GRASAS Y ACEITES, 60 (5),OCTUBRE-DICIEMBRE, 468-474, 2009,ISSN: 0017-3495DOi: 10.3989/gya,021409

Producción de biodiesel a partir de residuos grasos animales por vía enzimática

Por Ivanna Rivera, Gerardo Villanueva y Georgina Sandovar

Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ),44270 Guadalajara, Jalisco, México.

(*Autor para correspondencia: gsandoval@ciatej.net.mx / georgina@confluenda.net)

RESUMEN

Producción de biodiesei a partir de residuos grasosanimales por vía enzimática

Grasas animales extraídas directamente de residuos or-gánicos de un matadero municipal fueron empleadas conéxito en la reacción de transesterificación como materia pri-ma alternativa de bajo costo para la producción de biodiesel.Las reacciones de transesterificación se realizaron por víaenzimática con dos lipasas comerciales N435 y RM IM. Delas dos enzimas probadas, la enzima N435 fue la más efi-ciente tanto en el sistema libre de solvente como en el siste-ma con terbutanol como solvente. En ambos sistemas el ex-ceso de etanol fue la mejor condición para la reacciónalcanzando conversiones de 80% en 48 horas en el caso delsistema libre de solvente y 65% en 24 horas en ei sistemacon terbutanol,

PALABRAS CLAVE: Biodiesel - Etil esteres - Lipasa -Residuos grasos - Solvente - Transesterificación.

SUMMARY

Biodiesel production from animal grease wastes byenzymatic catalysis

Animal grease wastes were successfully used in thetransesterification reaction as an alternative raw material forbiodiesel production. Transesterification reactions wereperformed using an enzymatic catalysis with two commerciallipases N435 and RM IM. N435 was the most efficient in asolvent free system as well as in the system with terbuthanol.In both systems the excess of ethanol turned out to bebeneficial for the reaction obtaining conversions of 80% in 48hours and 65% in 24 hours.

KEY-WORDS: Biodiesel - Ethyl esters - Grease waste -Upase - Solvent free system - Transesterification.

1. INTRODUCCIÓN

El biodiesel se define como una mezcla demonoacilésteres de ácidos grasos de cadena largade origen vegetal o animal, para su uso en combus-tión. Además este biocombustibie constituye unaalternativa viable para la obtención de energía lim-pia y renovable. (Knothe y Dunn, 1996).

Sin embargo, su precio en promedio en el mer-cado es el doble del precio dei diese! fósil (Balat yBalat, 2008; Canakci y Sanll, 2008). Adicional-mente, algunos estudios (Haas et ai, 2006) handeterminado que la materia prima representa apro-

ximadamente entre 75% y 88% del costo total deproducción de este biocombustible por lo que esimperativo reducir estos costos para obtener unproducto competitivo en el mercado. Para ello, unaopción prometedora es encontrar alternativas a lasmaterias primas usadas tradicionalmente queactualmente son aceites vegetales vírgenes o refi-nados.

Entre las materias primas alternativas, destacanlos residuos grasos animales y vegetales, los cua-les son una materia prima ideal a bajo costo.Además se ha demostrado que existe una buenadisponibilidad, por ejemplo en USA se tiene unadisponibilidad estimada de 470 millones de tonela-das (Canakci, 2005). Estos residuos podrían serutilizados como materia prima para biodiesel, evi-tando los debates éticos de utilizar cultivos y tierrasque se destinan para fines alimenticios.

Convencionalmente el biodiesel se produce uti-lizando catalizadores básicos (Meher etal., 2006),los cuales presentan problemas de recuperacióndel catalizador y corrosión. Por otra parte, la catá-lisis enzimática se ha explorado recientementecon buenos resultados (Al-Zuhair, 2005; Dizge yKeskinler, 2008; Du, 2005; Royon eí ai, 2007);demostrando ser un sistema que proporcionagrandes ventajas en el proceso como: mayorseguridad, pueden ser usadas materias primas demenor calidad, el producto y subproducto seobtienen con mayor grado de pureza y los proce-sos enzimáticos son generalmente más limpios yecológicos.

