Biodegradación de Petróleo Diesel

Docente:Alumno :

Universidad Nacional “Pedro Ruiz Gallo”

Microbiología Industrial

MSc. Carmen Carreño FarfánRómulo Aycachi Inga.

Lambayeque – Marzo 2007

Biodegradación de Petróleo Diesel

Rómulo Aycachi Inga

El crudo de Petróleo El crudo de petróleo se caracteriza por ser un líquido

negro, viscoso y con una composición química sumamente compleja, pudiendo contener miles de compuestos, básicamente de la familia de los hidrocarburos.

Los hidrocarburos componen la familia predominante de compuestos (un 50-98% de la composición), por lo que constituyen uno de los grupos de contaminantes ambientales más importantes, tanto por su abundancia, como por su persistencia en distintos compartimentos ambientales.

Mayoritariamente son alcanos de cadena lineal (n-alcanos o nparafinas), alcanos ramificados (en menor cantidad), cicloalcanos (o naftenos) y cantidades variables de hidrocarburos aromáticos.

Los principales componentes se subdividen y purifican en distintas fracciones: Fracción saturada (n-alcanos, alcanos

ramificados con cadenas alquílicas y las cicloparafinas),

Fracción aromática (monoaromáticos, diaromáticos y hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs),

Fracción de resinas y Fracción de asfaltenos que son menos

abundantes y consisten en compuestos más polares, pudiéndose encontrar hidrocarburos heterocíclicos, hidrocarburos oxigenados y agregados de alto peso molecular .

Refinado del crudo de Petróleo El refinado pasa por un proceso de destilación,

con la finalidad de eliminar el color y olor, así como también, los compuestos del azufre.

Se destila a temperaturas crecientes obteniendo 4 fracciones principales: gasolina, queroseno, destilados medios (querosenos, gasoil, aceites lubricantes) y un residuo.

Este residuo se destila al vacío obteniéndose otros aceites lubricantes (más pesados), ceras y parafinas y betunes asfálticos (alquitranes).

Durante el proceso de refinado, se eliminan componentes de la fracción asfalténica (altamente recalcitrante) lo que implica que los refinados intermedios (gasoil, fueles, querosenos y también las gasolinas) sean productos relativamente más biodegradables que los coques o alquitranes residuales.

Así pues, la composición química de la gasolina es diferente a la del gasoil debido a que se han obtenido como productos de destilación del petróleo a partir de diferentes intérvalos de temperatura.

En la gasolina encontramos como componentes más abundantes: nbutano, isopentano, pentano, mono y dimetilpentanos, hexano, BTEX, mono y dimetil hexanos, trimetilbencenos, metiletilbencenos, y en menor cantidad los naftalenos, sus mono y dimetilados y heptano (de menor índice de octanaje).

Biorremediación del Petróleo Diesel usando diversos microorganismos

La biorremediación es la adición de materiales a ambientes contaminados para producir una aceleración del proceso natural de biodegradación.

La elevada complejidad de la composición del crudo de petróleo y derivados, implica la existencia de una amplia capacidad enzimática si se quiere conseguir una degradación significativa del crudo.

La mayor parte de los estudios realizados se han llevado a cabo con cepas bacterianas individuales o con la combinación de diferentes cepas aisladas.

En la mayoría de los casos, son degradadoras de alcanos, debido a que los alcanos son los componentes más abundantes del crudo de petróleo. No obstante en algunos casos, estas cepas tienen la capacidad de oxidar selectivamente las cadenas alquílicas de ciertos HAPs alquilados, compuestos abundantes en el crudo.

La alternativa a la utilización de cepas individuales es la obtención y utilización de cultivos mixtos, los cuales pueden ser consorcios definidos y consorcios no definidos.

Los consorcios definidos se caracterizan por ser una combinación de cepas aisladas con capacidades degradativas conocidas que son complementarias entre sí.

Los consorcios no definidos se caracterizan por ser el resultado de procesos directos de enriquecimiento a partir de muestras ambientales con historia previa de contaminación y por lo tanto no son el resultado de una combinación de cepas previamente aisladas.

Biosurfactantes Se dice que un soluto es un agente tensoactivo o

surfactante cuando da lugar a un descenso significativo de la tensión superficial.

El descenso de la tensión facilita la eliminación de las partículas de la suciedad de las superficies sólidas.

Son moléculas que contienen un segmento liposoluble (soluble en aceite) y otro hidrosoluble (soluble en agua o disolventes polares). La solubilidad parcial tanto en agua como en aceite permite al surfactante ocupar la interfase.

Reducen la tensión superficial y las tensiones interfaciales entre moléculas individuales en la superficie y la interfase, respectivamente. Tienen propiedades emulsionantes.

