BIOACUMULACIÓN, DEGRADACIÓN Y EFECTOS …

BIOACUMULACIÓN, DEGRADACIÓN Y EFECTOS ECOTOXICOLÓGICOS DE

CLORPIRIFOS EN LA PLANTA ACUÁTICA NATIVA: Lemna valdiviana Phil.

PROFESOR PATROCINANTE

DR. JORGE NIMPTSCH MAASS

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

PROFESOR CO-PATROCINANTE

DR. FRANCISCO ENCINA

UNIVERSIDAD CATOLICA DE TEMUCO

PROFESOR INFORMANTE

DR. STEFAN WOELFL

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

Tesis de Grado presentada como parte

de los requisitos para optar al grado de

Licenciada en Biología Marina y

Título Profesional de Bióloga Marina.

KATHIA FABIOLA ALMONACID POBLETE

VALDIVIA- CHILE

2015.

2

A mis padres:

Amanda y Ecio.

3

Agradecimientos

Les agradezco sinceramente a todas las personas que de una u otra forma me apoyaron y

formaron parte de la gestación de este trabajo. A mi profesor patrocinante Dr. Jorge

Nimptsch, por darme la oportunidad de realizar esta tesis bajo su tutela, por su paciencia y

dedicación para enseñar y por el apoyo brindado; a mi profesor informante Dr. Stefan

Woelfl, por sus precisas intervenciones y de gran ayuda en la realización de este informe.

A mis compañeros de laboratorio les agradezco la grata compañía y los buenos momentos

compartidos, a Pepe por su constante ayuda y su buena voluntad y a Macarena por su

colaboración en los experimentos. Al proyecto RLA7019.

A Adriana Nario por su disponibilidad y preocupación, a Anita María gracias por su cariño

y dedicación, y también a Xime por su alegría; fue una gran experiencia haber compartido

con ustedes. A Rodrigo Palma por sus sugerencias.

A mis entrañables amigas. Los memorables tiempos de distracción junto a ustedes siempre

evocaran una sonrisa.

A mi familia, por su amor, apoyo, constancia y paciencia incondicionales, a mis hermanos

por ser una fuente inagotable de alegría; y a Yare, por su amistad transversal e

incondicional a todo, y también por hacerme parte de su familia.

4

Índice general

I. Resumen ........................................................................................................................ 11

1.1 Abstract ....................................................................................................................... 12

II. Introducción ..................................................................................................................... 13

2.1 Plaguicidas .................................................................................................................. 13

2.2 Plaguicidas y su uso en la agricultura ........................................................................ 14

2.3 Clorpirifos ................................................................................................................... 16

2.4 Métodos para evaluar efectos de plaguicidas.............................................................. 19

2.4.1 Bioensayos de ecotoxicidad ..................................................................................... 20

2.4.2 Biomarcadores ......................................................................................................... 21

2.4.2.1 Estrés oxidativo ..................................................................................................... 22

2.4.2.2 Enzimas de acción antioxidante en plantas .......................................................... 24

2.4.2.2.1 Catalasa (CAT: EC. 1.11.1.6) ........................................................................ 24

2.4.2.2.2 Glutatión reductasa (GR: EC 1.8.1.7) ............................................................ 24

2.4.2.2.3 Glutatión peroxidasa (GPx: EC 1.11.1.9) ...................................................... 25

2.4.2.2.4 Enzima de biotransformación: Glutatión-S- transferasa (GST: EC 2.5.1.18) 25

2.5 Bioacumulación y vías de degradación de los plaguicidas. ........................................ 26

2.5.1 Biodegradación..................................................................................................... 26

2.5.2 Fotodegradación ................................................................................................... 27

2.5.3 Hidrólisis .............................................................................................................. 27

2.5.4 Técnicas isotópicas .................................................................................................. 27

2.6 Problemática ............................................................................................................... 28

2.7 Hipótesis ..................................................................................................................... 29

2.8 Objetivo general .......................................................................................................... 29

2.9 Objetivos específicos .................................................................................................. 29

5

III. Metodología .................................................................................................................... 30

3.1 Lemna valdiviana ........................................................................................................ 30

3.2 Cultivo de Lemna valdiviana. ..................................................................................... 31

3.3 Pesticidas utilizados .................................................................................................... 32

3.5 Bioensayos de ecotoxicidad ....................................................................................... 33

3.5.1 Exposición a Clorpirifos....................................................................................... 33

3.5.2 Número de frondas ............................................................................................... 35

3.5.3 Área de las frondas .............................................................................................. 36

3.5.4 Peso húmedo ....................................................................................................... 36

3.5.5 Contenido total de clorofila .................................................................................. 36

3.5.6 Evaluación de los resultados .................................................................................... 37

3.6 Biomarcadores ........................................................................................................... 38

3.6.1 Exposición a Clorpirifos .......................................................................................... 38

3.6.2 Preparación de las muestras .................................................................................... 39

3.6.3.1 Catalasa (CAT). ................................................................................................. 40

3.6.3.2 Glutatión Reductasa (GR). ................................................................................ 40

3.6.3.3 Glutatión peroxidasa (GPx). .............................................................................. 41

3.6.3.4 Glutatión-S-transferasa (GST). ......................................................................... 41

3.6.4 Análisis estadístico. ................................................................................................. 41

3.7. Bioacumulación-degradación .................................................................................... 42

3.7.1 Material biológico .................................................................................................... 42

3.7.2 Clorpirifos-14

C ........................................................................................................ 42

3.7.3 Preparación de soluciones ........................................................................................ 42

3.7.4 Inoculación de organismos ...................................................................................... 44

3.7.5 Determinación de actividad ..................................................................................... 44

6

3.7.6 Determinación de bioacumulación. ......................................................................... 45

3.7.7 Cálculo de bioacumulación y degradación .............................................................. 47

3.7.8 Análisis estadístico .................................................................................................. 48

IV. Resultados ...................................................................................................................... 49

4.1 Bioensayos de ecotoxicicidad ................................................................................ 49

4.1.2 Contenido Total de Clorofila (CTC) .................................................................... 54

4.1.3 EC50 para CTC .................................................................................................... 56

4.2 Determinación de Biomarcadores. .............................................................................. 57

4.2.1 Enzima de biotransformación (GST) ................................................................... 57

4.2.2 Enzimas antioxidantes .......................................................................................... 57

4.2.3 Determinación de EC50 de las actividades enzimáticas ...................................... 59

4.3 Bioacumulación y degradación de Clorpirifos. .......................................................... 62

4.3.1 Bioacumulación .................................................................................................... 62

4.3.2 Degradación de Clorpirifos en agua destilada...................................................... 64

V. Discusión ......................................................................................................................... 69

5.1 Bioensayos de ecotoxicidad ........................................................................................ 69

5.2 Biomarcadores ............................................................................................................ 72

5.3 Bioacumulación-degradación de Clorpirifos. ............................................................. 76

5.3.1 Bioacumulación de Clorpirifos. ........................................................................... 76

5.3.2 Degradación de Clorpirifos. ................................................................................. 77

5.4 Consideraciones .......................................................................................................... 80

VI. Conclusiones .................................................................................................................. 81

VII. Recomendaciones.......................................................................................................... 82

VIII. Referencias bibliográficas ........................................................................................... 83

IX. Anexo ............................................................................................................................. 92

7

Índice de Figuras

Contenido Página

Figura 1. Porcentaje de plaguicidas vendidos según serie, total país 2012 (SAG, 2012). ... 16

Figura 2. Estructura química y vías de degradación de Clorpirifos (Piola, 2011). .............. 19

Figura 3. Biomarcadores a diferentes niveles de organización biológica. ........................... 22

