UNIVERSIDAD AUTONOMA DE ZACATECASFrancisco Garca Salinas

AREA DE CIENCIAS QUIMICAS

UNIDAD ACADEMICA DE CIENCIAS QUIMICAS

PROGRAMA DE QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICA

DOCENTE: Araceli

INTEGRANTES DE EQUIPO:Gwendolyne Mndez FraustoEdwin Antonio Reyes OlivaLaura Monserrat Saucedo HerreraFlor de Mara Torres Jurez

Nombre de la prctica: Determinacin de glucosa (Mtodo glucosa oxidasa/peroxidasa) OBJETIVO:Realizar la determinacin de glucosa en suero por medio de una tcnica enzimtica-colorimtrica, para la valoracin de las alteraciones del metabolismo de los carbohidratos.INTRODUCCIN:Clsicamente se han clasificado los mtodos de determinacin de la glucosa en tres apartados diferentes: Mtodos que dependen del poder reductor de la glucosa (mtodos reductores). Mtodos qumicos. Mtodos enzimticos.Actualmente podemos decir que los primeros grupos se encuentran prcticamente obsoletos, por lo tanto no nos referiremos a ellos.Los mtodos enzimticos consiguen una gran especificidad, ya que utilizan enzimas purificadas que actan selectivamente sobre la molcula de glucosa, no interfiriendo el resto de los hidratos de carbono o derivados que se encuentran fisiolgicamente en los lquidos biolgicos.Mtodo de la glucosa oxidasaEs un mtodo especfico para la glucosa, pues la enzima glucosaoxidasa (GOD) acta oxidando a la beta-D-glucosa, con una mnima accin sobre la alfa-D-glucosa, la cual est presente en las soluciones en equilibrio con la forma beta. Habitualmente el punto de equilibrio se obtiene a travs de mutarrotacin y se alcanza cuando existe un 36 por 100 en la forma alfa y un 64 por 100 en la forma beta. Para lograr una oxidacin completa de la glucosa es necesario que sta sea transformada completamente en la forma beta, es decir, debe producirse una mutarrotacin total de alfa a beta durante el periodo de incubacin la velocidad con la que se produce la mutarrotacin est afectada por el pH, el aumento de temperatura y, ms especficamente, por una enzima, la mutarrotasa. Algunas preparaciones comerciales de glucosa oxidasa contienen la enzima glucomutarrotasa, que acelera especficamente este paso.La reaccin tiene dos fases, en la primera la GOD oxida a la beta-D-glucosa:

La segunda fase se basa en la utilizacin de un sistema enzimtico conjugado, en el cual el H2O2 formado se acopla a travs de una peroxidasa (POD) a un receptor cromognico (aceptor de oxigeno) y permite la medida fotomtrica directa de la glucosa.

Como receptores cromognicos se han utilizado la orto-toluidina, que da lugar a un cromgeno rojo, etc.Esta segunda fase es menos especfica porque hay muchas sustancias reductoras que compiten con el aceptor de oxgeno, que por mtodos polarogrficos nos miden la velocidad de consumo se oxgeno, el cual sera directamente proporcional a la cantidad de glucosa de la muestra, permitiendo la determinacin directa de la glucosa.

MATERIAL:Material biolgico3 ml de sangre perifrica en ayuno sin anticoagulante

Reactivos Reactivo R de color rosa para glucosaPatrn de glucosa concentracin 5.56 mmol/L 100 mg/dlMaterial para puncin sangunea1 jeringa de 3 ml1 tubo 13X100 mm con tapnGradillaTorundas

Material para el desarrollo de la prctica2 puntillas amarillas Celdas para espectrofotmetro3 tubos 12X751 tubo eppendorf1 pipeta pasteur1 aspirador Gradilla

EquipoCentrfuga Espectrofotmetro para lecturas de 500 nmMicropipeta para 6l y 600lIncubadora a 37C Cronmetro

PROCEDIMIENTO REALIZADO: Se extrajo 3 ml de sangre perifrica en ayunas y fue colocada en un tubo 13X100 mm sin anticoagulante y rotular. Se centrifug los tubos a 3000 rpm durante 5 minutos y el suero se separ. Se marcaron 3 tubos 12X75 mm como blanco, patrn, muestra. El reactivo se esper a que estuviera a temperatura ambiente. Se agreg lo siguiente en cada uno de los tubos:

BlancoPatrnMuestra

Patrn-------10l-------

Muestra-------------10l

Reactivo1.0 ml1.0 ml1.0 ml

Se agit e incub durante 5 minutos a una temperatura de 37C. Se ley la absorbancia del patrn y la muestra en el espectrofotmetro a una longitud de onda 500 nm.

