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Dra. Laura Alvarez Berber Centro de Investigaciones Químicas, UAEM 1 BIOMOLECULAS CON POSIBLE EFECTO TERAPÉUTICO A PARTIR DE PLANTAS MEDICINALES MEXICANAS
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Dra. Laura Alvarez Berber
Centro de Investigaciones Químicas, UAEM1
BIOMOLECULAS CON POSIBLE EFECTO TERAPÉUTICO A PARTIR DE PLANTAS MEDICINALES MEXICANAS
2
RECOLECCION/CULTIVO
EXTRACCION Y/O FRACCIONAMIENTO
SELECCCION DE LA FUENTE
BIOENSAYO
ESTANDARIZACIONSEPARACION Y AISLAMIENTO
COMPUESTOS PUROSENSAYOS DE
TOXICIDAD
DETERMINACION
ESTRUCTURAL
ANALISIS
FARMACOLOGICO
CABEZA DE SERIEPRODUCCION INDUSTRIAL
DEL EXTRACTO
Análisis espectroscópico
Determinación estereoquímica
Busquedas bibliográficas
Modificaciones químicas
Síntesis
PN COMERCIAL
Estudios estructura-actividad
(SAR y QSAR)
Optimización
Técnicas cromatográficas
Bioensayo de fracciones
Metodología
Bioensayo in vivo
Metodologia para
la obtención de
PN bioactivos
biodirección
3
LINEAS DE INVESTIGACION
1. AISLAMIENTO DE PN A PARTIR DE PLANTAS MEDICINALES
MEXICANAS
2. MODIFICACIONES QUÍMICAS Y/O ENZIMÁTICAS DE PN
3. SINTESIS DE SERIES DE PN MODIFICADOS
4. ESTUDIOS DE RELACION ESTRUCTURA ACTIVIDAD
5. MEDICION INTRACELULAR DEL EFECTO SOBRE MEDIADORES DE
LA INFLAMACION EN MACROFAGOS RAW 264.7
6. DETERMINACION DE LAS INTERACCIONES ESPECIFICAS
PN/BLANCO MOLECULAR IMPLICADOS EN LA INFLMACION Y EL
CANCER (TUBULINA, COX, FOSFOLIPASAS)
44
O
HO
HO
OH
OH
OO
HOHO
OH
R
O
O
O
O
O
12
14
15
1510
O17
9O
17
O20
A-1
A-2
A-3
A-4
A-5
A-6
A-7
Lanceolitoles A1-A7 Y B1-B7 aislados de
Solanum lanceolatum
O
HO
HO
OH
OH
ORO
HOHO
OH
OH
LANCEOLITEOLES A
LANCEOLITOLES B
Inhibición de
COX-2
IC50 = 237 g/ml
58.5% de inhibición de la
fosfolipasa (100 g/ml)
55
OH
OH
OHHO
OHHO
-Ciclodextrinas
15 % p/v
CGTasa 24 h, 50 ºC, buffer pH = 6.0
Digestión con glucoamilasa de A. niger, 24 h,
50 ºC, Buffer pH = 6.0
OH
HOO
OH
OH
HO
O
OH
HO
OH
OH
+
ESQUEMA GENERAL DE GLUCOSILACIÓN DE INOSITOLES CON CGTasa
INOSITOL
β-CD
rx sin
aceptor
rx con
myo-
inositol
monogluco
sil-myo-
inositoles
Glucos
a
1 1t
i
2 2t
i
CGTasa = ciclodextringlucosil transferasa
66
α-D-glc-(12)-2L-chiro-inositol
O
O
OH
HO
HOOH
HO
HOOH
OH
OH
3 1
α-D-glc-(15)-5L-chiro-inositol
α-D-glc-(13)-3D-chiro-inositol
HO
HO
OH
O
OH
O
OH
HO
OH
OHOH
O
HO
HO
OH
OH
O
HO
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
HO
OH
HO
OH
OH
OH
1
2
α-D-glc-(11)-muco-inositol
OBTENCION DE LOS -GLUCOSIDOS DE INOSITOLES
O
O
OH
OH
OH
OH
HO
OH
HO HO
OH
54
2
α-D-glc-(15)-allo-inositol
7
Usos en la medicina tradicional:
• antihipertensivo
• diurético
• antimicrobiano
• control del colesterol
• disminución de fiebres
• antiinflamatoria
Hibiscus sabdariffa L. (Jamaica)
Estudios clínicos:
La infusión de cálices secos disminuyó la presión
arterial en 193 pacientes mexicanos con
hipertensión esencial moderada, demostrando que
existen 2 modos de acción: diurético e inhibidor de
la enzima convertidora de la angiotensina (ECA).
