Crditos.

Editora.

Melany Espinosa

Colaboradores.

Marcela Muoz.

Fabin Carrin.

Contenido

ESTIMULACIN DE ALGUNAS

ENZIMAS RELACIONADAS CON

LA DEFENSA EN PLANTAS DE

ARROZ (Oryza sativa,

L.)OBTENIDAS DE SEMILLAS

TRATADAS CON QUITOSANA

CARACTERSTICAS

MORFOLGICAS Y BIOQUMICAS

DE FRUTOS DE CHINENE (Persea

schiedeana Nees.)

EMPLEO DE MARCADORES RAPD

PARA EL ANLISIS DE LA

VARIABILIDAD GENTICA EN

GENOTIPOS DE TOMATE

(Lycopersicon esculentum, Mill.)

Editorial

La Bioqumica es una ciencia que

estudia la composicin qumica de

los seres vivos, especialmente las

protenas, carbohidratos, lpidos y

cidos nucleicos, adems de otras

pequeas molculas presentes en

las clulas y las reacciones

qumicas que sufren estos

compuestos (metabolismo) que

les permiten obtener energa

(catabolismo) y generar

biomolculas propias

(anabolismo). La bioqumica se

basa en el concepto de que todo

ser vivo contiene carbono y en

general las molculas biolgicas

estn compuestas principalmente

de carbono, hidrgeno, oxgeno,

nitrgeno, fsforo y azufre.

RESUMEN.

La aplicacin de elicitores es

uno de los mtodos ms

ecolgicos y econmicos para

el control de plagas y

enfermedades. La quitosana

es un elicitor que tiene la

capacidad de estimular

mecanismos defensivos en

las plantas, las cuales van a

conferir resistencia a

enfermedades. En el trabajo

se presentan los primeros

resultados logrados en Cuba

en el empleo de elicitores

quitinosos en el cultivo del

arroz, en particular de la

quitosana obtenida en el

Departamento de Fisiologa y

Bioqumica Vegetal del

Instituto Nacional de

Ciencias Agrcolas (INCA).

Durante la investigacin se

determin in vivo el efecto de

este compuesto aplicado a la

semilla, en la estimulacin de

algunas enzimas defensivas

como la PAL, glucanasa, quitinasa y

quitosanasa en

plantas de arroz (varie- dad J-104). Se

observ el mayor incremento de la

actividad de estas enzimas en las

plantas tratadas con respecto al control.

ABSTRACT.

The application of elicitors is one of the

most ecological and economic methods

for pest and disease control. The

chitosan is an elicitor that stimulates

defensive mechanisms in plants, which

confer disease resistance. This work

presents the first results obtained in

Cuba by using chitinous elicitors in rice

Crop, particularly the chitosan obtained

in the Department of the crop

Physiology and Biochemistry from the

National Institute of Agricultural

Sciences (INCA). During the

investigation, the effect of this

compound applied to seed was in vivo

determined, to estimulate some

defensive enzymes, such as PAL,

glucanase, chitinase and chitosanase in

rice plants (cv. J-104). The highest

increment of enzymatic activity was

recorded in treated plants-1

ESTIMULACIN DE ALGUNAS ENZIMAS RELACIONADAS CON LA

DEFENSA EN PLANTAS DE ARROZ (Oryza sativa, L.)OBTENIDAS DE

SEMILLAS TRATADAS CON QUITOSANA

Key words: chitosan, seed, glucans, Oryza sativa, defense mechanisms

INTRODUCCIN

Los elicitores son molculas de origen

bitico, capaces de estimular

mecanismos defensivos en las plantas,

que pueden ser aplicados de forma

preventiva o directa a las plantas .

Estas sustancias desencadenan en las

plantas una serie de mecanismos

defensivos, que provocan una

resistencia sistmica ante el ataque de

los patgenos. Dentro de estos

mecanismos se incluyen el incremento

en la activacin de enzimas tales como

la fenilalanina amonio liasa (PAL), la

cual es clave en la sntesis de

metabolitos defensivos importantes,

donde se destacan las fitoalexinas.

Tambin se inducen otras enzimas

defensivas entre las que se encuentran:-

1,3 glucanasas, quitinasas,

quitosanasas, entre otras.

Entre los elicitores se encuentran los

oligmeros de glucano, cido

galacturnico y quitosana (3). En

cuanto a la quitosana se le ha prestado

especial inters en los ltimos aos por

su doble efecto: inhibir el crecimiento

micelial de algunos hongos

fitopatgenos y activar mecanismos

defensivos en las plantas, lo cual brinda

la posibilidad de utilizar estos

principios activos en el control de

enfermedades en cultivos de inters

econmico. Este elicitor y sus derivados

han demostrado que con la aplicacin

preventiva de estos a las plantas, se

logra adems de la estimulacin en

algunas de las enzimas defensivas, una

disminucin de los sntomas de la

enfermedad.

