BIODIVERSIDAD Y BIODEGRADACIÓN Introducción Mecanismos de evolución y adaptación Ejemplos.
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BIODIVERSIDAD Y BIODEGRADACIÓN
Introducción
Mecanismos de evolución y adaptación
Ejemplos
PROCARIOTAS en la biosfera
Hay de 4-6 x 1030 células de procariotas
Su biomasa es muy superior a la biomasa de eucariotas
90% de los procariotas se encuentran en el SUBSUELO
10% en SUELOS, SEDIMENTOS, MASAS DE AGUA, AIRE, EUCARIOTAS
Mucha BIODIVERSIDAD
Estimación del nº de especies bacterianas: entre 10.000 y > 1 billón (109) Existen desde hace cerca de 3,5 G-años (las plantas existen desde hace 600 millones de años)
Woese, 1994
4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
Homo sapiens
Caballo
Dinosaurios
Trilobitesprocariotas
Formación de la tierra
Estabilización de la corteza Atmósfera de oxígeno
Billones de años
• Sin embargo, sólo unas 6000 especies descritas, frente a más de 1 millón entre animales y plantas, o ca. 1 millón de especies de insectos.
¿PORQUÉ? Pequeños, simples, dificultad cultivo puro, pocos estudios taxonómicos, ...
Número de procariotas en habitats acuáticos
Hábitat Volumen, Celulas/ml Nº total de celulas cm3 × 105 × 1026
Marino Plataforma continental 2.03 × 1020 5 1.0 Océano abierto Agua, por encima de 200 m 7.2 × 1022 5 360 Agua, por debajo de 200 m 1.3 × 1024 0.5 650 Sedimento, 0-10 cm 3.6 × 1019 4600 170 Dulce Lagos 1.25 × 1020 10 1.3 Rios 1.2 × 1018 10 0.012
Lagos salinos 1.04 × 1020 10 1.0
Total 1180 x 1026
Whitman et al., 1998
Número de procariotas en el suelo
Tipo de ecosistema Area, No. of cells,
× 1012 m2 × 1027
Selva tropical lluviosa 17.0 1.0 Selva tropical pluviestacional 7.5 0.5 Bosque templado esclerófilo 5.0 0.3 Bosque templado caducifolio 7.0 0.4 Bosque boreal (taiga) 12.0 0.6 Bosques y arbustedas 8.0 28.1 Sabana 15.0 52.7 Praderas templadas 9.0 31.6 Matorral desértico 18.0 63.2 Tierras cultivadas 14.0 49.1 Tundra y vegetación alpina 8.0 20.8 Pantanos y zonas húmedas 2.0 7.3 Total 123.0 255.6 x 1027
Número total de procariotas en sedimentos subsuperficiales no consolidados (por debajo de 10 m)
Nº de células, × 1028
Intervalos de Cells/cm3 Océanos Plataforma Planiciesprofundidad (m) × 106 profundos continental costeras
0.1 220.0 66.0 14.5 4.4 10 45.0 121.5 26.6 8.1 100 6.2 18.6 4.1 1.2 200 19.0 57.0 12.5 3.8 300 4.0 12.0 2.6 0.8 400 7.8 10.1 3.2 600 0.95 3.7 1.2 1200 0.61 3.2 1.0 2000 0.44 2.6 0.9 3000 0.34 0.7
Total 275.1 79.9 25.3 Grand Total: 380 × 1028 = 3.8 × 1030
¿Quién está ahí?
CULTIVOS (puros)ESTUDIO DE COMUNIDADESOBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO
CULTIVOS (puros)
Estudios fenotípicos: muy limitadosSecuencias grandes cambios en la taxonomía bacteriana%GC16S Árboles filogenéticosAnálisis de fosfolípidos u otros marcadores
Inconvenientes: Hay que cultivar! (VNC)Es posible que sólo detectemos el 1% de los presentes< 5000 especies en colecciones
APROXIMACIONES AL ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD BACTERIANA
OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO
Muestras fijadasTinción general
Inconvenientes:Información sobre ABUNDANCIA de microorganismos. NO sobre tiposTinción específica (sondas) controles muy difíciles
Métodos moleculares: aislamiento de ADN totalPCR + clonaciónAnálisis de secuencias conservadas (16S)
Inconvenientes:Información de secuencia 16S puede NO ser suficiente para delimitar especies< 5000 secuencias de ARNr 16S en bases de datos
Se recomienda utilizar una combinación de todas las aproximaciones.
ESTUDIO DE COMUNIDADES
Microorganismos presentes en la naturaleza pero que NO somos capaces de cultivar en el laboratorio.
