Universidad de Colima

Facultad de Medicina

Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas

Canales iónicos involucrados en la activación

de Linfocitos T

TESIS Que para obtener el grado de

Maestra en Ciencias Fisiológicas

PRESENTA

QFB. Mariana Irigoyen Anguiano

ASESOR Dr. Carlos G. Onetti Percello

COASESOR

Dr. Alejandro Elizalde Lozano.

Colima, Colima Octubre 2007

Esta tesis se desarrollo en el laboratorio de “Biofísica de canales iónicos” del Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Colima, bajo la dirección del Dr. Carlos G. Onetti Percello y el Dr. Alejandro M. Elizalde Lozano (coasesor) con el apoyo de CONACYT, beca número: 201495

2

Dedicatoria

Dedico este trabajo a mi papi por su apoyo incondicional y por ser siempre mi fuerza para salir adelante ante toda adversidad, a mi madre (q.e.p.d ) la cual al pasar de los

años cada vez me hace más falta y a Renato Galván Orozco por su amor .

3

Agradecimientos

Al Dr. Carlos Onetti por su apoyo y confianza para poder realizar este trabajo en su laboratorio. Al Dr. Alejandro Elizalde por su ayuda en la revisión de este trabajo como coasesor. A la Dra. Gabriela Ramírez por su gran ayuda en la revisión de este trabajo. A la Q.F.B. Adriana Leal por su amistad y apoyo. Agradezco a la familia Galván Orozco por su apoyo incondicional. Agradezco a mi hermano y mis niñas por su cariño y familia en general. Agradezco a mi tía Alida Reyes por su gran cariño y a todas mis tías. A mi amiga Maribel Martínez Casas por su apoyo en momentos difíciles y momentos felices. A mi amiga Karla Susana Vera por su gran apoyo y su sincera amistad gracias nene!.

4

INDICE Índice 5Abreviaturas 7Índice de figuras 10Índice de Tablas 12Resumen 13Abstract

14

1. El sistema inmunológico 151.1 Tipos de Inmunidad 15

1.1.1 Inmunidad Innata 151.1.2 Inmunidad Adaptativa 18 1.1.2.1 Inmunidad Humoral 19

1.1.2.2 Inmunidad Celular

19

2. Respuesta Inmune 21 2.1 Reconocimiento del Antígeno 21 2.2 Presentación del Antígeno

25

3. Bases celulares del sistema inmunitario

26

3.1 Linfocitos T y B 263.2 Distinción entre linfocitos T y B mediante marcadores de superficie

28

3.3 Linfocitos T 31 3.3.1 Selección positiva 31 3.3.2 Selección negativa

32

4. Activación de los linfocitos T 33 4.1 Inducción 33 4.2 Expansión

40

5. Canales iónicos relacionados con linfocitos

42

5.1 Canales de potasio 44 5.1.1 Canal Kv1.3 45 5.1.2 Canales de K+ activados por calcio

47

5.1.3 Canales de potasio sensibles a ATP (KATP)

49

5.1.3.1 Estructura de los canales (KATP)

49

5.1.3.2 Receptores a sulfonilurea

51

5

5.1.4 Canales mitocondriales de potasio sensibles a ATP (mitoKATP)

53

5.2 Canales CRAC

58

5.3 Canales de cloro (Cl-)

63

Conclusiones 66Perspectivas 67Referencias 68

6

Abreviaturas Ac. Anticuerpo. Ag. Antígeno. API-1. Proteína activadora 1. ChTx. Caribdotoxina. CPA.Célula presentadora de antígeno. CRAC. Canal activado por calcio liberador de calcio. CSF. Factores estimuladores de colonias. Em. Potencial de membrana. ICAM. Moléculas de adhesión intracelular. IFN. Interferón. Ig. Inmunoglobulina. IL. Interleucina. IKCa1. canal de potasio sensible a calcio de conductancia intermedia. IP3. Inositol trifosfato. IPC. Pre-condicionamiento isquémico. IP3R. Receptor específico a IP3. KATP Canales de potasio sensible a ATP. Kv1.3. Canal de potasio sensible a voltaje 1.3 KCOs. Abridores de canales de potasio. LAT. Acoplador para la activación de células T. LPS. Lipopolisacárido. MHC. Complejo mayor de histocompatibilidad.

7

MgTx. Margatoxina. mIg. Inmunoglobulina de membrana. mitoKATP. Canal mitocondrial de potasio sensible a ATP. NK. Célula citocida natural . NLS. Localización de secuencias nucleares. NFAT. Factor nuclear de células T activadas. NF-kb. Factor nuclear de la cadena Kappa en células B. NO. Óxido Nítrico. PAMPs. Patrones moleculares asociados a patógenos. PHA. Fitohemaglutinina. PLA. Fosfolipasa A. PLC. Fosfolipasa C. PKC. Proteína cinasa C. Po. Probabilidad de apertura del canal. PRRs. Receptores de reconocimiento de patrones. RVD. Regulación del decremento del volumen. RVI. Regulación del incremento del volumen. Tc. Linfocito T citotóxico. TCR. Receptor de antígeno de células T. TEA. Tetraetilamonio. Th. Linfocito T colaborador. TK. Tirosina cinasa. TLR. Receptores toll.

8

TNF. Factor de necrosis tumoral. VCAM-1. Molécula de adhesión vascular. 4(AP) 4-Aminopiridina. 5-HD. Hidroxidecanoato.

9

Índice de Figuras

Figura 1. Inmunidad Innata e

Inmunidad Adaptativa

20

Figura 2. Representación

esquemática de las moléculas

MHC I y MHC II

22

Figura 3. Estructura esquemática

del receptor para antígeno

de los linfocitos

23

Figura 4. Presentación del

antígeno

25

Figura 5. Clases principales de

linfocitos T

27

Figura 6. Moléculas accesorias

que participan en la sinapsis

entre linfocito T y la molécula

presentadora de antígeno

34

Figura 7. Principales vías de

señalización en la activación

de linfocitos T

36

Figura 8. Activación de c-Lck y

Fyn

37

10

Figura 9. Dominios ITAMs de las

moléculas ζ del CD3

y como interviene la ZAP-70.

38

Figura 10. Interacciones celulares

que participan

en la activación y proliferación de

los linfocitos.

41

Figura 11. Relación hipotética

entre canales de K+

y proliferación celular

45

Figura 12. Estructura octamérica

del canal de potasio

sensible a ATP

50

Figura 13. Estructura del canal

KATP

52

Figura 14. Reguladores

fisiológicos de canales KATP

mitocondriales

55

Figura 15. Corrientes

representativas del canal mitoKATP

57

Figura 16. Eventos de calcio en

linfocitos T

59

Figura 17. Canales iónicos en linfocitos T

62

11

Índice de tablas

Tabla 1. Células fagociticas y sus

localizaciones.

17

Tabla 2. Inmunidad innata vs.

Inmunidad adaptativa

21

Tabla 3. Clasificación de las

citosinas de acuerdo a su función

30

Tabla 4. Canales iónicos

caracterizados en linfocitos

43

Tabla 5. Isoformas del canal KATP

53

12

Resumen

Los linfocitos T son células del sistema inmune que reconocen un objetivo

no-propio como un patógeno, solo después de que los antígenos (pequeños

fragmentos del patógeno) han sido procesados y presentados en combinación

con un receptor propio, una molécula del llamado complejo mayor de

histocompatibilidad.

En los linfocitos T se han caracterizado diferentes tipos de canales

iónicos. Estudios electrofisiológicos en estas células del sistema inmunológico

han sugerido que los canales iónicos juegan un papel importante en la respuesta

inmune, quizá por el inicio de una cascada bioquímica de eventos

enzimáticamente controlados, por ejemplo, el canal CRAC el cual tiene un papel

esencial durante el desarrollo y maduración de los linfocitos, con la activación de

este canal viene la activación del canal Kv1.3, importante en la regulación del

potencial de membrana así como de la proliferación celular, por su parte el canal

IKCa1 responde a concentraciones elevadas de calcio en el linfocito

hiperpolarizando la membrana del linfocito y podemos encontrar también al

canal de Cl- responsable del volumen celular.

Por otro lado se han caracterizado canales de potasio sensibles a ATP en

mitoblastos de linfocitos T los cuales podrían estar implicados en la activación

de dichas células relacionando el estado energético de la célula con el potencial

de membrana.

13

Abstract

Lymphocytes T are cells of the immune system that recognize an not-own

objective like a pathogen,only after the antigens (small fragments of the

pathogen) process and have been presented in combination with an own

receiver, a molecule called Major Histocompatibility Complex.

In lymphocytes T different types from ionic channels have been

characterized. Electrophysiology studies in these cells of the immunological

system have suggested play an important role in the immune response, perhaps

by the beginning of a biochemical cascade of events enzymatically controlled, for

example, CRAC channel which has an essential paper during the development

and maturation of the lymphocytes, with the activation of this channel comes the

activation from the Kv1.3 channel, important in the regulation of the membrane

potential as well as of the cellular proliferation, on the other hand the IKCa1

channel responds to elevated calcium concentrations in the lymphocyte

hyperpolarizing the membrane of the lymphocyte and we can also find to the

channel of Cl- responsible for the cellular volume.

On the other hand sensible potassium channels to ATP have been

characterized in mitoplast of lymphocytes T which could be implied in the

activation of these cells relating the power state of the cell to the membrane

potential.

14

1. EL SISTEMA INMUNOLOGICO 1.1 Tipos de inmunidad

El término inmunidad, se ha definido en el campo biológico como

protección contra enfermedades, y más específicamente enfermedades

infecciosas.

El sistema inmunitario esta constituido por células y moléculas

responsables de esta inmunidad, y su colectiva y coordinada respuesta al

reconocimiento de sustancias extrañas incluyendo macromoléculas como

proteínas y polisacaridos provocan la respuesta inmunitaria. Existen dos tipos

de tipos de respuesta inmune: la inespecífica o innata y la específica o

adaptativa (Abbas y cols., 1997).

1.1.1 Respuesta Inmune innata

La inmunidad innata distingue aquellos agentes externos potencialmente

patógenos (antígenos Ag) de aquellos que no lo son aún cuando nunca antes

hubieran estado expuestos a ellos (Zambrano,1999), y constituye la primera

línea de defensa del organismo, ya que se activa rápidamente. Este tipo de

inmunidad esta presente en todos los individuos normales, sólo que varía de uno

a otro según sus condiciones fisiológicas; actúa de manera inespecífica porque

no distingue entre microorganismos de especies diferentes y su intensidad de

respuesta no se altera con exposiciones repetidas al antígeno.

