BIODEGRADACIN DEPETRLEO DIESEL EN SUELOSI. Introduccin:La industria petroqumica es importante en una sociedad moderna, no obstante lafalta de un programa de proteccin ambiental, hace que el medio ambiente se contamine al producirse derrames de petrleo, principalmente de crudo, por un deterioro de los oleoductos, descargas de efluentes contaminados, afloramientos naturales a travs de fisuras de la corteza terrestre y debido a la produccin, transporte y almacenamiento de este recurso natural.A nivel mundial, el volumen de derrame de petrleo es de 1.7 a 8.8 millones de toneladas mtricas por ao y en nuestra regin (Pacfico Sudeste) es de 6000 toneladas mtricas al ao. En el Per se registran derrames de petrleo desde 1978, uno de ellosfue el producido en el oleoducto marino de Talara, estando entre los ltimos el ocurridoel ao 2000 en el ro Maran que afect la Reserva Pacaya-Samiria y el producido el30 de enero del 2008 en el que, debido a una explosin producida en un barco carguero,se derramaron frente al mar de Tumbes 1300 barriles de crudo de petrleo. Pero no sloderrames mayores causan contaminacin sino tambin los constantes derramesaccidentales en suelos de nuestra selva, los que se producen por el rompimiento delOleoducto Nor-Peruano, debido a accidentes naturales y por la actividad extractiva. Losmares del planeta sufren cada ao millones de pequeos derrames contaminantes procedentes de barcos, refineras costeras y plataformas petrolferas. Un estudio de laUniversidad Politcnica de Catalua advierte de que el impacto ambiental de los pequeos vertidos diarios es mucho mayor que el ocasionado por un gran accidente yhan lanzado una seria advertencia sobre el enorme impacto ambiental que provocan los pequeos vertidos de petrleo -desde un litro a unas 80 toneladas- por su excesivafrecuencia.Los dispersantes qumicos utilizados para favorecer la remediacin de los ambientescontaminados pueden causar un mayor impacto ecolgico que el mismo derrame, por sutoxicidad y recalcitrancia a la biodegradacin. Por tanto, una mejor alternativa desolucin es el proceso de biorremediacin, que es el tratamiento biolgico del suelo,aire y agua, mediante la biodegradacin de compuestos txicos para transformarlos encompuestos de menor o ningn impacto ambiental. II. MARCO TEORICO

2.1. HIDROCARBUROS EN LA NATURALEZA.Los hidrocarburos (HC) son un clase de compuestos naturales que no solo pueden ser encontrados en reas contaminadas por petrleo y sus derivados, sino que cantidades relativamente bajas pueden ser halladas en suelos y sedimento, derivados de la biosntesis por parte de plantas, insectos y algunos microorganismos mediante la reduccin de acil-CoA con NADH o NADPH (Rosenberg, 2006) y se consideran como los compuestos de origen natural ms estables.En el suelo, varios tipos de microorganismos han sido reportados como productores de hidrocarburos, ya sea como productos intracelulares o extracelulares; intracelularmente algunos tipos de cianobacterias se caracterizan por la produccin de 7- y 8-metil-heptadecanos; otras bacterias fotosintticas se distinguen por la produccin de hidrocarburos acclicos como pristano yfitano, mientras que la produccin de hidrocarburos alifticos de cadena larga es predominante en ciertos hongos miceliales. Extracelularmente algunos producen hidrocarburos alifticos y voltiles diferentes a metano (e.g. Bacillus spp. productor de isoprenoides)(Ladygina et al., 2006).Otra fuente importante de hidrocarburos en suelo la constituye las plantas, la superficie de los tallos, races y en especial las hojas, las cuales estn cubiertas por una mezcla a menudo cristalina, de lpidos llamados comnmente como ceras. Los componentes ms comunes de las cuales son hidrocarburos, steres, flavonas y terpenos, muchos de los cuales tienen como funcin la proteccin contra la desecacin, en especial en regiones con vientos fros secos. En especies de conferas y otras gimnospermas, las hojas contienen cantidades menores de polifenoles y resinas, las cuales tambin son usadas en procesos de cicatrizacin. La degradacin de estas ceras por parte de algunos animales es limitada, siendo los microorganismos los que logran la mineralizacin completa (Kolattukudy, 1970).A nivel interno de la regin vegetativa de la planta, los hidrocarburos pueden ser encontrados en forma de lignina, la cual es un compuesto aromtico conformado por subunidades de oxifenilpropano, formados a su vez por la polimerizacin de tres tipos de alcoholes p-coumaril, coniferil y sinapil. La lignina puede unirse a partculas de arcilla y ser degradado por bacterias de los gneros Pseudomonas spp., Xanthomonas spp., Acinetobacter spp., Bacillus spp., Arthrobacter spp. y Micrococcus spp. En el reino animal, los lpidos cuticulares de los insectos contienen hasta un 60% de alcanos, todos los cuales son saturados, aunque pueden presentarse en forma ramificada como metil alcanos, y que adems de servir como una proteccin contra la desecacin, tambin se han vinculado con seales de comunicacin para atraccin de parejas (StanleySamuelson y Nelson, 1993).El proceso general de formacin de alcanos comienza a partir de cidos grasos ya sea por elongacin luego de una decarboxilacin, o por condensacin entre dos cidos grasos 25 bioqumicamente disimilares. El acil-CoA graso es luego reducido al aldehdo, posteriormente a alcohol, el cual luego es esterificado con radicales acilo, acil-CoA o fosfolpidos.2.1.1. Degradacin microbiana de hidrocarburos. Los hidrocarburos de petrleo pueden ser divididos en cuatro clases: los saturados, los aromticos, los asfaltenos (e.g., fenoles, cidos grasos, cetonas, esteres y porfirinas) y las resinas (piridinas, quinolonas, carbazoles, sulfxidos y amidas).Todos difieren en su susceptibilidad al ataque microbiano, siendo las tasas de degradacin mayores para los saturados, seguido por los aromticos ligeros, siendo los aromticos de alto peso molecular y los compuestos polares los que exhiben las tasas ms bajas. Los HC se han clasificado en un orden de susceptibilidad al ataque microbiano en forma decreciente as: n-alcanos, alcanos ramificados, aromticos de bajo peso molecular y alcanos cclicos. Sin embargo esto no es una regla, ya que esto depende de factores como: concentracin del HC, estado fsico del HC, la temperatura, oxigeno disuelto disponible, nutrientes como N, P y K, y en menor grado, la salinidad, la presin, actividad del agua y pH (Leahy y Colwell, 1990).La degradacin de HC se realiza solamente en presencia de agua y el crecimiento de los microorganismos degradadores no se efecta sobre estos compuestos, sino en el agua que los rodea, ya que la mayora de estos compuestos son solubles en cierto grado, siendo la formacin de emulsiones un paso fundamental en el proceso de degradacin.El proceso general en la va asimilatoria de alcanos, alquenos y alquinos en Pseudomonas spp.(Figura 1) incluye inicialmente la accin de una mono-oxigenasa unida a membrana, que junto con rubredoxina y rubredoxina reductasa, ayudan a transferir electrones desde NADH+H+ , hasta una hidroxilasa citoplasmtica, para la conversin de los alcanos en alcoholes; posteriormente el alcohol es oxidado a aldehdo y luego a cido antes de proceder a la -oxidacin y luego al ciclo de cidos tricarboxlicos (ATC) o ciclo de Krebs, para servir tanto como fuente de carbono como de energa. (Van Hamme et al., 2003).En el caso de los hidrocarburos aromticos, el metabolismo asimilatorio en Pseudomonas spp. (Figura 2), implica inicialmente un primer conjunto de reacciones las cuales median la conversin del ncleo aromtico en catecol mediante la accin de dioxigenasas, y luego la conversin va rompimiento orto o meta del catecol, que conduce a acetaldehdo y piruvato, y posteriormente a la formacin de acetil-CoA los cuales son incorporados en el ciclo ATC. La mayora de estudios en la gentica del metabolismo de hidrocarburos han identificado que los genes implicados en la degradacin estn codificados en su mayora en plsmidos tanto para la degradacin de alcanos como de PAH. Bacterias, cianobacterias, algas y hongos, son capaces de degradar HC policclicos de bajo (dos o tres anillos) o alto peso molecular (cuatro o ms anillos) como naftaleno, acenafteno, antraceno, fluoranteno, pireno y criseno y usarlos como nica fuente de carbono (Leahy y Collwel, 1990; Van Hamme et al., 2003), y benzo(a) pireno por cometabolismo.