En este sentido, se ha demostrado que

la quitosana aplicada a plntulas de

tabaco y posteriormente infectadas con

Phytophthora parastica se logra una

induccin de la actividad de las

enzimas PAL y glucanasa, adems de

observarse proteccin . Tambin en

hojas de man se aplic quitosana, se

infect con Puccinia arachidis,

observndose una estimulacin en la

actividad quitinasa y glucanasa y una

disminucin de las lesiones.

En cuanto al cultivo del arroz (Oryza

sativa, L.) se puede plantear, que es el

alimento bsico de ms del 65 % de la

poblacin mundial. En Cuba constituye

el 60 % de la dieta de los cubanos y la

demanda interna slo se satisface

aproximadamente el 33 %. Una de las

causas de los bajos rendimientos de este

cultivo son los daos causados por

enfermedades y en especial, las de

origen fungoso, siendo en el estado de

plntulas, entre los 25 y 35 das despus

de germinada la semilla, donde la

planta muestra la mayor

susceptibilidad. Las prdidas oscilan

entre un 10-30 %, pero su capacidad

destructiva en condiciones favorables

llega a ser hasta un 80 % (6, 7).

Resulta importante destacar, que una

de las vas de transmisin de este

patgeno es por semillas contaminadas,

siendo el tratamiento a la semilla con

fungicidas qumicos uno de los

mtodos ms usado para el control de

la piriculariosis, pero los mismos son

muy costosos y txicos al ambiente.

Toda esta situacin conduce a la

necesidad de utilizar nuevos mtodos,

muchos ms econmicos y ecolgicos,

que se unan a los tradicionales para el

control integrado de las enfermedades

fungosas. Teniendo en cuenta estos

antecedentes el objetivo del trabajo es

determinar la dinmica de algunos

indicadores de resistencia sistmica

inducida: fenilalanina amonio liasa, -1,3

glucanasa, quitinasa y quitosanasa

estimulada por la quitosana en una

variedad de arroz (J-104)

MATERIALES Y MTODOS

Elicitor utilizado. La quitosana con

grado de acetilacin 36.5 % (Q-63),

obtenida en el Laboratorio de

Oligosacarinas del Departamento de

Fisiologa y Bioqumica Vegetal del

Instituto Nacional de Ciencias

Agrcolas (INCA), por desacetilacin

alcalina de quitina de langosta, calidad

farmacutica (8). Estimulacin de los

mecanismos de defensa por la

quitosana. Las semillas de arroz

variedad J-104 despus de

desinfectadas con hipoclorito de sodio

al 3 % durante tres minutos y lavadas

con agua destilada estril, fueron

tratadas con disoluciones de quitosana

a las concentraciones 100, 500 y 1000

mg.L-1 mediante imbibicin durante 15

minutos. Posteriormente, fueron

secadas a temperatura ambiente y ms

tarde sembradas en bandejas plsticas

con suelo Gley Nodular Ferraltico

concrecionario (9), esterilizado

previamente durante una hora en auto-

clave a 121oC, por tres das

consecutivos. Se incubaron las bandejas

en cuarto de crecimiento con

alternancia de luz (16 horas) y

oscuridad (8 horas) a una temperatura

de 22-24oC y a los 18, 25, 32 y 39 das de

germinadas las semillas se

determinaron las diferentes actividades

enzimticas: fenilalanina amonio liasa

(PAL), 1,3 glucanasa, quitinasa,

quitosanasa, que se compararon con un

control (tratado con agua). Extraccin

de enzimas. El material vegetal

utilizado para la extraccin fue hojas de

arroz de las cuales se tomaron 2 g y

maceraron en mortero con nitrgeno

lquido. Se procedi a la extraccin con

una solucin tampn de acetato de

sodio 0.1 mol.L-1 a pH 5,2 para la

determina cin de las actividade -

1,3 glucanasa, quitinasa y quitosanasa y

para determinar la actividad PAL se

utiliz como solucin tampn

tetraborato de sodio 0,1 mol.L-1 y cido

brico 0.1 mol.L-1 a pH 8.8.

Para ambas extracciones se us 1 g de

tejido por cada 2 mL de solucin

tampn. Determinacin de las

actividades enzimticas Determinacin

de la actividad PAL. Se tom 0.9 mL de

L-Fenilalanina 1 mg.mL-1 (Merck

calidad bioqumica) se le adicion 0,1

mL de extracto enzimtico, se incub a

40oC durante 30 minutos. La reaccin

se detuvo con 0.25 mL de cido

clorhdrico 5 N, se colocaron las

muestras en bao helado y se le

adicion 5 mL de agua destilada. Los

valores de absorbancia se determinaron

a 290 nm. Se defini como una unidad

de actividad enzimtica equi- valente a

la produccin de 1 mmol de cido

transcinmico producido por minuto

por mg de protenas (10).