Figura 4. Factores bióticos y abióticos que incrementan la formación de EROs en las

plantas, (modificado de Meyer, 2008). ................................................................................ 23

Figura 5. Producción de Especies Reactivas de Oxígeno (ERO) ......................................... 23

Figura 6. Reacción catalizada por CAT. .............................................................................. 24

Figura 7. Reacción que cataliza la GST ............................................................................... 25

Figura 8. Lemna valdiviana. ................................................................................................. 31

Figura 9. Izquierda. Lorsban®

10D, formulado en polvo. Derecha. Troya 4 EC. ................ 33

Figura 10. Imagen de tratamiento analizado con software ImageJ. ..................................... 36

Figura 11. Clorpirifos marcado con 14

C ............................................................................... 42

Figura 12. Vasos precipitados inoculados con 0.5 g de Lemna valdiviana. ......................... 45

Figura 13. Diseño experimental para el ensayo de bioacumulación. ................................... 45

Figura 14. Izquierda. Liofilizador CHRIST modelo DELTA 1-20KD. Derecha. Plantas

liofilizadas, pesadas y cubiertas de Manitol, listas para ser combustionadas....................... 46

Figura 15. Izquierda. Oxidizador biológico modelo OX500. Derecha. Contador de

Centelleo Líquido, Beckman LS 5000TD. ........................................................................... 46

Figura 16. Curvas de concentración-efecto en Biensayos de ecotoxicidad. ......................... 52

Figura 17. Contenido de Clorofila Total (mg g-¹)................................................................. 55

Figura 18. Contenido de Clorofila Total (mg g-¹)................................................................. 55

Figura 19. Efectos de LBN y TYA en Lemna valdiviana .................................................... 57

Figura 20. Respuesta de GST, CAT, GR y GPx en Lemna valdiviana ............................... 58

Figura 21. Curvas de concentración-efecto de actividad enzimática ................................... 61

Figura 22. Porcentaje de bioacumulación de Clorpirifos en Lemna valdiviana .................. 63

Figura 23. Bioacumulación promedio de los 4 ensayos realizados ..................................... 64

8

Figura 24. Degradación de Clorpirifos en 4 ensayos de exposición .................................... 65

Figura 25. Degradación promedio de Clorpirifos ................................................................. 66

Figura 26. Porcentaje de degradación de Clorpirifos en diferentes tiempos de exposición. 67

Figura 27. Metabolismo de Clorpirifos catalizado por GST y P450 (Fujioka & Casida,

2007). .................................................................................................................................... 74

Figura 28. Colonias de Lemna valdiviana expuestas a TYA y a LBN. ................................ 93

Figura 29. Curva de calibración para la determinación de LD y LC de Clorpirifos (Miranda,

2013). .................................................................................................................................. 106

9

Índice de Tablas

Contenido Página

Tabla 1. Plaguicidas vendidos según serie (Kg L-1

de principio activo) ............................. 16

Tabla 2. Resumen de los nutrientes utilizados para la preparación del medio de cultivo de

Steinberg modificado por Altenburger (OECD, 2006). ....................................................... 32

Tabla 3. Concentraciones ensayadas de Clorpirifos ............................................................. 34

Tabla 4. Condiciones empleadas en los bioensayos ecotoxicológicos ................................. 35

Tabla 5. Concentraciones de Clorpirifos utilizadas. ............................................................. 38

Tabla 6. Volumen de Clorpirifos-14

C utilizado para cada ensayo. ....................................... 43

Tabla 7. Toxicidad del insecticida Clorpirifos en Lemna valdiviana en mg L-1

. Ensayo 1.

.............................................................................................................................................. 50


. Ensayo 2 50

Tabla 9. Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el NF ..................................... 53

Tabla 10. Parámetros del análisis de regresión PROBIT para AF ...................................... 53

Tabla 11. Parámetros del análisis de regresión PROBIT para biomasa ............................... 54

Tabla 12. Valores de EC50 calculado con el software ICPIN, para el contenido de clorofila

.............................................................................................................................................. 56

Tabla 13. Concentraciones de efecto del 50% del insecticida Clorpirifos en Lemna

valdiviana en mg L-1

, CE50, NOEC .................................................................................... 59

Tabla 14. Parámetros del análisis de regresión PROBIT para actividad enzimática de GST,

CAT, GR y GPx. .................................................................................................................. 62

Tabla 15. Porcentaje de Clorpirifos en las 3 fracciones medidas y el total resultante. ........ 68

Tabla 16. Comparación de valores de EC50 (mg L-1

) ....................................................... 70

Tabla 17. Propiedades fisicoquímicas de Clorpirifos. (Footprint, 2014) ............................. 92

Tabla 18. Propiedades técnicas de los dos compuestos comerciales utilizados. .................. 92

Tabla 19. Estimación diaria de crecimiento NF, AF (cm2) y Biomasa inicial y final (mg).

Ensayo 1. .............................................................................................................................. 94

Tabla 20. Resultados obtenidos de la medición de clorofila a y b. Ensayo 1....................... 95

10

Tabla 21. Estimación diaria de crecimiento NF, AF (cm2) y Biomasa inicial y final (mg).

Ensayo 2. .............................................................................................................................. 96

Tabla 22. Resultados obtenidos de la medición de clorofila a y b. Ensayo 2....................... 97

Tabla 23. Medición de la actividad enzimática de GST ....................................................... 98

Tabla 24. Resultados de la medición de la actividad enzimática de Ca ............................... 99

Tabla 25. Medición de la actividad enzimática de GR ....................................................... 100

Tabla 26. Medición de la actividad enzimática de GPx ..................................................... 101

Tabla 27. Valores calculados de GST. ............................................................................... 102

Tabla 28. Valores calculados de CAT. ............................................................................... 103

Tabla 29. Valores calculados de GR. ................................................................................. 104

Tabla 30. Valores calculados de GPx. ................................................................................ 105

Tabla 31. Límites de detección (LD) y cuantificación (LC) en el equipo Contador de

Centelleo Líquido (Beckman LS 5000 TD). (Miranda, 2013). .......................................... 106

Tabla 32. Planilla Excel para bioacumulación y degradación de Clorpirifos en el ensayo 1.

............................................................................................................................................ 107


............................................................................................................................................ 110


............................................................................................................................................ 113


............................................................................................................................................ 116

Tabla 36. Cálculos correspondientes a porcentaje de bioacumulación de Clorpirifos y mg L-

1 de Clorpirifos bioacumulados por Lemna valdiviana en los 4 ensayos realizados. ......... 119

Tabla 37. Cálculos correspondientes a porcentaje de degradación de

Clorpirifos…………………………………………………………………………….…..120

11

I. Resumen

Clorpirifos es un insecticida organofosforado, utilizado intensivamente en la agricultura

chilena. Su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la acetilcolinesterasa (AChE) y

este efecto es conocido en animales acuáticos. No existen estudios previos que describan

efectos ecotoxicológicos de este insecticida en la especie endémica Lemna valdiviana. En

el presente trabajo se estudió la bioacumulación y biodegradación de Clorpirifos utilizando

Clorpirifos-14

C, efectos ecotoxicológicos mediante bioensayos (EC50) y determinación de

biomarcadores relacionados con el estrés oxidativo, como Glutatión-S-transferasa (GST),

catalasa (CAT), glutatión reductasa (GR) y glutatión peroxidasa (GPx) en la macrófita

acuática Lemna valdiviana (Phil). Nuestros resultados muestran que las exposiciones con

12,5 mg L-1

de Clorpirifos, durante 96 horas de exposición, se observó un promedio de

bioacumulación de 16,8% en L. valdiviana, mientras que la degradación, en el mismo

tiempo de exposición, fue en promedio 34,8%. Los valores de EC50, en 7 días de

exposición, mostraron que la respuesta más sensible fue el área de la fronda con valores de

8,5 mg L-1

. En términos de respuesta al estrés oxidativo, la biotransformación a través de

GST aumentó significativamente a partir de 0,78 mg L-1

de Clorpirifos, el mismo patrón se

observó para las enzimas antioxidantes CAT, GR y GPx, cuyas actividades especificas

aumentaron significativamente a 0,78 mg L-1

. En conclusión, Clorpirifos induce la

respuesta al estrés oxidativo, aumenta la biotransformación, y en cuanto a la

biodegradación, ésta es más alta que la bioacumulación en Lemna valdiviana.