V. cholerae en habitats “puros” incubadas en agua de mar artificial, permanecían viables pero PERDÍAN la capacidad de formar colonias en medios de cultivo
Muchas especies pueden alcanzar un estado de VIABLE, NO CULTIVABLEFallan los medios de cultivo. ¿Por qué?
“Desacoplamiento” entre metabolismo y división celular (daño oxidativo)
(atracón)
(suicidio microbiológico)
SOLUCIÓN: cultivos con restricciones nutricionales
VIABLES PERO NO CULTIVABLES
Biodiversidad y biodegradación de aromáticos
¿Por qué existen bacterias capaces de degradar tolueno y otros compuestos aromáticos, incluso xenobióticos?
¿Cómo son?
¿Cómo se originan?
CH3
tolueno
LigninaCH3
tolueno
Meter aquí transparencia 15 de Biodiversidadvamos a hablar de dioxigenasas del anillo
OH
OH
COOH
CH3
OH
OH
3-metilcatecol
OHOH
COOH
protocatecuato
OH
COOH
OH
protocatecuato
nahAa ndoAB C
cbdA B C
bphA1 A2 A3 A4 B C E G F D
tcbAaAbAcAd BIS IStcbF E D C R
cbaA B CIS IS
Mcat D F I C B benD C B AA
H I K Q J F G E T L Z Y XxylR S N B A M C
ISP
ISPß
Fd Rasa
Fd
DHDH
Rasa
C2, 3O
DIOXIGENASA DEL ANILLO
Van der Meer, 1997
Generalidades-Conclusiones
Patrones muy conservados de organización cromosómicas de las rutas,aunque se observan reorganizaciones.
Flanqueadas por secuencias de inserción en algunos casos.
La mayoría son operones.
La mayoría están reguladas.
En muchos casos se puede predecir la ruta por les genes presentes.
Toma de muestra
Carretera
Aguas subterráneasMancha alquitrán
U
DL
50 m
¿Ocurre Biodegradación en la naturaleza? (Madsen et al., 1991)
Se ha producido una adaptación de las poblaciones autóctonas a hidrocarburos poliaromáticos Ha habido crecimiento estimulado por el contaminante
Capacidad biodegradadorafenantreno
naftaleno
OH
COOH
p-HB
100
p-HB NAF FEN
50
0
D
D
D UU
U
L
L L% M
iner
aliz
ació
n
Abundancia microbiológica
D
D
D
U
U
U
L
L
L
109
0
106
103Lo
g c
fu
viables totales protozoos
Evolución natural: RESPUESTA ADAPTATIVACon frecuencia, se observa:
Compuesto xenobiótico
Comunidad microbiana incapaz de degradarlo.
Incubación en presencia del compuesto
Pasado un tiempo, se produce mineralización total del compuesto.
Ha habido un CAMBIO en la comunidad bacteriana
MECANISMOS POSIBLES:
inducción de enzimas
crecimiento de una subpoblación de la comunidad
SELECCIÓN de una subpoblación con propiedades nuevas (adaptación genética)
Lleva más tiempoNo es reproducible
Mutación /Selección
Mutaciones ocurren AL AZAREl medio selecciona las favorables.
MECANISMOS NATURALES DE EVOLUCIÓN
Transferencia genéticaPaso de ADN de una bacteria a otra
Elementos de inserciónPueden tener consecuencias varias
Duplicaciones.(de uno o varios genes, generalmente por recombinación o slippage)Suponen grandes ventajas
Recombinación y transposiciónPueden producir reorganización genética.
Mutaciones puntualesOcurren al azar, constantemente (dependen de la tasa de crecimiento)Cambio de una base en el ADN
Mutaciones puntuales- mutaciones silenciosas (se acumulan).- mutaciones con efecto fenotípico (numerosos ejemplos en el laboratorio)Son la fuente principal de biodiversidad.
ATG TTC GGA GGC ACC TTG.... . Gly: GGNMet Phe Gly Gly Thr Leu ...... Proteína A Phe: TTC, TTT
Leu: TTG, TTA
ATG TTC GGT GGC TTG.... . ATG TTA GGA GGC TTG.... . Met Phe Gly Gly Leu ...... Met Leu Gly Gly Leu ......
Proteína A*
Mutación silenciosaMutación no silenciosa
bphA1 A2 A3 A4 B C E G F D
benD C B A
Recombinación y transposiciónSe observa en rutas conocidas.
Duplicaciones.Se observan con frecuenciaMecanismo importante de evolución: no se pierde ninguna función
gen A
Duplicación
gen AMutación
gen A
Acumulación de mutaciones
gen A
gen A
gen A gen B
Etc...