- 1,3

glucanasa. A 0.2 mL de sustrato

laminarina 1 mg.mL-1 (Sigma para

anlisis) (11) se le adicion 0,1 mL de

tampn acetato de sodio 0.1 mol.L-1 a

pH 5,2 y 0,1 mL de extracto enzimtico,

las muestras se incubaron a 40oC

durante 30 minutos. Se determin la

actividad enzimtica por medicin del

nivel de produccin de azcares

reductores (12) y se expres en

trminos de actividad especfica como

mol de glucosa producido minutos-

1.mg-1 de protenas.

Determinacin de la actividad

quitinasa. Para este ensa- yo se

procedi adicionando 2 mL de tampn

de cido ctrico 0,1 mol. L-1 e hidrgeno

fosfato de sodio 0,1 mol.L-1 pH 5,2 a 1

mL de extracto enzimtico y a un 1 mL

de quitina coloidal 0.5 % (Sigma con

fines analticos). Se incubaron las

muestras a 37oC durante 20 minutos

con agitacin continua. La reaccin se

detuvo al calentarla a ebullicin por 5

minutos. Se determin el incremento de

azcares reductores (2) se ley la

absorbancia a 420 nm. La actividad

enzimtica se expres como moles de

azcares reductores por minuto por mg

de protenas.

Determinacin de la actividad

quitosanasa. A 0.5 mL de quitosana al

0.5 % en buffer de acetato de sodio 0,1

M a pH 5.2, se le aadi 0.5 mL de

muestra. La mezcla se incub a 37oC

durante 24 horas, posteriormente para

detener la reaccin se colocaron las

muestras en bao Mara a 100oC

durante cuatro minutos (2). Se ley la

absorbancia a 420 nm. La actividad

enzimtica se expres como moles de

azcares reductores por minuto por mg

de protenas.

En todos los casos se registraron las

actividades especficas de las enzimas

para ello se determin la concentracin

de protenas presente en los extractos

(13). Anlisis estadstico. Se utiliz un

diseo completamente aleatorizado y

con tres repeticiones por tratamientos.

Las medias se compararon con el

empleo de la prueba de Rangos

Mltiples de Duncan para un 5 % de

significacin, as como se determinaron

los errores estndar para cada

momento evaluativo. El experimento se

repiti dos veces con resultados

coincidentes.

RESULTADOS Y DISCUSIN

La enzima PAL es una de las primeras

que se activa en el metabolismo

secundario y a partir de ella se

desencadena rpidamente una serie de

mecanismos como la va de los

fenilpropanoides que da lugar a la

sntesis de fitoalexinas, ligninas, cido

benzoico, cido saliclico, siendo este

ltimo considerado una importante

seal en la amplificacin de las

respuestas defensivas sistmicas (14,

15). Los resultados de la actividad de la

enzima PAL en plntulas de arroz

provenientes de semillas tratadas con

quitosana se muestran en la Figura 1.

Como se puede observar, se apreciaron

mayores niveles de actividad PAL en

las plantas suplementadas con las

diferentes dosis de elicitores que en el

control, con diferencia significativa

entre los tratamientos aplicados. Este

comportamiento se mantuvo desde la

primera evaluacin realizada a los 18

das despus de germinada la semilla

de arroz y hasta los 39 das, tiempo en

que se realiza la ltima evaluacin.

Se debe destacar que los mayores

valores de actividad PAL se alcanzaron

aproximadamente entre 0,12 y 0.14

moles de cido transcinmico

producido.mg-1 de protenas.minuto-1

con la dosis de 1000 mg.L-1 para todas

las evaluaciones, mientras que a las

concentraciones de 100 y 500 mg.L-1

fueron significativamente inferiores,

aunque mejores que el tratamiento

control. Los resultados sugieren que la

tendencia al mayor incremento de la

actividad PAL ocurre entre los 25 y 32

das, despus de germinada la semilla.

El hecho de que a la mayor

concentracin de quitosana se encontr

la mayor actividad PAL pudiera

explicarse teniendo en cuenta que a

1000 mg.L-1 la solucin es ms viscosa,

por lo que debe adherirse mejor a la

semilla y su liberacin debe ser ms

lenta que el resto de las concentraciones

cuya viscosidad es menor. Esto trae

como consecuencia que las sustancias

activas se mantengan ms tiempo en

contacto con las semillas y plntulas de

arroz (16). En cuanto a los resultados de

la actividad de la enzima-1,3 glucanasa

se muestran en la Figura 2

La dosis 1000 mg.L-1 y en menor

medida la de 500 mg.L-1 de quitosana

fueron las que provocaron la mayor

estimulacin enzimtica, con

diferencias significativas con el resto de

los tratamientos. Se debe destacar que a

los 25 das despus de germinada la

semilla se alcanz la mayor

estimulacin de la actividad1,3

glucanasa para la concentracin 1000

mg.L-1.

Algunos autores (1), en trabajos

relacionados con la actividad de esta

enzima ante la aplicacin de quitosana,

han observado un incremento de la

actividad de la misma en el tiempo. Por

ejemplo, en hojas de man encontraron

un incremento de la actividad

enzimtica a partir del segundo da

despus de la aplicacin del elicitor y el

mximo de induccin se mostr a los 10

das despus del tratamiento. Sin

embargo, en otras investigaciones

realizadas (4) se observ que a las 24

horas despus del tratamiento a

plntulas de tabaco a travs de la raz,

provoc un aumento de la actividad-1,3

glucanasa cuatro veces mayor respecto

al control.