12

1.1 Abstract

Chlorpyrifos is used intensively within agriculture in Chile. It is known as AChE inhibitor

in aquatic animals, thus very little is known regarding the ecotoxicological effects in

aquatic plant species, especially native Chilean duckweed Lemna valdiviana. The present

study assessed bioaccumulation & biodegradation using C14

radiolabeled Chlorpyrifos, and

ecotoxicological effects in terms of bioassays (EC50 values) and intracellular stress

responses (i.e. glutathione S-transferase (GST), catalase (CAT), glutathione reductase (GR)

and glutathione peroxidase (GPx) in native aquatic macrophyte Lemna valdiviana (Phil.).

Our results show that exposures with 12.5 mg L-1

C14

radiolabeled Chlorpyrifos for 96 h an

average of 16,8 % bioaccumulation in L. valdiviana was observed, where as degradation

was in average 34.8 % after 96 h of incubation at the same concentration. EC50 values in 7

day exposures showed highest sensitivity frond area with values of 8,5 mg L-1

. In terms of

intracellular stress response, biotransformation via GST was significantly increased at 0.78

mg L-1

of Chlorpyriphos. The same pattern was observed in antioxidative enzymes CAT,

GR and GPx where specific activities were increased significantly at concentration of 0.78

mg L-1

of Chlorpyrifos. Concluding, Chlorpyrifos induces oxidative stress response,

increases biotransformation and degradation is higher than bioaccumulation in the aquatic

plant Lemna valdiviana.

13

II. Introducción

2.1 Plaguicidas

El artículo 2° del Código Internacional de Conducta para la Distribución y Utilización de

Plaguicidas define los plaguicidas como “cualquier sustancia o mezcla de sustancias

destinadas a prevenir, destruir o controlar cualquier plaga”, incluyendo los vectores de

enfermedades humanas o de los animales, las especies no deseadas de plantas o animales

que causan perjuicio o que interfieren de cualquier otra forma en la producción,

elaboración, almacenamiento, transporte o comercialización de alimentos, productos

agrícolas, madera y productos de madera o alimentos para animales, o que pueden

administrarse a los animales para combatir insectos, arácnidos u otras plagas en o sobre sus

cuerpos. El término incluye las sustancias destinadas a utilizarse como reguladoras del

crecimiento de las plantas, defoliantes, desecantes, agentes para reducir la densidad de fruta

o agentes para evitar la caída prematura de la fruta (Wheeler, 2002).

El uso de sustancias químicas para el control de plagas se practica hace más de 2000 años,

cuando los romanos utilizaban desechos químicos inorgánicos para mantener sus caminos

libres de malezas. En los años 1800, se empleaban sustancias químicas inorgánicas como

herbicidas (Stephenson & Solomon, 2013).

El Dinitrofenol, introducido en la década de 1930, fue el primer plaguicida químico

organosintético usado para controlar malezas, insectos y enfermedades, pero su uso masivo

empezó a mediados de los años cuarenta con el descubrimiento y uso masivo del

insecticida DDT, el herbicida 2,4-D y el fungicida Captán (Stephenson & Solomon, 2013).

Los plaguicidas, rara vez se emplean en su forma pura. Las compañías fabricantes

combinan el ingrediente activo plaguicida (el producto químico que realmente controla la

plaga) con otros ingredientes o coadyuvantes, con el fin de desarrollar el producto

plaguicida formulado, listo para su utilización. El propósito de estos coadyuvantes es

mejorar la actividad biológica del plaguicida o las características de la aspersión

(Stephenson & Salomon, 2013).

14

2.2 Plaguicidas y su uso en la agricultura

El crecimiento de la población a nivel mundial y la consecuente alza en la demanda por

alimentos ha desembocado en la expansión de cultivos agrícolas, esta expansión no habría

sido factible sin el desarrollo de tecnologías como la mecanización, mejoramiento genético

de semillas y el aumento en el uso de agroquímicos para el control de plagas y malezas

(Altieri & Rojas, 1999).

Desde la década del 80, Chile, se comenzó a impulsar como potencia exportadora de

productos silvoagropecuarios en los mercados internacionales (ODEPA, 2013). De acuerdo

al Censo Nacional Agropecuario y Forestal del año 2007, en Chile, la superficie de los

suelos cultivados alcanza 2 millones 123 mil hectáreas. Esta superficie se distribuye en

1.303.210 hectáreas utilizadas en cultivos anuales y permanentes, 401.018 hectáreas en

praderas sembradas y 419.714 hectáreas en barbecho y descanso (ODEPA, 2013). La

superficie sembrada con cultivos anuales se concentra en el sur del país: en la temporada

2011/12 el 36% de las siembras se realizó en la Región de La Araucanía, el 21% en la del

Bío Bío y el 19% en la Región del Maule.

Todo el ciclo del proceso de producción de alimentos y de otras materias primas, depende

en todo momento del uso directo o indirecto del suelo y del agua, en consecuencia la

actividad agrícola y la disponibilidad y calidad del recurso hídrico son dos temas

intrínsecamente ligados. El sector productivo conformado por la actividad agrícola y

forestal representa un 73% de las extracciones consuntivas del agua, lo que constituye,

aproximadamente, el riego de 1,1 millones de hectáreas que se localizan principalmente

entre las regiones de Coquimbo y Los lagos. Las extracciones consuntivas de agua

implican que después de su uso, una fracción importante del caudal (utilizado para riego)

retorna a su cauce, evidentemente esto causa problemas de contaminación tanto de forma

localizada como difusa. Un estudio realizado en la cuenca del río Traiguén, IX Región,

Chile, reporto la existencia de plaguicidas como Simazina, Hexazinona, 2,4-D, Picloram

y el fungicida Carbendazim en ecosistemas acuáticos (Palma et al., 2004), según este

estudio las concentraciones medidas en el ambiente de Hexazinona, Simazina y Picloram

son muy inferiores a los niveles de toxicidad aguda para Daphnia magna y trucha arcoíris.

15

En Chile, la ley 19.300 sobre bases del medioambiente define como contaminación la

presencia en el ambiente de sustancias, elementos, energía o combinación de ellos, en

concentraciones o concentraciones y permanencia superiores o inferiores, según corresponda,

a las establecidas en la legislación vigente.

En nuestro país, se sigue la normativa para los Límites Máximos Permitidos (LMP) de

plaguicidas según el “Codex Alimentarius”, código que fue creado en la década de los 60

por la FAO y la OMS, de Naciones Unidas, el cual tiene por principal objetivo, velar por la

salud de la población en general a través de normas y reglamentos que garantizan la

inocuidad de los productos (SAG, 2009). La importación de pesticidas es regulada por el

Servicio Agrícola y Ganadero (SAG, 2006). Esta institución dictó la resolución Nº 3670, la

cual establece las normas para la evaluación y Autorización de plaguicidas, la cual

constituye la base de control de plaguicidas y se desarrolla en forma previa a la

comercialización y uso de un producto en el país. El sistema de autorización está basado en

el principio de “identidad” y opera para productos formulados. El producto formulado o

producto comercial se define como la suma de una o más substancias activas más co-

formulantes, solventes o coadyuvantes. (ACHIPIA, 2012/2013).

