Biología molecular 01-1

MÓDULO 1 Introducción a las herramientas para la

detección de ácidos nucleicos (PARTE I)

Herramientas moleculares I: parámetros y validación para el diagnóstico bioquímico

Dr. Diego Chouhy

INFRAESTRUCTURA DEL LABORATORIO

Sala de preparación de reactivos

Preparación de reactivos para la PCR

Preparación de la mezcla de PCR

Sala de preparación de muestras

Procesamiento de muestras clínicas.

Aislamiento de ácidos nucleicos

Agregado de ácidos nucleicos a los tubos de reacción de PCR

Sala de amplificación y detección

PCR (termocicladores) Detección de los productos amplificados

Pipetas Microcentrífuga Vortex

Pipetas Microcentrífuga

Pipetas Microcentrífuga Cicladores térmicos Cubas de electroforesis Fuentes de poder Transiluminador UV Microondas

OBTENCIÓN - sangre entera anticoagulada con EDTA - plasma / suero - líquido cefalorraquídeo - biopsia - etc

ETAPAS EN EL PROCESAMIENTO

MÉTODOS MOLECULARES

CONSERVACIÓN - dentro de las 24 horas: 2 - 8°C - más de 24 horas congelar a –20°C o –70 °C.

EXTRACCION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

1- REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA

2- AMPLIFICACIÓN

3- DETECCIÓN

MÉTODOS MOLECULARES

AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

AMPLIFICACIÓN DE LA SEÑAL

AMPLIFICACIÓN DE LA SONDA

Branched DNA signal amplification (bDNA)

Ligase Chain Reaction (LCR)

Amplificación Isotérmica

TMA NASBA 3SR SDA LMPA

Amplificación No Isotérmica

Standard PCR RT-PCR Multiplex PCR Nested PCR real time PCR

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

KARY MULLIS 1985: PCR

1993: PREMIO NOBEL DE QUÍMICA

Amplificación Génica

Luego de 30-40 ciclos ≈ 109 – 1012 copias

Reacción en Cadena de la Polimerasa

Luego de 30-40 ciclos ≈ 109 – 1012 copias

La PCR es una metodología que consiste en la amplificación enzimática en ciclos repetidos de un fragmento específico de ADN utilizando la enzima

ADN polimerasa termoestable (Taq)

La amplificación in vitro del ADN se logra en tres pasos básicos:

1).-Desnaturalización del ADN a copiar (molde o diana) mediante el incremento de la temperatura (92-95°C).

2).-Hibridación de los cebadores al ADN molde mediante la disminución de la temperatura a la temperatura de anillado de los cebadores (55-65°C).

3).-Copia de las cadenas delimitadas por los cebadores. Se consigue elevando la temperatura de la reacción a la óptima de la ADN polimerasa utilizada.

N=1 N=2 N=4

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)


Oligonucleótidos (cebadores) Tampón (Buffer) ADN Polimerasa termoestable Desoxinucleótidos (dNTPs) Cloruro de Magnesio (MgCl2) ADN molde


COMPONENTES DE LA PCR


Secuencias cortas de ADN (18 - 24 nucleótidos) que flanquean el fragmento a amplificar y actúan como iniciadores (“cebadores”) de la polimerización.

1- Oligonucleótidos

Necesario para crear las condiciones óptimas para la actividad de la ADN polimerasa. A menudo contienen Tris-HCl, KCl, y a veces, MgCl2.

2- Tampón (Buffer)

Sustrato necesario para la formación de las cadena de ADN. Unen iones Mg2+. Para 1.5 mM de MgCl2, la [dNTPs] ideal es de 200 μM. Pequeños incrementos en la [dNTPs] pueden inhibir la reacción porque atraparan los iones Mg2+ necesarios para que la ADN-polimerasa funcione. Si cambiamos la [dNTPs] es importante tener en cuenta que existe una relación entre las cantidades de MgCl2 y las de dNTPs en la reacción.