En la Figura 3 se pueden apreciar los

resultados de actividad quitinasa, otra

de las enzimas analizadas, en las

plntulas de arroz obtenidas de

semillas tratadas con quitosana. Como

se puede observar las plantas tratadas

con las diferentes dosis del elicitor

mostraron una mayor ac- tividad

quitinasa que las correspondientes a las

plantas controles en la mayora de las

evaluaciones realizadas. Cuando se

aplica la quitosana, se evidencia que la

mayor estimulacin de la actividad de

la enzima se produce con la dosis de

1000 mg.L-1 para todas las evaluaciones

y 500 mg.L-1 en la ltima evaluacin,

con diferencias significativas con el

resto de los tratamientos. Se debe

sealar que los mayores valores de

actividad enzimtica se encontraron a

los 39 das despus de germinada la

semilla de arroz para todos los

tratamientos.

CONCLUSIN

De forma general, se puede plantear

que las plantas obtenidas de semillas de

arroz tratadas con quitosana a la dosis

de 1000 mg.L-1 lograron la mayor

estimulacin en todas las actividades

enzimticas evaluadas (PAL,- 1,3

glucanasa, quitinasa y quitosanasa)

desde los 18 hasta los 39 das despus

de germinada la semilla. Por lo que se

demostr la capacidad que presenta la

quitosana de estimular la actividad de

algunas enzimas relacionadas con la

defensa y que esta estimulacin se

diferencia en cuanto a la magnitud,

rapidez en alcanzar los valores mayores

de actividad y la dosis utilizada. Lo

cual sugiere, la posibilidad de que este

elicitor pueda ser empleado en la

proteccin de plntulas de arroz contra

algunos patgenos fngicos.

REFERENCIAS

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R. Chitosan induces resistance

components in Arachis hypogaea

against leaf rust caused by Puccinia

arachidis Speg. Crop Protection, 1998,

vol. 17, no. 4, p. 307-313.

Inui, H.; Yamaguchi, Y. y Hirano, S.

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Biosci.

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Ramrez, M. A.; Cabrera, G.; Gutirrez,

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Tropicales, 2000, vol. 21, no. 1, p. 81-84.

Cuba. MINAGRI. Instituto de Suelos.

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enzimticos. Cultivos Tropicales, 1999,

vol. 15, no. 2, p.26-29.

Paz-Lago, D.; Gutirrez, A. y Luzardo,

L. Relevancia biolgica de la

activacin de la resistencia sistmica del

tabaco inducida por la pared celular

fngica. Cultivos Tropicales, 1998, vol.

19, no. 3, p. 25-27

RESUMEN.

El chinene es un rbol frutal

nativo de Mesoamrica y forma

parte de la familia Lauraceae. Su

consumo, como buena fuente

nutricional es reconocido en

regiones tropicales de Mxico y

Centroamrica. Sin embargo,

poco se conoce sobre su

contenido nutrimental. Para ello,

se llevaron a cabo anlisis de

cidos grasos en pulpa de

chinene por dos aos

consecutivos utilizando

cromatografa de gases. Se

obtuvieron concentraciones de

cido oleico, y palmitico

parecidas a las encontradas en

aguacate. Las concentraciones de

cido oleico fueron comparables

con las del aguacate Hass. En

otro estudio, se midieron

morfolgicamente frutos de

chinene provenientes de varias

comunidades de la regin central

de Veracruz, Mxico. Result una

gran variacin en tamao, peso,

y contenido de pulpa. Asimismo,

el patrn de crecimiento de los

frutos fue caracterizado por una curva

simple sigmoide con un acumulado de

1635.11 unidades calor arriba de 6 oC,

desde el amarre de fruto hasta la

cosecha.

PALABRAS CLAVE ADICIONALES:

Chinin, cido oleico, frutales

subutilizados, curvas de crecimiento

del fruto, unidades calor, ndice de

cosecha.

ABSTRACT.

Chinene is a fruit native from

Mesoamerica and belongs to the

Lauraceae family. Chinene pulp

consumption is recognized as a good

nutritional source in tropical regions of

Mexico and Central America. However,

little is known about its nutrient

content. Lipid analyses of chinene fruit

pulp were carried out during two

consecutive years using gas

chromatography. Oleic and palmitic

acid concentrations were comparable to

those found in Hass avocado cultivar.

In other study, the chinene morphology

from several locations of the central

region of Veracruz, Mexico, was

measured. Large variation in size,

weight and pulp content was found.

CARACTERSTICAS MORFOLGICAS Y BIOQUMICAS DE

FRUTOS DE CHINENE (Persea schiedeana Nees.)

The pattern of fruit growth follow a

simple sigmoid curve with 1635.11

accumulated heat hours above 6 oC

from set to harvest.