Entre los mecanismos innatos de defensa participan las barreras

naturales físicas como la piel y la mucosa, los cilios en el epitelio de las vías

respiratorias o bien secreciones como el ácido del estómago o de las glándulas

15

sebáceas. Además de estas barreras físicas de defensa también participan una

serie de mecanismos celulares y humorales mediados por la activación del

complemento, citosinas, el sistema fagocitario (neutrófilos, macrófagos) y de

células asesinas naturales o NK (del ingles natural killers) (Zambrano, 1999;

Pterov, 1982) y dependiendo de su secuencia de actuación podremos

agruparlos en:

• Actuación rápida (entre los 4 minutos y las 4 horas) mediada por:

activación del complemento por la vía alternativa y activación de los

macrófagos.

• Actuación media y lenta (entre las 4 horas y los 4 días) mediada por: La

inflamación, la activación de las células NK (asesinas naturales) y la

producción y liberación de interferón.

Los determinantes principales de éste tipo de inmunidad están bajo

control genético y el grado de protección, es por tanto, hereditario; pero se

modifica en el transcurso de la vida por factores como edad, sexo, alimentación

y estado físico del individuo ( Weir, 2004; Zambrano, 1999).

La capacidad de la inmunidad innata para reconocer agentes patógenos

que entran al organismo se basa en una serie de patrones de reconocimiento a

receptores (PRRs), que reconocen patrones moleculares conservados en

diferentes grupos de patógenos microbianos (PAMPs). La unión de estos

receptores con sus ligandos induce la activación de diferentes mecanismos

dirigidos a la eliminación de los patógenos. Por ejemplo algunos receptores

solubles, como la proteína C reactiva, estimulan la vía del complemento (Abbas,

1997; Hernandez-Urzua y Alvarado-Navarro, 2001), el cual es un grupo complejo

de proteínas séricas, que existen en concentración baja en el suero normal,

activado también por reacciones antigeno-anticuerpo y que es esencial para la

hemólisis inmune y la bacteriólisis mediada por anticuerpos (Ac), juega un papel

importante en otras reacciones biológicas como la opsonización, quimiotaxis y

16

citólisis inmune; existen dos vías para su activación, la alterna y la clásica, que

llevan a las mismas consecuencias fisiológicas (opsonización, activación celular

y lisis) pero usan diferentes procesos de iniciación (Petrov 1982; Weir 2004, Bier

y col., 1981)

Otros receptores de membrana, como los receptores depuradores (o el

receptor de manosa, induce la fagocitosis o endocitosis de los microorganismos

por parte de macrófagos, neutrófilos y células dendríticas. (Abbas, 1997;

Hernandez-Urzua y Alvarado-Navarro, 2001 )

Existen tres tipos principales de células fagocíticas: 1) los neutrófilos; 2)

las células del sistema fagocítico mononuclear, incluyendo los monocitos de la

sangre y los macrófagos (que proceden de los monocitos) de los tejidos

conjuntivos; y 3) los fagocitos específicos de órganos como hígado, bazo,

ganglios linfáticos, pulmones y cerebro (Tabla 1).

Tabla 1. Células Fagocíticas y sus localizaciones Fagocitos Localización

Neutrófilos Sangre y todos los tejidos Monolitos Sangre Macrófagos (histiocitos) Todos los tejidos (incluyendo bazo,

ganglios linfáticos, médula ósea) Células de Kupffer Hígado Macrófagos alveolares Pulmones Microglia Sistema nervioso central

Otra característica que puede observarse en este tipo de inmunidad es

que los mecanismos innatos de defensa pueden distinguir entre los hidratos de

carbono producidos por las células de los mamíferos y los producidos por

bacterias. Los hidratos de carbono bacterianos que “marcan” la célula para su

17

ataque fagocítico forman parte de las glucoproteínas y los lipopolisacáridos de la

pared bacteriana.

También algunos PRRs como los TLRs (receptores Toll) promueven la

producción de proteínas que ayudan a la eliminación de los microorganismos por

ejemplo la lisozima, fosfolipasa A (PLA), defensinas, proteínas de complemento,

lactoferina, óxido nítrico (NO) sintasa, mieloperoxidasa; y la producción de

citosinas que inducen la reacción inflamatoria local, caracterizada por la

atracción y activación de otros leucocitos. (Abbas, 1997; Hernandez-Urzua y

Alvarado-Navarro, 2001 )

En resumen la inmunidad innata, representa la respuesta inicial contra

numerosos microorganismos patógenos, y en muchos casos es suficiente para

eliminar el patógeno. No obstante, la inmunidad innata esta estrechamente

relacionada con la inmunidad adaptativa.

1.1.2 Respuesta inmune adaptativa

La inmunidad adaptativa (también denominada inmunidad adquirida o

específica), es un mecanismo de respuesta más evolucionado, que es

estimulado de forma específica tras la exposición a un determinado agente

extraño. Aunque la activación completa de estos mecanismos requiere varios

días, se adquiere mayor especificidad e intensidad de la respuesta alcanzada,

así como capacidad de memoria (Tabla 2). De esta manera, la respuesta de

estos mecanismos ante exposiciones repetidas al mismo patógeno, es mucho

más efectiva que la respuesta innata sin embargo, la activación de la respuesta

adaptativa depende de la activación previa de la respuesta innata, puesto que es

esta última la que tiene la capacidad de distinguir aquellos agentes con potencial

patógeno (Abbas y col., 1997 ; Puertas 2006).

18

Las respuestas de la inmunidad específica están clasificadas en dos

tipos, basados en los componentes del sistema inmune que median esta

respuesta: la inmunidad humoral y la inmunidad celular.

1.1.2.1 Inmunidad Humoral

La Inmunidad Humoral es mediada por moléculas en la sangre que son

responsables del reconocimiento específico y eliminación de antígenos;

llamados anticuerpos como son las inmunoglobulinas (Igs) producidas por los

linfocitos B (Fig. 1). Los linfocitos B se renuevan periódicamente, pero siempre

permanecen células de memoria que permiten repetir una respuesta inmune al

producirse un nuevo contacto con el antígeno específico.

La zona del antígeno reconocida por los anticuerpos es el epítope o

determinante antigénico. Cuando los anticuerpos se unen específicamente al

antígeno, pueden tener un efecto neutralizante directo.

Además, la unión del anticuerpo a la superficie de los agentes

infecciosos se puede favorecer en función del isotipo de la inmunoglobulina en

cuestión (IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, en humanos), la lisis

mediada por el complemento, mecanismos de fagocitosis y (o) la liberación de

mediadores inflamatorios (Abbas y col., 1997; Jeneway y col., 1999; Penninger y

Crabtree., 1999; Puertas 2006).

1.1.2.2 Inmunidad Celular

La Inmunidad celular es mediada por células llamadas linfocitos T y este

tipo de inmunidad esta especialmente orientada a la eliminación de aquellos

microorganismos que residen y proliferan en el interior de las células del

huésped por lo que no son accesibles a los anticuerpos circulantes. Los

linfocitos T citotóxicos, mayoritariamente CD8+, tienen función citolítica sobre las

19

células infectadas. Por su parte, los linfocitos T CD4+ colaboradores, están

especializados en la producción de citosinas que coordinan el desarrollo de la

respuesta inmunitaria entre una de sus funciones esta la de estimular a los

linfocitos B para producir anticuerpos. Según el patrón de citosinas producido

por estos linfocitos se favorece la activación de una respuesta de tipo celular,

también denominada Th1 y Th2 (Fig. 1) (Abas y col., 1997).

Figura 1. Inmunidad Innata e Inmunidad Adaptativa. En la figura se muestra

la activación de la inmunidad innata por la presencia del antígeno. En la inmunidad

adaptativa se puede presentar una respuesta humoral la cual esta dada por la

liberación te anticuerpos de los linfocitos B gracias al estimulo de los linfocitos

colaboradores 2 por la liberación de diferentes citosinas, por otro lado la inmunidad

celular esta dada por la estimulación de linfocitos T colaboradores tipo 1.

20

En la siguiente tabla 2 se presenta una comparación de características de

la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa.

Tabla 2. Inmunidad natural vs. Inmunidad adaptativa

Característica Inmunidad natural Inmunidad adaptativa

Reconoce antígenos

concretos No Si

Reconoce “patrones” de

patógenos Si No

Desarrolla memoria No Si

Mediada por receptores Si Si

Participan citosinas y

otros mediadores Si Si

2. RESPUESTA INMUNE 2.1 Reconocimiento del antígeno

Para que se inicie la respuesta inmune específica, se requiere el

reconocimiento del antígeno por parte de los linfocitos y la subsiguiente

activación de los mismos.

Los linfocitos B reconocen el antígeno mediante inmunoglobulinas de

membrana (mIg) las cuales puede reconocer a estos antígenos en su

conformación nativa, mientras que los linfocitos T lo reconocen mediante el

21

receptor de linfocitos T (TCR) (Fig.3) el cual sólo puede reconocer fragmentos

peptídicos derivados del antígeno que este unido a moléculas del MHC a lo cual

se le conoce como “ fenómeno de restricción del MHC” (García y col., 1998).

Para ello, los antígenos procedentes de agentes externos son internalizados,

procesados y presentados por células especializadas que se denominan células

presentadoras de antígeno (CPA) (Abbas y col., 1997; Jeneway y col., 1999;

Penninger y Crabtree., 1999; Reinherz y col., 1999).

Las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad mencionadas

anteriormente son glicoproteínas presentes en las membranas de la mayoría de

las células nucleadas, entre las que se encuentran las células

inmunocompetentes. Estas moléculas son esencialmente de dos tipos, tipo I y

tipo II y tienen entre otras funciones la de presentar el antígeno a los linfocitos

así como participar en el proceso de maduración de los linfocitos T en el timo

(Fig. 2).

Figura 2. Representación esquemática de las moléculas MHC I y MHC II. Se

muestran lo lugares de presentación del Ag y el lugar de anclaje en la membrana celular

así como el tipo de cadenas en cada clase.

22

Las moléculas de este complejo son altamente polimórficas y presentan

más de cuarenta alelos comunes para cada gen individual. Estas proteínas,

identificadas como antígenos, distinguen a los miembros de una misma especie.

Tanto las moléculas de clase I como las de clase II fueron reconocidas

originalmente por su capacidad de inducir respuesta por parte de los linfocitos T,

originándose así el rechazo de tejidos transplantados (Abbas y col., 1997;

Matheux, 2004; Reinherz y col., 1999).

