Bioq. María de los Angeles SosaCatedra de Microbiología GeneralFACENA-UNNE

Metodologías moleculares para el diagnóstico en Microbiología

ADN de doble hebra

constituído por dos cadenas de nucleótidos unidos por un esqueleto de azúcar y fosfato, las cuales están- orientadas en sentido opuesto y son complementarias (A=T, G=C). La estructura de doble cadena del ADN es esencial para el proceso de replicación y garantiza que cada célula que se

divide recibe copia idéntica del ADN.

Comencemos analizando la Estructura del ADN

Dogma de la Biología Molecular

Estrategias

¿En que circunstancias se recurre a métodos de biología molecular en microbiología?

•Patógenos intracelulares ( Virus, M.genitalium)•Agentes no cultivables en condiciones de laboratorio (Pneumocystis carinii)•Escasa sensibilidad diagnóstica (Aspergilosis invasora, Candidiasis diseminada)•Proliferación lenta (H. capsulatum, M. tuberculosis )•Cuando se requiere de genotipificación para definir estrategias de acción terapéutica (Ej: HPV, HCV)•Cuando se desea detectar genes de resistencia antimicrobiana.•Poca cantidad de material. (LCR pediátricos)•Alto factor de dilución (análisis de agua)

MICROORGANISMOS METODOLOGÍA

VIRUS

Citomegalovirus PCR / bDNA / CH/secuenciación

HBV PCR / TMA / branched DNA

HCV RT-PCR / RT-PCR RFLP / TMA / branched DNA

HSV 1 y 2 PCR

HIV RT-PCR / bDNA / NASBA / TMA /secuenciación

Virus papiloma humano PCR-RFLP / CH

BACTERIAS

Neiseria gonorrehae PCR / TMA / LCR / CH

Bordetella pertussis PCR

Chlamydia pneumoniae PCR

Chlamydia trachomatis PCR / TMA / LCR/ CH

Legionella pneumophila PCR

Mycoplasma pneumoniae PCR

Mycoplasma hominis PCR

Ureaplasma urealyticum PCR

Mycobacterium tuberculosis PCR / TMA/ LCR

Staphilococcus aureus PCR

HONGOS

Aspergillus spp/Candida spp PCR

Pneumocystis carinii PCR

Estas estrategias diagnósticas pueden ser resumidas en:

A) Hibridación ( Southern blots, sondas moleculares, hibridación “in situ”,etc.).

B) Amplificación de material genético del organismo patógeno (PCR, LCR, etc.)

Ahora....como separo el DNA?

(Sangre, aspirados nasofaringeos, hisopados nasales, exudados, etc)

Obtención de la muestra

PRECIPITACION - Sales (apantallan cargas)

- Alcohol (dism. Cte dielectrica)

RESUSPENDER ADN

Separar las células de interés

Disgregar y homogeneizar (sin romper las células!!!)

ROMPER LAS CELULAS!!!- Medios hipotónicos- Sonicado- detergentes (FL)- Enzimas (Proteínas)

Fase acuosa enriquecida en ADN

EXTRACCION - Sv. Orgánicos

(Fenol, cloroformo, eter)

Extraccion y purificación de ADN

Ensayos de Hibridación

de

Ácidos Nucleicos.

•Southern blot.•Northern blot.•Western blot.•Hibridación in situ (FISH)•Microarray

Hibridación de ácidos nucleicos

Hibridación molecular: Desnaturalización y Renaturalización.

Desnaturalización: la doble hélice de ADN se disocia en dos hebras separadas (por calor o pH ≥ 13)

Renaturalización o hibridación molecular: reconstitución de la doble cadena de acuerdo al principio de complementariedad de bases nitrogenadas. Las cadenas complementarias se mantienen unidas por puentes de hidrógeno → interacciones débiles: las afecta el pH, Tº, concentración salina.

Tº: al ↑ T, ↓ estabilidad del duplex (por ↑ E cinética).Tmelting: -es la T a la cual se separan el 50% de los nt.

- ↑ con el % GC.

1- Sondas de Ácidos Nucleicos.

Sondas de AN: son fragmentos de ADNsc o de ARN puros y homogéneos que permiten detectar una determinada secuencia blanco en una muestra, mediante su complementariedad de bases.

Marcadas radioctivamenteMarcadas no radioctivamente ( Digoxigenina, avidina)

Principios Generales de los Ensayos de Hibridación.

Enzimas de Restricción

Enzimas que afectan AN

1. Modifican AN: fosfatasas, Kinasas, metilasas, etc.

2. Cortan AN: ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ER)

son endonucleasas que reconocen secuencias de ADN bicatenario y la cortan

TIPOS I II III

CORTE at random

fuera de sec de reconocimiento

específico

en sec de reconocimiento

específico

fuera de sec de reconocimiento

Productos heterogéneos homogéneos homogéneos

Enzimas de Restricción

1-Southern Blot

2-Northern Blot.