ADDITIONAL KEY WORDS: Chinin,

oleic acid, neglected fruits, fruit growth

curves, heat units, harvest index

INTRODUCCIN

El chinene (Persea schiedeana Nees.) de

la familia Lauraceae es un rbol frutal

nativo de Mesoamrica que se

distribuye desde Mxico hasta Panam

(Smith et al., 1992). Es poco conocido en

las zonas urbanas, y su nmero se ha

reducido debido al establecimiento de

plantaciones de caf y de otros cultivos

en el estado de Veracruz.

En Mxico, tambin se le conoce como

chinin, aguacate de manteca, escalar o

paga, y en Guatemala es chucte o

coyo. Asimismo, es nombrado como

supte y yas en Honduras y Costa Rica,

respectivamente. Este rbol que se

encuentra en algunas fincas cafetaleras,

se aprovecha principalmente por la

sombra que proporciona. A la fecha, no

existen plantaciones comerciales de

chinene (Herrera et al., 2005). Su fruto

en Mxico se consume untando la

pulpa del fruto en tortillas de maz. Se

han observado frutos de chinene que

presentan pulpa con buenas

caractersticas organolpticas

adecuadas para su comercializacin en

mercados de mayor exigencia, y

competencia comercial. En algunas

pocas del ao el precio del chinene ha

rebasado al del aguacate Hass en

mercados regionales de Veracruz y

Tabasco.

El rbol del chinene tolera

inundaciones (Smith et al., 1992) por lo

tanto ha sido estudiado para controlar

enfermedades de la raz del aguacatero

(Zentmyer et al., 1988), sin embargo, los

estudios relacionados con las

caractersticas de los frutos de chinene

son escasos. De manera que no se ha

caracterizado el crecimiento del fruto y

tampoco se ha cuantificado su

contenido nutrimental. Estudios de este

tipo permitiran determinar indicadores

de madurez para eficientar la cosecha y

promover el consumo de esta fruta por

sus cualidades culinarias.

Los objetivos del presente estudio

fueron: 1) evaluar parmetros

morfolgicos en frutos de chinene

comercializados en el mercado regional

de Coscomatepec, Veracruz, 2)

determinar la curva de crecimiento del

fruto y obtener las unidades calor como

dos posibles parmetros de estimacin

de cosecha, 3) determinar el contenido

de cidos grasos y fibra de la pulpa de

los frutos.

MATERIALES Y MTODOS

Variabilidad de calidad del fruto

Frutos de chinene con madurez de

consumo en el mercado de

Coscomatepec, Veracruz, provenientes

de los municipios de Calcahualco,

Comapa, Crdoba, Excola, Fortn de las

Flores, Ixhuatln del Caf, Tepatlaxco y

Tomatln fueron seleccionados en

agosto del 2004. A cada uno se les

determin: peso fresco (g), dimetro

(mm) proximal, medio y distal,

longitud (cm), peso de la semilla (g),

peso de la pulpa (g), peso de la cscara

(g), y dimetro y longitud de la semilla

(cm). Con estos datos, se efectu un

anlisis cannico discriminante (Cruz-

Castillo et al., 1997) utilizando el

programa de computo SAS-8e.

Dinmica de crecimiento del fruto e

ndice de madurez

A una semana del amarre, un total de

300 frutos promediando 10 mm de

longitud fueron seleccionados al azar

en la parte media de cinco rboles que

medan 14 m de altura con una edad

aproximada de 20 aos. Semanalmente

se registr la longitud y dimetro (mm)

del fruto utilizando un vernier digital,

desde el 15 de abril de 2005 hasta la

cosecha. Debido a la cada de frutos

ocasionada por el viento en las ltimas

cuatro mediciones slo se midieron 50

frutos en tres rboles. Para calcular la

velocidad de crecimiento se utiliz la

frmula de Schechter et al. (1993): VCF

= ( TF2 TF1 ) / ( T2 T1 ) Donde: VCF

= Velocidad de crecimiento de la

longitud y/o dimetro del fruto

(mm.da-1); TF2 = Tamao de fruto en

un tiempo 2 (dimetro o longitud en

mm); TF1 = Tamao de fruto en el

tiempo 1 (mm); T2 = Tiempo del ltimo

registro (lectura 2) en das; y T1 =

Tiempo del registro anterior al ltimo

(lectura 1).

Determinacin de unidades calor

Las unidades calor (uc) con relacin al

ritmo de crecimiento del fruto tambin

fueron determinadas para obtener un

estimado de madurez y momento de

corte. stas fueron consideradas como

la cantidad de temperatura acumulada

medida en grados centgrados que

necesita el fruto para completar su

cosecha. Las temperaturas fueron

obtenidas cada 30 min diariamente con

un sensor Dataloger que fue colgado

dentro de un rbol a unos 8 m de

altura. El total de los datos fue

promediado por da y la suma de todas

las temperaturas promedio superiores a

6 C fue expresada como la cantidad de

uc requeridas para el crecimiento de

frutos medidos, de acuerdo con el

mtodo residual de Ortiz (1987). Frutos

tropicales almacenados abajo de 6 oC

presentan daos por fro (Kasmire y

Thompson, 1992), por esta razn se

escogi esa temperatura para obtener

las uc. Los valores promedio de lecturas

tomadas semanalmente para las

variables de longitud y dimetro de

fruto fueron graficados en funcin del

tiempo, calculando la media y el error

estndar con ayuda del programa

estadstico de cmputo Sigma Plot 10.0

(Systat software Inc., 2002).