El reconocimiento antigénico por los linfocitos T mediante el receptor TCR

es muy importante para la generación y regulación de una respuesta inmunitaria

eficaz por lo cual es una pieza clave dentro de este proceso. (Lanzavecchia y

col., 1999; Chang y col.,1997). (Fig. 3) Figura 3 Estructura esquemática del receptor para antígeno de los linfocitos T. constituido

por una glucoproteína heterodimérica unida por

puentes disulfuro (αβ ó δγ) el cual se encuentra

estrechamente ligado con CD3 que es un

complejo polipeptídico. (Tomado de Peña

Imunologyonline)

El TCR está constituido por una glucoproteína heterodimérica unida por

puentes disulfuro (αβ ó γδ), lo cual se define durante su diferenciación. En las

etapas tempranas de la ontogenia, hay un predominio de linfocitos γδ; a partir

del nacimiento, más del 90% de los timocitos expresan receptores αβ. Estos dos

linajes muestran además una distribución diferencial en el organismo, y llevan

acabo funciones diferentes.

Más del 95% de los linfocitos T periféricos y de la mayoría de los

timocitos que expresan TCR corresponden al tipo αβ. Por el contrario, los

linfocitos γδ son abundantes en diversos epitelios, como la epidermis (en

23

ratones), el epitelio intestinal, el útero y la lengua, aunque la función para los

linfocitos γδ no está muy bien establecida. El TCR, a su vez, se encuentra en

estrecha asociación en la superficie celular con un complejo polipeptídico

conocido como CD3 (Rud,1999). Esta asociación es necesaria para una correcta

expresión en la superficie celular del TCR. Los componentes de CD3 no

muestran variabilidad de aminoácidos en diferentes células T, por lo que no

contribuyen a la diversidad genética del receptor. La función mejor conocida

para este complejo de proteínas es la transducción de señales generadas por la

activación celular como resultado del reconocimiento del antígeno por el

heterodímero del receptor. El complejo polipeptídico CD3 comprende al menos

cinco cadenas polipeptídicas, llamadas γ, δ, ε, ζ, ψ, η (Bronstein-Sitton, 2006;

Chang y col., 1997).

Las cadenas α, β, γ y δ de los receptores antigénicos presentan una

región constante, común para cada una de ellas, y una región variable propia de

cada uno de los distintos clones de linfocitos T y diferentes a todas las demás.

La presencia de esta región variable es lo que le confiere su carácter polimórfico

al receptor. Las cuatro cadenas provienen de la reordenación de genes

constituidos a su vez por la unión de un elemento procedente de cada una de

las diferentes regiones del gen, denominadas V (variable), D (diverso), J (unión)

y C (constante). Este proceso se cumple para las cadenas β, γ y δ. La cadena α

está constituida solo por elementos de las regiones V, J y C. los dominios

extracelulares tipo inmunoglobulinas de estas cadenas, junto con los de las

cadenas γ, δ, ε del CD3, probablemente forman asociaciones; se propone que

al menos los dos dominios V (variables) de los receptores de ambos tipos se

asocian de manera similar a como lo hacen los dominios VH/VL de las

moléculas de inmunoglobulinas. (Bronstein-Sitton, 2006; Gascoigne y col., 1987

Chang y col., 1997).

24

2.2 Presentación del antígeno

Para que los linfocitos T, tal como se ha dicho anteriormente puedan

reconocer al Ag, éste debe ser debidamente presentado por las células CPA

(Janeway y cols, 1999). Los péptidos resultantes después del procesamiento

intracelular del Ag son presentados en la superficie de las células, unidos a

moléculas del MHC de clase II (linfocitos T CD4+) ó clase I (linfocitos T CD8+) y

estos péptidos podrán interactuar con el TCR de linfocitos T (Fig.1). Las

moléculas del MHC de clase I, presentes en la mayoría de las células de un

organismo, presentan péptidos derivados de proteínas endógenas; mediante

este mecanismo, los linfocitos T citotóxicos pueden unirse a péptidos originados

por un microorganismo patógeno intracelular (Armstrong y col., 1997 ;Modino y

col., 1996) (Fig.4).

Figura 4. Presentación del antígeno. El antígeno es reconocido por los linfocitos B pero los

linfocitos T requieren que este sea presentado por moléculas de histocompatibilidad.

25

3. BASE CELULAR DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO

3.1 Linfocitos B: respuesta de anticuerpos humorales; Linfocitos T: respuesta inmunitaria mediada por células.

Durante la década de 1960 se descubrió que dos clases de respuesta

inmune estaban mediadas por diferentes clases de linfocitos: las células T, que

se desarrollan en el timo, y que son responsables de la inmunidad mediada por

célula; y las células B, que en los mamíferos se desarrollan a partir de la médula

ósea en el adulto o en el hígado fetal, y que producen anticuerpos.

Existen dos clase principales de linfocitos T: los linfocitos T colaboradores

(Th, del inglés helper) y los linfocitos T citotóxicos (Tc) (Fig 5). Los linfocitos

colaboradores aumentan la respuesta de otras células inmunitarias, como los

linfocitos B que producen los anticuerpos. Por su parte, los linfocito T citotóxicos

se encargan de destruir células infectadas, y debido a que, a diferencia de la

células Th, participan directamente en la defensa contra infecciones, las Tc

reciben el nombre de células efectoras. Las células Th caen dentro de dos

categorías generales, Th1 y Th2, definidas por el tipo de citosinas que secretan

(Abbas y cols, 1997; Farrar y cols, 2002). Las citosinas particulares producidas

durante una respuesta inmune determina otras células inmunes reclutadas.

Aunque existen excepciones, la separación de las funciones de los linfocitos Th

y Tc viene dada por el origen de los antígenos que reconocen.

26

Figura 5. Clases principales de linfocitos T. El antígeno (péptido) es presentado por

moléculas de histocompatibilidad clase I a las células Tc mientras que las moléculas

clase II lo hacen a los Th.

Los Tc, mayoritariamente CD8+, tienen función citolítica sobre las células

infectadas. Por su parte, los linfocitos T CD4+ colaboradores, están

especializados en la producción de citosinas que coordinan el desarrollo de la

respuesta inmune. Según el patrón de citosinas producido por estos linfocitos se

favorece la activación de una respuesta de tipo celular, también denominada

Th1 (IL-2, IL-12, IFNδ, TNFBβ) tienden a promover la respuesta citotóxica y

activación de macrofagos, o de tipo humoral Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13).

(Bergman 2001; Fanger y col., 2000; Hernández-Ruiz y col., 2006).

27

3.2 Distinción entre linfocitos T y linfocitos B mediante marcadores de superficie

Los linfocitos T y B se pueden distinguir morfológicamente sólo después

de su activación por el antígeno.

Las células T y B no estimuladas (en “reposo”) tienen un aspecto muy

similar, incluso al microscopio electrónico; ambas son pequeñas, la mayor parte

de la célula corresponde al núcleo y tienen que ser activadas por el antígeno

para poder proliferar y avanzar en la maduración. Los linfocitos B activados se

convierten en células productoras de anticuerpos, en cuyo estado maduro, se

conocen como células plasmáticas, que poseen un abundante retículo

endoplásmico rugoso. Las células T activadas contienen muy poco retículo

endoplásmico y no secretan anticuerpos, aunque sí diversos mediadores

denominados linfocinas, interleucinas y citosinas. (Abbas y col.,1997; Zambrano,

199).

Las interleucinas son proteínas solubles de bajo peso molecular

mediadoras de crecimiento celular, inflamación, inmunidad, diferenciación y

reparación, entre otras actividades. (Hernandez-Urzua y Alvarado-Navarro,

2001).

Las citosinas constituyen un grupo grande de moléculas que participan

en la señalización entre las células durante las respuestas inmunitarias. Por lo

general son proteínas pequeñas solubles y, en algunos casos, glucoproteínas,

producidas por una célula que pueden afectar el comportamiento y las

propiedades de otras células. Son producidas por diferentes tipos celulares, no

sólo por las células inmunitarias, y por lo general regulan las fases efectoras de

la respuesta inmunitaria tanto natural como especifica. En la inmunidad natural

las citosinas efectoras son producidas principalmente por los fagotitos

mononucleares y por ello reciben el nombre de monocinas. Las monocinas

pueden ser producidas directamente como respuesta a un estímulo microbiano,

28

o bien en respuesta a los linfocitos T estimulados por Ag, como parte de una

respuesta específica. (Abbas y col.,1997; Zambrano, 199; Petrov, 1982).

También desempeñan un papel importante como coestimuladoras de la

activación de linfocitos, proporcionando mecanismos de amplificación para las

respuestas inmunitarias especificas. La mayoría de las citosinas presentes

durante una respuesta inmunitaria específica son producidas por los linfocitos T

activados, y tales citosinas han sido denominadas linfocinas (Carosi, 1990;

Chung, 2001). En general, las citosinas provenientes de los linfocitos T son las

moléculas efectoras de la inmunidad mediada por células y son también

responsables de la comunicación entre células del sistema inmunitario e

inflamatorio. Los linfocitos T producen diversas citosinas que regulan la

activación, el crecimiento y la diferenciación de diferentes poblaciones de

linfocitos, también tiene otras funciones como activadoras y reguladoras de

células inflamatorias, tales como los fagocitos mononucleares, los neutrófilos y

los eosinofilos. (Abbas y col., 1997)

Existen también otro grupo de citosinas producidas tanto por linfocitos

como por fagocitos mononucleares, llamadas de forma genérica factores

estimuladores de colonias, CSF, las cuales estimulan el crecimiento y la

diferenciación de los leucocitos inmaduros de la médula ósea.

Las citosinas poseen la capacidad de influir tanto en la síntesis de otras

citosinas como en la acción de estas (Granger, 2004; Chung 2001). Al igual que

otras hormonas polipeptídicas, las citosinas inician su acción al unirse a

receptores específicos presentes en la superficie de las células diana, y la

expresión de muchos de estos receptores esta regulada por señales específicas.

En general, la mayoría de las respuesta celulares a las citocinas ocurren en un

período de horas y requieren de la síntesis de novo de ARNm y de proteínas.

Finalmente, para muchas células diana, las citosinas actúan como reguladoras

de la división celular, esto es, como factores de crecimiento.(Abbas 1999; Weir,

29

2004). Una forma de clasificar las citosinas es sobre la base de sus funciones,

como se muestra en la (tabla 3). (Chung, 2001)

Tabla 3 . Clasificación de las citosinas de acuerdo a su función.

Función Citosina

Mediadores de la inmunidad natural IFN-α ó β (Tipo I), TNF-α, IL-1, IL-6,

Quimiocinas (IL-8, MCP-1, MIP-1α y

1β)

Reguladores de la activación,

crecimiento y diferenciación de los

linfocitos.

IL-2, IL-4 y TGF-β

Activadores de las células

inflamatorias.

IFN-γ, LT, IL-10, IL-5, IL-12, MIF

Estimuladores del crecimiento y

diferenciación de leucocitos inmaduros.

