Cadenas ligeras libres y Bandas oligoclonales en ...
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Cadenas ligeras libres y Bandas oligoclonales en Esclerosis Múltiple David Martín del Pozo. Residente Servicio de Bioquímica Clínica Hospital Puerta de Hierro 23 de Abril de 2013
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Cadenas ligeras libres y
Bandas oligoclonales en
Esclerosis Múltiple
David Martín del Pozo. Residente
Servicio de Bioquímica Clínica
Hospital Puerta de Hierro
23 de Abril de 2013
ESCLEROSIS MÚLTIPLE • Enfermedad inflamatoria
desmielinizante degenerativa
del SNC crónica.
• Etiopatogenia:
• Autoinmunidad
• Hipótesis víricas
• Factores genéticos
• Factores ambientales
•
INFLAMACIÓN
DESMIELINIZACIÓN GLIOSIS
FORMAS CLÍNICAS
Recidivante/remitente (RR) (mayoritaria):
Primariamente progresiva:
deterioro mantenido y creciente,
desde el principio (sin brotes)
Secundariamente progresiva
Formas RR, que experimentan
con el tiempo deterioro
mantenido, con o sin brotes
Progresiva recurrente: Brotes de
enfermedad con recuperación completa
con o sin secuelas, con progresión
entre las recaídas
Hay que destacar que puede haber solapamiento de las formas clínicas entre sí
Escalada terapéutica
SDA/EMRR Estable Brotes leves Brotes persistentes Brotes graves de inicio No respuesta a lo anterior EDSS sin cambios Aumento EDSS /RMN
Tto 1ª línea Aumento dosis IFN Cambio a 2ª línea Fingolimod Rituximab IFN IFN AG Fingolimod Natalizumab Alentuzumab AG AG IFN Natalizumab Mitoxantrona Ciclofosfamida TMO
Servicio de Neurología, HUPH
Sensible pero inespecífica.
Permite determinar la extensión de
las lesiones. Diseminación de
lesiones anatómicas por todo el
espacio del SNC (cerebro, tronco,
periventricular, médula y nervio
óptico).
Discrimina: Aguda vs Crónica.
Diagnóstico
CLINICA LCR
RMN
Potenciales Evocados
Registros de potenciales. eléctricos que
se generan en el SNC tras la
estimulación de un órgano sensitivo
periférico.
Debut: 20-40 años.
Síntomas motores,
sensitivos, cognitivos.
Fatiga, debilidad y neuritis
óptica y esfínteres.
•Refleja el
contenido del
espacio
extracelular del
SNC
•Bioquímica:
recuento celular,
glucosa y
proteínas, Igs,
albúmina (Alb)
Inmunoglobulinas (Igs) en LCR
• Cuantificación de los niveles de Igs en
LCR=>nefelometría
• En condiciones normales las células plasmáticas no
están presentes en el SNC y la concentración de Igs en
LCR depende de su paso desde la sangre a través de
la barrera hematoencefálica (BHE). El índice de Igs
establece la relación de concentraciones entre ambos
compartimentos
• Índice Ig G = IgG LCR / Ig G SUERO
• Índice Albúmina= Alb LCR x 1000/Alb suero
Se recomienda el uso del cociente Alb LCR/ Alb suero
para evaluar disfunción de la BHE.
Arch Neurol. 2005;62:865-870
Los niveles de Igs en LCR pueden
incrementarse como consecuencia de:
- Aumento de los niveles séricos de Igs.
- Alteración de la permeabilidad de la BHE
- Síntesis intratecal de Igs (SIT).
En la EM (proceso inflamatorio) debido a la presencia en el SNC de un pequeño número de clones de células plasmáticas se produce síntesis intratecal de Igs oligoclonales.