• Dos características importantes de esta técnica :– Especificidad de la reacción dada por la

complementariedad de la sonda.– La sonda puede encontrar la secuencia

complementaria en una mezcla de millones de moléculas relacionadas pero no complementarias

Hibridación de captura

HPV – Chlamydia trachomatis – Neisseria

Release and Release and denature denature nucleic acidsnucleic acids

Release and Release and denature denature nucleic acidsnucleic acids

Hibridación de captura CH (Digene)

Hybridize RNA Hybridize RNA probe with probe with target DNAtarget DNA

Capture Capture RNA:DNA RNA:DNA hybrids onto a hybrids onto a solid phase solid phase (in tube or microplate format)

React captured React captured hybrids with hybrids with multiple antibody multiple antibody conjugatesconjugates

Detect amplified Detect amplified chemiluminescent chemiluminescent signalsignal

Detect amplified Detect amplified chemiluminescent chemiluminescent signalsignal

Métodos de Amplificación

1. Amplificación de la secuencia diana: PCR (reacción en Cadena de la Polimerasa).

2. Amplificación basada en la transcripción (NASBA o TMA)

3. Amplificación dependiente de la DNA ligasa (LCR)4. Amplificación de la señal (bPCR)

PCR • Amplificar una secuencia en forma exponencial.

• Luego de 35 ciclos, a partir de una copia se puede obtener 236 copias de un fragmento de DNA —68 mil millones de copias.

• Comenzando con 100 copias se puede obtener 3.73 ug de DNA, a partir del cual se puede visualizar en geles, clonar en vectores particulares, secuenciar, etc.

ADN Polimerasatermoestable

Par de“primers”específicos

dH2O estéril

MgCl2

dTTP

dGTP

dCTP

dATP Desoxinucleótidos

Buffer p/ ADN Pol.

PCRPCRMezcla de Mezcla de ReacciónReacción

ADN templado

PCR: Ciclador térmico

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

PCR: pasos de la reacción

– desnaturalización• Separar las hebras

molde para la síntesis de nuevas hebras

PCR

– annealing• “aparear” primers a la

hebra molde para dirigir la síntesis de DNA

• La síntesis de DNA requiere de primers para comenzar

PCR

– Extensión

• Adición de nucleótidos, uno a la vez, para extender la hebra de DNA (extremo 3’) utilizando a la hebra madre como molde

PCR animation

PCR

• Agarosa• Buffer de corrida (ej:TBE)

• Muestra• Buffer de siembra (ej: ABF) densidad marca frente de corrida

PREPARADO DEL GEL SIEMBRA DE LA MUESTRA CORRIDA ELECTROFORETICA

PCRCorridas en gel de Agarosa

Variantes de PCRa) Simplex

b) Nested PCR.

c) Multiplex.

d) PCR real time

PCR Simplede Chlamydia tracomatis

1. Amplificación de una secuencia del gen que codifica para el ARNr 16S

2. Amplificación de una secuencia del plásmido críptico de C. trachomatis.

10 a 100 veces mas sensibles que la primera.

a. PCR - Ct• Muestra: endocervical o uretral / PBS. Neonatos: Secreción conjuntival o aspirados

nasofaríngeos.• Extracción y purificación de ADN: Proteinasa K /

Fenol-cloroformo.• PCR : Primers plásmido Ct específicos : KL1,

KL2

C. trachomatis: 241 pb

Métodos molecularesVentajas • Método “Gold standart” para C. trachomatis• Se independizan del transporte.• Alta sensibilidad y especificidad• Se pueden utilizar sondas simultáneas para

N.gonorrheae y C. trachomatis.• Se puede utilizar en muestras no invasivas

( orina)

b. PCR anidada (nested PCR)

1º Ronda de PCR

2º Ronda de PCR(primers internos al producto de la primer PCR)

-Ventajas:Aumento de la sensibilidad: Se detectan cantidades de ADN muy inferiores a las que se detectan con una PCR normal.Aumento de la especificidad: Al utilizar otros 2 cebadores internos se aumenta la posibilidad de amplificar sólo un tipo de molécula. -Desventaja:Muy sensible a las contaminaciones.