CSFs, IL-3, ligando para c-kit, SCF,

GM-CSF

Aunque morfológicamente los linfocitos T y los linfocitos B son muy

similares, existen muchas diferencias en sus proteínas de membrana

plasmática, que se pueden considerar como marcadores de superficie; como

ejemplos de marcadores se puede citar CD3, específicos de las células T, o los

marcadores CD4 y CD8, específicos de subpoblaciones de linfocitos T (Janeway

y col., 1999).

30

3.3 Linfocitos T

Los linfocitos T derivan de células pluripotenciales de la médula ósea y

sufren la reorganización de sus genes en un microambiente especializado, para

producir moléculas receptoras únicas en cada célula. Están células migran

desde etapas muy tempranas hacia el timo (el nombre de linfocitos T se refiere a

que derivan del timo), donde se lleva a cabo su maduración, pasando por una

serie de estadíos o fases que se distinguen por la expresión de diferentes

moléculas de superficie como son CD44 y CD25, el complejo CD3:TCR

(Glimcher y Singh., 1999) y las proteínas correceptoras CD4 y CD8 (Modino y

cols, 1996). Por lo tanto solo aquellas células que reconocen las moléculas del

MHC propias de su organismo serán capaces de contribuir al desarrollo de la

respuesta inmunitaria adaptativa. De igual forma, algunas células T deberán

reconocer péptidos propios también unidos a moléculas de MHC para

convertirse en autotolerantes.

Para cumplir este doble requisito, los linfocitos T sufren dos procesos de

selección, un proceso de selección positiva en el cual son seleccionados de

acuerdo con la restricción por las moléculas del MHC, y un proceso de selección

negativa, durante el cual se eliminan las células especificas contra péptidos

propios unidos a moléculas propias del MHC (Modino y col., 1996).

3.3.1 Selección positiva

En el timo, además de la maduración de linfocitos T también tiene lugar

un proceso de selección de timocitos (linfocitos inmaduros), previo a la liberación

de éstos al torrente circulatorio. Las células epiteliales de la corteza tímica

presentan péptidos derivados de autoantígenos en el contexto de moléculas

MHC entonces durante su paso por la corteza tímica, aquellos timocitos cuyo

31

TCR no es capaz de interaccionar adecuadamente con las moléculas de MHC

vuelven a reordenar su TCR o son delecionados directamente.

Mediante este proceso de selección positiva, solo aquellos timocitos que

se pueden unir adecuadamente a las moléculas de MHC sigue su proceso de

maduración en la medula tímica (Modino y col., 1996; Kisielow y col., 1995;

Singer y col., 1990).

3.3.2 Selección negativa

En la médula, las células epiteliales medulares tímicas y las células

dendríticas son las responsables de la presentación de autoantígenos a los

timocitos, en presencia de moléculas coestimuladoras (CD80 y CD86). En esta

fase, los timocitos son muy sensibles a la apoptosis por hiperactivación, de

manera que aquellos que reconocen autoantígenos son eliminados “in situ”

(selección negativa) (Palmer, 2003). Además cabe destacar que las células

epiteliales medulares tímicas son capaces de expresar, de manera ectópica,

autoantígenos que normalmente sólo se expresan en ciertos tejidos periféricos.

Tras estos procesos de selección positiva y negativa, sólo maduran y salen del

timo aquellos linfocitos que pueden interactuar con moléculas de MHC pero no

reconocen autoantígenos (Liston y col., 2007).

De lo anterior podemos observar que el desarrollo de los linfocitos T se

acompaña de acontecimiento de muerte celular, reflejo del intenso procesos de

selección de los linfocitos T y de la eliminación de clones con especificidades

por péptidos propios.

32

4. ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T

La activación de los linfocitos T puede provocar una variedad de

respuestas incluyendo proliferación, migración y aún apoptosis (Bronstein-Sitton,

2006) y la intervención de los canales iónicos en la activación de dichas células

ha sido sugerida por los reportes de despolarización de la membrana,

hiperpolarización, incremento en el flujo iónico a través de la membrana y un

incremento intracelular de calcio después de una estimulación mitogénica

(Chandy et al., 1984). La “decisión” de las células T de ser activadas o no es

crucial: una respuesta inapropiada o exagerada podría provocar enfermedades

autoinmunes mientras que una falla en la respuesta provocaría infección o

incluso muerte (Bronstein-Sitton, 2006).

Por lo general, la respuesta de anticuerpos y las reacciones de inmunidad

celular están dirigidas hacia determinantes antigénicos diferentes. Esto se debe

a que los antígenos no son presentados por las moléculas del MHC de forma

intacta, sino que, como se explica con anterioridad, requieren ser procesados y

presentados en la superficie celular. Una diferencia importante en este

mecanismo de procesamiento y presentación radica en que del origen del

antígeno depende el tipo de respuesta.

4.1 Inducción

Una vez que el complejo TCR/CD3 reconoce el epitope antigénico en

unión con las moléculas del MHC, las moléculas involucradas sufren cambios

bioquímicos importantes (Lanzavecchia y cols, 1999; Penninger y Crabtree.,

1999). Sin embargo, dicho reconocimiento no es suficiente para lograr la

activación total de linfocitos que conduce a la generación de respuestas

biológicas, ya que para iniciar una respuesta inmunitaria se requieren señales

33

coestimuladoras (CD4, CD8, CD2, CD45, y CD28 y sus ligandos respectivos)

(Fig. 6), (Janeway y col., 1999).

Por el contrario, la ausencia de estas señales tras el reconocimiento del

antígeno conduce a la inactivación de los linfocitos T.

Figura 6. Moléculas accesorias que participan en la sinapsis entre linfocitos T y la molécula presentadora de antígeno.

Dentro de las principales moléculas accesorias que contribuyen a

proporcionar las señales coestimuladoras se encuentran, en el caso de los

linfocitos T, algunas moléculas de adhesión, correspondientes a la familia de las

integrinas, tales como LFA-1 y VLA-4, las cuales unen a ICAM (moléculas de

adhesión intracelular) y VCAM-1 (del ingles Vascular cell adhesión molecule)

respectivamente sobre la superficie de las CPA (Dustin y col., 1991); miembros

de la superfamilia de las inmunoglobulinas como la molécula CD28 la cual se

expresa en todos los linfocitos CD4 y aproximadamente en el 50% de los

linfocitos CD8. Los ligandos naturales de la molécula CD28 pertenecen a la

familia B7, ésta molécula es muy importante porque además de su papel en el

proceso de adhesión también participa en el mecanismo de transducción de

34

señales y activación de la célula T. Las moléculas CD2, son moléculas de

adhesión que contribuyen a potenciar la afinidad de unión del linfocito T con la

CPA, sus ligandos naturales son CD58 (LFA-3) y CD45 (ICAM-1).

La tirosina fosfatasa CD45 de los linfocitos T, también ha sido

relacionada con la generación de las señales coestimuladoras. La unión de

todas estas moléculas trae como consecuencia una serie de acontecimientos a

nivel intracelular llamados de manera colectiva activación de los linfocitos T.

Estos cambios se inician con la generación de segundos mensajeros, los cuales

finalmente desencadenan un complejo proceso de señalización que se traduce

desde la membrana plasmática hasta el núcleo, dando lugar a las principales

respuestas biológicas que son: 1) acontecimientos tempranos de transducción

de señales; 2) activación transcripcional de algunos genes; 3) expresión de

nuevas moléculas de superficie; 4) secreción de citoquinas efectoras y/o

desarrollo de funciones citolíticas; 5) inducción de actividad mitogénica (Fig. 7)

(Bronstein-Sitton, 2006; Dustin y col., 2000; LLoyd y col., 1987).

35

Figura 7. Principales vías de señalización en la activación de linfocitos T. Se

aprecia el reconocimiento del epitópe por el TCR lo cual trae como consecuencia una

serie de acontecimientos intracelulares Como la activación transcripcional de algunos

genes, acontecimientos tempranos de transducción de señales y expresión de nuevas

moléculas de superficie así como la activación de algunos canales iónicos. (Bronstein-

Sitton, 2001).

Un acontecimiento intracelular después del reconocimiento de complejo

TCR/CD3, es el incremento en la fosforilación de las cadenas no polimórficas de

la molécula CD3. Estas cadenas tienen dominios intracitoplasmáticos regiones

llamadas ITAM (del ingles Immunoreceptor Tyrosine-based activation Motifs) que

se fosforilan por la acción de tirosinas cinass como c-Lck o c-fyn (Fig.8) (Aguado

y col, 2006; Lovatt y col, 2006; Sugie y col, 2004).

36

Figura 8. Activación de c-Lck y Fyn. Tras el reconocimiento del TCR de la molécula

de antígenos leucocitarios, HLA (del inglés Human Leukocyte Antigen) y péptidos, se

produce la activación de la tirosina cinasas c-Lck y Fyn que fosforilan las cadenas ζ del

CD3.

La tirosina cinasa c-Lck está localizada en la parte intracelular de la

membrana plasmática unida a la bicapa lipídica y la asociación física y funcional

de CD4 y CD8 con el complejo TCR/CD3 provoca que la c-Lck asociada a éstas

moléculas se aproxime a la porción citoplasmática de las proteínas del complejo

CD3 donde puede fosforilar en tirosinas a sus regiones ITAM (Racioppi y cols,

1996; Dustin y Chan 2000; Sugie y cols, 2004), una vez fosforiladas se

convierten en sitios específicos de acoplamiento para la unión de proteínas

citoplasmáticas como la ZAP-70 (Fig. 8 y 9), ésta proteína es muy importante ya

que funciona como acoplador de señales desde la superficie celular hasta el

núcleo por fosforilación de adaptadores como Lat (acoplador para células T) y

una de las consecuencias de su mal funcionamiento o de su ausencia es una

falla en la función de los microtubulos del citoesqueleto por lo que la transmisión

de señales se vería afectada (Goda y cols, 2004; Blanchard 2002; Dustin y

Chan, 2000; Myung y cols, 2000). Los adaptadores para células T como por

ejemplo el adaptador Lat, son proteínas transmembrana con 4 residuos tirosina

37

requeridos para su activación (Y132, Y171, Y191 y Y226) cuya función una vez

fosforilados es organizar complejos multimoleculares en determinados

subdominios lipídicos de la membrana plasmática (Aguado y cols, 2006), estos

complejos contienen proteínas claves en la señalización interior de la célula

como la PLC-γ (Fosfolipasa C- gamma) (Faccetti y col, 1999; Sommers y col.,

2002).

Figura 9. Dominios ITAM de las moléculas ζ del CD3 y como interviene la ZAP70.