CLCULOS:Cmuestra(mg/dl)=(absorbancia de la muestra/ absorbancia del patrn) X100 mg/dlCmuestra(mg/dl)=(0.096/ 0.138) X100 mg/dlCmuestra (mg/dl)= 69.56 mg/dl

RESULTADOS:LABORATORIO DE BIOQUMICA CLNICANombre del paciente: Laura Monserrat Saucedo HerreraSexo: FemeninoEdad: 21 Fecha: 11/ febrero / 13Mdico: A quien correspondaPARMETRORESULTADOVALORES DE REFERENCIA

Glucosa en ayuno69.56 mg/dl70-110 mg/dl

INTERPRETACIN:En la prueba realizada al paciente se puede ver que los niveles de glucosa estn por debajo de los valores de referencia pero se tomo como un resultado normal porque la diferencia es muy pequea.CONCLUSIONES:Durante esta prctica realizamos la determinacin de glucosa en la muestra de sangre perifrica de un paciente haciendo uso de un mtodo enzimtico oxidasa/peroxidasa para poder determinar el metabolismo de carbohidratos y as lograr un diagnstico acerca de una patologa.BIBLIOGRAFA CONSULTADA:Daz Portillo J., Fernndez del Barrio MT., Paredes Salido F. Aspectos bsicos de bioqumica clnica. (1997). Ediciones Daz de Santos. 293p.

PERFIL DE LIPIDOSObjetivo:Realizar la determinacin en suero de un perfil de lpidos el cual consiste en colesterol total (por el mtodo colesterol oxidasa/peroxidasa), colesterol HDL (por el mtodo por precipitacin con fosfotungato/magnesio), triglicridos (por el mtodo glicerol fosfato oxidasa peroxidasa y colesterol LDL (por el mtodo polivinil sulfato/polietilenglicol) para la evaluacin del riesgo alergnico, as como de otras patologas.Introduccin: El perfil lipdico lo constituye la cuantificacin analtica de una serie de lpidos que son transportados en la sangre por los diferentes tipos de lipoprotenas plasmticas. La determinacin de estos parmetros es un procedimiento analtico bsico para el diagnstico y seguimiento de enfermedades metablicas, primarias o secundarias. Entre estos parmetros analticos que se pueden determinar estn: el colesterol total, el colesterol transportado por las LDL, el colesterol transportado por las HDL, los triglicridos totales, ciertas apoprotenas particulares etc. El colesterol es una sustancia adiposa que forma parte de las membranas celulares. El cuerpo produce la mayor parte del colesterol en el hgado. Por este motivo, los niveles de colesterol estn determinados en gran medida por la gentica, y el colesterol alto puede ser una caracterstica hereditaria. Una dieta con alimentos ricos en colesterol, grasas saturadas, grasas trans y grasa total tambin puede afectar sus niveles de colesterol. La mayor parte del colesterol presente en su dieta proviene de productos animales, tales como carnes, grasas lcteas y yema de huevo. Los niveles de colesterol altos contribuyen a la formacin de placa en los vasos sanguneos; este proceso se denomina aterosclerosis. La placa de colesterol dentro de las paredes de los vasos sanguneos hace que estos se estrechen (enfermedad arterial coronaria), y aumenta su riesgo de ataque cardaco y derrame cerebral. Es importante que controle sus niveles de colesterol (perfil o panel lipdico) en forma rutinaria.El colesterol total es el nivel total de colesterol en la sangre. Un nivel superior a los 200 mg/dL se considera alto. El colesterol LDL, o lipoprotenas de baja densidad, tambin se denomina colesterol malo debido a la relacin comprobada entre los niveles altos de LDL y la enfermedad cardaca. La meta principal de cualquier programa de tratamiento para el colesterol es reducir el colesterol LDL. La cantidad de LDL que debe reducirse depende de sus otros factores de riesgo de enfermedad cardaca. Por ejemplo, un nivel de LDL de 130 mg/dL es aceptable en una persona sana que no tiene factores de riesgo de enfermedad cardaca. Sin embargo, si usted ya tiene una enfermedad cardaca u otros factores de riesgo significativos como diabetes o enfermedad renal crnica, debe reducirse su nivel de LDL en la mayor medida posible. Los pacientes pertenecientes a este grupo de alto riesgo deben tener un nivel de LDL igual o inferior a 70 mg/dL. El colesterol HDL, o lipoprotenas de alta densidad, tambin se denomina colesterol bueno. Se ha demostrado que niveles ms altos de colesterol HDL reducen el riesgo de enfermedad cardaca. El HDL ayuda a eliminar parte del colesterol del torrente sanguneo y lo lleva de regreso hacia el hgado. Los niveles objetivo de HDL son superiores a 40 mg/dL en el caso de los hombres y superiores a 50 mg/dL en el caso de las mujeres. En el caso de pacientes con enfermedad cardaca, el nivel de colesterol HDL debe ser el ms alto posible. Los triglicridos son partculas de grasa cuyos niveles aumentan en circunstancias tales como diabetes no controlada y obesidad. Cuando se bebe demasiada cantidad alcohol y se toman determinados medicamentos, pueden aumentar los niveles de triglicridos. Los niveles altos de triglicridos (superiores a 150 mg/dL) significan un mayor riesgo de enfermedad cardaca. La relacin colesterol total/HDL es un marcador importante de su riesgo de enfermedad cardaca. En el mejor de los casos, este valor debera ser 3 o menos.Procedimiento realizado:Colesterol total:Se extrajo la sangre de un paciente y se separ el suero de esta, se rotularon tres tubos de 12X75 como muestra, blanco y patrn, al tubo rotulado como patrn se aadieron 10l del patrn ms 1ml de reactivo , al tubo rotulado como blanco solo se aadieron 1ml de reactivo y al ltimo al tubo rotulado como muestra se le aadieron 10l de suero y 1ml de reactivo, se agitaron cada uno de los tubos y se incubaron en una estufa a 37C por 5 min pasado el tiempo se leyeron las absorbancias en espectrofotmetro a 500nm.HDL:PrecipitacinSe tomaron 0.2 ml de suero y se depositaron en un tubo eppendorf al que se le aadieron 0.5ml de reactivo precipitante, la mezcla fue agitada y incubada por 10 minutos a temperatura ambiente. Transcurridos los 10 minutos se prosigui a centrifugar durante 10 minutos a 4000 revoluciones por minuto, de nueva fue recolectado el sobrenadante en un eppendorf limpio.ColorimetraAntes de comenzar con la segunda fase se atempero el reactivo de color a temperatura ambiente. Se marcaron tres tubos de ensayo con las siguientes leyendas: blanco, patrn y muestra. Al tubo blanco se le adicionaron 100l de agua destilada, al tubo estndar se le adicionaron 100l de estndar y a el tubo muestra se le adicionaron 100l de sobrenadante, por ultimo a cada tubo se le adiciono 1000l de reactivo de color. Los tres tubos fueron agitados y se incubaron 30 minutos a 37C. La absorbancia del patrn y la muestra fueron ledas frente al blanco a una longitud de onda de 500nm.Triglicridos:Para comenzar la prctica colocamos los reactivos a temperatura ambiente para que no hubiera algn tipo de interferencia en los resultados, luego rotulamos tres tubos de 12X75 como blanco, patrn y muestra respectivamente, despus aadimos 10 l de patrn y 10 l de muestra (suero del paciente) al tubo respectivo ya marcado, para realizar las reacciones adicionamos 1ml de reactivo a cada tubo blanco, patrn y muestra mezclamos muy bien y pusimos a incubar durante 10 min a 37C en la estufa, al trmino de este tiempo medimos la absorbancia (A) del patrn y la muestra a 500 nm contra el blanco de reactivo para as llevar a cabo los respectivos clculos. El color de la reaccin es estable durante 2 horas.Clculos:Colesterol total:Formula