3- Desoxinucleótidos (dNTPs)


La [MgCl2] afecta a la incorporación de dNTPs, la actividad polimerasa y temperatura de hibridación del híbrido cebador-ADN templado. [MgCl2] Especificidad de la reacción. [MgCl2] Eficiencia de la reacción

A: 0,5 mM - B: 0,8 mM - C: 1,5 mM D: 2,0 mM - E: 2,5 mM - F: 3,0 mM

Efecto de la concentración de MgCl2

4- Cloruro de Magnesio (MgCl2)

Producto final debe estar limpio y libre de cualquier residuo de buffers. Estos productos residuales pueden inhibir la acción de la enzima o

modificar la concentración salina del buffer de reacción. Inhibidores en la muestra (Columnas vs Técnicas manuales de extracción)

5- ADN molde




Dirección de polimerización 5’-3’. Solamente añaden desoxirribonucleótidos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a una cadena cebadora ya existente unida a una cadena molde. No inicia síntesis de ADN de novo.

6- ADN Polimerasas


Pfu ADN polimerasa

Taq ADN polimerasa Hot Start Taq ADN polimerasa

Mix de enzimas

http://www.thermoscientificbio.com

http://www.thermoscientificbio.com/

PROTOCOLO GENERAL DE MEZCLA DE REACCIÓN

Componente Volumen Concentración final

Tampón (buffer) 10X 5 µl 1X

dNTP 2 mM 5 µl 0.2 mM

Cebador sentido (10 pmol/µl)

0.5-5.0 µl 0.1-1.0 µM

Cebador antisentido (10 pmol/µl)

0.5-5.0 µl 0.1-1.0 µM

MgCl2 25 mM 2-8 µl 1-4 mM

ADN templado 5 µl 10 pg – 1 µg

Taq ADN polimerasa 5 U/µl 0.2-0.5 µl 1.0-2.5 U

H2O (libre de nucleasas) hasta 50 µl

Volumen Total 50 µl


Paso Temperatura Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial 95ºC 3-5 min. 1

Desnaturalización 95ºC 30-60 seg.

25-40 Anillado 50-68ºC 30-60 seg.

elongación 72ºC 30-60 seg.

Elongación final 72ºC 5-10 min. 1

PROTOCOLO GENERAL DE MEZCLA DE REACCIÓN


ARN

ADNc

Retrotranscripción, M-MLV

PCR, Taq cebadores

RT-PCR


En esta modificación de la PCR se incluyen dentro de la misma reacción de amplificación múltiples pares de cebadores específicos para diferentes dianas, por lo que se produce una co-amplificación de diferentes dianas. Esta modificación tiene las siguientes ventajas: se pueden testear grandes regiones de una única secuencia de

ADN en busca de alteraciones o modificaciones. se pueden testear segmentos no relacionados del genoma diana. se pueden incluir controles internos de amplificación de la muestra. se puede testear una misma muestra contra diferentes patógenos.

200 pb 300 pb 500 pb

Electroforesis

200 pb

300 pb

500 pb

PCR

PCR multiplex


Desventaja: Mayor probabilidad de contaminación. No es recomendable la apertura del 1° tubo de amplificación (sobre todo en laboratorios de

diagnóstico clínico), ya que durante la transferencia se producen aerosoles que pueden contaminar reacciones sucesivas. Para evitar esto se han desarrollado alternativas a fin de evitar la transferencia de un tubo a otro tras la 1° amplificación.

500 pb

250 pb

1ª amplificación

2ª amplificación

Nested-PCR o PCR anidada

Ventajas: Mejor sensibilidad. Se puede detectar una sola copia de

la diana sin necesidad de hibridar con sondas marcadas.

Mejor especificidad. La re-amplificación con el par de

cebadores internos sirve para verificar la especificidad de la primera ronda de amplificación.


Los procesos de amplificación y detección se producen simultáneamente. Disminución del riesgo de contaminación. Por detección fluorescente se puede medir la cantidad de ADN sintetizado en

cada momento durante la amplificación . Posibilidad de cuantificación La emisión de fluorescencia producida en la

reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.

Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos: Agentes intercalantes: fluorocromos que aumentan la emisión de fluorescencia al unirse al ADN de doble hélice. Baja especificidad. Sondas de hibridación específicas: sondas marcadas con 2 fluorocromos (un donador y un aceptor) y el fenómeno de Transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET).