La PLC-γ se fosforila en tirosina y se activa dentro de los complejos

multimoleculares lipídicos de la membrana donde se induce la hidrólisis de su

substrato específico, el fosfotidilinositol bifosfato (PIP2) generando los

metabolitos inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DGA) (Bronstein- Sitton, 2001;

Granja y col., 1991).

El metabolito inositol trifosfato IP3 se une a un receptor específico (IP3R) localizado en unas estructuras específicas localizada en el retículo endoplásmico

facilitando la liberación del calcio intracelular. La depleción de las cisternas

internas de calcio activa a los canales CRAC y el flujo de Ca+2 del espacio

38

extracelular a través de estos canales resulta en una despolarización de la

célula.

Como se ha comentado anteriormente, la activación fisiológica de

receptores extracelulares, TCR, originan un incremento de Ca+2 intracelular esto

conduce a la activación de la fosfatasa calcineurina (dependiente de Ca+2 y

calmodulina) que desfosforila al factor nuclear de células T activadas (NFAT), altamente fosforilado en células T en reposo. (Wu y col, 2003)

La translocación al núcleo, el aumento de afinidad para unirse al ADN y la

inducción de la actividad transcripcional de NFAT están regulados por esta

desfosforilación que promueve cambio conformacionales en el factor que

permiten la exposición de sus secuencias de localización nuclear (NLS), y a la

entrada del factor al núcleo. Esta entrada la realiza NFAT acomplejado con la

calcineurina, que mantiene el factor desfosforilado en el núcleo lo que permite la

transcripción de múltiples genes dependientes de NFAT como los que codifican

para citosinas (IL2, IL4, TNF-α, GM.CSF) y receptores de superficie (FasL,

CD40L) todo esto mientras se mantiene las señales de calcio. Cuando el calcio

intracelular desciende, la calcineurina se desactiva y varias cinasas fosforilan al

factor, provocando su exportación al citosol. (Quesada y Redondo, 2003: Wu y

col., 2003).

Por otro lado, la proteína cinasa C (PKC) mostrada en la figura 7 es una

proteína de la familia de isoenzimas ampliamente distribuida en tejidos y órgano

de mamífero. En condiciones de reposo celular se encuentra localizada en el

cistosol donde es inactiva, una vez que recibe el estímulo del DAG se trasloca a

la membrana donde en presencia de fosfolípidos como la fosfatidilserina ejerce

su función de cinasa de proteínas en aminoácidos serina y treonina. Las PKCs

regulan la activación de genes en linfocitos T, mediante el control de varios

factores de transcripción.

39

Las tirosinas cinasas son activadas por la unión del epitope al TCR, esto

no solamente induce hidrólisis de fosfolípidos, también activa vías de

señalización a través de Ras (Fig. 7) mediadas por Lat, el cual, una vez

fosforilado por ZAP70 se une a un adaptador intermediario (Grb-2) acoplándose

a una proteína de intercambio de nucleotidos de guanina (Sos), convirtiendo la

forma inactiva de Ras (Ras-GDP) a su forma activa (Ras-GTP) el cual se une a

C-Raf activandolo, una vez activado actúa como una cinasa de MAPK

(MAPKKK) que a su vez activará y fosforilará una o más MAPKs como a ERK-1

y ERK-2 las cuales después de ser activadas migran al núcleo donde regulan a

determinados factores de transcripción involucrados en la proliferación y

diferenciación celular por ejemplo el complejo API-1 (proteína activadora-1). El

factor de transcripción API-1 está formado por proteínas pertenecientes a las

familias Jun (c-Jun, v-Jun, JunB y JunD), Fos (c-Fos, FosB, Fra1 y Fra2) o ATF

(ATF2 y ATF3). (Wu y col., 2003; Czyzyk y col., 2002).

Otro factor de transcripción es el NF-kB (Factor nuclear de la cadena

Kappa en células B) el cual se encuentra fundamentalmente en todos los tipos

celulares y esta implicado en la activación de multitud de genes en respuesta a

inflamación, infeccion y otras situaciones de stress que requieren una rápida

reprogramación génica. Los complejos de NF-kB se encuentran en el citoplasma

retenidos por moléculas llamadas inhibidores de NF-kB o IkB, dos de las más

estudiadas en linfocitos T son IkB-a e IkB-b que en condiciones de reposo están

unidas a los dimeros de NF-kB. Cuando el linfocito es activado se induce una

cascada de cinasas y proteasas que regulan la degradacion de IkB lo que

provoca la liberación de NF-kB/rel y su traslocación al núcleo (Fig. 7) (Wu y cols,

2003; Czyzyk y cols, 2002).

4.2 Expansión

Uno de los requerimientos mas importantes para que se lleve acabo la

proliferación de los linfocitos T es la presencia de la IL-2 definida como el factor

40

autocrino para dicha población, por lo que la transcripción de este gen es

necesaria para que ocurra la mitosis. De manera correspondiente, la

transcripción del gen para el receptor de IL-2 (IL-2R) es otro de los componentes

del proceso de activación necesario para el crecimiento de los linfocitos T en

respuesta a la IL-2 producida (Solomou y cols., 2001; Fierro y cols 2003). En la

parte 5´ del gen IL-2 se encuentra una región de aproximadamente trescientos

pares de bases que contienen sitios de unión para factores de transcripción

como los descritos anteriormente (NF-kB, API-1, NFAT), la acción conjunta de

estos factores es necesaria para conseguir la activación completa del gen IL-2.

En términos generales, tanto el proceso de inducción o activación como el

de expansión se aplica a todas las poblaciones de linfocitos T, con diferencia de

que las células CD4+ o T colaboradoras proliferan y secretan citosinas, mientras

que las CD8+ o T citotóxicas proliferan y son entonces capaces de ejercer su

activación citotóxica (Hernandez-Ruiz y cols., 2006)(Fig. 1o).

Figura 10. Interacciones celulares que participan en la activación y proliferación de los linfocitos.

41

5. CANALES IÓNICOS EN LOS LINFOCITOS

Los canales son proteínas insertadas en la membrana que permiten el

flujo pasivo de iones bajo sus gradientes electroquímicos. Estos canales tienen

importantes funciones en diversos procesos como la excitación nerviosa y

muscular, secreción hormonal, proliferación celular, aprendizaje y memoria,

regulación de la presión sanguínea, balance de agua y sales, proliferación de

linfocitos, fertilización y muerte celular, también existen canales iónicos

involucrados en las funciones del sistema inmune (Ashcroft, 2006; DeCoursey y

col., 1985; Pardo 2004; Ledoux y col., 2006). Debido a sus importantes

funciones, su localización en membrana, su heterogenicidad estructural y la

restrictiva expresión de algunos tipos de canales en tejidos, los canales iónicos

son blanco atractivo para terapias farmacológicas. De hecho muchas de las

drogas existentes, como anestésicos locales, sedantes, drogas antidiabéticas e

incluso terapias antivirales, ejercen sus efectos interactuando con canales

iónicos. (Ashcroft, 2006; DeCoursey y col., 1985).

En linfocitos T de humano, células que no son eléctricamente excitables,

existen diferentes tipos de canales iónicos, estudios electrofisiológicos en estas

células del sistema inmunológico (Gardner P, 1990; Teisseyre, 2001), han

sugerido que los canales iónicos juegan un papel importante en la respuesta

inmune, quizá por el inicio de una cascada bioquímica de eventos

enzimáticamente controlados. Algunas de las funciones inmunológicas en las

que se encuentran involucrados los canales iónicos son: fagocitosis y activación

de macrófagos y citotoxicidad de linfocitos T y células NK.

Los linfocitos T han sido blanco de numerosos estudios de canales

iónicos debido a que tanto canales de K+ como canales de Ca+2 han sido

caracterizados en linfocitos T y relacionados con su función celular (McCann y

col., 1990) por ejemplo los canales de potasio dependientes de voltaje tienen un

papel importante en su activación. El canal Kv1.3 ha sido claramente

42

demostrado que tienen un papel importante en la proliferación y regulación del

volumen celular (Szabo y col., 2004; Teisseyre A. 2001).

En la siguiente tabla se muestran canales iónicos que han sido

caracterizados en linfocitos T

Tabla 4 Canales iónicos caracterizados en linfocitos T

Nombre Expresión Función Referencia

Kv1.3 Células T de ratón, rata y

Humano.

Celulas T (Jurkat)

Mitocondria de linfocito T

Proliferación celular,

Regulación del

potencial de membrana

en reposo

Pardo, 2004;

Aiyar y cols., 1994;

Beeton y cols, 2001;

Lewis 1995; Cahalan

1991; Gutman, 2005

Deutch y col., 1993

IKCa1 Células T (Jurkat)

Células T de Humano

En el aumento de la

regulación

transcripcional durante

la mitogenesis,

principal regulador de

señales de calcio en la

activación de linfocitos.

Beeton y cols, 2001;

Ghanshani y cols,

2000; Kerschbaum y

cols, 1997

KATP Mitocondria de linfocito T Vincula el estado

energético de la célula

con el potencial de

membrana.

Dhalem y cols, 2004

CRAC Células T de humano

Células T (Jurkat)

Timocitos de rata

Sostenimiento del

influjo de calcio para la

activación de linfocitos

T

Panyi y cols, 2004;

Lewis y Cahalan,

1995; Ross, 1995;

Feske y cols, 2005

Cl- Células T T (Jurkat).

Timocitos de rata

Regulación del

volumen celular

Lewis y cols, 1993;

Lepple- Wienhues,

1998

43

5.1 Canales de potasio

Como se menciona anteriormente, se ha encontrado evidencia de que los

canales de K+ juegan un papel relevante en el control del proceso de

proliferación celular. En general, la inhibición de la función de estos canales da

como resultado un decremento en la proliferación; esto se ha visto en modelos

donde la proliferación es una respuesta fisiológica (como en el caso de los

linfocitos) y en donde hay manifestación de una condición patológica (como en

células cancerosas) (Cahalan y cols, 1991), en el año de 1996 fue publicada

una lista de líneas celulares donde bloqueadores no específicos del canal de K+

como la 4-aminopiridina (4-AP) (Choquet y Korn, 1992), quinidina, y

tetraetilamonio (TEA) tienen efectos antiproliferativos en linfocitos, células de

Schwan, melanoma, cáncer de mama, neuroblastoma y cáncer pulmonar entre

otros (Pardo, 2004).

Por otro lado, cambios en el potencial de membrana y en el volumen

celular son necesarios para la progresión del ciclo celular (Fig. 11) y ambos

requieren la acción de los canales de K+. Si los canales particulares

involucrados en ambos procesos no fueran los mismos, seria concebible que

algunas drogas interfirieran con la proliferación mediante la regulación del

volumen y algunas otras con la interferencia en cambios del potencial de

membrana. (Pardo, 2004).