A. Herrera-Arellano, et. al.,Planta Medica, 2007 73, 6
8
O
OH
HO
OH
OH
O
O
OH
OH
O
HO
OH
OH
OH
OH
Sambubiosido de delfinidina
TR = 6.13 min (2)
O
OH
HO
OH
OH
O
O
OH
OH
O
HO
OH
OH
OH
Sambubiosido de cianidina
TR = 8.95 min (1)
Valores de IC50 para el extracto acuoso, fracción y antocianos
puros aislados de H. sabdariffa
Inhibidor IC50
g/mL
IC50
M
Extracto acuoso 40,04*
HSFM 91.22 ± 5.74
1 84.55 ± 2.21 141.61 ±0.003
2 68.41 ± 2.87 117.75 ±0.004
lisinopril 1.2 X 10-4 ±1.2
1.8 ±0.002
9
El extracto hidroalcohólico de la corteza
mostró actividad citotóxica y
antitumoral en el linfoma murino
L5178Y. 2
1. Puebla et al., Phytother. Res. 1998, 12, 545–548
2. Rojas-Sepulveda et al., 2012
Bursera fagaroides var. fagaroides
Aceitillo, copal, cuajiote, jiote, papelillo
De B. fagaroides existen 3 variedades:
B. fagaroides var. purpusii
B. fagaroides var elongata
B. fagaroides var fagaroides
Bursera fagaroides
10
OO
O
OCH3
OCH3
O
5´- desmetoxi-desoxipodofilotoxina (3)
PC-3, ED50 = 1.72X10-3
KB, ED50 = 0.4
MCF-7, ED50 = 0.4
HF-6, ED50 = 0.68
CC = 3.69
OO
O
OCH3
OCH3
O
H3CO
OCH3
PC-3, ED50 = 7.8X10-4
KB, ED50 = 0.35
MCF-7, ED50 = 1.28
HF-6, ED50 = 0.0389
-peltatina-A-metileter (1)
CC = 3.23CC = 2.45
OO
O
OCH3
OCH3
O
O CH3
O
H3CO
Acetil podofilotoxina (6)
PC-3, ED50 = 1X10-4
KB, ED50 = > 4MCF-7, ED50 = > 4
HF-6, ED50 = 2.41
CC = 3.08
ACTIVIDAD CITOTOXICA Y SOBRE EL CICLO CELULAR DE LOS
LIGNANOS AISLADOS DE B. FAGAROIDES VAR FAGAROIDES
OO
O
OCH3
OCH3
O
H3CO
OH
Podofilotoxina (7)
PC-3, ED50 = 0.95
KB, ED50 = 1.91X10-6
MCF-7, ED50 = 1.04X10-6
HF-6, ED50 = 1.8X10-4
11
Derivados naturales de la podofilotoxina de mayor abundancia elegidos para
determinar el mecanismo de acción mediante el estudio de las interacciones
específicas tubulina-lignanos
O
O
O
O
OCH3
OCH3
H3CO
OH
1'
2'
3'
4'
5'
6'
2
3
4
5
61
78
9
7'8'
Pdx
O
O
O
O
OCH3
OCH3
H3CO
OAc
1'
2'
3'
4'
5'
6'
2
3
4
5
61
78
9
7'8'
A
O
O
O
O
OCH3
OCH3
H3CO
OAc
1'
2'
3'
4'
5'
6'
2
3
4
5
61
78
9
7'8'
B
O
O
O
O
OCH3
OCH3
1'
2'
3'
4'
5'
6'
2
3
4
56
17
89
7'8'
OCH3
D
O
O
O
O1'
2'
5'
6'
2
3
4
56
17
89
7'8'
I
O
O
O
O
O
O
OCH3
OCH3
H3CO
OH
1'
2'
3'
4'
5'
6'
2
3
4
5
61
78
9
7'8'
L
OCH3
5´desmetoxi-β-peltatina-A-metileterAcetilpodofilotoxina7´-8´ dehidroacetilpodofilotoxina
Burseranina Podofilotoxina6-metoxipodofilotoxina
1212
✓ Efecto citotoxico.