Además, en estudios recientes se han probadoresiduos grasos vegetales en la producción de bio-diesel. Sin embargo hay muy pocos estudios sobreresiduos grasos animales, los cuales al tener mayorcontenido de ácidos grasos saturados, proporcio-nan mayor estabilidad al producto final, indepen-dientemente del catalizador empleado, aunquepuede aumentar la temperatura de fusión del bio-diesel obtenido, io que puede ser una desventajabajo algunos climas (Lee et al., 2002), más no asíen el caso de climas tropicales.

En este trabajo se estudia el efecto de la rela-ción molar y el uso del terbutanol como solventesobre la reacción de transesterificación sobre resi-duos grasos animales extraídos de los residuosorgánicos de un matadero municipal. Para ello, secaracterizaron las materias primas y se llevaron a

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PRODUCCIÓN DE BIODIESEL A PARTIR DE RESIDUOS GRASOS ANIMALES POR VÍA ENZIMÁTICA

cabo los estudios de los efectos estadísticamentesignificativos de estos factores sobre la velocidadinicial de reacción y la conversión.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Materiales

Las lipasas RM IM (lipasa de Rhizomucor mie-hei inmovilizada soporte hidrofílico) y N435 (lipasaB de Candida antárctica inmovilizada en soportehidrofóbico), fueron una generosa donación deNovozymes, los residuos grasos animales fueronobtenidos del matadero municipal de la ciudad deSan Luis Potosí (México), el hexano HPLC fuemarca Karal y todos los demás solventes utilizadosfueron grado reactivo.

La relación molar grasaretanol fue calculada enbase a la composición en ácidos grasos encontra-da. La masa molecular de la mezcla reaccional secálculo en 936 g/mol.

Indice de yodo

El índice de peróxido o índice de yodo se deter-minó usando el método 28.022-28.023 de AOAC(1984).

índice de acidez

E! contenido de ácidos grasos libres (AGL) sedeterminó por titulación alcalina de acuerdo almétodo Ca 5a-40 de la AOCS (1989) y su resulta-do es expresado como por ciento de ácido oleico.

2.2. Extracción de las grasas

Las muestras obtenidas de residuos orgánicosde res y de cerdo (conteniendo porciones visiblesde grasa) son cortadas en porciones pequeñaspara posteriormente extraer la grasa mediantecalentamiento en estufa a una temperatura de50 °C durante 24 horas. Eí líquido obtenido se hacepasar por una gasa para evitar la presencia de resi-duos sólidos. Finalmente se almacena a -20 gra-dos centígrados para su posterior uso.

2.3. Caracterización de las grasas

Perfil de ácidos grasos

Para la obtención del perfil de ácidos grasos seutiliza el método de trifloruro de boro y para el aná-lisis cromatográfico se emplea un cromatógrafo degases Agilent 6980, equipado con una columna HP23 y cuyo método opera bajo las siguientes condi-ciones temperatura inicial del horno: 200 °C, gra-diente: 25 "C/min hasta 180 °C y mantener por 30min además 5 °C/min hasta 250°C durante 15 min.,flujo de helio 2 ml/min., flujo de aire: 400 ml/min,flujo de H2 : 40 mí/min, volumen de inyección: 0.5M.L., makeup: 30 ml/min, relación split: 100/1. Parala derivatización se adicionan 300 mg de muestra aun matraz con perlas de ebullición desengrasadasy 4 mL de NaOH 0.5 N. Se conecta un refrigerantey se coloca en baño maria a 75 "C por 12 min.Pasado este tiempo se añade por la parte superiordel refrigerante 5 mL de trifluoruro de boro y se dejaen el baño otros 2 min. Posteriormente, adicionar 3mL de n-heptano y se mantiene en eí baño 1 min.El matraz se retira del sistema y se tapa paraenfriarlo con agua corriente agitando al mismotiempo. Se agregan 20 mL de solución saturada deNaCI para llevar la fase orgánica al cuello delmatraz. Mediante una pipeta Pasteur, ayudado deuna perilla se recoge la fase heptánica tomando 1mililitro del extracto para inyectar la muestra en elcromatógrafo.