44

Figura. 11 Relación hipotética entre canales de K+ y proliferación celular. Señales mitogénicas alcanzan a las señales supramoleculares que transfieren la señal

al canal de K tanto porque el canal es una parte física del complejo o indirectamente

por segundos mensajeros. La naturaleza exacta de la activación del canal dependerá

particularmente de ser activados y resultará de la combinación de los efectos en

+

tre el

otencial de membrana y los cambios en la regulación del volumen (Pardo, 2004).

.1.1 Canal Kv1.3

bos lados de

ésta y juegan un papel importante en la activación de linfocitos T.

+

an la respuesta mitogénica en linfocitos ( Aiyar y cols, 1994; Beeton col.,

2001).

p

5

Los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) son aquellos que

controlan el flujo de iones potasio a través de la membrana, y su mecanismo de

acción se basa en la sensibilidad a la diferencia de potencial a am

Pocos tipos de canales de K han sido identificados para una correlación

con la proliferación celular, los casos mas estudiados corresponden al canal

Kv1.3 (KCNA3) (Robbins et al., 2005) y el IKCa1 (KCa3.1. KCNN4), los cuales

gobiern

45

xComo ya se había mencionado los canales Kv1.3 y los canales IKCa1

fueron el primer caso donde hubo un claro ligamiento entre los canales de K+ y

mitogenesis. El canal Kv1.3 es un típico canal 6TM1P (seis segmentos

transmembrana y un asa entre el quinto y el sexto segmento transmembrana). El

canal se aber durante una despolarización aproximada de -40mV, si esta

despolarización es mantenida, el canal se inactiva con una constante de tiempo

de 100-200 msec.

El canal Kv1.3 fue clonado por primera vez en cerebro de rata, donde se

le llamó RCK3, Kv3 o RGK5. Posteriormente se clonó en cerebro de ratón y se

le llamó MK3. Por otro lado este canal también fue clonado en linfocitos T de

ratón, rata y por primera vez en humano al cual se le llamó HGK5 y HLK3. Todos

estos clones codifican para el mismo canal de potasio que, con la nomenclatura

estandarizada, pasó a llamarse Kv1.3. La distribución mayoritaria de esta

proteína es en sistema inmunitario, donde se expresa en linfocitos T, linfocitos B

y microglía (Cahalan et al., 2001), y en sistema nervioso con una localización

restringida al hipocampo, córteza piriforme y el bulbo olfatorio. También se ha

encontrado éste canal en la membrana interna de mitocondria de linfocitos T

(Jurkat) con propiedades que son idénticas a las que presenta éste canal en la

membrana de esta misma línea celular (Rourke., 2007). En linfocitos T se sabe

que el canal Kv1.3 expresa las subunidades auxiliares Kvγ1.1 y Kvγ2.1 las cuales

incrementan su expresión cuando los linfocitos son estimulados con la citosina

proliferativa IL2.

Existen péptidos bloqueadores de Kv1.3 como la margatoxina (MgTX)

(Kerschbaum y col., 1997) y la caribdotoxina (ChTx) que resultan en una

despolarización en las células T. (Koo y col., 1997). Existe evidencia de que la

Genisteina puede afectar la actividad de este canal, recordando que la

Genisteina es un isoflavonoide abundante en algunos vegetales y conocida

como un importante inhibidor específico de la proteína tirosina cinasa (PTK), ha

sido reportada como un agente natural anticáncer, inhibe la proliferación celular

46

y promueve la apoptosis en cáncer de colon en células HT-29; así los canales de

potasio pueden ser considerados un blanco importante en el tratamiento del

cáncer (Teisseyre y Michalak, 2005).

5.1.2 Canales de potasio activados por Ca+2

Los canales de potasio activados por calcio no son tan numerosos como

los canales de potasio dependientes de voltaje y han sido clasificados en tres

diferentes familias en base a la conductancia del canal. Son usualmente

nombrados de alta- (big, BK), intermedia- (IK) (11-35 pS) y pequeña (SK) (2-8

pS) conductancia En linfocitos T están presentes el canal de pequeña

conductancia y el de conductancia intermedia. Farmacológicamente los canales

SK e IK han sido estudiados extensamente, la actividad de ambos puede ser

incrementado por 1-etil-2-benzimidazolinona (1-EBIO) a concentraciones

milimolares.

La estructura de los canales SKCa es muy similar a la de los (Kv) : seis

dominios transmembrana (1-6) y una región P, con terminación N y C

intracelular, además poseen un dominio C-terminal llamado “de union a

calmodulina” (CaMBD), el cual permite al canal interactuar con la calmodulina y

ser regulada por Ca2+. Estos canales presentan una condctancia de 2-8pS, se

encuentran escasamente en linfocitos B, no se encuentran en celulas T de

humano pero son abundantes en celulas Jurkat, este canal es bloqueado por

TEA y apamina. Tanto el canal SkCa como el IKCa son activados por una

concentración de calcio intracelular de 200-400nM

A pesar que el canal IKCa1 no es un canal de K+ dependiente de voltaje,

su rol fisiológico en la proliferación de linfocitos es conceptualmente muy difícil

separarlo del canal Kv1.3, en muchas ocasiones se refieren a ellos en conjunto

(Pardo, 2004). El canal Kv1.3 es abierto en respuesta a una despolarización de

la membrana y mantienen el potencial de reposo, mientras que el canal IKCa1

47

es abierto en respuesta a un incremento de Ca2+ citosólico e hiperpolariza el

potencial de membrana (Aiyar y cols, 1994; Beeton y cols, 2001) por lo que se le

considera un canal dependiente de calcio y parece estar constitutivamente

asociado a calmodulina (aún en la ausencia de Ca2+), y unido a calcio para esta

asociación, la calmodulina induce un cambio conformacional en el canal que

abre las vías de permeación. (Panyi y col., 2004; Ghanshani y col., 2000).

Se ha demostrado que la actividad de los canales de K+ se requiere para

la migración, adhesión, y regulación de volumen en linfocitos T pero el proceso

mejor estudiado donde se requieren éstos canales de K+ es en la activación de

estos linfocitos (Beeton y col., 2001; Pardo, 2004).

El fenómeno de la activación fisiológicamente relevante, lo podemos

observar en el proceso de inmunotolerancia a la placenta donde la progesterona

inhibe a los canales Kv1.3 y al IKCa1 dañando la activación de los linfocitos T y

mientras los niveles de ésta hormona sean altos (en la placenta) y manteniendo

la activación normal de estos canales en el resto del organismo de la madre.

De forma similar, la modulación del canal Kv1.3 por hipoxia podría ser la razón

de los efectos inmunosupresivos del bajo Po2 (Robbins y col., 2005; Pardo,

2004).

Bloqueadores selectivos de Kv1.3, pero no de IKCa1, suprimen la

estimulación por mitógenos, producción de citosinas y la proliferación de células

T en humanos (in vitro), y una respuesta hipersensitiva retardada (in vivo), un

selectivo bloqueo del canal IKCa1 suprime la producción de citosinas y la

mitogénesis de células pre-activadas. (Beeton, 2001).

Es importante mencionar que al hablar de mitógenos nos referimos a

sustancias que estimulan a los linfocitos y a la síntesis de DNA, transformación

blástica y ploriferación. Contrario a la estimulación inmune, los mitógenos

activan de forma policlonal. Hay mitógenos específicos de linfocitos T como

48

concanavalina A y fitohemaglutinina (PHA) (Ghanshani y col., 2000) y otros de

linfocitos B como LPS.

Una particular aplicación terapéutica de estos canales sería en

enfermedades autoinmunitarias, más específicamente en la esclerosis múltiple

(MS) (Beeton et al., 2001) ya que en esta patología se ha mostrado que la

activación de linfocitos conservan un fenotipo “preactivado” (alto Kv1.3, bajo

IKCa1) (Pardo, 2004).

5.1.3 Canales de potasio sensibles a ATP (KATP)

Los canales de K+ sensibles a ATP (KATP), son una familia de

rectificadores entrantes débiles de K+ que se pueden encontrar en diferentes

tipos celulares. Los canales KATP en células pancreáticas β, como otro tipo de

canales KATP descritos en neuronas (Birgit y Jochen., 2001), músculos liso,

cardiaco y esquelético, (Dahlem y cols., 2004; Quayle y cols., 1997) y en

mitocondria de linfocitos T de humano (Szewczyk y col., 2006) son inhibidos por

ATP intracelular (Aguilar-Bryan and Bryan, 1999; Ashcroft., 2005).

Los canales KATP son muy importantes en el acoplamiento del

metabolismo energético celular con la excitabilidad de la membrana de

diferentes tipos celulares, y quizás han sido los canales K+ más extensamente

explorados en términos de su potencial terapéutico (Noma, 1983; Misler y col.,

1986). La actividad de estos canales se reduce por el ATP intracelular y se

incrementa por MgADP.

5.1.3.1 Estructura de los canales KATP

Los canales KATP son estructuras de estequiometria octamerica (SURx/

KIR6.y)4 (Fig. 12) compuestos por cuatro subunidades Kir6.1 (Kir6.1 o Kir6.2)

(Loussouarn y cols, 2000) que forma el poro y cuatro subunidades reguladoras,

49

el receptor a sulfonilureas (SUR1 o SUR2) (Inagaki y col., 1997; Aguilar-Bryan

and Bryan, 1999; Koster y col., 2005; Matsuo y col., 2005). En células-β y

neuronas encontramos canales KATP conformados por SUR1/Kir6.2, en músculo

cardiaco SUR2A/Kir6.2 y SUR2B/Kir6.1 (o Kir6.2) en músculo liso vascular (Isomoto y

cols, 1996; Inagaki y col., 1997; Okuyama y col., 1998; Schwanstecher y cols,

1998; Koster y col., 2005; Song y Ascroft., 2001). La sola expresión de Kir6.1 o

Kir6.2 no forma canales funcionales. (Gribble y col., 1997). Puesto que

mutaciones en Kir6.2 modulan la conductancia de los canales SUR1/ Kir6.2 de

manera característica (Shyng y col., 1997), se concluyó que Kir6.1 o Kir6.2,

respectivamente, representa a la subunidad formadora del poro. Se han usado

dos criterios farmacológicos para definir y clasificar los canales KATP,

generalmente es posible distinguir dos tipos de canales de KATP basados en su

sensibilidad a las sulfonilureas (SUR1 100-1000 veces mas sensibles que SUR2).

De la misma forma, hay diferencias en la respuesta a los KCOs (abridores de

canales de potasio), como por ejemplo, los canales con SUR1 y SUR2B

responden mejor al diazoxido que el SUR2A de los canales cardiacos. Se cree

que los sitios de unión tanto para las sulfonilureas como para los KCOs residen

en el receptor SUR (Aguilar-Bryan y Bryan, 1999; Tucker y col., 1998).