Figura 1. Esquema de reacciones del catabolismo aerobio de hidrocarburos alifticos. Esquema general del catabolismo del octano en Pseudomonas putida. Modificado de: Module Five: Biodegradation Microbiology: General biodegradation of naturally-occurring compounds. Disponible en lnea en: . Septiembre 16 200

Figura 2. Esquema de reacciones del catabolismo aerobio de hidrocarburos aromticos. Esquema general del catabolismo del benceno en Pseudomonas spp. Modificado de: Biodegradation Microbiology: General biodegradation of naturally-occurring compounds. Disponible en lnea en:. Septiembre 16 2009.2.2. DIVERSIDAD BACTERIANALa diversidad bacteriana puede ser definida como el nmero de especies o biotipos y su abundancia relativa en un espacio y tiempo determinados dentro de una comunidad o tambin puede ser definida como la cantidad y distribucin de informacin (e.g. gentica, funcional) dentro de la comunidad (i.e. comunidades complejas poseen mayor informacin). Esto incluye la diversidad de genes, hbitats, nichos y la diversidad funcional de las poblaciones; de esta forma la diversidad puede considerarse un atributo de la comunidad, relacionada con estabilidad, productividad y estructura trfica (Stirling y Wilsey, 2001). No obstante conocer que en representantes de los dominios Arquea y Bacteria se pueden encontrar todos los sistemas biolgicos de conversin de energa conocidos por el hombre, nuestro conocimiento sobre la estructura y composicin de las comunidades de procariotas, responsables en gran parte del ciclaje de materia y energa de compuestos orgnicos e inorgnicos, es an mnimo. Este fenmeno no solo puede ser atribuido a las limitaciones de las herramientas tcnicas y tericas para medir, evaluar e interpretar la diversidad de especies, sino tambin en parte por la falta de acuerdo en la definicin misma de especie bacteriana.La definicin actual de especie propuesta por Rosello-Mora y Amann (2001), reconocida por el comit ad-hoc para la re-evaluacin de la definicin de especie en bacteriologa es: es un grupo monofiltico y genmicamente coherente de organismos individuales que muestran un alto grado de similaridad en muchas caractersticas independientes, diagnosticables por una propiedad fenotpica discriminativa, referido por los autores como el concepto polifsico de especie, afirmando que una especie procariota debe ser clasificada despus de analizar y comparar tantos parmetros como sea posible incluyendo caracteres feno y genotpicos. A pesar del acuerdo sobre este concepto de especie y del conocimiento que las comunidades bacterianas no se comportan de igual manera que las comunidades vegetales o animales, los estudios de diversidad bacteriana se basan an en ndices y modelos de diversidad diseados para el estudio ecolgico de comunidades de macro-organismos. Estos ndices de valoracin de diversidad podemos dividirlos en tres grupos: a) ndices de riqueza de especies, como los ndices de Shannon-Wiener, ndice de Margalef, estadstica Q y estimadores de la riqueza de OTUs; b)ndices basados en abundancias proporcionales de especies (i.e., medidas de equitatividad/dominancia), como el ndice de equitabilidad de Shannon, ndice de Simpson, ndice de Berger-Parker e ndice de Lloyd y Ghelardi; y c) modelos de abundancia de especies como el modelo serie log, modelo log normal, modelo de la palo quebrado (broken stick) y modelo de nicho sobrelapante (Magurran, 1988; Hill, 2003).Muchos de estos ndices se han adaptado para su aplicacin con datos discretos como los proporcionados por tcnicas moleculares, pero su uso e interpretacin debe ser cuidadoso, pues cada uno as como tiene ventajas tiene limitaciones. La extensin de su utilidad depende tanto del tipo de muestreo, tamao de la muestra, as como de la sensibilidad inherente que algunos ndices poseen respecto a la dominancia o equitatividad de las poblaciones. Existen propuestas alternas para la determinacin de la diversidad que no utilizan los ndices antes mencionados; Curtis et al. (2002), afirma que es suficiente conocer el rea bajo la curva de abundancia de especies de un ambiente dado, para determinar la diversidad de especies, demostrando que la diversidad de procariotes puede estar relacionada solo con el nmero total de individuos y la abundancia del grupo ms predominante de esa comunidad.2.2.1. Diversidad bacteriana y ambiente. La conexin entre la diversidad y la funcin de los sistemas biolgicos es an un tema de discusin abierto. Para algunos una mayor diversidad implica un detrimento para el sistema ya que como