Del total de plaguicidas vendidos en Chile el año 2012, el 19% correspondió al grupo

constituido por insecticidas, rodenticidas y acaricidas (Figura 1).

Actualmente, en el país existen 1171 formulaciones de plaguicidas con autorización vigente

del Servicio Agrícola y Ganadero (SAG, 2014).

16

Tabla 1. Plaguicidas vendidos según serie (Kg L-1

de principio activo)-total país

(Modificado de SAG, 2012)

Serie Tipo de plaguicida Total (Kg L-1

)

1000 Insecticidas, Rodenticidas,

Acaricidas

7.437.867

2000 Fungicidas, Bactericidas

18.270.194

3000 Herbicidas 7.938.786

4000 Misceláneos 5.217.208

Total 38.864.056

Figura 1. Porcentaje de plaguicidas vendidos según serie, total país 2012 (SAG, 2012).

2.3 Clorpirifos

El Clorpirifos (Figura 2), es un insecticida de amplio espectro. Clasificado como

perteneciente a la clase II, moderadamente tóxico (Stephenson & Solomon, 2013).Fue

registrado por primera vez en 1965 y comercializado por la empresa Dow Chemical

Company para uso doméstico, siendo en la actualidad uno de los insecticidas

organofosforados más utilizados en agricultura.

Actúa como inhibidor de la acetilcolinesterasa (Van Der Well & Wellis, 1989; Stephenson

& Solomon, 2013) y se utiliza en más de cien cultivos diferentes, como cereales, maíz,

17

arroz, tabaco, plantas ornamentales y numerosas frutas y legumbres. También se usa para el

control de mosquitos en las viviendas de animales.

Varios estudios de campo realizados en Canadá, Estados Unidos y los Países Bajos han

informado vidas medias en los ecosistemas acuáticos de < 1 a 3 días (Racke et al., 1993).

La corta persistencia del Clorpirifos en sistemas naturales se debe a su volatilidad, baja

solubilidad en agua, y una fuerte afinidad por los sedimentos y sólidos en suspensión

(ATSDR 1997). En la fase Sedimento-agua se describen vidas medias de un rango de 1 a

34 días (Schimmel et al., 1983).

El contenido de materia orgánica, la porosidad, la capacidad de intercambio iónico del

suelo y la transformación de plaguicidas, influyen en la movilidad y transferencia entre

compartimientos ambientales. Una interacción débil suelo-plaguicida, permite la migración

de sustancias con altos valores del log Kow y del log Koc hacia cuerpos de agua a pesar de

su carácter lipófilo (Narvaéz et al., 2012).

El coeficiente de partición octanol/agua (log Kow = 3,31 a 5,27) de Clorpirifos indica una

afinidad por lípidos y por lo tanto se estima un alto potencial de elevados factores de

bioconcentración en organismos acuáticos (BCF). Racke et al., (1993), menciona que

organismos acuáticos expuestos a Clorpirifos, en ensayos in situ, han reportado BCF de 100

a 4667, y aquellos expuestos en condiciones de laboratorio, van desde 58 a 5100. El grado

que el Clorpirifos es bioacumulado varía según la especie, duración de la exposición, y la

dosis. Los factores que contribuyen bioconcentración incluyen la tasa metabólica, la

velocidad de depuración, la biodisponibilidad de Clorpirifos, y la disponibilidad de

alimento para el organismo (Eisler; 2000). Los valores del BCF para este insecticida

sugieren un potencial de moderada a muy alta tasa de bioconcentración en peces (Franke et

al., 1994).

La información toxicológica indica que en el ser humano, Clorpirifos es neurotóxico y

disruptor endócrino. Se lo ha asociado con problemas de asma, toxicidad reproductiva y del

desarrollo, además de efectos agudos.

18

El principal producto de degradación de Clorpirifos es el 3,5,6-tricloro-2-piridinol o TCP

(Figura 2).

Racke et al (1993), indica que en peces que han ingerido Clorpirifos, producen como

principal producto de biodegradación TCP, el que es encontrado en sangre, orina y bilis de

estos organismos. Varó et al., (2002), señala que peces (A. Iberus) alimentados con

Artemia contaminada con Clorpirifos, bioacumuló este pesticida, pero a través del tiempo

la biomagnificación fue disminuyendo, debido a características fisicoquímicas del pesticida

pero también la capacidad de biotransformación del pez así como su capacidad de

adaptación a la exposición continua al xenobiótico (32 días), sin embargo en estos peces, el

contenido de la proteína de estrés HSP70, aumentó significativamente en comparación a los

peces alimentados con artemias sin Clorpirifos. En plantas, la vía de exposición a tóxicos,

ocurre a través de la pared celular, estos organismos dirigen todo su potencial energético y

metabólico hacia la degradación del compuesto tóxico, las enzimas antioxidantes son las

primeras barreras que se conjugan para hacer frente a esta situación (Catalasa, Glutatión

peroxidasa y Glutatión reductasa, entre otras). La exposición a xenobióticos consituye la

señal para que comience una serie de reacciones enzimáticas (p.e. Glutatión-S-tranferasa)

con la única finalidad de comenzar reacciones bioquímicas para la biotransformación del

tóxico a productos más solubles y con mayor capacidad de ser eliminados (Kvesitadze et

al., 2001).

19

Figura 2. Estructura química y vías de degradación de Clorpirifos (Piola, 2011).

2.4 Métodos para evaluar efectos de plaguicidas

Los efectos que ejercen los plaguicidas u otros agentes tóxicos a nivel de organismo u

organizaciones biológicas más complejas necesitan ser evaluadas mediante estudios

ecotoxicológicos. La ecotoxicología, se ocupa del estudio del efecto y destino de los

agentes tóxicos de origen natural y antropogénico en los ecosistemas acuáticos y terrestres

(Truhaut, 1977). La aproximación más importante para la evaluación del efecto se realiza

mediante técnicas bioanalíticas conocidas como bioensayos de toxicidad aguda y crónica

(Larraín et al., 1995), siendo la toxicidad una propiedad inherente de un agente químico

que produce efectos dañinos a un organismo cuando es expuesto durante cierto

tiempo a determinadas concentraciones.

20

2.4.1 Bioensayos de ecotoxicidad

Los bioensayos son herramientas ampliamente utilizadas en el campo de la ecotoxicología.

Estas pruebas de toxicidad permiten realizar mediciones experimentales del efecto de

agentes químicos o físicos en sistemas biológicos, estableciendo relaciones concentración-

respuesta bajo condiciones controladas en terreno o laboratorio.

Los efectos adversos en un individuo pueden ser tanto de inhibición como de magnificación

generando desde la muerte del individuo (efecto letal) o produciendo una gran diversidad

de respuestas a diferentes niveles de organización biológica (efectos subletales), que van

desde alteraciones bioquímicas y celulares incluyendo genotoxicidad y disrupciones

endocrinas, alteraciones a nivel morfológico y fisiológico, efectos en el crecimiento y

desarrollo, además de alteraciones en parámetros poblacionales.

Existen diversos organismos biológicos para realizar bioensayos de toxicidad, entre los

cuales destacan cuatro organismos representantes de distintos niveles tróficos

(microcrustáceos, lentejas de agua, microalgas y peces), pero debido a la individualidad de

las respuestas frente a cierto tipo de contaminante de cada especie se han utilizado diversos

bioensayos, (bacterias, cianobacterias, equinodermos, insectos; etc.).

Organismos oficiales de protección ambiental, recomiendan el uso de Lemnáceas en la

aplicación de protocolos estandarizados de ensayos para la evaluación de efectos

fitotóxicos de xenobióticos, además de su uso en la certificación y registro de nuevas

sustancias (USEPA, 1996; OECD, 2002; Environmental Canada, 2007).