Figura 12. Estructura octamerica del canal de potasio sensible a ATP. El canal consiste de cuatro

subunidades SURx y cuatro Kir6.y

50

5.1.3.2 Receptores sulfonilurea

Los receptores sulfonilureas (SURs) son sensores intracelulares de

ATP/ADP, regulando así la actividad de los canales Kir6.y, además, pertenecen

a la familia de proteínas ABC (Fig. 13) (Tusnády y col., 1997; Aguilar-Bryan y

Bryan, 1999; Matsuo y col., 2005), mas específicamente de la subfamilia ABCC

(ABC8 para SUR1 y ABC9 para SUR2), que se identifican como transportadores

activos de membrana de varios aniones orgánicos y drogas hidrofóbicas

(Tusnády y col., 2006). Esta familia es probablemente el grupo más grande de

proteínas transportadoras selectivas de sustancias a través de las

biomembranas (Higgins, 1995). Un requerimiento estructural mínimo para un

transportador ABC funcional es la presencia de dos dominios transmembranales

TMD1-2 y dos dominios de unión a nucleótidos como el ATP, NBD1-2. En los

seres humanos éstos pueden estar presentes dentro de una cadena

polipéptidica (transportadores completos), o en membrana formando homo o

heterodimeros (transportadores incompletos), con arreglos variables, los cuales

serán definidos por la topología de la membrana (Tusnády y col., 2006). Algunas

proteínas como las MRP1-3, MRP6-7 y SURs, tienen un TMD0 que se conecta

con TMD1 por una asa citoplasmática conocido como L0 (Chan y col., 2003:

Campbell y col., 2003; Babenko y Bryan., 2002). Babenko y Bryan (2003)

demostraron que el dominio L0 de SUR1 (junto con TMD0) modula la compuerta

del canal de K+. Además, Chan y col., (2003) demostraron que la región TMD0

de SUR1, es esencial tanto para el ensamblaje del complejo SUR1/Kir6.2 como

para la modulación de la compuerta y el trafico del canal KATP. Se ha demostrado

que solo los TMDs y no los NBDs son necesarios para la interacción con Kir6.2.

Tusnády y cols, (1997) sugiere que SUR1 esta formada por once segmentos

transmembana antes de NBD1 y seis entre NBD2 y el carboxilo terminal.

51

Figura 13. Estructura del canal KATP. En A se aprecia la subunidad SUR 2 A

con el Kir6.2 presentes en tejido cardiaco y músculo esquelético así como los sitios de

unión a nucleótidos y sus dominios transmembranales TMD. En B se aprecia la

subunidad SUR1 con el Kir6.2 presente en células β pancreáticas y tejido neuronal se

aprecian también los sitios de unión a nucleótidos y sus dominios transmembranales,

se observa la unión de la glibeclamida, compuesto bloqueador de los canales KATP por

lo que el canal esta cerrado (Modificado de Babenko y col., 1999).

Las NBDs catalizan la hidrólisis del ATP, y la energía libre resultante es

utilizada para conducir el substrato a través de un camino específico formado

por TMD1 y TMD2 (Locher y col., 2002; Chan y col., 2003; Matsuo y col., 2005).

La secuencia y estructura de ambos NBD está altamente conservada a través de

todas las proteínas ABC en células eucariontes y procariontes. Cada una

contiene accesorios Walker A y Walker B (WA y WB) altamente conservados y

una unión accesoria intermedia (Aguilar-Bryan y Bryan, 1999; Campbell y col.,

2003). Estudios funcionales en proteínas ABC de eucariontes y bacterias han

proveído evidencia de que ambas NBD de la proteína ABC interactúan

operando como una unidad funcional. Estos estudios soportan un modelo en el

52

cual las NBDs se dimerizan en una conformación ‘nucleotide-sandwich’, esto

porque WA y WB de NBD1 se asocian con la secuencia de union de NBD2 y

viceversa (Locher y col., 2002; Smith y col., 2002; Campbell y col., 2003).

La Tabla 5. Muestra las subunidades conocidas del canal por el tipo de

tejido. Esta clasificación esta basada en un criterio farmacológico .

Receptor Sulfonilurea Rectificador entrante Tejido /subtipo de canal

SUR1 Kir6.1 Kir6.2

?? Células β

pancreáticas/neuronal SUR2A Kir6.1

Kir6.2 ??

Músculo/cardiaco y esquelético

SUR2B Kir6.1 Kir6.2

Músculo liso vascular Músculo liso vascular

Tabla 5. Isoformas del canal KATP (modificado de Matsuo et al., 2005)

5.1.4 Canales mitocondriales de K+ sensibles a ATP Una variedad de vías de transporte de iones en mitocondria han sido

identificados a través de mediciones de fluorescencia en mitocondrias aisladas y

por patch-clamp en mitocondrias aisladas y mitoblastos (Rourke 2007).

Años atrás se realizaron mediciones de corriente del canal KATP en el

interior de la membrana mitocondrial (mitoKATP) en hígado de rata

complementando los canales KATP de membrana plasmática. El canal mtKATP

permite el transporte de potasio dentro de la matriz mitocondrial bajo

condiciones control de ATP intracelular. Estos canales vinculan el estado

energético de la célula con el potencial de membrana. (Dahlem y cols, 2004;

53

Jiang y cols, 2005). Se han encontrado canales mitoKATP en el interior de la

membrana mitocondrial de corazón, cerebro y linfocitos T (Bajgar y cols, 2001).

Los canales mitoKATP son bloqueados por ATP (~10-100µM), ADP, 5-

hidroxidecanoato (5-HD), palmitoil y glibenclamida (Sanguinetti y Salata 1996).

La activación puede llevarse acabo por aplicación de GTP o GDP,

además agentes sintéticos como el diazoxido y la cromakalim fueron

identificados como activadores, donde los canales mitoKATP son 2000 veces

más sensibles al diazoxido que los canales KATP de la membrana plasmática.

(Dhalem y col., 2004, Quast, 1996).

El canal mitoKATP ha sido caracterizado en mitoplastos obtenidos de

cultivos de linfocitos T de humano y se ha demostrado que bajo condiciones

control este canal se encuentra permanentemente abierto con cierres cortos

regulares a frecuencias de 17.7 Hz. La cinética es similar a la del canal mitoKATP

encontrado en hígado de rata y en miocardio bovino y de acuerdo a estos

mismos experimentos realizados por Dahlem y cols, 2004. El ATP no solo

reduce la actividad Po (probabilidad de apertura) de los canales sino que también

modula la frecuencia de ráfagas del canal (Dahlem y col., 2004).

La actividad del canal (mitoKATP) es modulada por varios nucleotidos (Fig. 14).

Recientemente se ha mostrado que los efectos del ATP en el canal KATP puede

ser modulada por Ca+2. (Szewczyk y col., 2006).

54

Figura 14. Reguladores fisiológicos de canales de potasio mitocondriales.

Regulados por ATP (mitoKATP), Canal de calcio de larga conductancia (mitoBKCa) Canal

de potasio voltaje dependiente (mitoKv1.3), especies oxigeno reactivas (ROS), oxido

nítrico (NO). Tomado de Szewczyk y col., 2006; Samavati y col, 2002.

De acuerdo con Szewczyk y cols ( 2006), se tendrá un canal mitoKATP si

las siguientes propiedades farmacológicas están presentes en el registro del

canal de potasio:

(1) El canal tiene que ser bloqueado por ATP/Mg,

(2) La inhibición del canal por ATP/Mg puede ser activado por diazoxido,

(3) El canal puede ser bloqueado por acido 5-hidroxidecanoico (5-HD), como

se menciona anteriormente, una sustancia conocida como bloqueador del

canal mitocondrial,

(4) El canal puede ser bloqueado por glibenclamida,

(5) El bloqueo del canal KATP de la membrana plasmática del tejido cardiaco

por HMR1098 no tendra efecto en la actividad del canal.

55

Dahalem y col. (2004), propusieron un mecanismo hipotético de la

modulación del canal mitoKATP por Ca2+. Este modelo esta basado en las

siguientes afirmaciones (1) el canal mtKATP tiene dos sitios donde Ca2+ y ATP se

unen irreversiblemente, (2) Incremento de la frecuencia de rafagas y la siguiente

reducción de Po es debida a la formación del complejo Cax y ATPy.Ca (x, y

numero de iones unidos, x,y ≥2).

Una vez que la concentración se incrementa sobre un valor umbral, el

Ca2+ puede ser irreversiblemente único al canal mitoKATP. En soluciones que

contienen ATP esto provoca un sitio viable para la formación del complejo ATP-

Cax y causar el bloqueo del canal mitoKATP. Entonces si el canal es expuesto a

ATP y alto Ca+2 (>100µM), existen dos sitios en donde puede ocurrir un

bloqueo.

Sin embargo no se puede excluir la posibilidad de que el ATP-Cax/ATPy-

Ca se una a otros sitios alostéricos del canal mitoKATP y causar cambios

conformacionales e inhibir la actividad del canal (Dahlem y cols, 2004).

En la figura 14 se muestran evidencias experimentales del registro de

este tipo de canales en membrana interna de mitocondria de linfocito.

56

Figura 15. En A Corrientes representativas del canal mitoKATP en linfocitos T

humanos, a varios potenciales de membrana, obtenidas en condiciones simétricas de

K+ (150mM). En B se muestra la curva I/V de un canal rectificador saliente con una

conductancia de 15 y 82 pS a potenciales negativos y positivos respectivamente.

Tomado de Dahlem y col., 2004

57

5.2 Canales CRAC.

El Ca+2 tiene un papel esencial durante el desarrollo y maduración de

linfocitos. En linfocitos T maduros la presentación del antígeno provoca una serie

coordinada de eventos los cuales culminan en la activación y proliferación

celular.

Las etapas tempranas de la activación de los linfocitos T pueden ser

separados en dos eventos: (1) el evento pre- Ca+2 y post- Ca+2. La presentación

del antígeno al receptor se da de 1-100 segundos, en donde ocurrirán los

eventos pre- Ca+2 que incluyen la activación de tirosina cinasa y la generación

de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) (Cahalan y Chandy., 1997; Verheugen , 1998)

provocando, como se menciona anteriormente, la liberación de Ca+2 e

incrementando la concentración intracelular de Ca+2 (Lewis y Cahalan, 1990),

después se necesitaran de minutos a horas para que ocurran los eventos post-

Ca+2 que involucran cambos en la serina/treonina cinasa y actividades fosfatasa,

alteración en el citoesqueleto y actividad de canales iónicos y transcripción de

genes. El incremento de Ca+2 intracelular activa a la fosfatasa calcineurina la

cual desfosforila los factores de transcripción localizados en el citoplasma,

permitiendo que se acumulen en el núcleo uniéndose a elementos promotores

del gen de interleucina 2 (IL2) (Fig. 15). Además de otros eventos paralelos

como la activación de la proteína cinasa C (PKC) y Ras, la transcripción de

genes provoca la proliferación celular (Fig. 7) (Cahalan y Chandy., 1997).