Valoración de la Síntesis intratecal de IgG:
1. Índices:
• Índice de link: índice de IgG/índice de albúmina (<0.69)
• Indice de Reiber:
{IgGLCR /IgGs -[0,8 x [(AlbLCR /Albs)2 + 15x10-6]1/2-18x10-4 ]} x IgGs
• Indice de Schuller:
IgGLCR - {30 + [[(AlbLCR - 240)/60 ] x [IgGs]]} > 240 mg/l
• Fórmula de Tourtelotte > 8 mg/día (3´5 mg/d)
0´5 l/día x (Ig GLCR – Ig Gs/369) – (AlbLCR – Albs/230) x (Ig Gs/
Albs) x 0´43(0´215)
2. Análisis cualitativo de bandas oligloconales (BOC).
SEQC Rodríguez Segade 2006; Richard 2002
Análisis cualitativo de Igs en LCR:
Bandas Oligoclonales (BOC)
La caracterización de las Igs del LCR se puede
realizar mediante diversas técnicas:
(a) Electroforesis en gel
(b) Isoelectoenfoque
La presencia de Igs
oligoclonales se
evidencia por la aparición
de diversas bandas bien
definidas tras separación
electroforética o por
isoelectroenfoque (BOC).
a) Electroforesis en gel.
El principio supone la separación de proteínas (IgG's) por electroforesis (pH
constante) en gel de agarosa, seguida de una transferencia a una
membrana de nitrocelulosa y posterior detección de las Igs separadas.
IFPOD Inmunofijación con Peroxidasa automatizada
HRAGE Electroforesis en Gel Agarosa de alta resolución
IFE Electroforesis por Inmunofijación
IFPOD usa HRAGE + IFPOD anti - Ig G antisuero para detectar Ig OC en
LCR
COMPARACIÓN DE
DOS PACIENTES
CON LAS TRES
TÉCNICAS
Izquierda: HRAGE
Centro: IFE
Derecha: IFPOD
Richard et al., 2002
Es un tipo de electroforesis
en gel de agarosa en la que
la separación tiene lugar en
presencia de un gradiente de
pH (continuo, lineal y
estable).
A
N
O
D
O
+
+
+
+
+
+
+
+
+
_
_
_
_
_
_
_
_
_
C
Á
T
O
D
O
Incremento de pH
pI = 8.6 pI = 6.4 pI = 5.1
b) Isoelectroenfoque
En estas
condiciones cada
proteína migrará
hasta su punto
isoeléctrico.
Identificación de bandas oligoclonales en LCR
mediante isoelectroenfoque e inmunodetección.
Es el método más sensible para la detección de BOC en
LCR.
Freedman et al. (2005) publicaron una declaración de consenso acerca del
análisis del LCR para el diagnóstico de EM, recomendando la detección de
las BOCs en el LCR de los pacientes con sospecha, como “gold standard”
con excelente sensibilidad (>95%) y especificidad.
Es importante realizar el procedimiento “en paralelo”, en una muestra de
suero y de LCR. La muestra de sangre debe tomarse al mismo tiempo que
la punción lumbar.
El suero debe diluirse con el fin de aplicar la misma cantidad de Igs que la
muestra pareada de LCR.
Es conveniente el uso de controles internos positivos y negativos en cada
ensayo y control de calidad externo.
Detección de bandas oligoclonales en LCR
mediante isoelectroenfoque e inmunodetección.
Tras la separación de las BOC por isoelectroenfoque se procede a la identificación del patrón de Igs mediante incubación con anticuerpos específicos frente a la inmunoglobulina en estudio:
Inicialmente se puso a punto el ensayo para determinar la presencia de BOC IgG (criterio diagnóstico)
Posteriormente se puso a punto la técnica para BOC IgM (criterio pronóstico).
El “revelado” se puede hacer mediante:
- Anticuerpos anti-IgG o anti-IgM marcados con peroxidasa (Keir et al., 1990)
- Inmunofijación (Fromonst et al., 2005)
- Anticuerpos anti-IgG o anti-IgM marcados con fosfatasa alcalina (Sádaba et al., 2004)
Patrones característicos:
1.- Negativo: Ausencia de bandas en LCR y suero.
2.- Negativo: Espejo: Bandas similares en suero y LCR
3.- Positivo: “Mas que”: más BOC en LCR que suero
4.- Positivo: Bandas solo en LCR, no en suero
BOC IgM BOC IgG
I II III IV
Isoelectroenfoque
Bandas oligoclonales presentes
en LCR y ausentes en suero.
