Biología molecular en el laboratorio clínico: cómo implementar ?

Dra. Gabriela Muñoz

Laboratorio Biología Molecular

Servicio Laboratorio Clínico

Hospital Clínico Universidad de Chile

Curso Microbiología Mayo 2015

Temario

• Qué considerar ?

• Qué implementar?

• Cómo implementar?

• Cómo evaluar costos?

• Cómo controlar la calidad?

• Cómo eliminar desechos?

• Cómo interpretar?

• Cómo informar?

Es necesario implementar BM?

Necesidad clínica Sensibilidad Especificidad oportunidad

Demanda UCI Pediatría Ginecología Urologia Med Interna Infectología Ambulatorio

semanal

Frecuencia

24/7 diaria

Infraestructura Personal Equipamiento/formato/menú

Costo Implementación / costo por muestra

oportunidad

Equipos y formatos de PCR Convencional TIEMPO REAL

Investigación

IVD - RUO – S - E

SINGLE

FORMATO

COMPRA COMODATOS

ADQUISICIÓN

MULTIPLEX

PROGRAMAS UNICOS

PROGRAMAS COMPARTIDOS

OFE

RTA

D

EMA

ND

A

CO

STO

OPCIONALES PREDEFINIDOS

CUANTITATIVOS URGENCIAS

CUALITATIVOS SINDROMES

EQUIPO MENOR Y FUNGIBLES

DEFINICION NECESIDADES UTILIDAD CLINICA COSTO PRESTACIÓN DEMANDA

CUALITATIVOS SEMI Q

• Microcentrifuga /spin

• Termobloque/baño TR

• Vortex

• Micropipetas

• Microtubos RNAse free /tips con filtro

• Gradillas

• Cooler /cool rack

• Refrigeradores- Freezer

Equipos menores y fungibles

Cuál es el costo ?

• Costo por determinación

• Costo por muestra procesada

– Costo de cada reactivo desde extracción a detección (IVA): costo por determinación

– Costo de Fungibles por corrida

– Cuantas determinaciones necesito hacer por una corrida para 1 muestra ( controles, stds): costo total por muestra

– Estimación demanda mínima y máxima: costo total por protocolo

–

ANALISIS COSTO HSV (VZV)

MUESTRAS EXTRAC AMPLI CAPIL EXTRAC AMPL CAPIL

TOTAL

REACT COSTO/MTA

1 3 5 5 16.353 73135 1660 91.148 91148

2 4 6 6 21.804 87762 1992 111.558 55779

3 5 7 7 27.255 102389 2324 131.968 43989

4 6 8 8 32.706 117016 2656 152.378 38095

5 7 9 9 38.157 131643 2988 172.788 34558

6 8 10 10 43.608 146270 3320 193.198 32200

7 9 11 11 49.059 160897 3652 213.608 30515

8 10 12 12 54.510 175524 3984 234.018 29252

9 11 13 13 59.961 190151 4316 254.428 28270

10 12 14 14 65.412 204778 4648 274.838 27484

11 13 15 15 70.863 219405 4980 295.248 26841

12 14 16 16 76.314 234032 5312 315.658 26305

13 15 17 17 81.765 248659 5644 336.068 25851

14 16 18 18 87.216 263286 5976 356.478 25463

15 17 19 19 92.667 277913 6308 376.888 25126

Cotización 0119 julio

KIT EXTRACCION x 32 $145.480 + iva = $ 174.431 costo x extraccion: $5.451 5451

KIT AMPLIFICACION x 48= 590.000 + IVA 112.100 = $ 702.100 costo x amplif : $ 14.627 14627

Capilares x 480 $ 149.900 + iva = $159.381 costo x capilar: $ 332 332

total determ: 20410

Rendimiento máximo: 48 AMPLIFICACIONES 4 controles x protocolo

PCR tiempo real

Infraestructura y diseño

Extracción

transcripción One step

automatizada Manual

Extracción Mezclas carga

Separadas físicamente Equipos y fungibles exclusivos Pipetas exclusivas Zonas despejadas Guantes/delantales exclusivos