afirman Atlas y Bartha (2002), las comunidades que poseen una estructura compleja generalmente poseen tasas de produccin primaria menor, debido a que se necesita menor cantidad de energa para mantener la estabilidad de la comunidad, sin embargo, las comunidades diversas poseen un mayor rango de respuestas ante una perturbacin.A pesar de esta flexibilidad, las comunidades expuestas a un factor unidireccional fuerte (e.g. estrs fisicoqumico) tienden a ser menos diversas debido a los procesos de seleccin, asegurando la estabilidad con pocas especies especializadas. Este fenmeno lo han reportado Rainey et al. (2005) en bacterias resistentes a ionizacin, reducindose la diversidad taxonmica a medida que la dosis ionizante aumentaba y Leys et al. (2004) y Nakatsu et al. (2000) para suelos contaminados con fenantreno y PAH respectivamente; cuando el control de la comunidad deja de ser abitico, dejando paso al predominio de las interacciones biolgicas, la diversidad aumenta y la estabilidad de la comunidad se asocia al alto nmero de especies. En general tanto el grado de relacin entre diversidad y estabilidad de la comunidad, como el grado de relacin entre diversidad y funcionalidad del sistema ecolgico, son aspectos an poco entendidos (Saville, 1999). Aunque una alta diversidad pueda significar una amplia flexibilidad frente a cambios ambientales, esto no quiere decir que pueda soportar alteraciones crnicas extremas y conocida la alta redundancia funcional de los microorganismos en el suelo se desconocen los efectos que la ausencia de algunas poblaciones tengan en la funcin total de la comunidad (Andren y Balandreau, 1999; Bardgett et al., 2005).Tericamente la diversidad debera aumentar con la sucesin ecolgica, generalmente en sus primeras etapas y etapas intermedias, tendiendo a la estabilidad con una disminucin de especies en la comunidad clmax.2.2.2. Diversidad bacteriana en el suelo. Dada la multiplicidad de microambientes disponibles en el suelo y las mltiples interacciones con organismos animales y vegetales, la diversidad esperada de microorganismos en el suelo es alta. Curtis et al.(2002), estimaron usando curvas de abundancia de especies que en el suelo pueden encontrarse de 6.000 a 38.000 taxa por gramo, una cantidad enorme comparada con las aproximadamente 5000 especies de bacteria reportadas hasta ahora, indicando el gran desconocimiento que se tiene de la composicin de las comunidades. Por su parte Whitman et al. (1998), estimaron el nmero total global de procariotes en 4-6 x1030 clulas, de las cuales 2,6 x1029 clulas corresponden a procariotas en hbitat de suelo, siendo la mayor abundancia la de suelos de matorrales desrticos (63.2 x1027 clulas) y la menor la de bosques tropicales estacionales (1x1027 clulas). Estos altos tamaos poblacionales pueden implicar que eventos que ocurren rara vez en el laboratorio (i.e. interacciones con otros organismos), sean frecuentes en la naturaleza, reflejndose en un nmero limitado de taxa cultivables reconocidos. Las interacciones con otros microorganismos constituyen un factor determinante en la composicin de las comunidades, como lo demuestra la reduccin en miembros de la divisin Proteobacteria y el aumento en Gram positivos con bajo contenido G+C debido a la depredacin por protistos en suelos de arrozales, aunque paradjicamente la diversidad present un aumento con la presencia de esta poblacin de depredadores (Murase et al., 2006).

2.2.2.1. Efecto del tipo de suelo en la diversidad y estructura de comunidades microbianas. En la mayora de estudios en diversidad y efecto de usos del suelo en la actividad microbiana, el tipo de suelo se ha identificado como factor relevante en la estabilidad de las comunidades microbianas; Mummey et al., (2006) reportan una mayor abundancia de Gemmatimonadales en un ultisol, y de Rubrobacteridae y -Proteobacteria en un molisol. El efecto del tipo de suelo incluso prevalece sobre el tipo de manejo, separando las comunidades en virtud de las caractersticas fisicoqumicas y no de las prcticas agrcolas como lo reportan Girvan et al.