2.4. Reacciones de transesterificación

Las reacciones de transesterificación se lleva-ron a cabo en un volumen de 5 mL de. La mezclade reacción constaba de 0.8 M de una mezcla 50%grasa de cerdo y 50% grasa de res, la proporcióncorrespondiente de etanol para alcanzar una rela-ción molar 1:1 y 1:4 triglicérido: etanol y 100 mg delipasa. Las condiciones de operación en las que sellevaron a cabo las reacciones fueron 45 °C y unaagitación magnética de 300 rpm.

Las reacciones de transesterificación en terbu-tanoí se llevaron a cabo en un volumen de 5 mL dela mezcla reaccional que constaba de 0.2 M de unamezcla 50% grasa de cerdo y 50% grasa de res, laproporción correspondiente de etanol para alcan-zar una relación molar 1:1 y 1:4 triglicérido: etanoly 100 mg de lipasa. Las condiciones de operaciónen las que se llevaron a cabo las reacciones fueron45 "C y una agitación magnética de 300 rpm.

2.5. Análisis cromatográficos y estadísticos

100 |xL de muestra fueron diluidos en 900 ^LL dehexano HPLC y analizadas por cromatografía degases con una columna HP5 bajo las siguiente con-diciones: Temperatura inicial del horno: 200 °C., gra-diente: 5°C/min, hasta 300 "C y mantener por 13min.. Flujo de helio 2 ml/min., Flujo de aire: 400ml/min. Flujo de Hg : 40 ml/min. Volumen de inyec-ción: 0.2 tJiL.Makeup: 30 ml/min. Relación split: 50/1.

Todas las determinaciones fueron Nevadas acabo por duplicado. El cálculo del porcentaje deconversión en las reacciones de transesterificaciónse Nevo a cabo mediante ía siguiente ecuación:

% Conversión =(mM totaíes de etií esteres* 100)

(3*mM trigíicérido)(1)

El análisis de los datos experimentales se líevoa cabo por medio dei software Statgraphics"". Eídiseño experimental utiíizado fue un 2^ con unarépíica. Los tres factores estudiados fueron: el bio-cataíizador, la presencia de solvente y el radio

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molar. Con dos variables de respuesta: % de con-versión y velocidad inicial de reacción.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Caracterización de las grasas

La determinación de índice de peróxido permi-te identificar el nivel de oxidación, presente en gra-sas y aceites, lo cual es un indicativo de la calidadde los mismos. Analizados los índices de peróxidoobtenidos en los residuos grasos {Tabla 1), seobserva que en nuestro caso son menores a losencontrados en la literatura, lo que es indicativo depoca oxidación {Badui, 1993). Esto puede ser debi-do a que las grasas son extraídas directamente delos residuos orgánicos y que se encuentran prote-gidas de la oxidación por los tejidos, lo cual repre-senta una ventaja.

El índice de acidez (Tabla 1), nos permite deter-minar la presencia de ácidos grasos libres en lamuestra. Es importante mencionar que en el casode la catálisis enzimática la presencia de ácidosgrasos libres no afecta el rendimiento de la reac-ción, ya que las enzimas son capaces de llevar acabo la reacción de esterificación directa a partir deácidos grasos libres (Canakci, 2005; Lee ef al.,2002). Esto es una ventaja frente al proceso clási-co en el cual se emplean catalizadores básicosdonde la presencia de ácidos libres en las grasas o

Tabla 1Características de las grasas

Determinación Grasade res

Grasade cerdo

Indice de acidez 4.8(% acido oleico)

índice de peróxido (meq/kg) 1.0

0.4

17.9

aceites, así como un alto nivel de oxidación, afec-tan de manera significativa los rendimientos de lareacción.