Anlisis nutrimental

Fueron seleccionados seis frutos de

chinene con cscara verde y seis con

cscara negra colectados en Huatusco,

Veracruz, y otros seis con cscara verde

colectado en Teapa, Tabasco a los

cuales se les extrajo la pulpa para

determinar el contenido de cidos

grasos y fibra.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Variabilidad de calidad del fruto

En el Cuadro 1 se muestran los

promedios de todas las variables

medidas sobre los frutos. Se observaron

frutos con longitudes de 11 hasta 16.2

cm. Los dimetros distales del fruto

fueron desde 51.6 hasta 60.8 mm, y el

peso de los frutos vari de 160.1 hasta

254.7 g. Los frutos del mercado regional

de Coscomatepec provenientes de

municipios ubicados en la regin

central del estado de Veracruz fueron

diversos.

Las primeras cuatro funciones

cannicas fueron significativas (P0.05)

y cubrieron el 88 % de la variabilidad

de los datos. stas fueron interpretadas

considerando los valores absolutos

mayores para cada variable medida y

municipio dentro de la funcin (Cruz-

Castillo et al., 1997).

La primera funcin cannica

comprendi 34 % de la variabilidad y

resaltaron frutos de mayor longitud de

semilla (Cuadro 2). Frutos de color caf

y negro de comunidades en Tepatlaxco

y Tomatln, respectivamente, fueron

los mejores descritos por esta funcin

(Cuadro 3). En contraste, los frutos

verdes de Comapa presentaron semillas

con menor longitud (Cuadro 3). Esto

indica que los frutos estudiados no

llegaron al mercado con parmetros de

valor comercial. Cuando se caracteriza

la calidad del fruto y existe una previa

seleccin de rboles por tamao y/o

peso del fruto, las primeras funciones

resaltan estas variables (Cruz-Castillo et

al., 1997; Alavz-Lpez et al., 2000). Los

frutos de chinene estudiados fueron

cosechados de rboles propagados por

semilla creciendo en forma silvestre o

en traspatios y una variable de poca

importancia comercial como la longitud

de la semilla ocup gran parte de la

variabilidad de los datos.

En la segunda funcin cannica se

presentaron principalmente frutos de

menor peso con un dimetro distal

sobresaliente (Cuadro 2), y los frutos de

Tepatlaxco alcanzaron los mayores

valores medios estandarizados (Cuadro

3). En la tercera funcin, destacaron

frutos de mayor peso asociados a un

alto peso de su cscara (Cuadro 2) y los

frutos negros de Calcahualco se

distinguieron en este aspecto (Cuadros

1 y 3). Frutos pequeos con poca

longitud y peso destacaron en la

funcin cuatro que cubri solamente el

10 % de la variabilidad (Cuadro 2), y los

verdes de Comapa alcanzaron el mayor

valor medio absoluto (Cuadro 3) con un

peso de 163.3 g y una longitud de 12.7

cm (Cuadro 1). Estos resultados son

tiles para futuros estudios donde se

considere seleccionar rboles de

chinene para mejoramiento gentico, ya

que a la fecha no existen cultivares de

chinene registrados.

Dinmica del crecimiento e ndices de

madurez del fruto

El crecimiento del fruto de chinene fue

de tipo simple sigmoidal (Figura 1).

Curvas de crecimiento de este tipo

tambin han sido determinadas en el

aguacate (Schroeder, 1953; Blumenfeld

y Gazit, 1974; Coger, 1985). Esta curva

se caracteriz por un crecimiento

acumulado que present una actividad

inicial alta y cambios significativos

constantes entre lecturas, marcando un

aumento rpido y progresivo en la

longitud y dimetro hasta los 91 das

despus del amarre de fruto (DDAF).

Este crecimiento acelerado disminuy

alrededor del da 84 DDAF y 91 DDAF,

para las variables longitud y dimetro

respectivamente (Figura 1).

En la Figura 2 se muestra la velocidad o

tasa de crecimiento diario de frutos de

chinene. La tasa de crecimiento

aument rpidamente durante los

primeros das de desarrollo (0-21

DDAF), seguido por una leve

disminucin (28 DDAF), para despus

continuar acelerando hasta alcanzar

cierta estabilizacin en la velocidad de

crecimiento en los das subsecuentes

(42-97 DDAF). Este comportamiento

puede atribuirse a que el aumento de la

velocidad de crecimiento es ocasionado

por la divisin y elongacin celular en

los periodos iniciales de fruto

(Schroeder, 1953; Schechter et al., 1993).