(2003), y Bossio et al. (2005), independientemente si es uso agrcola o forestal.En un gran esfuerzo por catalogar la biodiversidad en suelo a escala continental, as como los factores ambientales que la influencian, Fierer y Jackson (2006), basndose en la comparacin de secuencias de rDNA, colectaron muestras a lo largo de norte y sur Amrica y encontraron que la diversidad no estaba relacionada con factores biogeogrficos como la temperatura, latitud y otras variables que predicen tpicamente la diversidad de plantas y animales. La composicin de especies tampoco se relacion a la posicin geogrfica, aunque si encontraron que la riqueza de las comunidades difera entre tipos de ecosistema, pudiendo ser explicados estos cambios, por diferencias en el pH del suelo, siendo mayor en suelos neutros y menor en cidos, sugiriendo que la biogeografa es un factor irrelevante en la definicin de la composicin de comunidades y la diversidad.2.2.2.2. Efecto de la vegetacin en la diversidad y estructura de comunidades microbianas. La composicin de las comunidades bacterianas no slo est determinada por las caractersticas fisicoqumicas del suelo, sino que tambin los cambios en la aparicin y frecuencia de taxa pueden estar determinadas por la diversidad vegetal (Garveva et al., 2004; Grter et al., 2006) , siendo la rizsfera un ambiente propicio para la proliferacin de poblaciones de hetertrofos. En algunos casos, la presencia de ciertas especies vegetales puede ser un factor predictor de la presencia de grupos bacterianos especficos, como lo demuestra Hackl et al. (2004), para bosques de picea y roble, donde predominan grupos de Proteobacteria, Holophaga/Acidobacterium y Verrucomicrobia en contraposicin a bosques de pino donde predominan Gram positivos ricos en G+C (Grter et al., 2006).El efecto que la vegetacin puede inferir sobre el nmero, biomasa y actividades metablicas de bacterias, se observa en trabajos de Rooney et al. (2006), quienes identificaron mayores tasas de actividad enzimtica microbiana en rizsfera de legumbres versus cereales. Para Stephan et al. (2000), tanto la densidad como la diversidad funcional, se incrementaron linealmente con el logaritmo del nmero de especies vegetales y con el nmero de grupos funcionales vegetales en pastizales experimentales, relacin que no encuentran Orwin y Wardle (2005), quienes observan un efecto de la comunidad vegetal en la resistencia y resiliencia de las comunidades microbianas, independiente de la especie; no encuentran relacin entre el grupo funcional de una planta y las comunidades bacterianas, pero si encuentran relacin con especies bacterianas individuales.Incluso la respuesta a impactos externos puede ser diferencial, dependiendo del tipo de vegetacin, favoreciendo a algunos grupos bacterianos como lo reporta Hflich et al. (2000) para Pseudomonas spp., Agrobacterium spp. y Xanthmonas spp., en presencia de leguminosas en suelo margoso. Este efecto puede incluso estar influenciado por el estado de desarrollo de la planta y ser independiente del lugar de la raz (Duineveld et al., 2001) y del gradiente sucesional de vegetacin en trminos de estructura funcional y gentica (Chabrerie et al.(2003). Los cambios en las coberturas vegetales, pueden inferir en la composicin de las comunidades bacterianas, como reportan Nsslein y Tiedje (1999), para un cambio de predominio de Fibrobacter spp.y Syntrophomonas spp. en bosque a Burkholderia spp. y Rhizobium-Agrobacterium en pastizal Aunque las plantas pueden actuar indirectamente sobre las comunidades microbianas mediante compuestos generados durante la descomposicin de hojas, frutos y ramas en la hojarasca que generan, gran parte de su influencia es ejercida por el rizoplano y la rizsfera, que establecen ambientes que pueden ejercer quimiotaxias positivas o negativas en tipos especficos de poblaciones, gracias a la gran variedad de exudados que secretan al suelo y maximizado por una mayor rea superficial (Bremer et al., 2007). Aunque el cultivo de especies como leguminosas represente cambios en las entradas de materia orgnica post-cosecha, eso no necesariamente se refleja en cambios significativos en las poblaciones bacterianas activas. Duineveld et al. (2001), reportan sin embargo mayor complejidad en suelo no asociado a rizsfera de crisantemo, influencia que parece no estar determinada a un nivel taxonmico amplio, sino a nivel de cepa o de especie.2.2.2.3. Efecto del tipo de manejo del suelo sobre la abundancia, diversidad y estructura decomunidades microbianas. Aunque en muchos casos sea el tipo de suelo el determinante de la composicin de las comunidades bacterianas, en otros casos es el tipo de manejo el parmetro ms relevante. Procesos como el arado pueden aumentar el nmero de bacterias de grupos especficos como BOA, como mencionan Bruns et al. (1999), pero a la vez disminuir su diversidad; o no tener efecto como reportan Lupwaji et al. (2001), quienes tampoco identifican un efecto del tamao de agregados en la