Gabinete bioseguridad II

campana aire muerto

Amplificación/detección

Flujos de aire: presiones

A R E A S

FLUJO - FRECUENCIA

Flujos de aire en PCR

Área limpia Área contaminada

Extracción manual y PCR - TR

In house Incubaciones /lavados Centrifugaciones

Columnas silica Incubaciones/lavados Centrifugaciones presion

AREA EXCLUSIVA aislada separada CAMPANA BS UNIDIRECCIONAL INSTRUCCIONES ESTRICTAS

Extracción manual y PCR - TR

TIPS

Limpiar area de trabajo antes y despues del trabajo

Decontaminar con UV post término

Area despejada al término

Preparar todo el material necesario previamente

Tubos de muestra cerrados. Abrir solo tubo en uso.

Tubos de lisis cerrados. Abrir solo en uso

Separar tubo de lisis por medio en gradilla

Seguir instrucciones

Cambiar Tips y eliminar

Usar control de extracción

Guantes / delantal desechable exclusivo

Extracción Mezcla PCR Carga eluído Amplificación/

detección

Extracción manual y PCR - TR

UNIDIRECCIONAL areas separadas /aisladas/ independiente

Exclusiva

Campana BS

(aislada)

Separada

Exclusiva

Separada

Independiente

Exclusiva

independiente

aislada (gabinete)

Separada

Exclusiva

Aislada (Gabinete)

Separada

Extracción automatizada y PCR - TR

Zona carga muestra

AREA EXCLUSIVA ( gabinete BS)

Extracción Extracción + amplificación

Zona carga eluído

Preparación de mezclas

Mantener área limpia y despejada

Bajo campana o en área exclusiva independiente

Seguir instrucciones

Mantener reactivos en frío

Marcar descongelación de reactivos

Alicuotar reactivos

Mezclar previa preparación

Mirar volumen al depositar en tubos/capilares

Guantes y delantal exclusivos

NO VOLVER A ESTA ÁREA (M)

• Bajo campana aislada separada(BS II)

• Área limpia y despejada

• Aseo previo y post con UV

• Tubos cerrados. Abrir al cargar y cerrar.

• Capilares. Tapar al cargar.

• Mirar volumen de carga. No trabajar mecanicamente.

• Cambiar tips / eliminar

• Guantes y delantal exclusivo

• Cambiar guantes para el traslado

Carga de eluídos/extraídos

Amplificación y detección

Equipos y PC Seguir instrucciones de carga y establecimiento de protocolo Mantener secuencia Area separada independiente - Climatizada -limpia Guantes nuevos al trasladar y depositar Sin guantes al programar Eliminar tubos / capilares/ placas

PCR Cuantitativa

Monitoreo infección

Pronóstico

Rol patogénico

Cuantificación acumulación exponencial : Interpretación Log10

• Uso de estándares

Diferente linearidad

Diferente formatos de unidad Copias/ ml

UI/ ml

Copias /PCR

Copias/5 ml

No intercambiables entre sí No equivalentes entre sí Copias/ ml y log10 Repetir positivos bajos / diluir

Capacitación personal

• Capacitación metodologías

• Certificado

• Capacitación en manualidades de PCR

• Mínimo 2 profesionales

• Rotación

• Mínimo frecuencia de 2-3 veces a la semana

EPP - Eliminación desechos

Sin talco

Exclusivo en cada área No tocar NADA sin guantes

•Muestras

•cortopunzante Reactivos

Tips

guantes

• AREA LIMPIA AREA SUCIA

• MATERIAL EXCLUSIVO

• CONTROLES DE CONTAMINACIÓN

• ALICUOTAR REACTIVOS

• DECONTAMINACIÓN (UDG/ UV/ hipoclorito 0,5%/ etanol 70%)