En el perfil de ácidos grasos que se presenta enla Tabla 2, se observa la presencia de alrededor de50% de ácidos grasos saturados en la grasa decerdo y alrededor de 70% en la de res, lo cual esuna de las principales diferencias con respecto a lacomposición de los aceites vegetales. Los residuosgrasos estudiados están compuestos en su mayo-ría por los ácidos esteárico, palmíttco y oleico.Estos ácidos representan el 88% y el 79%, en elcaso de los residuos grasos de res y de cerdo res-pectivamente, lo cual es consistente con los datosreportados en la literatura (Badui, 1993).

3.2. Efecto de los factores sobre la conversión

El análisis estadístico (Figura 1) demostró quetodos los factores (radio molar de sustratos, biocata-lizador y la presencia de solvente) son significativossobre la conversión final. Además la interacción entreel biocatalizador y el radio molar de sustratos esigualmente importante en el desempeño de la reac-ción. Esto implicaría que todos los factores y la inter-acción que resurto significativa se deben optimizar.

En el sistema libre de solvente, las condicionesbajo las cuales se obtuvieron mayores conversio-nes fueron un radio molar 1:4 con la enzima N435,alcanzando una conversión del 79% en 48 horas.No obstante, en las otras condiciones de reacciónanalizadas se obtuvieron conversiones menores al10% (Figura 2). Lee et al. (2002), en un estudiosimilar llevan a cabo la reacción de transesterifica-ción con fracciones grasas animales y metanol conun radio molar 1:3 y 10% p/v de la enzima N435logrando una conversión de apenas 2.6% despuésde 48 horas de reacción a una temperatura deßO^C, sin embargo al agregar 10% p/v de silica gelalcanzaron conversiones del 58%. En el mismoestudio al utilizar etanol en una reacción con adicio-

Tabla 2Perfil de ácidos grasos

Perfil obtenido (%) Literatura (%) '

LaúricoMirísticoPal míticoPaimitoleicoHeptadecanoicoEsteáricoOleicoCis-vaccénicoLinoleicoAlfa-linolénicoAraquídicoEicosenoicoOtrosTotal

SaturadoSaturadoSaturado

InsaturadoSaturadoSaturado

InsaturadoInsaturadoInsaturadoInsaturadoSaturado

Insaturado

Grasa de cerdo

0.081.46

26.851.790.43

18.3633.72

2.2112.170.540.240.671.48

100.00

Grasa de res

0.082.83

28.641.142.00

33.1326.45

0.871.890.520.430.101.92

100.00

Grasa de cerdo

0.101.50

26.003.300.40

13.5043.90

0.009.500.400.200.700.50

100.00

Grasa de res

0.103.20

24.303.701.50

18.6042.60

0.002.600.700.200.302.20

100.00

Datos de literatura: Badui (1993).

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B:ENZIMA

A:SOLVENTE

C:RELACIÓNMOLAR

BC

AB

AC

O

Diagrama de Pareto para % Conv.

1Figura 1

Diagrama de Pareto, análisis estadístico del % de conversión. Los tres factores estudiados fueron: enzima, tipo de sistemay relación molar. Los tres factores fueren significativos con 95% de confianza.

nes del equivalente a un radio molar durante 3ciclos se logro una conversión del 70%. Es decirque en el presente estudio se alcanzan mayoresconversiones que las anteriormente reportadaspara la reacción de transesterificación de grasasanimales catalizada por lipasas inmovilizadas.