Atendiendo a estos criterios un biosurfactante sería una molécula biológica (orgánica) con propiedades surfactantes o tensoactivas producidas sobre superficies vivas, mayormente superficies de células microbianas, o excretados al medio extracelular.

Todas las propiedades y usos de los surfactantes provienen de dos propiedades fundamentales de estas sustancias: su capacidad de adsorberse a las interfases y de otra parte su tendencia a asociarse para formar estructuras organizadas.

Naturaleza químicaa) Lípidosb) Hidratos de carbonoc) Aminoácidosd) Glucolípidose) Lipopéptidos

Clasificación de los Biosurfactantes

Peso molecular a) Bajo peso molecular: glicolípidos. El más estudiado

es el rhamnolípido, producido por diversas especies como Pseudomonas. La función principal de estos biosurfactantes es reducir la tensión superficial entre fases (agua-roca).

b) Alto peso molecular: Suelen ser polisacáridos, proteínas, lipoproteínas, LPS o mezclas de estos polímeros. Estos biosurfactantes no son tan eficaces en cuanto a la reducción de la tensión superficial entre fases, pero si son buenos emulsionantes. Además se ha demostrado que son muy eficaces a bajas concentraciones y poseen una considerable afinidad por el sustrato. P.Ej. Alasan producido por Acinetobacter radioresistens.

Carga iónica Agentes aniónicos: Contiene generalmente

uno de cuatro grupos polares solubles-carboxilato, sulfonato, sulfato o fosfato- combinado con una cadena hidrocarbonada hidrófoba. Si esa cadena es corta son muy hidrosolubles y en el caso contrario tendrán baja hidrosolubilidad y actuaran en sistemas no acuosos como aceites lubricantes. Se usan principalmente en la industria de jabones y detergentes.

Agentes catiónicos: Están compuestos por una molécula lipofílica y otra hidrofílica, consistente de uno o varios grupos amonio terciarios o cuaternarios. Son utilizados comúnmente en detergentes, agentes limpiadores, líquido de lavaplatos, tratamiento de textiles, como sustancias activas antimicrobianas y en cosmética.

Agentes no iónicos: No se disocian en iones hidratados en medio acuoso. Las propiedades hidrofílicas son provistas por hidratación de grupos amido, amino, éter o hidroxilo.

Otros tipos de surfactantes: La combinación en la misma molécula de un

grupo con tendencia aniónica y de un grupo con tendencia catiónica produce un surfactante anfotérico, como por ejemplo los aminoácidos, las betainas o los fosfolípidos. Según el pH del medio una de las dos disociaciones prevalece.

Este tipo de surfactante se usa sólo en casos particulares debido a su alto costo.

Utilización de los Biosurfactantes Los contaminantes hidrofóbicos presentes en los

hidrocarburos del petróleo, suelos y aguas del medio ambiente requieren su solubilización antes de ser degradados por la célula microbiana.

Los surfactantes pueden aumentar el área de los materiales hidrofóbicos, como pesticidas en suelos y agua del medio, aumentándose así su solubilidad en agua.

La presencia de biosurfactantes puede aumentar la degradación microbiana de los contaminantes.

La habilidad de los biosurfactantes para emulsionar hidrocarburos mezclados con agua ha sido ampliamente divulgada.

Estas propiedades emulsionantes también se ha demostrado que favorecen la degradación de los hidrocarburos en el medio ambiente, por tanto los hacen muy útiles para el control de la contaminación por vertidos de aceites.

En la biorremediación en vertidos de petróleo, estudios recientes han mostrado que se puede utilizar el poder solubilizante de las micelas para extraer ciertas sustancias contaminantes aún cuando su concentración sea extremadamente baja.

Función de los biosurfactantes a la hora de aumentar la biodisponibilidad

Dispersar el petróleo aumentando la superficie de contacto.

Aumenta la biodisponibilidad de compuestos hidrofóbicos. Serían en este caso sobre todo los de bajo peso molecular.

Pueden ayudar a los microorganismos productores a desprenderse de las gotas de petróleo una vez se ha agotado la fuente de hidrocarburo que utilizaba.

Bacterias degradadoras de PD Achrornobacter Acinetobacter Actinomyces Alcaligenes Arthrobacter Bacillus Beneckea Brevebacterium Coryneformes Erwinia Flavobacterium Klebsiella

Lactobacillus Leumthrix Moraxella Nocardia Peptococcus Pseudomonas Sarcina Spherotilus Spirillum Streptomyces Vibrio Xanthomyces

Hongos degradadores de PD Allescheria Aspergillus Aureobasidium Botrytis Candida Cephalosporium Cladosporium Cunninghamella Debaromyces Fusarium Gonytrichum Hansenula Helmintrosporium

Mucor Oidiodendrum Paecylomyses Phialophora Penicillium Rhodosporidium Rhodotorula Saccharomyces Saccharomycopisis Scopulariopsis Sporobolomyces Torulopsis Trichoderma Trichosporon

También se ha reportado la utilización de dos especies de camarones en la biodegradación del petróleo, siendo estos Peanus duorarum y Peanus aztecuz cuya capacidad de degradar los hidrocarburos casi en su totalidad van desde los compuestos de 12 carbonos hasta los compuestos de 22 carbonos.

