bronquitis infecciosa

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La bronquitis infecciosa aviar (BI) es unaenfermedad respiratoria altamente contagiosade los pollos (Cavanagh y Naqui, 1997) y seconsidera una de las enfermedades viralesmás importantes de los pollos de difícil control,debido a la existencia de diferentes serotiposy variantes antigénicas del virus causal (Wanget al, 1997; Gelb y Jackwood, 2000).La bronquitis infecciosa se caracteriza porestertores traqueales, coriza y estornudos en

las aves más jóvenes mientras que en lasponedoras la sintomatología respiratoria esmenor pero provoca una disminución marcadaen la producción y calidad del huevo, esproducida por un virus del género Coronavirusde la familia Coronaviridae (Cavanagh y Naqui,1997). La importancia económica de estaenfermedad se manifiesta porque los pollosinfectados tienen una pobre ganancia de pesoy una rápida declinación en la producción y

Bronquitis Infecciosa Aviar: obtención deantígeno y detección de anticuerpos por

inhibición de la hemoaglutinación

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calidad de los huevos (Song et al., 1998).El control de la enfermedad se lleva a cabopor la vacunación con vacunas vivas einactivadas (Cavanagh y Naqui, 1997). Elmonitoreo de la respuesta de anticuerpos esde gran importancia para evaluar losprogramas de vacunación, y se empleandiferentes pruebas serológicas. Las pruebasserológicas como la sueroneutralización, laagar gel precipitación, la inhibición de lahemoaglutinación (IHA) y la pruebainmunoenzimática (ELISA) son utilizadas coneste fin (de Witt et al.,1997). La suero-neutralización y la IHA son utilizadas de formarutinaria para revelar anticuerpos tempra-namente en la infección o vacunación(Cavanagh y Naqi,1997) y en la diferenciaciónantigénica de las cepas de IB donde se hanpodido revelar variantes antigénicas porreacción cruzada (Capua et al., 1994).Mientras que el ensayo inmunoenzimático(ELISA) se aplica para determinar los perfilesserológicos de poblaciones de avesvacunadas (De Witt et al., 1992; Cuello et al.,2001).

Virus. La cepa M41 de este virus (SPAFAS),multiplicada en embrión de pollo y con títuloinfectivo de 10 6.5 DIEP

50 / ml (dosis infectiva

en embrión de pollo).

Titulación viral. Se realizó en EP y dilucionesde 10-1 - 10-8 y por vía de la cavidad alantoidea(CA) y colocados en incubación a 370 Cdurante 7 días para observar las lesionescaracterísticas que produce este virus (Gelb,1998) y el título infectivo en DIEP

50 fue

calculado por el método de Spearman-Kärberg(Finney, 1964).

Obtención del antígeno. Para la obtencióndel antígeno se inocularon EP con la cepaM41 en la dilución de 104,62 DIEP50

en volumende 100 ì por vía de la CA y se incubaron a 370

C por 30 y 48 horas (King et al, 1988) y ellíquido alantoideo fue colectado a ese tiempo.Se dejaron embriones inoculados hasta 7 díaspara verificar la multiplicación viral con laobservación de los cambios morfopatológicosproducidos por este virus (Gelb y Jackwood,

1998).

El líquido alantoideo fue clarificado por cen-trifugación a 3 000 g durante 30 minutos, laconcentración viral se realizó por ultra-centrifugación a 20 000 g 2 horas a 40C, elprecipitado fue tratado con el filtrado crudode C. perfringens por método referido en elManual OIE (2000). Se prepararon cinco loteslos que se evaluaron por título HA y seconservaron a 40C.

Título hemoaglutinante. Se realizó enmicroplacas de 96 pocillos de fondo en U yen volumen de 25 µL de los reactantes, lasdiluciones de los antígenos en log

2 (1:2 hasta

1:2048), en tampón fosfato salino pH7,4, tresréplicas log

2. Se agrega la suspensión de

glóbulos al 0,5% y 0,7%; se esperan 30 – 45minutos hasta que se observe la precipitaciónde los glóbulos rojos en los pocillos controles(Gelb y Jackwood, 1998).

Sueros. Como suero de referencia se utilizóun antisuero específico contra la cepa M41del virus BIA como control negativo gentilmentedonados por la Dra. Ilaria Capua (InstitutoZooprofilactico y Experimental de Padova,Italia) y suero de pollos libre de patógenos

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En Cuba, la bronquitis infecciosa se hainformado asociada a la forma respiratoriacrónica (Guilarte et al, 1985) y se haempleado la hemoaglutinación pasiva (HAP)para la detección de anticuerpos enpoblaciones de pollos afectados, pero lamisma es de baja sensibilidad y sólo revelala respuesta a infecciones recientes, lo cuallimita su uso en la evaluación de la respuestaa las vacunas y la inmunidad materna. Por elcontrario la IHA se utiliza extensivamentetanto para el diagnóstico serológico (Gutierrez-Ruiz, et al., 2000), como para diferenciaciónde serotipos y cepas variantes del virus de laBIA (King, 1988; Parsons et al., 1992) y esde utilidad en la detección de coronavirus depavos (Capua et al., 1994). Por lo que elpresente trabajo tiene como objetivo laobtención y evaluación de un antígeno parasu utilización en la detección de anticuerposa BIA por la técnica de IHA, que permitaincorporarla al desarrollo del diagnóstico deesta enfermedad.