CI50 de los compuestos
A, B, D e I en líneas
A549 y A2780.
✓ Efecto sobre el ciclo
celular. Citometria de
flujo en línea celular
A549.
✓ Efecto sobre red de
microtubulos. Ensayo
de inmunofluorescencia
en A549.
✓ Muerte celular.
Aposptosis y Necrosis
✓ Modulación de
desensamblaje de
tubulina.
Concentraciones criticas
(Cr)
✓ Sitio de unión. Ensayo
de desplazamiento
de MTC del sitio de la
colchicina
compuestos A, B, D, I y
L.
✓ Contantes de afinidad
de unión Kb. Análisis por
desplazamiento de MTC
por fluorescencia.
✓ Mapeo del epítopo de unión.
RMN STD de compuestos B,
D y L.
✓ Conformación de
compuestos en estado libre y
enlazado. RMN TR-NOE de
Comp B, D y L.
✓ Búsqueda conformacional.
Maestro 7.5, OPLS 2005.
Estudios realizados para determinar las interacciones
específicas tubulina-lignanos
Ensayos biológicos Ensayos bioquímicos Reconocimiento molecular
por RMN
1313
Efecto de los lignanos sobre los microtubulos en células de cáncer de próstata PC-3
OO
O
OCH3
OCH3
O
OCH3
OO
O
OCH3
OCH3
OO
O
O
OCH3
OCH3
O
O CH3
O
H3CO
OO
O
OCH3
OCH3
O
H3CO
OH
1414
9β
OCH3-6OCH3-4´
OCH3-3´
O-CH2-O
Off-res
STD
5´
2´
6´
38´
8
90 - 100%
80 - 90 %
50 - 80 %
Proton ppm % STD%
relativeSTD
H-5´ 6.78 40 92.3
H-2´ 6.76 38 86.2
H-6´ 6.46 41 93.3
H-3 6.23 43 98
O-CH2-O 5.8 39 89.8
H-7´ 4.5 -- --
H-9 α 4.41 -- --
H-9 β 3.96 22 51.9
OCH3- 6 3.85 44 100
OCH3- 4´ 3.66 36 83.8
OCH3- 3´ 3.64 37 85.5
H-7 α 3.07 22 50.8
H-8´ β 2.87 23 52.8
H-8 α 2.61 -- --
H-7 β 2.41 -- --
Epitope de Unión del Compuesto D (5´desmetoxi-β-peltatina-A-metileter)
Sample conditions:
Molar relation 1/30
300 μM compound.
10 μM tubulin.
1H NMR (600 MHz, D2O, 10 mM NaPi, 0.1 mM GTP pH 7.0, 298 K) of D, off resonance (down)
STD (top)
STD
General conditions:
1 s saturation
Off resonance 100ppm
On resonance -1 ppm
Time acquisition: 1:15 hrs
RECONOCIMIENTO MOLECULAR POR RMN
1515
Epítopo de unión del compuesto B (acetilpodofilotoxina)
90 - 100%
70 - 90 %
< 70 %
Protón ppm % STD
% relativo STD
H-6 6.93 10 100
H-3 6.56 10 100
H-2´ H-6´ 6.46 7 70
O-CH2-O 5.96 6 60
H-7 β 5.84 -- --
H-7´β 4.57 -- --
H-9 α 4.42 -- --
H-9 β 4.26 -- --
OCH3- 6´, 2´ 3.71 5 50
OCH3- 4´ 3.68 6 60
H-8´ β 3.32 7 60
H-8 α 2.89 -- --
OAc 2.15 6 60
100 μM compuesto
5 μM tubulina
8% DMSO
Espectro 1H STD (600 MHz, D2O, 298 K) del Compuesto B off resonance (arriba) y
STD (abajo).
16
Representación de poses de unión de la podofilotoxina (1) en color naranja y sus
derivados naturales 3 y 7 en color gris. A) Superposición de la estructura
cristalográfica PDB 1SA1 (azul) y la estructura modelada a partir de RMN
(naranja). B) Poses de unión de 1 y 7. C) poses de unión de 1 y 3. D) Superficie
molecular de la proteína alrededor del sitio de unión de 1.