• MANIPULACIÓN

• PERSONAL ASEO

Contaminación

La contaminación no se ve ni se siente Detección tardía

FUENTE Templado Amplicones

VIA Contacto Aerosoles

Estandarización de PCR Característica Fuente Forma /frecuencia

Precisión Reproducibilidad Repetibilidad

Conocidas positivas negativas

Cuali: 3 mts LOD/ < 20%/ > 20% x 40 veces c/u QT: 5 mts alta/baja/LOD x duplicado x20 dias

Linearidad Rango detección alto y bajo

Estandarizadas positivas

7-11 concent diferentes Sobre y bajo Limites alto /bajo 2-4 replicados por concentración

S analítica Rango detección baja estandarizadas diluidas

2-40 replicados en diluciones 20 mts bajo y sobre LOD

E analítica Reacción cruzada/ interferentes/inhibición

Conocidas negativas Relación genetica Sindrome / interferentes

Cada Tipo de muestra diferente Duplicado Contaminar

Exactitud trueness Estandarizada Metodo referencia

40 -50 mts x duplicado (+) alto bajo medio 50 (-) genotipos

Revalidación

Cambio modificacion ensayo/ tipo mts

Conocidas positivas negativas

Intervalo Referencia

Cualitativo NO QT

Estandarizadas clinicamente

Diluciones LOD / CUTOFF asintomatico vs activa

Limitaciones

• Costo

• Disponibilidad de controles

• Método de referencia

• Positivos conocidos /negativos

•clinicos •otro método

• Estandares QT de proficiencia • Otros laboratorios

• Kit completo ( > 50 determinaciones) • Positivos y negativos (60/40) • Duplicado • Diluciones (LOD) QT

Controles de PCR

CLIA ( each run)

• Cualitativa – Extracción

– Amplificación :positivo/negativo

– Control interno

• Cuantitatitativa – Extracción

– Amplificación: negativo/alto /bajo

– Control interno

– Control calibración (cutoff)*

– Control rango analitico*

ISP (contaminación)

• Control extracción – H20 RNAse free

• Control reactivos – Mezcla sin DNA

• Control manipulación – Tubos con H2O intercalados

cada 3-4 mts

• Control de réplica – Mts en duplicado (TR)

Controles de PCR

Extracción

Amplificación

Inhibición

´Contaminación

Positiva* Negativa Mezcla E

Mezcla A Duplicadas

* Q positivo bajo y alto

CI

Control de inhibición (CI)

Control Interno

Homólogo extrínseco Target modificado

Heterólogo extrínseco Target diferente Primers – probes diferentes

Heterólogo intrínseco Housekeeping genes Primers – probes diferentes

Inhibidores Endógeno Exogenos CI en bajas concentraciones

Co-amplificación (Competitivo) /paralelo Desde extracción ( proceso completo) Desde mezcla ( amplificación) Diferentes tipos según formato

Protocolos

M 1

M 1

M 2

MC -

C E

M 2

MC +

C A

Muestras duplicadas •reproducibilidad •Contaminación •amplificación

Extracción amplificación

contaminación

(extraccion) Amplificación C +

contaminación

contaminación

CI

POS

NEG

Interpretación e Informes

Muestra Control (+) Control (-) CI Resultado

negativa positivo negativo positivo NEGATIVO

positiva positivo Negativo Positivo negativo

POSITIVO

negativa positivo negativo negativo INHIBIDO REPETIR

Positiva Positivo Positivo Positivo negativo

CONTAMINACION REPETIR

Positiva negativo negativo Positivo negativo

Cambio mta? Cambiar control Repetir

Método utilizado Tipo muestra Limite de detección / linearidad

No detectado / Detectado N° copias/ml log 10 Detectado fuera de rango de cuantificación ( < a 10 cps/ ml : > 100 mil cps/ml) Observaciones

Control de calidad

Cualitativos: Registro de valores de CT C(+) durante el mes (DS 2) Alternar ensayos

Cuantitativos: Registro de valores de log10 standard (+) durante el mes (CV < 20%) Alternar ensayos

Control Calidad Externo Cuali - cuantitativo

• Funcionamiento multiplex

• Desechos

• fotos