Algunos de los esfuerzos realizados para alcan-zar las mejores condiciones de reacción como losde Dizge y Keskinler (2008) y Yagiz et al. (2007),

utilizando aceites de desecho y aceite de cocinacon la enzima TL IM de Thermomyces lanuginosay los de Hsu etal. (2003), oon grasas de restauran-tes y la lipasa inmovilizada de Pseudomonas cepa-cia, han identificado, al igual que en el presente tra-bajo, que el radio molar es un parámetro importan-te en este tipo de reacciones, sobre todo el casodel sistema libre de solvente (Sandoval ef al.,2002). Además el exceso moderado de alcohol.

100

90 •

/ER

SIO

NC

UN

^

80 -

70 -

60 -

50 -

40 -

30 -

20 -

1 0 •

O <

RM IM 1:1RM IM 1:4N4351:1N435 1:4

10 20 30 40 50Figura 2

Efecto del radio molar triglicéridos: etanol en la reacción de transesterificación en un sistema libre de solvente, catalizadapor lipasas inmovilizada de R. m/e/ie/{RM IM) y C. antárctica B (N435). Condiciones: 45''C, 100 mg de enzima, 300 rpm.

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ayuda a alcanzar mayores conversiones de reac-ción, probablemente debido a que permite que bajela viscosidad y los sustratos sean más accesibles alsitio activo de la enzima. Sin embargo también esconocido que el exceso de etanol o metanol es uninhibidor de las lipasas (Sandoval etal., 2001).

Como se puede observar en la Figura 3, al igualque en ei sistema libre de solvente en presencia delsolvente terbutanol, las mejores condiciones dereacción fueron con un radio molar 1:4 y la enzimaN435. Sin embargo, a diferencia del sistema sin sol-vente, las conversiones obtenidas con terbutanolpara la enzima RM IM fueron mayores alcanzandoconversiones de 30% y 35% con relación molar 1:1y 1:4 respectivamente. Sin embargo, en el caso dela enzima N435 las conversiones fueron menores enterbutanol, 50% y 65% con las mismas relacionesanteriores. Además en terbutanol el equilibrio sealcanza en un menor tiempo, por lo que las cinéticassólo se siguieron durante 24 horas.

En la mayoría de estudios similares donde sellevan a cabo reacciones de esterificación-transes-terificación con solventes, se utiliza hexano debidoa la estabilidad de las lipasas en este solvente(Chulalaksananukul et al., 1990; Guncheva yZhiryakova, 2008; Sandoval etal., 2002). A diferen-cia de estos trabajos, en nuestro caso se eligió elterbutanol, ya que es más seguro que el hexano,pues es menos tóxico y menos volátil. Además, enestudios preliminares de transesterificación deaceite de oliva con etanol, se observó mayor velo-

cidad de reacción y conversión en terbutanol queen hexano (los datos no se presentan). Los mejoresresultados de la transesterificación en terbutanolcomparado con hexano pueden explicarse debido aque en este tipo de solventes más polares, el coe-ficiente de actividad termodinámica del alcohol, queademás de ser sustrato es también inhibidor com-petitivo de la lipasa, disminuye; disminuyendo sudisponibilidad real y volviéndose así menos inhibi-dor, además de tener una actividad termodinámicamenor en el denominador de la constante de equi-librio (Sandoval et al., 2002).

3.3. Efecto de los factores sobre la velocidadinicial de reacción

Las velocidades iniciales de cada cinética, semuestran en la Tabla 3. El único factor importantesobre la velocidad inicial de reacción es el tipo debiocatalizador utilizado (Figura 4). La enzima N435también se destaca en este aspecto, alcanzandouna velocidad inicial aproximadamente 3 vecesmayor que la de la enzima RM IM.