Cáceres et al., (2007), resaltan la importancia de trabajar con organismos endémicos ya

que los resultados obtenidos representan modelos realistas de los efectos locales que está

ejerciendo el xenobiótico en el ambiente lo que puede minimizar la varianza en los puntos

finales analizados.

21

2.4.2 Biomarcadores

Los biomarcadores han sido definidos como “parámetros biológicos que miden cambios

celulares, bioquímicos y/o componentes fisiológicos, procesos, estructuras o funciones

inducidas por algún contaminante y/o xenobiótico, en un sistema o muestra biológica”

(Kvesitadze et al., 2001).

En la ecotoxicología moderna los biomarcadores se han desarrollado como herramientas

eficaces para medir contaminación en organismos bioindicadores. Este desarrollo se debe a

la capacidad que estos presentan para expresar respuestas a niveles de organización

biológica más bajos, por lo que los efectos pueden ser conocidos antes que la comunidad

se vea afectada (Figura 3).

El uso de biomarcadores para el diagnóstico de alteración de ecosistemas y la exposición

de especies a xenobióticos tiene varias ventajas:

a) La respuesta de biomarcadores puede indicar tempranamente la presencia de

contaminantes biológicamente disponibles.

b) Pueden detectar eventos de contaminación intermitente e integrar en tiempo y

espacio la exposición.

c) Son capaces de detectar efectos inducidos por mezclas complejas de contaminantes.

Además, evidencian efectos en los organismos que han sido expuestos, ó afectados por

agentes xenobióticos, mostrando cambios bioquímicos, histológicos, morfológicos y

fisiológicos en todo el organismo y se han complementado para reconocer cambios a nivel

celular y molecular con biomarcadores de ácidos nucleícos y proteínas (Ryan &

Hightower, 1996). Existen 3 tipos de biomarcadores. Los biomarcadores de exposición,

que se refieren a la medición de un compuesto químico específico en un tejido o en fluidos

de un organismo (PCB, PAHs, Pb, Cd, DDT, etc). Biomarcadores de efecto, miden

alteración bioquímica, fisiológica o de comportamiento, y cuya alteración no esté asociada

a alguna enfermedad (Actividades enzimáticas de Fase I y II, (EROD), Acetil

Colinesterasas (AChe), Proteínas, mRNA, DNA, Aductos en el ADN, Metabolitos en bilis,

Micronúcleos, Vitelogenina, etc). Biomarcadores de susceptibilidad, indican la habilidad

22

inherente de un organismo para responder a la exposición de xenobióticos específicos

(fenotipo y polimorfismo genético). (Gold & Zapata, 2004).

Figura 3. Biomarcadores a diferentes niveles de organización biológica, y diferentes

escalas temporales (Gold & Zapata, 2004).

2.4.2.1 Estrés oxidativo

Haliwell (2006) define estrés oxidativo como el efecto tóxico provocado por especies

químicas altamente reactivas producidas durante la reducción del oxígeno molecular (O2)

en los organismos aerobios, que pueden ser o no radicales libres y se conocen como ERO

(Rinalducci et al., 2008).

Los organismos que se ven expuestos a xenobióticos, como forma de tolerancia, generan

una activación de sistemas de defensa que suprimen o eliminan las especies reactivas de

oxígeno (ERO). La producción celular de ERO es estimulada en respuesta a desbalances

metabólicos generados por una condición de estrés que rompe la homeostasis celular

(Mittler, 2002; Meyer, 2008). Una serie de factores bióticos y abióticos (Figura 4) entre

ellos la presencia de contaminantes, modifica el equilibrio entre la producción y la

eliminación de ERO e induce un estrés oxidativo (Peralta & Volke, 2012)

23

Figura 4. Factores bióticos y abióticos que incrementan la formación de EROs en las

plantas, (modificado de Meyer, 2008).

La reducción del O2 ocurre en varios pasos (Figura 5). Las especies reactivas de O2 pueden

reaccionar con componentes celulares, generando una cascada de reacciones que culminan

en la ruptura de ácidos nucleícos y proteínas, así como en degradación de pigmentos,

inactivación de enzimas y peroxidación lipídica. Sin embargo, su producción es un proceso

natural que ocurre en la fotosíntesis, por lo que las plantas han desarrollado un mecanismo

de depuración de estos radicales, llamado sistema antioxidante.

Figura 5. Producción de Especies Reactivas de Oxígeno (ERO) durante la reducción de

oxígeno molecular (O2) (Imlay, 2008; Gill & Tuteja, 2010)

Este sistema está integrado por las enzimas catalasa, superóxido dismutasa, glutatión

reductasa, ascorbato peroxidasa, guaiacol peroxidasa, glutatión, tioles, flavonoides,

flavonas, vitaminas (Medici et al., 2004).

24

2.4.2.2 Enzimas de acción antioxidante en plantas

2.4.2.2.1 Catalasa (CAT: EC. 1.11.1.6)

Las catalasas (CATs) son enzimas que contienen hierro en su estructura molecular, es una

de las enzimas más abundantes en el planeta, formando parte del sistema de detoxificación

tanto en animales como en vegetales. Su función antioxidante se asocia a la remoción de

peróxido de hidrógeno (H2O2) el cual es metabolizado a oxigeno molecular (O2) y H2O

(Figura 6). Las CATs, a diferencia algunas peroxidasas que pueden reducir varios

peróxidos lipídicos, solo reducen H2O2, (Stegeman et al; 1992).

El H2O2 es generado en el transporte de electrones de la cadena respiratoria y en ciertas

reacciones de hidroxilación y oxigenación (Arora et al., 2002).

En plantas esta enzima adquiere gran relevancia en situaciones de estrés, debido a que

neutraliza las ERO, protege las membranas celulares y organelos del daño oxidativo

(Menone et al., 2008).

Figura 6. Reacción catalizada por CAT.

2.4.2.2.2 Glutatión reductasa (GR: EC 1.8.1.7)

Esta enzima puede regenerar glutatión reducido (GSH) a partir de glutatión disulfuro

(GSSG), usando NADPH como agente reductor, participando asi en la detoxificación de

H2O2 a H2O, usando directamente GSH como reductor. Así, las formas oxidadas del

ascorbato (ASC) y el GSH son conducidas a sus estados reducidos iniciales, cerrando el

ciclo y previniendo así la acumulación de H2O2 (Apel & Hirt, 2004; Liu et al., 2009; Martí

et al., 2009).

25

2.4.2.2.3 Glutatión peroxidasa (GPx: EC 1.11.1.9)

Las peroxidasas son enzimas que reducen una variedad de peróxidos a sus respectivos

alcoholes. Estas enzimas utilizan sus productos reducidos como donador en la reducción de

otra molecula como por ejemplo el GSH. El ciclo de la glutathion peroxidasa (GPx) se

cierra con la regeneración del GSH, a partir de GSSG por acción de la GR (Ciclo ASC-

GSH). GPx presenta alta afinidad por H2O2 en el citosol de las células, donde catalasa se

encuentra en baja concentración (Kelly et al, 1998).

2.4.2.2.4 Enzima de biotransformación: Glutatión-S- transferasa (GST: EC 2.5.1.18)

La actividad GST se ha detectado en varias plantas, insectos, moluscos, y animales. En la

biotransformación de xenobióticos, GSTs son llamados enzimas de conjugación de la fase

II de la biotransformación. Reacciones de fase I suponen la hidrólisis, reducción y

oxidación de los xenobióticos. Reacciones de fase II conjugan metabolitos y compuestos

endógenos generalmente hidrofóbicos, lo que resulta en un aumento de la hidrosolubilidad

de xenobióticos, y aumento en la tasa de excreción de los mismos. En general las

reacciones de fase II, no ocurren necesariamente posterior a la fase I (Pecore, 2001).