La cantidad y diversidad de los microorganismos degradadores de petróleo depende de la exposición de las aguas a estos hidrocarburos.

La velocidad de degradación de los compuestos presentes en el petróleo es como sigue:

HC saturados > aromáticos ligeros > aromáticos de alto PM > asfaltenos, resinas

PARTE PRÁCTICA

Muestra: 100 g de suelo contaminado

con PD

Tamizar

50g de tamizado

A

100 mL de caldo BH + 1% PD

10 mL de la muestra

enriquecida A100 mL de caldo BH

+ 2% PD

30 ºC x 72 hB

30 ºC x 72 h10 mL de la

muestra enriquecida

A

100 mL de caldo BH + 4% PD

30 ºC x 72 h

C

Tomar una alícuota de la

muestra enriquecida C

Agar BH + 4% PD

Sembrar

30 ºC x 48 h

Seleccionar y repicar 3 colonias

Incubar

> biomasa, > rapidez de crecimiento

Repicar

Agar BH + 4% de PD + TSA 30 ºC x 48 h

Conservar las cepas en refrigeración

Tiempo requerido para su utilización

Reactivar

5 mL caldo nutritivo

Incubar

30 ºC x 24 hCentrifugar

3500 rpm x 15 min.

Eliminar sobrenadante

Lavar sedimento con SSFE x 2 veces

consecutivas

Preparar suspensión al Tubo Nº 3 del NMF (9x108 cel/mL)

1 mL

Inocular de cada cepa en botellas

Realizar esto por cada cepa

10 mL caldo BH con 0.2 mL de resarzurina y 0.1 mL de

PD

Dejamos un tubo con medio no inoculado como testigo

Incubar a 30 ºC x 5 d. a agitación cte. (150 rpm)

Observar diariamente si cambia de azul a rosado

brillante

Como se usó púrpura de bromocresol veremos el cambio de color de lila a amarillo

Del inóculo preparado al Tubo Nº 3 del NMF

(9x108 cel/mL)1 mL

Inocular en tubos de dilución con 10 mL de

caldo Extracto de Levadura + 0.2 mL de etanol

30 ºC x 3 d. en agitación constante (150 rpm)

Incubar

Observar y diariamente formación de burbujas y turbidez del medio

Centrifugar cada uno de los tubos (2000 rpm)

Tomar el sobrenadante

(1mL)

9 mL caldo levadura etanol +

0.2 mL de PDTapamos

herméticamente

Agitamos 1 min. hasta lograr una emulsión

Calibramos a cero el espectrofotómetro con el tubo

blanco

Leer absorvancia a 540 nm

Realizar la conversión de la absorvancia de cada una de

las muestras a UAE

Considerar 0.816 de absorvancia como 1 UAE/mL

RESULTADOS

Tiempo requerido para la utilización del PD como fuente de carbono y energía

CEPADÍAS DE VIRAJE

COLOR DE VIRAJE

pH

Cepa 01 ---- ---- ----

Cepa 02 5 días Violeta ≥ 6.8

Cepa 03 12 días Amarillo ≤ 5.2

Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante

CEPA UAE

Cepa 01 1.281

Cepa 02 1.353

Cepa 03 1.561

Identificación de las cepas aisladas

CARACTERISTICAS CEPA 01 CEPA 02 CEPA 03

Morfología

Bacilos cortos, espora

central no deformante

Bacilos largos, delgados,

espora terminal no deformante

Bacilos medianos no esporulados

DisposiciónDe a dos o en

cadenas cortas

De a dos Aislados y de a dos

Tinción Gram Positivo Positivo Negativo

Catalasa Positivo Positivo Positivo

Crecimiento en caldoPelícula, turbidez y sedimento

Película, turbidez y sedimento

Película, turbidez y sedimento

Reducción de NO3-

O – F glucosa

Rojo de Metilo -

Voges Proskawer + + -Hidrólisis de almidón + + +

Indol - -

Caldo glucosa + +

Caldo maltosa + +

Hidrólisis de gelatina + +

Género Bacillus sp. Bacillus sp.Pseudomonas

sp.

GRACIAS POR SU ATENCIÓN