Embriones de pollo. Se utilizan embrionesde pollo (EP) de la raza White Leghorn librede patógenos específicos (LPE), de 10 dìas

de desarrollo procedentes de la unidad deaislamiento del CENPALAB, para multiplicary titular el virus de la BIA.

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MATERIALES Y MÉTODOS

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específicos (LPE) Antisueros contra otrosvirus aviares hemoaglutinantes como el virusde la enfermedad de Newcastle (EN) y el virusdel síndrome de la caída de la puesta (SCP)para la prueba de especificidad, los queproceden del mismo laboratorio. Los suerospara la evaluación del antígeno proceden depollos White Leghorn con diferentes edadesy tiempos postvacunación evaluadospreviamente por IHA y por ELISA comercialcomo panel se sueros.Antígeno de referencia. Se emplea unantígeno de la cepa M41 gentilmente donadospor la Dra. Ilaria Capua del Instituto Zooprofilac-tico y Experimental de Padova (Centro de refe-rencia de Diagnóstico de EnfermedadesEmergentes de las Aves de Italia).Inhibición de la hemoaglutinación (IHA).Para la evaluación del título de anticuerposen los sueros se empleó la técnica de IHAdescrita para el virus BIA (Alexander y Chettle,1977), para lo cual se realizaron dilucionesseriadas de log de base 2 de los sueros(previamente inactivados a 56 °C durante 30minutos) desde 1:2 hasta 1:2048, en tampónfosfato salino y volumen de 25 µL y empleode 4UHA (Gelb y Jackwood, 1998).

Especificidad y sensibilidad. Se determinóla especificidad de tres lotes de antígeno frentea los antisueros de virus hemoaglutinantescomparado con el antígeno de referencia citadoanteriormente por la prueba de IHA. Lasensibilidad y especificidad diagnóstica (SDy ED), la eficacia (C) y el valor kappa (κ), conun panel de 172 muestras de suerospreviamente evaluados por el antígeno dereferencia (arriba señalado) y un ELISAcomercial (KPL) (Cuello, 2001).

Análisis estadístico. Las medias geométricasde la respuesta de anticuerpos por ANOVA.Las diferencias entre ambas comparacionesse determinaron con un nivel de significaciónde p<0.01 mediante la Dócima de Duncan(1955).

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tulos infectivos en el líquido al antoideo a las48 horas PI cuando se inocularon con 104,62

DIEP50

. Este tiempo PI es considerado el óp-timo debido a que se obtienen los mayorestítulos virales, aspecto que fue evaluado porKing (1988) con varias cepas de este virusentre ellas la M41, con excepción de la cepaH52 que mostró un título superior a las 30 ho-ras PI. Otros estudios en este sentido rela-cionan también la producción de mayorestítulos infectivos con la concentración del inó-culo y la temperatura de incubación de losembriones (King y Cavanagh, 1991) y no reco-miendan inocular dosis mayores pues oca-sionan mortalidad temprana del embrión ymenor título infectivo.Los embriones dejados en incubación durante7 días, como control de la replicación de estevirus, presentaron mortalidad entre 2-6 díasPI con disminución del crecimiento,enrollamiento con consistencia gomosa delembrión, malformaciones de las patas yenrojecimiento, alteraciones característicasde este virus (King y Cavanagh, 1991; Gelb yJackwood, 1998) y lo que permite utilizarlocomo control de multiplicación viral en el LA(biomasa viral) para la obtención de antígenoHA de BIA. El título viral del líquido alantoideopara la obtención de los antígenos fue de 106,6

DICT50

/ ml determinado tanto por mortalidadembrionaria como por la presencia de lasalteraciones antes descritas.Los resultados del título hemoaglutinante (HA)de los antígenos obtenidos según el métodoreferido en el Manual OIE (2000) donde seemplea como fuente de la fosfolipasa C unfiltrado crudo de un cultivo de Clostridiumperfringens en lugar de la enzima comercial;se muestran en la tabla 1. Se puede observarque los lotes 1, 2 y 4 presentaron títulos de1:256, mientras que el lote 3 y 5 fue de 1:512similar al antígeno de referencia. Para losantígenos a utilizar en la prueba de inhibiciónde la hemoaglutinación, los títulos superioresa 1:128 se consideran adecuados y en todoslos lotes estos fueron superiores, resultadossimilares fueron obtenidos por King (1988) conesta misma cepa, pero aplicando eltratamiento con la fosfolipasa C comercial.Por lo que el empleo del filtrado crudo de C.perfringens muestra su utilidad para laobtención de antígeno hemoaglutinante del