Sustitucin

HDLFormula

Sustitucin

Triglicridos:Formula

Sustitucin

ndice aterognico:Formula

Sustitucin

Resultados:Determinacin:Valor de la muestra.Valor normal.

Colesterol total224mg/dl140 a 200mg/dl

HDL18mg/dl150 g/dl

LDL

ndice aterognico2 g/dl.BilirrubinaLa bilirrubina que se detecta en la orina es la conjugada, y puede ser el primer indicador de una enfermedad heptica no detectada. La exposicin a la luz puede degradar esta substancia y hacerla indetectable.Material:1 frasco de boca ancha 1 probeta de 100ml1 tubo de ensaye1 portaobjetos1 cubreobjetos1gradillaEquipo:Centrifuga Microscpio.Reactivos:Muestra Biolgica de orina.Tiras reactivasCOMBUR TEST. COBAS 100 FESTS 11374208 Urin/Orina LOT 23051243 IVD, CAD 2010-10 Roche.Procedimiento Se colecto la primera orina de la maana en un frasco limpio de boca ancha.Examen fsico:Se homogenizo la muestra dando vuelta en crculos y se observo turbidez, sedimento, color y pH.Examen qumico: Se aadi del frasco de orina homogenizado a un tubo de ensayo de 13x100 hasta llenarse dos terceras partes, se introdujo la tira reactiva hasta que las almohadillas se mojaran, y se dejo que ocurriera la reaccin por 3 minutos y se procedi a leer comparando con la escala de colores de cada reaccin que viene en la etiqueta del frasco.Examen microscpico:De la muestra que se colecto en el tubo de ensayo se centrifugo a 2500 r.p.m durante 5 minutos, el sobrenadante se decant en la tarja en agua corriente y del sedimento que qued se coloc en portaobjetos, se coloc encima un cubreobjetos y se observ al microscopio a 10X y despus a 40X.

Resultados

LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLINICANombre del Paciente: Edwin Antonio Reyes Oliva.Sexo: Masculino Edad: 21 aosFecha:05 de Marzo del 2013.Mdico: A quien corresponda.

Examen Fsico:PARAMETRORESULTADOVALOR DE REFERENCIA

AspectoTransparenteTransparente

SedimentoMuy escasoNulo-escaso

ColorAmarillo oroAmarillo

pH6.05-7

Examen qumico:ParmetroResultadoValor de Referencia

GlucosaNegativo