Figura 7. Reacción que cataliza la GST (Donde R puede ser un alifático, aromático o un

grupo heterocíclico).

La versatilidad que presentan los sistemas acuáticos hace particularmente difícil la

medición y detección agentes contaminantes mediante mediciones puntuales con los

métodos de muestreo convencionales, sobre todo si se considera que la contaminación se da

de maneras puntuales y difusas y el destino de estos contaminantes depende tanto de

factores bióticos, y abióticos así como de características propias del xenobiótico. El uso de

estas herramientas complementa los estudios antes realizados además de proveernos de las

ventajas antes mencionadas.

26

2.5 Bioacumulación y vías de degradación de los plaguicidas.

La mayoría de los plaguicidas, una vez aplicados, sufren procesos de degradación y

transformación, total o parcial, que conducen a la formación de nuevos productos que, en

ocasiones, pueden ser más o menos móviles, persistentes y peligrosos que los compuestos

parentales (Narvaéz et al.2012; Barceló et al., 1993). Una vez aplicado, el plaguicida

produce un depósito en la planta que es eliminado progresivamente, con mayor o menor

rapidez, en función de factores tales como la tasa de crecimiento del vegetal, condiciones

ambientales (viento y lluvia), propiedades físico-químicas del plaguicida (volatilización y

solubilización) y degradación química, que puede ocurrir en el interior de la planta (para los

plaguicidas con poder penetrante) o en la superficie de la misma, en cuyo caso juega un

papel fundamental la radiación solar (Narvaéz et al., 2012; Barceló et al., 1993) .

El destino de los plaguicidas en el ambiente está relacionado con el coeficiente partición

octanol/agua (log Kow), las constantes de disociación ácida y básica (Ka y Kb), el coeficiente

de partición carbono orgánico/agua (Log Koc), el índice potencial de lixiviación y la presión

de vapor de los plaguicidas (Jekel & Reemstma, 2006).

Estos factores determinan la mayor o menor toxicidad de un compuesto. Sin embargo,

algunos productos de transformación pueden tener mayor o menor capacidad de

bioconcentración que los compuestos parentales (Narvaéz et al, 2012), por lo tanto la

transformación es un factor determinante en la dispersión, tiempo de contacto biota-

plaguicida y en la cantidad de especies acuáticas potencialmente afectadas (Arias et al.,

2008).

2.5.1 Biodegradación

En los ecosistemas acuáticos, la persistencia y toxicidad de los plaguicidas está

directamente relacionada con la eficiencia en los procesos de biodegradación, en dichos

procesos el papel que juegan las reacciones enzimáticas que ocurren en los organismos,

son de vital importancia en la transformación de estos tóxicos. El proceso de

biodegradación puede ocurrir bajo condiciones aerobias o anaerobias, dependiendo del

aceptor final de electrones utilizado por el microorganismo. Así, mientras los nitratos, los

27

sulfatos, el hierro y el manganeso son aceptores de electrones en condiciones anaerobias, el

oxígeno es el aceptor final en condiciones aerobias.

2.5.2 Fotodegradación

La luz UV-C (100-280nm) se absorbe casi en su totalidad en la capa de ozono. Sin

embargo, la luz UV-B y UV-A (280-400 nm), de gran valor energético, alcanzan la

superficie terrestre y producen la excitación molecular y la transformación de algunos

xenobióticos (Narváez et al., 2012). Sin embargo, la eficiencia de los procesos fotolíticos,

está limitada por el contenido de materia orgánica y otros filtros solares que atenúan la luz

UV en los cuerpos de agua. La energía de los enlaces químicos, determina la estabilidad de

los compuestos orgánicos. La ruptura de un enlace Carbono–Oxígeno puede requerir de una

exposición a longitudes de onda entre 280 a 320 nm durante tiempos diversos dependiendo

de la molécula irradiada (Sáenz et al., 2012).

2.5.3 Hidrólisis

La hidrólisis química de los plaguicidas está relacionada con el pH y ocurre mediante

ataques nucleofílicos o electrofílicos. Los ácidos y bases actúan como catalizadores al

activar grupos funcionales para un ataque de nucleófilos o electrófilos del entorno. En

estas reacciones, el rol del pH en el ambiente es un factor determinante en la vida media de

muchas sustancias hidrolizables (Pehkonen & Zhang; 2002). La hidrólisis química de

plaguicidas, potencia el efecto de otros procesos de transformación debido a que los

metabolitos producidos por la hidrólisis pueden ser más o menos fotosensibles, o tóxicos

que los compuestos parentales.

La degradación en el agua, de pesticidas organofosforados, puede ocurrir a través de varias

vías. La oxidación puede ser biótica, mediante enzimas específicas o abióticas mediante

mecanismos como ozono, oxigeno disuelto o cloro acuoso. (Racke et al., 1993).

2.5.4 Técnicas isotópicas

Los radioisótopos son utilizados como trazadores, ya que permiten seguir la trayectoria de

un compuesto a través de variados sistemas, de manera cuantitativa y eficaz. De acuerdo a

estas características el uso de pesticidas marcados con 14

C en experimentos de laboratorio,

28

permite una medida cuantitativa de las vías de disipación, mineralización y metabolización

de estos compuestos (Laabs et al., 2002). Para medir la actividad radioactiva de las

muestras con trazadores se usa comúnmente un Contador de Centelleo Líquido (CCL). El

CCL consta de un tubo fotomultiplicador, el cual transforma la intensidad luminosa en una

señal eléctrica medible. El analito (radioisótopo), es mezclado previamente con un líquido

centelleante y posteriormente la energía cinética de las emisiones nucleares (radiación) es

transformada en energía lumínica (luz). El líquido centelleador consiste en compuestos de

tipo orgánico u inorgánico, que emiten luz visible al ser expuestos a radiación ionizante. En

el caso de la radiación tipo beta poco energética, como la que emite el carbono 14, se

utilizan centelladores orgánicos solubilizados en una mezcla de solventes (Miranda, 2013).

2.6 Problemática

En Chile existen pocos estudios referentes a la relación entre la actividad silvoagropecuaria

y sus efectos en la biota acuática (Barra et al., 1995., 2001; Baez et al., 1996; Palma et al.,

2004). Considerando que la legislación chilena relega la existencia de contaminación a un

criterio normativo, permite que existan casos de emisiones claramente dañinas para la salud

de las personas, y para el medio ambiente, sin embargo estas normas amparan emisiones

límites, por lo que en principio, mientras éstas no superen la normativa, son plenamente

legales. En consecuencia, además de un incremento en el uso de plaguicidas y escasos

estudios referentes a su destino en el medioambiente existe una débil normativa legal

referente a estos contaminantes, por lo que estas situaciones conllevan un riesgo para el

bienestar de las personas y los ecosistemas. Todos estos antecedentes indican que los

efectos que los agroquímicos generan o podrían generar en el ambiente acuático y la biota,

es una situación que amerita ser estudiada. A su vez se desconoce el efecto de Clorpirifos

en organismos acuáticos nativos de los ecosistemas fluviales de nuestro país.

29

2.7 Hipótesis

En la realización de esta tesis se pusieron a prueba las siguientes hipótesis.

1. El pesticida Clorpirifos provoca fitotoxicidad en la macrófita acuática Lemna

valdiviana.

2. Ante una posible situación de estrés oxidativo causado por la exposición de

Lemna valdiviana a Clorpirifos, la planta activa mecanismos enzimáticos de defensa. Estos

mecanismos están constituidos por biomarcadores y vías de biotranformación.