17 17
Estudios químicos y farmacológicos previos
Galphimia glauca
Es conocida como calderona amarilla,
ramo de oro, hierba del piojo, flor de
diciembre y flor de chinche
1. Tortoriello, J. and Ortega, A. (1993) Planta Medica 59, 398-400.
2. Tortoriello, J., Ortega, A., Herrera-Ruiz, M., Trujillo, J., Reyes-Vázquez, C. (1998) Planta Medica, 309-313
Galphimina B * R = H
Galphimina E R = OAc
Principio activo sedante1,2
Actúa sobre las neuronas dopaminergicas
del área ventral tegmentalO
OH
OH
OH
O
OCH3O
R
H H1
3
24
5
25
6
4
23
26
9
12
14 16
1830
28
20
22
29
1818
GALPHIMINAS NATURALES CON ACTIVIDAD ESPASMOLITICA
Galphimina A Galphimina E Galphimina G
CE50= 16.54 g/ml CE50= 98.3 g/ml CE50= 98.3 g/ml
Galphimina BCE50 = 26.15 g/ml
Galphimina J
CE50 = 115 g/ml
O
H H OH
O
OAc
OH
OH
H3COO
O
H H OH
O
OH
OH
OH
H3COO
3
4
24
26
28
29
5
6
7
12
13
15
1718
20
21
22
30
O
H H OH
O
OH
OH
H3COO
O
H H OH
O
OH
OH
H3COO
O
O
H
R3OH
OAc
OH
OHH
19
RELACION-ESTRUCTURA-ACTIVIDAD BIOLOGICA
MODIFICACIONES QUE INCREMENTAN LA ACTIVIDAD
CE50 = 5.43 g/ml
CE50 = 26.15 g/ml
GBGA
CE50 = 16.54 g/ml
GFGA-HID
CE50 = 14.20 g/ml
isomerizaciónhidrogenación
O
O
H
HO
H
OH
OH
OHH
O
O
H
HO
H
OH
OH
OHH
O
O
H
HO
H
OH
OHH
O
O
H
HO
H
OH
OHH
2020
IDENTIFICACION DEL FARMACÓFORO
INDISPENSABLE
EN CONJUNTO
CON OH’s EN
ANILLO BNO IMPORTANTE
O
O
H
HO
H
OH
OH
OHH
21
EFICACIA
SEGURIDAD
COMERCIALIZACION
FITOFARMACO DE Galphimia glauca
ESTUDIOS CLINICOS
Cápsulas de extracto hidroalcohólico liofilizado y estandarizado en
las galphiminas activas
22
Algunas especies del género Bursera han adquirido importancia en los
sistemas etnobotánicos locales debido a sus propiedades aromáticas y
su aplicación etnomédica1, en particular aquellas especies de Burseras
que producen una resina llamada copal (resina aromática que se usa
como incienso2
además de su utilidad en etnomédica).
1.-Hernández J. (2005); Verticillane Derivatives from B. suntui and Bursera kerberi ; JNP; Vol. 68, No. 111, pp. 598-1602.
2- Purata S.E. (Ed.) (2008). Uso y manejo de los copales aromáticos: resinas y aceites. CONABIO/RAISES. i-60, 60.
RESINA DE COPAL
➢Gingivitis
➢ Tos
➢Sarampión
➢Infecciones bacteriales
➢Antiinflamatorio
➢Antiséptico (curaciones dentales)
➢Cicatrizante
232323
Resina de copal (Bursera copallifera)
30%
19% 0.04%0.35%
0.09%
0.07%
Efecto antiinflamatorio
Estudio químico biodirigido
HO
α-amirina
O
O
acetato de α-amirina
HO
3-epilupeol
O
O
H
formiato de 3-epilupeilo
O
O
acetato de 3-epilupeilo
O
lupenona
2424
MEDICION INTRACELULAR DEL EFECTO SOBRE MEDIADORES
DE LA INFLAMACION EN MACRÓFAGOS ACTIVADOS CON LPS
TPA= 57.25 % (1mg/oreja)NO = 33 % (30 ug/mL)COX-2 = 40.9 % (7.5 ug/mL)COX-1 = NPA (7.5 ug/mL)
(1a)O
TPA= 49.3 % (1mg/oreja)NO = 37 % (30 ug/mL)COX-2 = 28.5 % (7.5 ug/mL)COX-1 = NPA (7.5 ug/mL)
(1c)
O
O
TPA= 62.16 % (1mg/oreja)COX-2 = NPA (7.5 ug/mL)COX-1 = NPA (7.5 ug/mL)
(72)
OH
O