58

Figura 15. Eventos de calcio en linfocitos T. Existe una cascada de

señalización desde el receptor TCR hasta la secreción de IL-2. DAG, diacilglicerol; Em

potencial de membrana plasmática; IP3R receptor a inositol 1,4,5-trifosfato; NF-AT,

factor nuclear de activación de células T; TG, tapsigargina; TK, tirosina cinasa.

En la figura anterior, uno de los eventos post- Ca+2 la calcineurina, es

blanco y el sitio de acción para la inmunosupresión. Desafortunadamente

inhibidores de la calcineurina como la ciclosporina A y FK506 son tóxicos, en

enfermedades renales o del hígado, su uso se ve limitado (Chalan y Chandy,

1997).

Uno de los pasos bioquímicos tempranos en este proceso es la

activación de la fosfolipasa C (PLC)γ generando IP3 el cual como se ilustra en la

figura 7 y 15 , mediante la continua activación del IP3R depleta las cisternas

internas de Ca+2. El resultado de un decremento de Ca+2 en el ER provoca un

59

flujo de Ca+2 por la apertura de una clase de canal de Ca+2 en la membrana

plasmática conocido como canal de liberación de calcio activado por calcio

(CRAC) (Panyi y cols, 2004; Lewis y Cahalan, 1995; Ross, 1995). Sólo la

apertura del canal CRAC en la membrana plasmática permite la entrada de Ca+2

para mantener los niveles altos requeridos en el interior de la célula. Debido a

esta entrada de Ca+2 existe una despolarización de la célula lo cual reduce la

fuerza para entradas futuras de Ca+2, una sostenida entrada de Ca+2 solo puede

lograrse por la participación de canales Kv. En el caso de los linfocitos T es el

canal Kv1.3 localizado en la membrana y el cual se abre en respuesta a la

despolarización de la membrana causada por la entrada de Ca+2. Otro canal

involucrado en la regulación de la entrada de Ca+2 es el IKCa1 pero este canal al

contrario que el Kv 1.3 responderá a un incremento intracelular de Ca+2 y no por

la despolarización de la membrana (Fig. 7 y 15) (Bronstein-Sitton, 2006). La

función de los dos canales de K+ estabiliza el potencial de membrana a un valor

suficientemente negativo adecuando las fuerzas de manejo y manteniendo el

flujo de Ca+2 a través de los canales CRAC. El resultante mantenimiento de

[Ca+2]i elevado, activa vías de transcripción requeridas para la proliferación y

función efectora inmune. El Ca+2 también tiene un papel esencial en el

desarrollo de linfocitos T por la influencia de motilidad y selección positiva de

timocitos (Ross, 1995). Evidencias farmacológicas, electrofisiológicas y

genéticas soportan la noción de que los canales CRAC son la principal vía del

flujo de Ca+2 en el desarrollo y maduración de linfocitos T, y de esta manera,

están relacionados con muchos aspectos del desarrollo y función de los

linfocitos. La importancia de la entrada de Ca+2 para las defensas inmunológicas

del huésped es principal para ayudar a las deficiencias en la activación de

linfocitos T y expresión de genes en pacientes que carecen de esta entrada de

Ca+2. De esta manera se sabe que las propiedades funcionales y moleculares

de los canales CRAC es central para una completa comprensión de la activación

de linfocitos T (Feske y col., 2005).

60

Para finalizar la señal de Ca2+, este ha de volver a sus niveles basales

que son muy bajos en el citosol gracias a la actividad de diversas enzimas

transportadoras de iones. Las ATPasas de Ca2+, presentes en la membrana del

ER (SERCAs del ingles Sarco Endoplasmic Reticylum Calcium ATPase),

bombean Ca2+, hacia el interior de los reservorios, mientras que la ATPasas de

la membrana plasmática (PMCAs del ingles Plasma Membrana calcium ATPase)

y el intercambiador Na+/ Ca2+ llevan el Ca2+ hacia el exterior celular. La TG es

un inhibidor de SERCAs el cual produce vaciamiento de reservorios del ER por

salida pasiva de Ca2+ a favor de gradiente y es potente porque actúa

directamente sobre los mecanismos de regulación de la concentración

intracelular de Ca2+ sin involucrar ningún otro sistema de transducción de señal.

Panyi y col., (2004) muestran evidencia de la relación del canal Kv1.3 y

el canal IKCa1 después de la activación del canal CRAC y la función de estos

canales en la regulación del potencial de membrana (Kv1.3 e IKCA1) y la

señalización de calcio (CRAC) (Fig. 17).

61

Figura 17. Canales iónicos en linfocitos T. En A se muestra la estimulación

del antígeno a través del TCR/CD3 provocando una liberación de Ca2+ del ER vía

PLC/IP3, la depleción de Ca2+ resulta en una despolarización de la membrana. Los

canales Kv1.3 son abiertos por la despolarización y el sobrevenir del flujo de K+

hiperpolariza la membrana. El incremento de concentraciones internas de Ca+2 activa el

canal de K+ activado por calcio de conductancia intermedia (IKCa1). La función de los

dos canales de K+ estabiliza el potencial de membrana a un valor suficientemente

negativo adecuando las fuerzas de manejo y manteniendo el flujo de Ca+2 a través de

los canales CRAC. La señal de Ca+2 es requerida para activar factores nucleares y

estimular la producción d IL-2. En B se muestran corrientes de K+ en una célula T en

reposo. Las corrientes fueron obtenidas por pulsos de prueba de 1s de duración

incrementando el potencial de mantenimiento de -80 mV a +30 mV como se indica en

la figura. Bajo estas condiciones exclusivamente los canales Kv1.3 contribuyen a la

corriente. En C corrientes de K+ en una célula T estimulada por mitógenos. Las

corrientes fueron observadas por rampas de voltaje de 200 ms de -120 a +25mV. La

parte lineal del trazo a voltajes negativos representa corriente voltaje-independiente a

través de canales IKCa1 (la corriente es directamente proporcional al voltaje). La parte

en la que se observa un incremento de corriente en el trazo indica activación de canales

Kv1.3 a voltajes más positivos que -40mV. La pequeña corriente fue registrada en

62

presencia de 10 nM de caribdotoxina, la cual bloquea ambos canales y reduce ambos

omponentes de la corriente. Tomado de Panyi 2004.

incrementada por la edematización resultando en un

eflujo de ambos iones y un eflujo osmoticamente obligado de agua. (Lewis y col.,

1993 ;

tros tejidos, incluidos el ácido stilbene 4-

actemido-4´isotiociano-2,2´ disulfonico (SITS) y el ácido stilbene 4,4´-diis-

otocian

Cl- externo inhibe el flujo de Ca+2 estimulado por

c

5.3 Canales de cloro (Cl-)

La regulación del volumen es un extenso proceso que permite a las

células mantener su volumen en cambios de osmolaridad extracelular. Se han

investigado dos mecanismos de regulación de volumen en linfocitos expuestos a

soluciones hiperosmóticas o hipoosmóticas. Soluciones hiperosmóticas inducen

el eflujo de agua, contracción celular, fosforilación de una variedad de sustratos

celulares y activación de un mecanismo de intercambio de sodio-hidrogeno el

cual resulta en una subsecuente regulación del incremento del volumen (RVI).

Cuando los linfocitos son expuestos a soluciones hipoosmóticas, inicialmente se

edematizan por el agua entrante, pero en un periodo de minutos se contraen de

manera que igualan su volumen normal. Basado en mediciones de volumen

celular, potencial de membrana, y flujo de iones, han mostrado que una

regulación del decremento de volumen (RVD) involucra vías conductivas

separadas para iones de Cl- y K+. La conductancia de la membrana para los

dos iones Cl- y K+ se ve

Ross y col., 1993).

El eflujo de Cl- y el RVD son bloqueados por algunas drogas que

bloquean canales de Cl- en o

o-2,2´-disulfonico (DIDS).

Una función del Cl- en la proliferación de linfocitos se propuso desde que

DIDS o la remoción del

63

anticuerpos que es necesario para la activación del linfocito (Pahapill y Sclichter,

1992; Lewis y col., 1993).

Se ha demostrado que elementos del citoesqueleto participan en la activación de

estos canales. Estudios realizados por Lepple-Winhues (1998), demuestran que

la fosforilación de la tirosina cinasa p56lck activa la corriente de cloro que

dematiza a la célula (ICl-swell) mediando el RVD y que en células deficientes de

p56lck presentaban un defecto en RVD en la activación de la corriente ICl-swell.

demás la retransfección de esta cinasa resulta en una restauración osmótica

e la corriente de activación por lo que se concluyó que el edema osmotico

ctiva la corriente ICl-swell en linfocitos vía tirosina cinasa p56lck.

A

d

a

64

Conclusiones

- La expresión de canales iónicos en linfocitos T juega un papel muy

importante en el control del potencial de membrana y señalización de calcio,

afectan

énica.

- El canal ICa1 se requiere para la migración, adhesión, y regulación de

volume

Los canales CRAC son la principal vía del flujo de Ca+2 en el desarrollo

y mad

función de los linfocitos.

- Los canales iónicos involucrados en la activación de linfocitos T son

lancos para la producción de drogas inmunomoduladoras.

do vías de transducción de señales para la activación de estas células

después de la estimulación antig

- El canal de potasio Kv1.3 tienen un papel importante en la proliferación y

regulación del volumen celular.

n en linfocitos T. El proceso mejor estudiado donde se requieren éstos

canales de K+ es en la activación de los linfocitos.

-

uración de linfocitos T, y de esta manera, están relacionados con muchos

aspectos del desarrollo y

- Los canales mitoKATP vinculan el estado energético de la célula con el

potencial de membrana.

b

65

Pe

la membrana plasmática y las propiedades

biofísicas de este canal, así como su papel fisiológico en la respuesta inmune

y las probables alteraciones originadas por patologías metabólicas, por

ejemplo, la Diabetes Mellitus.

rspectivas

De acuerdo a las funciones de los canales de KATP en diferentes

tejidos, y con la evidencia de la presencia de estos canales en la membrana

mitocondrial de los linfocitos T, se podría efectuar estudios para comprobar la

presencia del canal KATP en

66

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