Elementos de inserción.
gen A
“salto” de un elemento de inserción
gen A DESTRUIDO
IS
IS
A
gen A
genB
“salto” de un elemento de inserciónque lleva gen de interés
genBB
GANANCIA DE FUNCIÓN
gen A EXPRESADO CONSTITUTIVAMENTE
“salto” de un elemento de inserciónque lleva secuencia promotora
CPx
Transferencia genética
Paso de ADN de una bacteria a otraMuy útil en ingeniería de rutas
Vehículos:
Plásmidos (TOL, NAH, SAL) unidad de replicación independienteTransposonesFagos
Existe transferencia génica en la naturaleza
- entre poblaciones naturales
- entre organismos introducidos y organismos indígenas
- ¿Retrotransferencia?
H I K Q J F G E T L Z Y XxylR S N B A M C
gen
Elementos que intervienen en la evolución molecular de procariotas
Fuente de diversidad
Estrategias de variación
Fuentes de mutación
Cambios locales de secuencia
Reorganizaciones
Adquisición de ADN
Errores Polimerasa
Agentes mutagénicos
Recombinación “Reshuffling”
Transferencia horizontal
Diversidad genética
Limitaciones a la diversidad
Aislamiento
Reparación
Selección naturalCondiciones de vida Entorno fisico-químico Entorno biológicoTamaño de la biosfera(ca. 1030 células)
INTERCAMBIO DE GENES EN LA NATURALEZA
A.- En microcosmos, entre organismos conocidos
B.- Entre organismos indígenas y organismos introducidos
C.- Entre poblaciones naturales, in situ
Lodos industriales Pseusomonas EB62 Plásmido TOL modificado. Crece en 4-Etilbenzoato.
Pseusomonas UWC1 RifR
Transferencia de genes entre Pseusomonas en microcosmos
Inocular lodos con las dos cepasMedir supervivencia de las poblacionesAparición de transconjugantes
0
104
108
Lo
g c
fu/m
l
Tiempo (días)
0 6 12
IndígenaUWC1
EB62
UWC1/EB62
Indígena
0
104
108
Lo
g c
fu/m
l
Tiempo (días)
0 6 12
UWC1
EB62
UWC1/EB62
Añadir 4EB (4 mM)
Transferencia de genes en el suelo:Obtención de organismos “recombinantes” in situ.
Buscamos degradadores de Bifenilos policlorinados (PCBs)Es normal encontrar en la naturaleza degradadores de bifenilo.NO es normal encontrar degradadores de clorobenzoato en la naturaleza.Tenemos Pseudomonas aeruginosa JB2, capaz de degradar clorobenzoato. Queremos ver si esta cepa le puede transferir sus genes a alguna cepa del suelo, o vice versa.
Cln Cln
COOH
Cln
Muestra de suelo
+BifeniloAroclor1242P. aeruginosa JB2
Tomar muestrasSembrar en medios selectivos
¿Ocurre en la naturaleza?
”INOCULAR” CON EL GEN QUE FALTA
Tomar muestras y conteo de dos poblaciones:
Degradadores de bifenilo
Degradadores de clorobenzoato Picar a bifenilo
ClnOH
OH
PCBs
Cln Cln
Ciclo de Krebs
bph
COOH
Ciclo de Krebs
clc
Cln
Esto se ha conseguido en el laboratorio
Estrategia
P. aeruginosa JB2
Cepa indígena
Tiempo (días)
0 25 50
Log
CF
U/g
de
suel
o
5
7
8
5
6
9
Después de 15 días, empiezan a aparecer cepas capaces de degradar los dos compuestos.
8 son P. aeruginosa JB2 (BIOLOG)
Se analizar algunos recombinantes: son INESTABLES
1 es diferente JB2-M (<78%)
La cepa indígena: Pseudomonas sp. AW
C.- Entre poblaciones naturales, in situ
Sitio contaminado con alquitrán (N.Y.)Análisis de la población:
Se aislan 21 cepas Gram – capaces de crecer en naftaleno
Se analiza la población con respecto al gen nahAc
Se analiza la población con respecto al gen del ARNr 16S
transparencia
C.- Entre poblaciones naturales, in situ
Sitio contaminado con alquitrán (N.Y.)Análisis de la población:
Se aislan 21 cepas Gram – capaces de crecer en naftaleno
Se analiza la población con respecto al gen nahAc
Se analiza la población con respecto al gen del ARNr 16S
Se observa que hay mucha más distancia evolutiva al analizar secuencias 16S que al analizar el gen nahAc
Se deduce TRANFERENCIA HORIZONTAL (reciente).
Datos sugieren que la transferencia de genes también ha ocurrido a grandes distancias (dispersión).
Todas las cepas aisladas llevan un megaplásmido. nahAc se encuentra tanto en plásmido como en cromosoma, o en ambos.
¿Puede mejorar el laboratorio a la
naturaleza?