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La prueba de IHA para el diagnóstico seroló-gico de la BI se ha aplicado por diferentesprocedimientos (King, 1988). En este trabajose utilizó la cepa M4 1 obtenida en embriónde pollo (EP) y se obtuvieron los mayores tí-

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virus BIA ya que además de fosfolipasa Ccontiene la enzima neuroaminidasa, la cualse considera más efectiva en remover losresiduos del ácido siálico de la glucoproteínapresente en las espículas de la envoltura del������ �� '� �%���� ����%�4�.���� � �%������2�� �%��3� ��%�������;�� � ���%��� ����% �.����� �� ��� ����� ��� ��3��� ��

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virus y que posee la actividad hemoaglutinantede este virus.(Schultze et al., 1992).En la prueba de especificidad analítica sereveló reacción de todos los lotes de antígenocon el antisuero de BI con título IHA de 1:128,con igual reacción que el antígeno dereferencia utilizado como control positivo y nose produjo reacción con el suero negativo(Tabla 2). Sólo se observó reacción frente al

antisuero de la EN pero con título de 1:8, yaque en sueros de aves pueden ocurrirreacciones de IHA las que no son específicasaún con títulos de 1:16 y se considerannegativas (Munner et al,1987).La evaluación con el panel de sueros nega-tivos y positivos comparado con el antígenode referencia reveló una sensibilidad de 96.2%y especificidad de 95.7%, la eficacia de 95.9y un κ=0.88, resultados muy favorables(Jacobson, 1998). También se puede apreciarque en cuanto a los reactores positivos y noreactores los resultados fueron muy similares(Tabla 3).

En cuanto a los títulos de anticuerpos, lospollitos de un día de edad presentaronreacciones positivas ≥1:16 y sólo 3 resul-taron negativos y se corresponden conanticuerpos pasivos transferidos a la progenieya que provienen de reproductoras vacunadas,las vacunas inactivadas oleosas aplicadasantes del comienzo de postura provocan engeneral la inducción de altos y prolongadosniveles de anticuerpos (Glisson y Kleven,1991). La presencia de estos niveles altos deanticuerpos es de gran importancia ya queson capaces de proteger los pollitos contralas infecciones tempranas con virus devirulentos (Naqi et al., 2003).y reducir lasaplicación al día de edad de las vacunas vivasel virus BIA (Cook,J.K.L et al ,1991). En lasponedoras por el contrario se detectaron sólocinco reactores positivos con títulos ≥1:16,

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con título de 1:8, los que se consideran nega-tivos (Alexander y Chettle, 1977; Munner etal, 1987), aspecto que también fue deter-minado por Toro et al. (2002) al utilizar la IHAcon antígeno de la cepa M41 y dos cepasvariantes antigénicas de este virus en unaencuesta serológica, donde consideraron 4 a5 log

2 de los títulos IHA como positivos a fin

de garantizar la especificidad de esta prueba;el resto de los sueros no reaccionaron. La

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presencia de sólo cinco aves con reacciónpositiva en el grupo de las ponedoras aúncuando recibieron tres vacunaciones de lavacuna viva (Tabla 4), sugiere una baja pro-tección de estas aves y pueden ser sus-ceptibles a la infección, pues se consideraque los niveles de anticuerpos en esta cate-goría de aves con 3 vacunaciones aplicadasdeben ser superiores a 1:80 (Ibarra et al,1993.) Estos autores recomiendan tìtulos de13:20 de IHA antes de comenzar la posturapara evitar pérdidas significativas en la pro-ducción ya que se ha informado una corre-lación entre los títulos de IHA y la resistenciacontra VBI homólogo (Cavanagh, D. y Naqi,S.A. (1997), es decir cepas semejantes a lasvacunales.

La utilidad de la técnica de IHA para laevaluación de vacunas se ha referido estarsustentada sobre la base de que la actividadhemoaglutinante está en la proteína S1inductora también de anticuerpos neutralizantes

(Koch et al, 1992; Ignjatovic, J. y Galli, L.,1995).También se aplica en el diagnóstico de laenfermedad que permite relacionar losresultados sero-lógicos con problemasrespiratorios en aves no vacunadas (Gutierrez-Ruiz, et al., 2000). Los resultados que seobtuvieron con el an-tígeno de IHA producidodemuestran sus condiciones para revelaranticuerpos inhi-bidores de la

hemoaglutinación según lo descrito para larealización de esta prueba en el manual OIE(2000) para el diagnóstico serológico. Ademásse evidenció, en la ca-tegoría de ponedorasdonde se produjo reac-ción positiva en pocasaves y con niveles muy bajos de losanticuerpos lo cual sugiere una pobreprotección contra esta enfermedad yrepresenta un alerta de la necesidad de re-vacunaciones de estas aves en producción.

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Poultry infectious bronchitis: obtaining anantigen and detecting antibodies by hemoaglutination inhibition

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