Síntesis intratecal de Igs
(como sucede en la EM)
Detección de bandas oligoclonales en LCR por
isoelectroenfoque: Patrones positivos
S = Suero. C = LCR.
Freedman 2005
University of Birmingham 2013
ánodo
Detección de bandas oligoclonales en LCR por
isoelectroenfoque: Patrones positivos
Patrón “más qué”: Bandas
idénticas en suero y LCR
con bandas extra en LCR.
Demuestra tanto síntesis
intratecal como sistémica de
IgG.
(También se ven in EM).
Freedman 2005
University of Birmingham 2013
ánodo
Ausencia de bandas oligoclonales
en LCR y suero:
No síntesis intratecal de IgG.
S = Suero. C = LCR. El número representa
la posición del ánodo.
Freedman 2005
University of Birmingham 2013
Detección de bandas oligoclonales en LCR por
isoelectroenfoque: Patrones negativos
ánodo
Detección de bandas oligoclonales en LCR por
isoelectroenfoque: Patrones negativos
Perfil “en espejo”: Aparecen bandas comparables en suero y
LCR. Sugiere síntesis sistémica de Igs.
Freedman 2005
University of Birmingham 2013
ánodo ánodo
Detección de bandas oligoclonales (BOC) en LCR:
Freedman 2005
La presencia de BOC en LCR indica respuesta inmune en SNC y es
compatible con diagnóstico de EM en pacientes con sospecha clínica.
La aparición de BOCs aisladas no tienen significado (otros procesos).
No correlación BOC en LCR y procesos desmielinizantes.
BOC pueden estar presentes incluso cuando el nivel de IgG en LCR es
normal.
Una respuesta oligoclonal puede perdurar durante toda la vida (excepto en
infecciones del SNC).
Los patrones importantes en EM son los que demuestran "síntesis
intratecal de Igs.
≥ 2 BOC en LCR ausentes en suero sugieren síntesis intratecal de Ig G.
Informe de
resultados (HUPH)
Indice Ig G = 0´9
Indice Ig M = 0´59
BOC Ig G (+) en LCR
BOC Ig M (+) en LCR
Cadenas ligeras de inmunoglobulinas libres
(CLL) en LCR
Control EM Otros trastornos
neurológicos Índice CLLk LCR/CLLk suero vs.
Índice de Albúmina
Se han podido determinar las concentraciones de CLL kappa y lambda en
LCR: Nefelometría.
La determinación en LCR y suero permite calcular el correspondiente
índice.
Fischer et al., 2004
En pacientes con EM las concentraciones de CLLk en LCR fueron
significativamente mayores que en grupo control (cut-off CLLk=0.5 mg/l).
Niveles elevados de CLL Kappa en LCR predicen
conversión de Síndrome Clínico Aislado (SCA) a EM
Villar et al., 2012
Respecto a los niveles de CLLk en LCR:
En los pacientes con SCA (sugestivo de
inflamación desmielinizante) se pueden
diferenciar dos grupos:
SCA1: Con niveles comparables al grupo
control.
SCA2: niveles significativamente más
elevados que el control.
El seguimiento de este grupo de pacientes
(Análisis Kaplan-Meier) demostró que la
probabilidad de mantenerse como SCA es
más alta en pacientes con bajo nivel de
CLLk en LCR (SAC2>0.53 mg/l alto
riesgo de desarrollar EM; SAC1<0´53
bajo riesgo).
SCA: cuadro unifocal de neuritis óptica, lesión tronco-cerebelosa o mielitis que aparece por primera vez).
Control: ENNI: Enfermedad neurológica no inflamatoria
SCA 2 SCA 1 control
Otros posibles marcadores:
Hevylite® Ac BOC Ig G k/λ en LCR y suero
Recientemente se han desarrollado anticuerpos específicos anti-IgGk y
anti-IgGλ que se han utilizando para analizar las BOC IgG pudiendo
discriminar entre BOC IgG k e IgGλ
Zeman et al., 2012