Mientras que la ligera disminucin

sealada arriba puede ser efecto de

competencia de carbohidratos con otros

frutos (Khne y Schutte, 1991) o por

influencia del medio ambiente (Ryugo,

1993). Esta curva es til cuando se

pretende maximizar el entendimiento

de los procesos de divisin y

elongacin celular con relacin a las

fases de crecimiento y a la

susceptibilidad de stas con el medio

ambiente. La tasa de crecimiento del

fruto de chinene coincidi con la del

aguacate Pinkerton (Sippel et al.,

1993).

CONCLUSIN

La morfologa de frutos de chinene en

varias regiones de Veracruz es diversa

en cuanto a longitudes de la semilla,

peso y dimetro distal. El patrn de

crecimiento de los frutos de chinene

corresponde al tipo simple sigmoidal.

El punto de madurez fisiolgica de los

frutos de chinene es entre 91 y 97

DDAF. Por otra parte, durante la fase

comprendida entre el amarre de fruto y

el momento de madurez (97 DDAF) el

fruto requiri un acumulado de 1635.11

unidades calor. En dos aos

consecutivos los anlisis de cidos

grasos del chinene revelaron

concentraciones de cidos oleico y

palmtico comparables a las del

aguacate.

AGRADECIMIENTO

Al Sistema Nacional de Recursos

Fitogenticos de la SAGARPA, Mxico,

por el financiamiento del presente

estudio (proyecto 60 Red Aguacate).

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RESUMEN.

En el Centro Nacional de Sanidad

Agropecuaria (CENSA), se

sembraron en condiciones

semicontroladas seis posibles

radiomutantes de tomate con sus

respectivos donantes, con el objetivo

de evaluar la variabilidad gentica

de estos mediante el empleo de

marcadores RAPD. Los 14

cebadores utilizados generaron 80

bandas polimrficas, determinando

un total de 90 bandas. Estos

resultados sugieren la existencia de

una gran diversidad gentica dentro

del material analizado,

diferencindose molecularmente

cuatro genotipos de sus respectivas

variedades donantes.

Palabras clave: Lycopersicon

esculentum, variacin gentica,

marcadores genticos, RAPD

ABSTRACT.

In the National Center of Agricultural

Health (CENSA), seeds from six

possible tomato radiomutants with

their respective donating varieties were

sown in glasshouses, with the objective

of evaluating their genetic variability

by means of RAPD markers. The 14

primers used generated 80

polymorphic bands, determining a total

of 90 bands. These results suggest the

existence of a great genetic diversity

inside the analyzed material,

molecularly differing four genotypes

from their respective donating varieties.

Key words: Lycopersicon esculentum,

genetic variation, genetic markers,

RAPD

INTRODUCCIN

Ha sido demostrada la importancia

de los marcadores morfolgicos y

bioqumicos (1, 2) en la evaluacin

de las diferencias entre genotipos de

tomate, para la discriminacin de

variedades de esta hortaliza, a travs de

programas de mejoramiento gentico,

para su adaptacin a las condiciones

climticas. Sin embargo, los marcadores

morfolgicos y bioqumicos no son

capaces de detectar suficiente

polimorfismo entre variedades o

especies prximas, debido a que son

EMPLEO DE MARCADORES RAPD PARA EL ANLISIS DE LA VARIABILIDAD GENTICA EN GENOTIPOS DE

TOMATE (Lycopersicon esculentum, Mill.)

resultados de la expresin genotpica,

del ambiente y de la interaccin entre el

genotipo y el ambiente (3), por lo que es

imprescindible caracterizar con la

mayor acuciosidad posible la

diversidad gentica que presenta cada

coleccin. Los avances de la tecnologa

del ADN recombinante han permitido

el desarrollo de los marcadores basados

en el ADN, consiguiendo estabilidad en

la identificacin de especies y

variedades (4). En este sentido, un

mtodo muy efectivo es la aplicacin de

marcadores moleculares como RAPD,

RFLP, AFLP, etc., que suministran un

buen diagnstico sobre la estructura de

las poblaciones silvestres o sobre la

diversidad de las colecciones

establecidas (5). En el presente trabajo

se emplearon los marcadores RAPD

con el objetivo de corroborar si los

genotipos seleccionados, por su alto

potencial productivo en condiciones de

bajos suministros de agua, se

diferencian molecularmente de sus

respectivas donantes

MATERIALES Y MTODOS

Las semillas de los genotipos de tomate

seleccionados en condiciones de bajos

suministros de agua en el Instituto

Nacional de Ciencias Agrcolas (INCA),

se colocaron conjuntamente con sus

respectivas variedades donantes (Tabla

I) en cajuelas con suelo Ferraltico Rojo

esterilizado, mantenidas en casa de

cristal en condiciones semicontroladas a

temperatura de 230C +/- 20C y a una

humedad relativa entre 80-85 %, con un

fotoperodo natural en el Centro

Nacional de Sanidad Agropecuaria

(CENSA)..