DR--------

Diagnóstico de laboratorio de las infecciones por Mycobacterium tuberculosis

- Microscopía Baciloscopía directa - ZN Búsqueda de BAAR

- Cultivo Medios sólidos: Loewenstein - Jensen Medios líquidos: Bactec - MB Check

- Diagnóstico genético-molecular DNA probes (Identificación en combinación con Bactec) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Importancia del diagnóstico por PCR del Mycobacterium tuberculosis

- Rapidez (vs. cultivo)

- Sensibilidad (vs. microscopía directa)

- Especificidad (vs. microscopís directa)

- Diagnóstico sobre tejidos incluidos en parafina

(de mayor importancia en aquellos casos en los que no seobservan bacilos en el estudio histopatológico, y en estudiosretrospectivos)

c. PCR Multiplex

Se realiza cuando en el análisis  es util amplificar varias regiones de un mismo gen o de distintos genes a la vez. En lugar de utilizar una única pareja de cebadores, se utilizan varias parejas, cada una de las cuales amplifica una región diferente. (Ej: E. coli O:157 H: 7)

 Leotta y col. Rev. Arg. Microbiol. 37:1-10, 2005

PRIMER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5’-3’)

UBICACION DENTRO DEL GEN

TAMAÑO

stx1a GAAGAGTCCGTGGGATTACG 1191-1210 130

stx1b AGCGATGCAGCTATTAATAA 1301-1320  

stx2a TTAACCACACCCCACCGGGCAGT 426-445 346

stx2b GCTCTGGATGCATCTCTGGT 752-771  

PCR Múltiple PCR Múltiple stxstx1 / 1 / stxstx2 / 2 / rfbrfbO157O157

346 bp259 bp

130 bp

O157F CGGACATCCATGTGATATGG 393-413 259

O157R TTGCCTATGTACAGCTAATCC 632-652  

PCR Factor eaePRIMER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5’-3’) TAMAÑO

FRAGMENTOpb

SK1 CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC 864

SK2 CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG

ReferenciaKarch H., Bohm H., Schmidt H, Gunzer F., Aleksic S., Heesemann J. Clonal structure and pathogenicity of Shiga-like toxin-producing, sorbitol-fermenting Escherichia coli O157:H-. J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 1200-5.

HIV

Beta actina

gagenv

PCR Múltiple HIV- diagnóstico

HIV- CARGA VIRAL

B- DNA : CHIRON

RT- PCR : AMPLICOR MONITOR ROCHE

NUCLISENS-NASBA : ORGANON-BIO MERIEUX

COBAS TAQMAN HIV 1 : REAL TIME PCR

EASY Q HIV 1 : REAL TIME NASBA

5-PCR en tiempo real

Permite cuantificar, aumento de especificidad y de sensibilidad

•Basado en la detección y cuantificación de un reporter fluorescente.•Se mide emisión de fluorescencia en cada ciclo de la PCR.

Sistemas de reporteros fluorescentes:

Syber Green Se intercala en el DNA doble cadena.

No emite fluorescencia cuando se encuentra en solución, pero sí cuando se encuentra unido al DNA.

Se mido la fluorescencia al final de cada ciclo (luego de la extensión)

VENTAJA:

- Es el más barato.

DESVENTAJA:

- No es específico, si hay amplificación de bandas inespecíficas también va a dar señal.

- No sirve para PCR multiplex

Molecular beacons Sonda que hibrida

específicamente entre los dos primers.5’ Fluorescencia3’ Quencher (apagador)

FRET: (Fluorescent Resonance Energy Transfer) el fluoróforo cuando se encuentra cercano al quencher no fluoresce ya que le transfiere su energía.

La sonda libre en solución toma una estructura de orquilla y no produce fluorescencia Cuando hibridiza con el DNA molde se separa el Fluoróforo y el quencher permitiendo la Fluorescencia.

Sondas Taqman La sonda intacta presenta un efecto FRET.

La actividad 5’ exonucleasa de la polimerasa degrada la sonda Taqman en la extención.

Se separa el fluoróforo del quencher emitiendo Fluorescencia que se incrementa en cada ciclo proporcionalmente a la sonda degradada.

Epidemiología microbiana

• RFLP Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción.(Candida)

• AFLP Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción.(HPV)

• Microarrays o chips de DNA

• Secuenciación

Polimorfismo de Largo de Fragmentos de

Restricción: RFLP Polimorfismo de Largo de Fragmentos de

Restricción: RFLP

Extraccion de ADN genómico.

Corte con enzimas de restricción.

Electroforesis en gel de agarosa.

Aislamientos de C. albicans, restricción con Eco R1, hibridización con sonda 27A

Amplificación por PCR y análisis de longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP o AFLP)

Restricción enzimática

Muestra HPVExtracción de DNA

DNA

Fragmentos de restricción

GENOTIPIF.