TPA= 89.01 % (1mg/oreja)NO = 14.9 % (30 ug/mL)COX-2 = 100 % (7.5 ug/mL)COX-1 = 37.8% (7.5 ug/mL)
(1d) C6H5
O
O
R R
TPA= 89.09 % (1mg/oreja)NO = 13.5 % (30 ug/mL)COX-2 = 69.8 % (7.5 ug/mL)COX-1 = NPA (7.5 ug/mL)
(1e) BrC6H5
RO
O
R
(1)HO
TPA= 66.39 % (1mg/oreja)NO = 54.8% (30 ug/mL)
COX-2 = NPA (7.5 ug/mL)COX-1 = NPA (7.5 ug/mL)
2525
INHIBICIÓN DE LA PRODUCCION DE OXIDO NITRICO EN
MACRÓFAGOS ACTIVADOS CON LPS
TPA= 25 % (1mg/oreja)NO = 34 % (30 ug/mL)COX-2 = NPA (7.5 ug/mL)COX-1 = NPA (7.5 ug/mL)
(2)HO
TPA= 6.04 % (1mg/oreja)NO = NPA (30 ug/mL)COX-2 = 78.6 % (7.5 ug/mL)COX-1 = NPA (7.5 ug/mL)
O
O
R
(2d) C6H5
R
TPA= 81.18 % (1mg/oreja)NO = 50 % (30 ug/mL)COX-2 = NPA (7.5 ug/mL)COX-1 = NPA (7.5 ug/mL)
(2a)
O
TPA= 69.45 % (1mg/oreja)NO = 9.2 % (30 ug/mL)COX-2 = 87.4% (7.5 ug/mL)COX-1 = NPA (7.5 ug/mL)
(2c)O
O
TPA= 77.76 % (1mg/oreja)NO = 8.8% (30 ug/mL)
COX-2 = 93.8 % (7.5 ug/mL)COX-1 = NPA (7.5 ug/mL)
O
O
R
(2e) BrC6H5
R
TPA= 79.28 % (1mg/oreja)NO = 100 % (30 ug/mL)COX-2 = NPA (7.5 ug/mL)COX-1 = 27.9 % (7.5 ug/mL)
(2g)
O
O
26
LABORATORIO NACIONAL DE ESTRUCTURA
DE MACROMOLECULAS (LANEM)
27
INFRAESTRUCTURA LANEM
2 Cromatógrafos de gases acoplado a un detector selectivo de masas (HP 5973)
3 Cromatógrafos de Líquidos acoplado a detector de masas
Espectrofotómetros FT-IR (Bruker Vector 22 y Midac Prospect),
Espectrofotómetro UV-vis con accesorio para estudios cinéticos (HP 8453),
Espectrómetro de masas de alta resolución con FAB y electrospray (Jeol JMS-
700)
Equipo de análisis elemental (Elementar Vario EL III)
Equipos de resonancia magnética nuclear (RMN) de 200, 400 MHz (Varian
Gemini y Varian Unity Inova), 500 MHz (Bruker, con sonda de sólidos), y un
equipo de RMN de 700 MHz con sonda criogénica
Difractómetro de rayos-X de monocristal con detector de área y difractómetro de
polvos (Bruker-Axs Apex)
Polarímetro Perkin-Elmer Modelo 341.
Además se cuenta con un taller de soplado de vidrio.
Se cuenta con las facilidades para el cultivo celular con una incubadora de CO2
Nuaire, una campana de flujo laminar vertical II de Fisher, centrífuga clínica,
microscopio invertido y óptico.
28
COLABORACIONES
UAEM
Silvia Marquina Bahena Elucidación estructural
María Luisa Villarreal Actividad citotóxica
Leticia González Maya Biología molecular
Judith González Christen Inflamación in vitro
María Luisa Garduño Inflamación in vivo
Amalia Maldonado Estudios de inhibición enzimática
IBT-UNAM
Enrique Salas Vidal Estudios con pez cebra
Edmundo Castillos Rosales Estudios enzimáticos
CIB-CSIC (España)
Jesús Jiménez Barbero Reconocimiento Molecular por RMN
Fernando Díaz Estudios con tubulina
Alicia Boto Síntesis Química
Conacyt Proyectos financiados 82851, C01 56431,
Programa de Cooperación Interuniversitaria
e Investigación Científica entre España e Iberoamérica (PCI-Iberoamérica)
LANEM (Laboratorio Nacional de Estructura de Macromoléculas)
31
33