A los 30 das de germinadas las

semillas, se tomaron las hojas jvenes y

se realiz una extraccin de ADN (6) a

todo el material vegetal mencionado

anteriormente. La calidad del ADN se

constat por electroforesis de los

extractos en geles de agarosa al 0.8 % y

solucin amortiguadora de corrida TBE

0.5X (45mM Tris-Borato, 1mM EDTA

pH 7), teidos con bromuro de etidio (5

mg.mL-1) y observados en un

transiluminador (Bioblock Scientific).

La concentracin se estim por la

medicin de la densi- dad ptica a 260

nm en un espectrofotmetro Ultrasepec

Plus Spectrophotometer Pharmacia

LKB.

La reaccin de amplificacin se realiz

en un volu- men total de 25 uL que

contena: 10 mM Tris-HCl a pH 8,3;

50mM KCl, 2mM MgCl2, 0.001 % de

gelatina, 100uM de cada dNTPs , 5

pmoles de cebador (Kits OPA y OPF de

la firma comercial Operon

Technologies), 100ng de ADN

genmico y 2U de Taq ADN polimerasa

(Amplicen). La amplificacin se

produjo en un termociclador marca

Techme de la firma Progene progra-

mado para 45 ciclos de 1 min. a 94C, 1

min. a 36C y 2 min. a 72C, y un ciclo

de 10 min. a 72C. Los productos de la

PCR se visualizaron por electroforesis

en gel de agarosa al 1.5 % en solucin

amortiguadora TBE 0.5X y se tieron

con bromuro de etidio, antes de ser

observados en un transiluminador. Se

informaron los productos de la PCR,

tomando las bandas ms intensas, como

presentes [1] o como ausentes [0] en

cada genotipo, creando as una matriz

de valores binarios que se analiz a

travs de la aplicacin del software

computacional CLATAX (7), para

determinar el grado de similitud

utilizando el coeficiente de similitud de

Nei y Li (8), entre el material gentico

analizado, para luego construir un

dendrograma mediante el algoritmo

UPGMA por medio del paquete

STATISTICA (9).

RESULTADOS Y DISCUSIN

A partir del anlisis molecular basado

en los 14 cebadores empleados, se puso

de manifiesto que estos generaron 90

bandas producto de la amplificacin

(Tabla II), de las cuales 80 fueron

polimrficas para un promedio de 5.7

bandas por cebador. Es de destacar que

casi la totalidad de los cebadores

usados fueron muy informativos, con

excepcin del OPA 13, que no detect

polimorfismo entre el material gentico

estudiado.

El cebador OPA 12 y todos los

cebadores OPF, excepto OPF 01,

alcanzaron el 100 % de bandas

polimrficas, resultando tiles en la

determinacin de polimorfismo. Se

destac el cebador OPF 13 por el gran

nmero de bandas generadas, de las

cuales el 100 % fueron polimrficas. De

acuerdo con la literatura consultada, los

porcentajes de polimorfismo gentico

alcanzados en este trabajo son altos, en

comparacin con los que se han

obtenido normalmente en tomate

(Lycopersicon esculentum Mill),

mediante los marcadores

morfoagronmicos y bioqumicos (2,

10), marcadores de RAPD (3, 11) y por

medio de otros marcadores moleculares

(12, 13, 14)..

Con el procedimiento no-jerrquico (K-

means) del Anlisis de Conglomerados,

basado en los ndices de similitud, se

identificaron al menos dos grupos de

diferente diversidad gentica (Figura

1): el primer grupo formado por el

genotipo R17-500 y su variedad

donante Amalia y el segundo por el

resto de los genotipos analizados. Este

ltimo grupo se dividi a su vez en tres

subgrupos, donde el genotipo R19-500

y su variedad donante INCA-9-1

integraron el primer subgrupo, los

genotipos R15-500 y R20-300 formaron

el segundo subgrupo y el tercero estuvo

compuesto por R16-300 y R4-300.

Las similitudes encontradas entre R17-

500 y R19-500, y sus respectivas

variedades donantes Amalia e INCA-9-

1, pudieran deberse a que los cebadores

empleados en este estudio conllevan a

no esclarecer la situacin, al no am-

plificar otras regiones que acentan

ms las diferencias, ya que los

marcadores RAPD son dominantes

porque solo se amplifica un producto o

variante allica: aquel que cumple los

requisitos de complementariedad entre

el cebador y las cadenas de ADN a una

distancia=2 kb (15).

CONCLUSIN

Los resultados alcanzados en este

trabajo permiten reafirmar el poder de

la tcnica de RAPD, para el estudio de

la diversidad en la secuencia de una

poblacin y corroboran la efectividad

del uso de rayos gamma 60Co, para la

induccin de variabilidad gentica y la

seleccin realizada para la obtencin de

genotipos de tomate con alto potencial

productivo en condiciones de bajos

suministros de agua.

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