PCR

Producto de amplificación

PCR Enzimas de restricción

CLASIFICACION DE LOS HPV CLASIFICACION DE LOS HPV

EN BASE A SU POTENCIAL EN BASE A SU POTENCIAL ONCOGÉNICO ONCOGÉNICO

Tipos virales mucosotropos:Tipos virales mucosotropos:

HPVs de bajo riesgo: 6,11,40,42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81

HPVs de alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82

(Muñoz et al, N Engl J Med 2003)

Genotipificación HPV

RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA

- Amplificación por PCR utilizando un solo primer de secuencia arbitraria.

- Un primer adecuado genera un patrón de bandas distintivo para una determinada especie o una determinada cepa.

Análisis de Aislamientos de C. neoformans Provenientes de Distintas Regiones Geográficas de

Sud AméricaPCR con el primer (GACA)4 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

CH8

CH10

B5

B8

B7

B6

B3

B2

B4

B1

PA10

CH9

PA5

CH11

PA8

PA7

PA3

PA2

PA1

CH6

B10

B9

C30

C28

C24

C29

C27

C25

C6

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

Distancia de Ligamiento

Argentina

Paraguay

Brasil

Esta Técnica permitió identificar genotipos asociados a regiones específicas

Secuenciación de ADN

Ej. aplicaciones en infectología:Ej. aplicaciones en infectología: Determinación de Determinación de resistencia de la transcriptasa reversa y proteasa a resistencia de la transcriptasa reversa y proteasa a antivirales en pacientes HIV+; resistencia a antivirales en pacientes HIV+; resistencia a ganciclovir en CMV y resistencia a rifampicina en ganciclovir en CMV y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis.Mycobacterium tuberculosis.

DNA CHIPDNA CHIPMICROARREGLOS DE MICROARREGLOS DE

DNADNA

MICROARREGLOS

Diamètre 100µM

Conclusiones

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa.

• Ventajas:-Es rápida (3-5 minutos por ciclo) y fácil de implementar en manos capacitadas.-Sensible.-Es robusta.-Permite numerosas aplicaciones.

• Desventajas:-Se necesita cierta información de la secuencia en estudio para poder diseñar los

primers.-Limitaciones del tamaño del fragmento a amplificar-Errores de la replicación.-Contaminación (se reduce considerablemente tomando las precauciones

necesarias y en manos experimentadas).

• Errores en la PCR

– Amplicón del tamaño incorrecto - problemas en el diseño del primer

- Problemas en el apareamiento del primer/Baja temperatura de annealing

- Secuencias redundantes

– Ausencia de producto de amplificación – no se produce apareamiento con los primers

– Muy alta temperatura de annealing temperature

- primer dimeros

• Mucha cantidad de molde • No inclusión de la enzyme en la mix• de dNTPs• mucho/poco MgCl2

Productos PCR con errores

mucho/poco MgCl afecta correcciones de la polymerase Baja fidelidad de la enzyme

Taq polymerase vs Pfu

Con esta técnica, prácticamente cualquier segmento de ADN de una determinada bacteria, hongo o virus puede ser amplificado y detectado. Sin embargo, los laboratorios deben analizar varios factores, entre los cuales destaca la aplicación clínica que podría tener la detección de un determinado organismo, así como los costos, sensibilidad y especificidad del examen en comparación con las técnicas tradicionales.

En general, las técnicas de diagnóstico molecular están indicadas cuando un organismo no puede ser cultivado in vitro, o cuando requiere de un medio complejo y largos períodos de incubación.

Interpretación

Debido a la alta sensibilidad de estos exámenes, la interpretación es en algunos casos díficil, ya que el organismo puede no estar viable pero su ADN puede todavía ser amplificado. Además, la presencia de un organismo en una determinada muestra no siempre significa infección. Es por ello que para el caso de infecciones virales (VIH y CMV) se recomienda realizar la determinación de la carga viral, la cual determina la cantidad de secuencias blanco presentes en el plasma de un individuo.

Falsos positivos debido a contaminación.

Falsa positividad debido a la contaminación con ácidos nucleicos, que puede provenir de tres frecuentes: - de contaminación entre muestras -otras muestras clínicas que contienen un número elevado se secuencias blanco- - de la contaminación de reactivos, por amplificaciones anteriores- de la acumulación de productos de PCR (amplicones) en el laboratorio por amplificaciones sucesivas de la misma frecuencia.

Por estas razones, los laboratorios que usan técnicas de amplificación deben tener normas estrictas de control de calidad. En nuestro país no existen regulaciones formales, pero los laboratorios debieran tratar de cumplir el mínimo de requerimientos, como es tener un espacio separado para el procesamiento de la muestra y otro para la amplificación y tener además el personal adecuado para realizar estas técnicas.