diversidad. Por su parte Neufeld y Mohn (2005) reconocen que durante el crecimiento de las plantas, la diversidad se increment en ausencia de arado y de manera proporcional al tamao del agregado, reconociendo una menor diversidad en suelos compactados. Por otro lado, Yao et al. (2006), reportan mayor ndice de diversidad y mayor coeficiente de similaridad de secuencias en suelos bajo rotacin.Los cambios en las comunidades pueden obedecer a la entrada de nuevas poblaciones, nutrientes como carbono (Drenovsky et al., 2004), cambios en propiedades fisicoqumicas del suelo por disturbios de origen antropognico o natural, (Wu et al., 2008), cambios en variables ambientales (Grter et al., 2006), aplicacin de fertilizantes (Susuki et al., 2005) o compuestos xenobiticos (Chen et al., 2007); a su vez los agro-ecosistemas tropicales generan procesos de degradacin del suelo por prdida de carbono y nitrgeno en la biomasa vegetal, agotamiento de nutrientes y reduccin de la capacidad de retencin de agua; estos cambios sin embargo pueden reversarse en tiempos que varan entre tres das, como lo reportan Fang et al. (2009), para uso del herbicida butaclor, a dos semanas como lo reportan Meier et al. (2008) en la introduccin de una cepa pura, un herbicida y nutrientes inorgnicos.Los organismos responden ante los disturbios causados por entradas de materia y energa al sistema con cambios en la abundancia de grupos especficos de organismos consecuencia de competencias en la explotacin de nuevos sustratos, y la ocupacin de nichos de especies que no se adecuan a las nuevas condiciones.Un factor importante que influye en el desarrollo y mantenimiento de las comunidades microbianas, es la disponibilidad de macroelementos como carbono, nitrgeno y fsforo, suministrados por sustratos colonizables, ya sea de forma endgena por el mismo sistema vegetal/animal o de manera exgena en la forma de fertilizantes y enmiendas orgnicas. Esto es corroborado por autores como Buckley et al. (2006), quienes asocian las variaciones en composicin de filotipos con variaciones en el contenido de materia orgnica, Ca+2 , pH y distribucin espacial del aceptor final de electrones y vreas y Torsvik (1998) quienes asocian una mayor diversidad bacteriana a suelos orgnicos en comparacin a suelos arenosos.En otros casos los impactos antropognicos no tienen efecto en las comunidades como lo reportan Hflich et al. (2000), tras varias aplicaciones de nitrgeno inorgnico, Ellis et al. (2003) para suelos contaminados con metales pesados, y Susuki et al. (2005), para aplicacin de fertilizantes orgnicos. En otros casos, la ausencia de efectos solo se observa en poblaciones especficas; Freitag et al. (2005) reportaron que la diversidad de Nitrobacter spp., no vari significativamente entre suelos fertilizados y no fertilizados con nitrgeno inorgnico; en forma similar Macur et al.(2007) lo reportan para el caso de la aplicacin del herbicida 2,4-D. en poblaciones de Burkholderia spp.2.3. METODOS DE ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD BACTERIANA.Dentro de los estudios de la dinmica de los sistemas ecolgicos, el entendimiento de la estructuray composicin de las comunidades constituye un requisito fundamental, siendo la biodiversidadun componente ms de estos sistemas y no simplemente un concepto descriptor (Gaston, 1996).Debemos mencionar inicialmente que en s mismas, las fluctuaciones naturales de las poblacionesmicrobianas son difciles de evaluar dada la dificultad inherente del anlisis simultneo deabundancia, actividad y respuesta a disturbios en mltiples poblaciones.Los intentos por describir la dinmica de las poblaciones microbianas han incluido mtodos deanlisis de comunidades y su diversidad, que han utilizado para la determinacin de la abundancia,tanto tcnicas de recuento dependientes de cultivo, como mtodos independientes de cultivo queincluyen herramientas moleculares como sondas de ADN, PCR competitiva y PCR en tiempo real.7.3.1 Mtodos dependientes de cultivo. Entre los mtodos dependientes de cultivo, las tcnicasms utilizadas son el recuento el placa, en el cual se seleccionan y se registra el nmero decolonias de organismos viables bajo condiciones especficas de nutrientes, temperatura, humedad,pH o resistencia a bioestticos o a biocidas. Otros mtodos dependientes del cultivo hacen uso delcultivo lquido en microplacas, como el mtodo BIOLOG y la tcnica de nmero ms probable(Song, et al., 2001). En la tcnica BIOLOG, se evalan los patrones de uso que hace una comunidadmicrobiana ya sea de una