Real time-PCR o PCR en tiempo real


DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS

1- Electroforesis

Separación de moléculas Matriz tamponada (agarosa, acrilamida) Separación de moléculas mediante el uso

de un campo eléctrico

“Electro” se refiere a la electricidad y “foresis” (del griego phoros) significa “trasladar”.

COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA

Agarosa Tampón o Buffer de corrida Tampón o Buffer de carga (Loading Buffer) Visualización


1- Electroforesis


Polisacárido extraído de algas. Electroforesis rápida, pero con una resolución limitada. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene determinada por su concentración. Un fragmento de ADN migra a diferentes velocidades a través de los geles según la concentración de agarosa.

AGAROSA

1- Electroforesis


La movilidad electroforética del ADN está afectada por la composición y la fuerza iónica del medio. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. Con elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. Generalmente el gel se funde y el ADN se desnaturaliza.

BUFFER DE CORRIDA

Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentración de 50 mM (pH 7,5 – 7,8). EDTA vs degradacion enzimática. Debido a la carga negativa del ADN, la migración en la corrida es hacia el ánodo (color rojo).


1- Electroforesis


BUFFER DE CARGA

Xylene cyanol Migra a aprox. 4Kb Azul de bromofenol Ayuda a visualizar que la muestra este migrando en el gel. Migra a aprox. 200 - 400 pb (depende del porcentaje de la agarosa) GLICEROL Añade densidad a la muestra.

incorporar un colorante a la muestra que, en un campo eléctrico, se desplace hacia el

ánodo a una velocidad previsible.

Añadir color a la muestra

aumentar la densidad de las muestras para que el ADN caiga

uniformemente en el pocillo


Aplicar 80 V

De 30-40 min

1- Electroforesis

CARGADO DE MUESTRA


1- Electroforesis


VISUALIZACIÓN

Para cuantificar y/o visualizar el ADN se utilizan agentes colorantes fluorescentes, los cuales aumentan notablemente su emisión cuando se unen a la doble hélice. Son agentes intercalantes que se introducen entre las bases del ADN. Generalmente son policíclicos aromáticos, hidrofobos y planares:

BROMURO DE ETIDIO

Reactivo mutagénico, por lo que se deben trabajar con equipo de seguridad.

El material contaminado con ellos generalmente se trata con nitrito sódico y ácido hipofosforoso para su degradación.


1- Electroforesis

DETECCIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO

1. Colocar gel sobre un transiluminador, encender la lámpara de UV 2. Visualizar bandas de ADN 3. Tomar fotografía 4. Determinar el peso molecular de las bandas

Marcador de peso molecular



2- Enzimoinmunoanálisis

AMPLIFICACIÓN CON CEBADORES BIOTINILADOS

PCR

B

B

B



2- Enzimoinmunoanálisis

HIBRIDACIÓN CON SONDA ESPECÍFICA

B

F

F

B +

CAPTURA EN MICROPLACA DEL HÍBRIDO

Microplaca revestida con Estreptavidina

F

B



2- Enzimoinmunoanálisis (EIA)

DETECCIÓN COLORIMÉTRICA DEL HÍBRIDO

Microplaca revestida con Estreptavidina

F

B

peroxidasa Reactivo

cromóforo NEGATIVO

POSITIVO

F

B


EIA-PCR - Amplificación NO isotérmica de ácidos nucleicos

Concentración y Purificación del ARN diana • Centrifugado a alta velocidad • Eliminación de componentes plasmáticos (por lavado)

Paso 1

Amplificación • Retrotranscripción (RT) • Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Paso 2

Detección • Hibridización • Revelado colorimétrico

Paso 3


Centrifugar 1 hora

1000 µL

600 µL

GuSCN Lysis Buffer + CI

Mix, Incubar 10 min

Centrifugar 15 min

Retirar SN

800 µL

Isopropanol

Lavar Pellet, Centrifugar 5 min

Retirar SN

1 ml

70% Ethanol 200 µL HCV

Resuspender Pellet

50µL

100 µL

Plasma

Tubos con Master Mix

HIV

HBV

Diluyente de muestra

EIA-PCR - Amplificación NO isotérmica de ácidos nucleicos


FIN DE LA PARTE 1 – MÓDULO I

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