3. L. valdiviana bioacumula Clorpirifos.

2.8 Objetivo general

Mediante bioensayos en laboratorio, en este trabajo nos planteamos evaluar la

bioacumulación, degradación y efectos ecotoxicológicos que genera el insecticida

Clorpirifos en la planta acuática Lemna valdiviana (Phil).

2.9 Objetivos específicos

1. Evaluar múltiples parámetros y/o indicadores considerados como puntos finales

ecotoxicológicos (número de frondas, área de la fronda, peso húmedo y contenido

total de clorofila) del crecimiento en lemnáceas y estimar sus valores de EC50

como respuesta a la exposición de Clorpirifos.

2. Medir la actividad de la enzima de biotransformación Glutatión-S-transferasa

(GST) en Lemna valdiviana expuesta a Clorpirifos.

3. Medir la actividad de enzimas antioxidantes (Catalasa (CAT), Glutatión reductasa

(GR) y Glutatión peroxidasa (GPx) en Lemna valdiviana expuesta a Clorpirifos,

4. Medir la bioacumulación de Clorpirifos en Lemna valdiviana utilizando técnicas

isotópicas.

5. Medir la degradación del insecticida Clorpirifos en agua destilada utilizando

técnicas isotópicas.

30

III. Metodología

3.1 Lemna valdiviana

La familia Lemnaceae (monocotiledóneas) son plantas acuáticas formadas por cuatro

géneros (Lemna, Spirodela, Wolffia y Wolfiella) y 37 especies. Representan las

angiospermas más pequeñas del mundo. Dependiendo de la especie y las condiciones de su

medio, se reproducen a través de división vegetativa (Landolt, 1986). Su amplio rango de

distribución hace que cada género y especie posea una distribución característica (Cross,

2002). Se localizan en todos los continentes excepto la Antártica, son abundantes en su

ambiente natural, donde sirven de alimento y protección para otros organismos, también se

ha comprobado el potencial de este género para depurar aguas contaminadas (Prasertsup

& Ariyakanon, 2011; Olette et al, 2008)

Lemna valdiviana (Figura 8) es una planta de pequeño tamaño (entre 2 a 10 mm), duplica

su biomasa entre 48 y 72 horas a través de división vegetativa, característica que hace de

esta planta, un organismo ideal para su cultivo en laboratorio en condiciones controladas de

intensidad de luz, fotoperiodo y temperatura, utilizando medios nutritivos de composición

definida. Además, constituye una especie nativa de Valdivia, Chile, lo que conlleva las

ventajas de usar organismos nativos para estudios ecotoxicológicos. El uso de este género

para este tipo de bioensayos es recomendado por organismos internacionales como USEPA,

(1996); OECD, (2002); Environmental Canada, (2007). Por todas estas razones

consideramos que Lemna valdiviana constituye un organismo idóneo para efectuar

bioensayos de ecotoxicidad, además estudios anteriores han demostrado la sensibilidad de

esta especie en el análisis de metales pesados y efluentes de psiculturas, entre otros

(Valenzuela, 2013., Barrera, 2015).

31

.

Figura 8. Lemna valdiviana.

3.2 Cultivo de Lemna valdiviana.

Las plantas utilizadas en este estudio se cultivan en el Laboratorio de Bioensayos y

Limnología aplicada del Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas de la Universidad

Austral de Chile,

El cultivo de esta planta se ha realizado según protocolo OECD (2006) mediante el cual se

prepararon 7 soluciones según la tabla 1, en la solución 8, se procedió a diluir primero

FeCl3*6H2O y posteriormente se agregó EDTA.

Para 1 litro de medio nutritivo se agregaron 20 mL de la solución 1, 2 y 3; 1 mL de las

soluciones 4, 5, 6 y 7 y finalmente 2 mL de la solución 8 (Tabla 2). Para el mantenimiento

de los cultivos se hizo recambio del medio cada 3 días aproximadamente, en cada recambio

¡se lavaron las plantas con agua potable para quitarles microorganismos, se lavó cada

acuario y se agregaron aproximadamente 300 mL de medio nutritivo a cada uno. Para la

exposición en cambio, el medio nutritivo fue concentrado 10 veces, ya que no se realizó

recambio de éste durante la exposición.

32

Tabla 2. Resumen de los nutrientes utilizados para la preparación del medio de cultivo de

Steinberg modificado por Altenburger (OECD, 2006).

3.3 Pesticidas utilizados

Se estimó la toxicidad del insecticida Clorpirifos, mediante el uso del formulado comercial

Lorsban®

10D (LBN) y Troya 4 EC (TYA) (Figura 9). El primero tiene una composición

de 10% de ingrediente activo Clorpirifos, mientras que Troya 4EC tiene un 48% p/v de este

insecticida. LBN es un polvo arcilloso que se aplica en una mezcla con el fertilizante

directamente al suelo una vez por temporada de cosecha. Por su parte, TYA contiene una

formulación emulsionable y es recomendado para ser aplicado tanto al suelo como

directamente a la hoja. La utilización de las 2 formulaciones de Clorpirifos se debió a que

en ensayos preliminares, utilizando las mismas concentraciones de ingrediente activo, los

formulados presentaron diferencias en los resultados. Por lo que para bioensayos de

Solución Macronutriente g L-1

1 KNO3

KH2PO4

K2HPO4

17,50

4,5

0,63

2 MgSO4*7H2O 5,0

3 Ca(NO3)2*4H2O 14,75

Solución Micronutrientes mg L-1

4 H3BO3 120,0

5 ZnSO4*7H2O 180,0

6 Na2MoO4*2H2O 44,0

7 MnCl3*6H2O 180,0

8 FeCl3*6H2O

EDTA Dinatriumsalz-dyhydrat

760,0

1500,0

33

ecotoxicidad utilizamos LBN, mientras que para la determinación de biomarcadores,

bioacumulación y degradación utilizamos TYA.

Figura 9. Izquierda. Lorsban®

10D, formulado en polvo. Derecha. Troya 4 EC.

Las concentraciones ensayadas en este trabajo, fueron previamente determinadas de

acuerdo a bibliografía (Iannacone et al, 2000; Turgut & Formin, 2002) y bioensayos de

ecotoxicidad previos. Se agregó una proporción de medio nutritivo concentrado 10 veces

para no hacer recambio de éste durante el tiempo de exposición.

3.5 Bioensayos de ecotoxicidad

3.5.1 Exposición a Clorpirifos

Se analizó la sensibilidad de Lemna valdiviana expuesta por 7 días a Clorpirifos. Utilizando

el formulado comercial LBN (Figura 9). Se evaluó como puntos finales, el número de

frondas, área de frondas, contenido total de clorofila y peso húmedo.

Las soluciones de exposición se realizaron según la Tabla 3.

Para la preparación de la solución madre de tóxico, se pesaron 0,5 g de LBN, de esta

manera la concentración de ingrediente activo Clorpirifos fue 50 mg, los 0,5 g LBN fueron

diluidos en agua destilada en un matraz de 500 mL, por lo cual la concentración madre de

Clorpirifos fue de 100 mg L-1

. Utilizando la fórmula 1, fueron preparadas las soluciones de

exposición (Tabla 3):

V1* C1 = V2* C2

34

Donde V1: volumen de toxico a añadir; C1; concentración inicial; V2: volumen final; C2:

concentración final.

Tabla 3. Concentraciones ensayadas de Clorpirifos como ingrediente (mg L-1

), volúmenes

(mL) de tóxico (Clorpirifos), medio nutritivo 10X y agua destilada.