fuente nica de carbono o de mltiples fuentes de carbono. La tcnicade nmero ms probable, es una alternativa al recuento en placa para conteo de organismosviables, en la cual se hace uso del cultivo en lquido en microplacas, de diluciones seriadas de unamuestra, conteo basado en modelos de distribucin estadstica binaria (distribucin de Poisson)del nmero probable de organismos en una muestra. Estos conteos se realizan ya sea valindosesimplemente del grado de turbidez del medio como indicador de crecimiento o mediante el uso deindicadores de crecimiento, por cambio de pH (e.g. fenolftalena, naranja de metilo), por el uso oextincin de nutrientes (e.g. reactivo de Griess-Illosvays, reactivo de Nessler, difenilamina), por lapresencia de metabolitos o productos finales (i.e. naftol), o por indicadores de actividadbacteriana aerobia o anaerobia, heterotrfica o autotrfica (i.e. sales de tetrazolio).Las tcnicas dependientes de cultivo muy a menudo representan una desviacin de la composicinreal de las comunidades dado que suelen proporcionarse condiciones que distan de las presentesen el medio del cual fueron extradas. En la mayora de los casos la ausencia de interacciones conotras poblaciones, implica que slo presenten crecimiento poblaciones con la mayorrepresentatividad o cuyo nicho ecolgico incluye las condiciones representadas in vitro. Pararesolver este tipo de problemas se ha planteado el uso de tcnicas independientes del cultivo parael estudio de comunidades bacterianas complejas.7.3.2 Mtodos independientes de cultivo. Este tipo de estudios puede involucrar el anlisis decomponentes de la membrana celular, como lo son los anlisis de PLFA (Ranjard et al., 2000; Liu yStahl, 2001; Kirk et al., 2004), el anlisis FAMES (Atlas y Bartha, 2002) o el anlisis de las secuenciasde cidos nucleicos. Los anlisis de cidos nucleicos en especial del DNA, pueden enfocarse ya seaen toda la informacin gentica del DNA extrado (anlisis completo de DNA comunitario) o ensecuencias genmicas especificas (anlisis parcial del DNA comunitario), de una muestraambiental o de cepas puras. Las tcnicas de anlisis de cidos nucleicos, se han enfocado 33principalmente en genes del opern ribosomal particularmente en los genes rrs (i.e., RNAr 5S,16S), rrl (i.e., RNAr 23S) y en la regin espaciadora intergnica (IGS) entre los genes rrs y rrl.Los mtodos de anlisis del DNA pueden estar basados en la diferencia de tamao de fragmentosgenerados por restriccin enzimtica de productos de PCR tanto de DNA como cDNA, o poramplificacin aleatoria de una regin del genoma (RAPDs); otro grupo de tcnicas que tambinpermiten realizar el anlisis basado en las diferencias en la secuencia de nucletidos de unfragmento de DNA son DGGE, TGGE y la secuenciacin (Muyzer 1999; Nakatsu et al., 2000; GarciaPichelet al., 2001). En stas tcnicas, las diferencias en la migracin electrofortica permitenobtener perfiles de bandas (i.e., genetic fingerprinting) que proporcionan una visin global de laestructura gentica de la comunidad microbiana. Estos datos permiten la estimacin y evaluacinde la diversidad de la comunidad y en menor medida la abundancia de poblaciones especficas enel caso de DNA total procedente de muestras ambientalesEn el caso de ARDRA, el anlisis de los genes rrs y rrl implica la amplificacin y discriminacin dediferencias en la secuencia de nucletidos por el uso de enzimas de restriccin, que en si mismorepresenta una limitacin debido a la escogencia de las enzimas adecuadas que sean losuficientemente informativas, pero a su vez no generen patrones de bandeo muy complejos paraser interpretados. Una alternativa lo constituye la tcnica t-RFLP, en la cual se hace uso deiniciadores marcados con fluorocromos, lo que permite ver no todo el conjunto de bandasgenerado en la digestin enzimtica sino solo aquellos fragmentos unidos al iniciador marcado,facilitando la interpretacin de los perfiles (Ranjard, et al., 2000; Liu, y Stahl, 2001).Existen algunas dificultades inherentes al uso de tcnicas basadas en amplificacin de genes porPCR y su interpretacin; estas incluyen a los iniciadores escogidos que pueden presentardiferencias en cuanto a su hibridacin preferencial por ciertas secuencias en la comunidad;tambin, a pesar de la alta sensibilidad de la tcnicas basadas en PCR, stas pueden no reflejar lapresencia de comunidades con baja representacin, debido a los problemas inherentes a la lisis yextraccin de cidos nucleicos, as como a la presencia de sustancias inhibitorias como los cidoshmicos y flvicos, los cuales estn