y

madera de olivo.

Los extractos etanólicos de hoja que son a nivel extractivo los más ricos en contenido

fenólico, muestran a las concentraciones de 600, 300 y 100 ppm PI similares entre sí,

dejando suponer esto, que la riqueza propia de los extractos no permite reflejar actividad

antirradicalaria proporcional al contenido fenólico. Tal vez a menores concentraciones

de extracto, se podría observar una disminución en el PI (con la relación estequiometría

extracto: DPPH 1,6:1 utilizada), tal y como se observa con los extractos etanólicos de

madera y de acetato de etilo de hoja, donde a 100 ppm se observa que el PI disminuye a

un 50%. En cuanto a los extractos de madera con acetato de etilo que son, en

comparación al resto de los extractos, los de menor concentración fenólica, se puede ver

la relación proporcional entre el contenido fenólico de los extractos y el PI (Tabla 3.10),

en coincidencia con lo reportado por Kim [8] y Cheung

[9].

En la tabla 3.10 se observa que en los extractos de madera a 600 ppm el acetato de etilo,

lejos de tener la mayor cantidad de polifenoles, genera el extracto con mayor capacidad

de captura de radicales libres, aunque la diferencia con el etanol acuoso no resulta

estadísticamente significativa (al nivel de 5%). No es casual que sea precisamente el

extracto MAc el que presenta la mayor proporción de ODF con respecto a los PFT.

Evidentemente la naturaleza de los principios activos de este extracto son los que




marcan su actividad antirradicalaria. Inclusive se podría pensar en un efecto de tipo

sinérgico entre los diferentes compuestos extraídos por el sistema madera-acetato de

etilo. Sin embargo, para las dos concentraciones más bajas ensayadas (300 y 100 ppm),

los extractos etanólicos, con mayor contenido fenólico, muestran una capacidad

antioxidante mayor que los de acetato de etilo. Estos resultados coinciden con los de

Pérez Bonilla et al., (2003) [3]

, en lo referido a que el mejor rendimiento extractivo de

un solvente puede ó no coincidir con la mayor actividad antioxidante del extracto

obtenido. A 100 ppm, los extractos etanólicos de hoja, con mayor rendimiento fenólico,

presentan una capacidad de captura de radicales libres significativamente superior

(p<0,0007) a la de los extractos en acetato de etilo. Igual comportamiento se verifica a

600 ppm aunque la diferencia entre los PI de los extractos de ambos solventes no es

significativa (al nivel del 5%), coincidiendo también con lo reportado por Pérez Bonilla

(2003) [3]. En tanto, los extractos en acetato de etilo a 300 ppm, con menor contenido

fenólico que los extractos etanólicos de la misma concentración, presentan mayor

actividad antioxidante, pero la diferencia no es significativa, al nivel de significancia

considerado.

En función de los contenidos fenólicos de las soluciones de los extractos (Tabla 3.10) se

hubiera esperado la mayor capacidad antirradicalaria por parte de los extractos

etanólicos de hoja, ya que son los que presentan mayor concentración en fenoles a las

tres concentraciones evaluadas. A pesar de esto, es el extracto de madera con acetato de

etilo 600 ppm el que supera a todos los demás extractos, con un PI de 95,14%. Aún a

esta concentración el extracto HE no presenta la mejor capacidad antioxidante, ya que

es la concentración de 300 ppm la óptima para ese extracto. Esta observación corrobora

que uno de los factores más importantes que determina la actividad antioxidante de los

polifenoles es su grado de hidroxilación y la posición de los grupos oxhidrilos en la

molécula que puede afectar la solubilidad y los efectos estéricos, aumentando o

disminuyendo consecuentemente la actividad antioxidante [10]. Por esto y conforme a los

resultados obtenidos (Tabla 3.9 y Gráfico 3.9) se puede establecer, por la diferencia en

la actividad antioxidante de los extractos analizados y el comportamiento particular de

cada uno de ellos frente a las diferentes concentraciones, que la capacidad de captura de

RL de los CF no sólo depende de su contenido, sino también, del tipo de compuestos

presentes en los extractos, que pueden manifestar diferentes formas de sinergismo.

En el gráfico 3.10 se representa la disminución de la absorbancia a lo largo del tiempo

de las mezclas de los cuatro extractos más activos con DPPH, en proporción 1,6:1.




0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0 500 1000 1500 2000

Tiempo/ s

Ab

so

rban

cia

515 n

m

HAc 600 ppm

HAc 300 ppmMAc 600 ppm

ME 300 ppm

Gráfico 3.10. Medianas de las absorbancia, en función del tiempo, de los cuatro extractos de

madera y hoja de olivo más activos (Extracto:DPPH = 1.6:1; 15 min.).

Analizando las pendientes de las curvas de absorbancia, se observa que al comienzo las

velocidades de reacción son distintas hasta alcanzar el equilibrio y que son los extractos

con acetato de etilo, tanto en hoja como en madera de olivo los que actúan mas

lentamente pero los que al cabo de quince minutos de ensayo registran PI más altos. Por

su parte, los extractos etanólicos exhiben reacciones prácticamente instantáneas.

En síntesis, los extractos etanólicos y en acetato de etilo de hoja y madera de olivo de la

variedad Arbequina del Valle Central de Catamarca, presentan una excelente capacidad

de captura del radical libre DPPH. Debería evaluarse su comportamiento antioxidante

sobre sustratos de diferentes características para corroborar su actividad efectiva y poder

realizar los ajustes necesarios para concretar la transferencia tecnológica al sector

industrial. En este sentido, en el capítulo siguiente se analiza el comportamiento de los

extractos en estudio sobre aceite de oliva sometido a condiciones forzadas de oxidación

con la finalidad de evaluar el efecto protector de los extractos procedentes de la poda de

olivo sobre una matriz lipídica.

Por otra parte, resultaría interesante la determinación y comparación de las estructuras

responsables de las velocidades de reacción y del grado de actividad antioxidante de los

extractos de hoja y madera de olivo de Arbequina del Valle Central de Catamarca, ya

que según lo observado en esta investigación y de acuerdo a los antecedentes

consultados, la actividad antioxidante de extractos de origen vegetal, depende de la

cantidad pero también de la naturaleza de los CF presente en ellos [12]

.




3.5.- Citas bibliográficas

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Sánchez A. (2003). “La madera de olivo como nueva fuente de antioxidantes naturales”.

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[8]. Kim D., Jeoung S., Lee Ch. (2003). “Antioxidant capacity of phenolic

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