Las velocidades iniciales de reacción son unode los parámetros importantes para llevar a caboios estudios de la reacción. Sandoval et al. (2002)compararon las velocidades iniciales en un sistemapor lotes para la esterificación de ácido oleico conetanol catalizada por la lipasa inmovilizada RM IM,en un sistema libre de solvente y utilizando hexanocomo solvente. Sus resultados mostraron que ía

70

60 -

50 -

'Q 40-cocm> 30 H

OO 20 -

10 -

0 -

RM IM 1:1RM IM 1:4N435 1:1N435 1:4

10 15 20 25 30

TIEMPO (HRS)Figura 3

Efecto del radio molar triglicéridos: etanol en la reacción de transesterificación empleando terbutanol como solvente, catalizadapor lipasas inmovilizada de R miehei (RM IM) y C. antartica B (N435). Condiciones: 45°C, 100 mg de enzima, 300 rpm.

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PRODUCCIÓN DE BIODIESEL A PARTIR DE RESIDUOS GRASOS ANIMALES POR VÍA ENZIMÁTICA

Tabla 3Velocidades inicíales de reacción

Enzima Relación molar grasa: etanolVi (mmol/h/g de enzima)

Libre de solvente Terbutanol

N435

RM IM

1:11:41:11:4

10.711.20.51.9

10.313.32.93.9

velocidad inicial de la reacción es independiente dela presencia del solvente y se ve afectado principal-mente por el radio molar, sin embargo en nuestrocaso al probar dos enzimas diferentes el efectoprincipal esta dado por este factor. Es comprensiblela mayor velocidad obtenida al utilizar la lipasaN435 ya que se trata de una lipasa no selectivahacia las tres posiciones del triglicérido, mientrasque la lipasa RM IM es 1,3 regioselectiva (Schmidand Verger, 1998), por lo que la transesterificaciónsólo se completa después de que se realiza lamigración intramolecular del acilo de la posición 2 auna de las otras posiciones.

4. CONCLUSIONES

Los residuos grasos animales cuentan con unagran cantidad de ácidos grasos esterificables quelos hacen ideales para la producción de biodiesel ydisminuye los costos de producción de este biocom-bustible. Además permite la solución de los proble-mas ambientales asociados con la generación deproductos secundarios de la industria ganadera.

Los residuos grasos animales son una materiaprima viable para las reacciones de transesterifica-

ción por vía enzimática. La enzima N435 fue la mejoropción en el sistema libre de solvente y en el siste-ma utilizando terbutanol como solvente, demostran-do su versatilidad, la cual es debida en parte a sucapacidad para modificar las tres cadenas del trigli-cérido de forma indistinta, así como al tipo de sopor-te en el que se encuentra inmovilizada la lipasa.

Para llevar a cabo con éxito la síntesis de biodie-sel, es determinante la selección de los parámetrosadecuados como son: el catalizador, el radio molary el tipo de solvente a utilizar. Estos tres parámetrosdemostraron ser claves para llevar a cabo la trans-esterificación.

Por otro lado en el sistema libre de solvente apesar de que se obtiene mayor conversión, esnecesario mayor tiempo de reacción, lo cual sedebe en gran medida a las limitaciones difusionalespropias del sistema. Sin embargo a nivel industrialtiene la ventaja de que se eliminarían los costos derecuperación del solvente.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo fue realizado gracias a lafinanciación del proyecto SLP2005-01-20 del

B:ENZIMA

A:SOLVENTE

C:RELACIÓNMOLAR

BC

AB

AC

Diagrama de Pareto para Vi

o 3 12 15Figura 4

Diagrama de Pareto, análisis estadístico velocidad inicial. Los tres faotores estudiados fueron: enzima, tipo de sistemay relación molar. El único factor significativo fue la enzima con 95% de confianza.

GRASAS Y ACEITES, 60 (5), ocTUBRE-DiaEMBHE, 468-474, 2009, ISSN: 0017-3495, DOl: 10.3989/gya.0214O9 473

IVANNA RIVERA, GERARDO VILLANUEVA Y GEORGINA SANDOVAL

Fondo IVIixto CONACYT-Gobierno de San LuisPotosí (México). ívanna Rivera agradece alCONACYT su beca de maestría.

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Recibido: 25/2/09Aceptado: 2/4/09

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