Bradford HCL-2015
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Determinación de proteínas Método de Bradford modificado a microplaca Principio Es un método colorimétrico que consiste en medición de la unión del colorante Azul de Coomassie G-250 a la proteína en una solución ácida. El colorante en presencia de proteínas pasa de rojo a azul formando un complejo coloreado que tiene un máximo de absorción de 595 nm (la absorción es directamente proporcional a la concentración). La estimación de la concentración de proteínas en la muestra desconocida se hace a través de una curva de calibración, la cual está construida con diferentes concentraciones de Albúmina de Suero Bovino (BSA). Materiales Reactivos Accesorios Equipos •Reactivo de Bradford 1x •BSA (2 mg mL -1 ) •Solución de dilución •Agua destilada •Tubos de 0.5 mL •Microplaca de 96 fondo plano •Puntas •Reservorios de reactivos •Micropipeta •Pipeta multicanal o pipeta de repetición •Lector espectrofotométrico de microplacas Procedimiento Antes de comenzar permita que los reactivos alcancen la temperatura ambiente. 1 Curva de calibración: Prepare las siguientes concentraciones de BSA 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5 mg mL -1 : En cinco tubos Eppendorf de 0.5 mL añada 5, 10, 15, 20 y 25 μL de BSA (2 mg mL -1 ), complete a 100 μL con solución de dilución y mezcle moderadamente. Blanco: solución de dilución. 2 En los pocillos correspondientes de la microplaca añada 10 μL de blanco, calibradores y muestras por triplicado. 3 Encienda el lector de microplacas. Use una pipeta multicanal y añada 200 μL del reactivo de Bradford e incube la reacción a temperatura ambiente por 5 minutos. 4 Durante el periodo de incubación diseñe la respectiva plantilla en el software del equipo. B: blanco; calibradores: 0.1-0.5; Muestras: 1-10. 5 Después del periodo de incubación mida la absorbancia a (A595), en un plazo no mayor de 10 minutos.
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Método para determinar proteinas
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Determinación de proteínas
Método de Bradford modificado a microplaca
Principio
Es un método colorimétrico que consiste en medición de la unión del colorante Azul de Coomassie G-250 a la
proteína en una solución ácida. El colorante en presencia de proteínas pasa de rojo a azul formando un complejo
coloreado que tiene un máximo de absorción de 595 nm (la absorción es directamente proporcional a la concentración).
La estimación de la concentración de proteínas en la muestra desconocida se hace a través de una curva de calibración,
la cual está construida con diferentes concentraciones de Albúmina de Suero Bovino (BSA).
Materiales
Reactivos Accesorios Equipos
•Reactivo de Bradford 1x
•BSA (2 mg mL-1)
•Solución de dilución
•Agua destilada
•Tubos de 0.5 mL
•Microplaca de 96 fondo plano
•Puntas
•Reservorios de reactivos
•Micropipeta
•Pipeta multicanal o pipeta de repetición
•Lector espectrofotométrico de
microplacas
Procedimiento Antes de comenzar permita que los reactivos alcancen la temperatura ambiente.
1 Curva de calibración: Prepare las siguientes concentraciones de BSA 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5 mg mL-1:
En cinco tubos Eppendorf de 0.5 mL añada 5, 10, 15, 20 y 25 µL de BSA (2 mg mL-1), complete a 100 µL con solución
de dilución y mezcle moderadamente.
Blanco: solución de dilución.
2 En los pocillos correspondientes de la microplaca
añada 10 µL de blanco, calibradores y muestras por
triplicado.
3 Encienda el lector de microplacas.
Use una pipeta multicanal y añada 200 µL del reactivo de
Bradford e incube la reacción a temperatura ambiente por 5
minutos.
4 Durante el periodo de incubación diseñe la respectiva
plantilla en el software del equipo. B: blanco;
calibradores: 0.1-0.5; Muestras: 1-10.
5 Después del periodo de incubación mida la absorbancia a
(A595), en un plazo no mayor de 10 minutos.
Precauciones
Si la concentración es muy alta (fuera dela curva estándar), diluya la muestra.
La utilización de detergentes (Triton X-100, SDS) en esta técnica puede originar resultados erróneos.
Los tiempos de incubación y temperaturas diferentes a las indicadas pueden originar resultados erróneos.
Añadir las muestras y los calibradores de forma precisa.
El almacenamiento de las muestras de forma apropiada es esenciales para la obtención de resultados precisos, por lo
tanto, evite ciclos de congelación-descongelación.
El reactivo utilizado es fotosensible por lo que se debe evitar la exposición prolongada a la luz directa.
Referencia Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of micro-gram quantities of protein utilizing the principle of
protein dye binding. Anal. Biochem., 72:248-254.
La información descrita en el presente documento
es producto de diversos análisis en muestras de
invertebrados y vertebrados marinos. Los usuarios
deben determinar sí esté método es apropiado
para su muestra.
© 2010 Honorio Cruz-López
Figura 1. Ejemplo de la curva de calibración. Esta curva no
debe ser utilizada (use la curva de calibración de tiempo real).
6 Absorbancia corregida: calcule el promedio de
absorbancia para cada prueba, reste promedio de
absorbancia del blanco a la curva estándar y muestras.
Curva de calibración: grafique la absorbancia frente a
las concentraciones conocidas de los calibradores y
determine la concentración de proteína en las muestras
(análisis de regresión lineal) Fig. 1. Si la muestra se
diluyo multiplique el resultado por el factor de dilución.
La curva generada debe cumplir los criterios de
validación estadístico.
Ejemplo del cálculo:
Pocillo Identidad A595 M-BCO mg mL-1
A1-3 BCO 0.373 - -
G1-3 M1 0.750 0.377 2.2
H1-3 M2 0.961 0.588 3.9
Nota: las muestras fueron diluidas 1:10. Muestras (M1, M2)