presentes en grandes cantidades en muestras de suelo ysedimento (von Wintzingerode et al., 1997). Existe tambin la posibilidad de generacin demolculas heteroduplex que pueden formarse entre cadenas sencillas de dos molculas similarespero no idnticas del DNA o la generacin de artefactos sobretodo en tcnicas como RAPD dada lanaturaleza aleatoria de este tipo de amplificacin, lo que conduce a conclusiones errneas acercade la composicin de la comunidad (von Wintzingerode et al., 1997; Ranjard et al., 2000; Liu yStahl, 2001 ).Ahora, sin embargo varios estudios han empezado a utilizar un enfoque polifsico en el que seincluyen tanto tcnicas cultivo dependiente, cultivo independiente, anlisis qumico y fisicoqumicoy anlisis de nemtodos (Phillips et al., 2000; van Diepeningen et al., 2006). Edenborn y Sextone(2007), recomiendan seguir un enfoque polifsico para el estudio de comunidades ya queencontraron que cuando compararon perfiles de DGGE cultivo dependiente con los constituidospor libreras de clones, 34% de las bandas eran exclusivas de cultivo dependiente, 32% de cultivoindependiente y 34% compartido.7.3.3 Electroforesis en gel de gradiente denaturalizante (DGGE) en el estudio de la diversidadbacteriana. Dentro de las estrategias para la caracterizacin del ARN SSU que frecuentemente sonFuente: los autoresFuente: los autores34usadas para diferenciar cepas o aislados, se encuentra la evaluacin de perfiles electroforticosgeneradas por separacin diferencial en geles de agarosa o poliacrilamida dependiendo de sutamao como en las tcnicas ARDRA, t-RFLP, RISA o RAPD o por su secuencia como en DGGE(Nakatsu, et al., 2000; Schafer y Muyzer, 2001; Green, 2005), TGGE (Muyzer, 1999) o SSCP(Schwieger y Tebbe, 2000). Estas ltimas estrategias se han convertido en las ms utilizadas dadasu capacidad de discriminar diferencias incluso de un solo nucletido, sin incluir el uso de enzimasde restriccin o sondas ligadas a isotopos radiactivos o fluorocromosEn la electroforesis en gel de gradiente denaturante descrito por primera vez por Fisher y Lerman,(1983), el DNA de doble cadena est sujeto a un ambiente denaturalizante creciente en el cual ladoble cadena de DNA se separa en segmentos discretos llamados dominios de denaturacin. Lascondiciones de denaturacin de estos segmentos son especficos de su secuencia, as cuando lamenor resistencia al ambiente inico presente es alcanzada, en el DNA parcialmente denaturadose crean molculas ramificadas lo cual reduce su movilidad en un gel. Dado que esta denaturacines dependiente de secuencia, la presencia de mutaciones alterar la migracin de la molcula enel gel, permitiendo de este modo la discriminacin de secuencias que se diferencian en tan solouna base (Muyzer et al., 1993).Debido a que cuando las molculas de DNA se denaturan completamente la migracin vuelve a serfuncin del tamao y no de su secuencia, los iniciadores utilizados en los procesos previos deamplificacin poseen una secuencia de 30 a 40 guaninas-citocinas (GC), lo que permite que lamolcula no se denature completamente (Green, 2005). El proceso de DGGE transcurre atemperatura constante en un gradiente lineal de denaturacin con urea y formamida (usualmentese utilizan rangos de denaturacin amplios de 0 a 100% 20 a70%), el cual es paralelo al sentidode la corriente aplicada. La tcnica de separacin en gradiente denaturante es muy til cuando sepretende evidenciar diferencias de secuencia entre fragmentos de DNA de igual tamao, los cualesen un gel no denaturante de poliacrilamida o agarosa, serian indistinguibles. La presencia dediferentes secuencias en un perfil electrofortico en un gel DGGE puede evidenciar la existencia depoblaciones diferentes que procedan de una muestra ambiental, de un sistema cerrado o de unbanco de cepas morfolgica y/o funcionalmente indistinguibles.La tcnica DGGE ha sido ampliamente usada ligada a amplificacin previa por PCR para el estudiode comunidades complejas de ambientes naturales (Muyzer et al., 1993) tanto en sistemasterrestres y acuticos (Schafer y Muyzer, 2001), o en sistemas controlados (Amador, 2006), basadoen el anlisis de genes especficos como genes ribosomales, genes del metabolismo del nitrgeno(Muyzer, 1999) o del metabolismo del azufre (Dar et al., 2007). 35III. Objetivos: Aislar bacterias degradadoras de de Petrleo Diesel. Cuantificar la actividad degradativa del Petrleo Diesel en las bacterias IV. Materiales y metodosMateriales:

Muestra: 1000 g de suelo de servicentro contaminado con Petrleo Diesel. Medios: Petrleo Diesel.

bacteria