Concentración de

Clorpirifos (mg L-1

)

Volumen de tóxico (mL) Volumen medio

nutritivo 10X (mL)

Volumen agua destilada

(mL)

0,62 1,86 30 268,1

1,24 3,72 30 266,2

2,49 7,47 30 262,5

4,98 14,9 30 255,1

10,0 30 30 240,0

20,0 60 30 210,0

40,0 120,0 30 150,0

Para cada concentración se preparó una solución final de 300 mL que contenía los

componentes calculados en la Tabla 3, posteriormente, a partir de estos 300 mL, se

agregaron 100 mL a cada réplica de tratamiento, excepto en los tratamientos control donde

el volumen de tóxico fue reemplazado por agua destilada.

35

Tabla 4. Condiciones empleadas en los bioensayos ecotoxicológicos.

Para estos bioensayos se realizaron 6 réplicas para el control negativo y 7 concentraciones

por triplicado (Tabla 4).

3.5.2 Número de frondas (NF).

Para obtener el número de frondas se contabilizó el número inicial de frondas con el que se

comienza el bioensayo y el número de frondas con el que se finalizó el bioensayo en cada

una de las concentraciones ensayadas incluyendo sus respectivas réplicas.

Utilizando los datos de número de frondas en el comienzo, durante la exposición, y al final

de ésta se calculó la curva de crecimiento para cada control y cada concentración.

La tasa de crecimiento (frondas en número de días) se calculó con la siguiente fórmula:

µ= ( Ln χt2 – Ln χt1) / tn

Fórmula 2. Fórmula empleada para el cálculo del número de frondas.

Dónde: χt1 y χt2 representan los parámetros de observación (número de frondas) en el

tiempo tn de duración del test.

Organismo de ensayo

Lemna valdiviana

Efecto a evaluar Inhibición del crecimiento (área foliar, número de frondas, clorofila total,

peso húmedo)

Número de tratamientos 7 de exposición+ control

Número de replicas 3

Número de colonias por

tratamiento

10

Volumen por réplica 100 ml

Duración del test 7 días

Tóxico utilizado Clorpirifos

Temperatura 20°C ±2°C

Intensidad de luz 5000 lux

Fotoperiodo 14/10 (luz/oscuridad)

36

3.5.3 Área de las frondas (AF).

Se analizaron las frondas mediante fotografía digital, se tomó constancia de cada una de las

réplicas ensayadas al iniciarse el bioensayo (día 0) y al terminar el experimento (día 7). Las

fotografías fueron analizadas mediante el software image-j donde a través de contraste

producido con el color que se busca analizar, se calcula el área inicial (día 0) y el área final

(día 7) (Figura 10). La resta del área final menos el área inicial nos entregó la superficie

neta de crecimiento de L. valdiviana en cada uno de los tratamientos.

Figura 10. Imagen de tratamiento analizado con software ImageJ.

3.5.4 Peso húmedo (Biomasa)

Las plantas fueron pesadas en balanza análitica Sartorius analityc modelo, en el tiempo 0 y

finalizado bioensayo, cuidando mantener el mismo criterio para manejo de las frondas La

estimación de la tasa de crecimiento para este parámetro fue calculada según la Fórmula 2.

3.5.5 Contenido total de clorofila (CTC).

El contenido total de clorofila, se analizó al finalizar la exposición de los organismos, se

incubaron las plantas de cada tratamiento durante 48 hrs en 3 mL de acetona al 90%

(Merck) en total oscuridad y temperatura ambiente, previo pesaje de la biomasa de todos

los tratamientos (peso húmedo). Pasadas las 48 hrs de extracción, se midió su coeficiente de

absorción de luz en espectrofotómetro Dr Lange, modelo CADAS 200. Se midió a través de

fotometría a 3 longitudes de onda: 647nm, 664nm y 665 nm.

37

La estimación de las clorofilas “a”, “b” y total (mg g-1

peso húmedo) fueron calculadas

según la ecuación de Inskeep & Bloom (1985):

Chl a = 12,63 A664,5 - 2,52 A 647

Chl b = 20,47 A647 – 4,73 A 664,5

Chl total = 17, 95 A647 + 7,90 A664,5

Fórmula 3. Ecuación de Inskeep & Bloom (1985).

3.5.6 Evaluación de los resultados

Al final de la prueba (7 días) se calculó el porcentaje de inhibición para cada concentración

para el contenido total de clorofila mediante el software ICPIN. Además se determinó el

EC50 (concentración de efecto en el 50% de la población ensayada) mediante la utilización

del software ToxRat®

versión 2.10.

La estimación de la concentración efectiva que inhibe al 50% de la población estudiada

(EC50) se calculó mediante la medida de bondad de ajuste Chi² a 5 grados de libertad. Los

valores de pendiente e intercepto muestran la ecuación de la recta para la estimación de la

dosis/efecto (y= mx+b).

Si la probabilidad (p Chi2), es menor o igual a 0,1 los datos presentan una alta dispersión

para la respuesta de dosis/función calculada.

El coeficiente r2

(0 <= r ² <= 1) da la proporción de la varianza explicada por la función

dosis/respuesta graficada. El test-F muestra el nivel de significancia entre los tratamientos,

por lo que si p (F) <= alfa seleccionado (en este caso, alfa = 0,05) la regresión muestra

resultados significativamente diferentes.

Los valores de NOEC y LOEC fueron calculados mediante un análisis de comparación

múltiple a través del Test de Dunnett.

38

3.6 Biomarcadores

3.6.1 Exposición a Clorpirifos

El compuesto comercial TYA, tiene una concentración de 48% p/v de Clorpirifos como

ingrediente activo, a partir de esta información preparamos la solución madre de

Clorpirifos, para lo cual sacamos una alícuota de 1,0 mL de TYA, este volumen que fue

diluido con agua destilada en 100 mL, lo que dio una concentración de ingrediente activo

de 4800 mg L-1

de Clorpirifos.

Tabla 5. Concentraciones de Clorpirifos utilizada.

Concentración de

Clorpirifos (mg L-1

)

Volumen de tóxico (mL) Volumen medio

nutritivo 10X (mL)

Volumen agua destilada

(mL)

0,78 0,04 30 270,0

1,56 0,09 30 269,9

3,12 0,19 30 269,8

6,25 0,39 30 269,6

12,5 0,78 30 269,2

25,0 1,56 30 268,4

50,0 3,12 30 266,8

Esta solución contenía el medio nutritivo y distintas concentraciones de Clorpirifos y

(Tabla 5). La exposición al insecticida se llevó a cabo por 5 días.

Se utilizó una biomasa de aproximadamente 0.4 g de Lemna valdiviana las cuales fueron

transferidas desde el cultivo stock a vasos precipitados, los cuales contenían 100 mL de

solución.

Al final de la exposición, las muestras fueron recolectadas con el fin de determinar la

actividad enzimática.

39

3.6.2 Preparación de las muestras

Una vez recolectadas las muestras, se pesó cada una, como no se trabajó con las muestras

inmediatamente, se cubrieron con aluza, se les agregó N líquido, posteriormente fueron

congeladas a -80ºC. Al momento de iniciar las extracciones las plantas fueron

homogenizadas, en un homogenizador de vidrio con 10 mL de buffer fosfato de sodio el

cual fue preparado previamente con 80 mL de NaP 0.1 M, (pH 6.5); 20 mL de glicerol;

0.022 g de 1,4 dithioeritriol y 0,045 g de EDTA (C10H12N2Na4O8 x H2O). Una vez molidas

las plantas fueron traspasadas a vasos de vidrio de 25 mL y agitadas por 30 minutos en un

recipiente con hielo. Pasado este tiempo fueron centrifugadas por 10 minutos a 15.000 rpm

a 4ºC en una centrifuga Semi Ultra Centrifuga Refrigerada. Después se extrajeron 10 mL

del sobrenadante sin partículas con pipeta de vidrio Pasteur. Se pesaron 4,488 g de

(NH4)2SO4, esta cantidad de sal fue agregada gradualmente a cada muestra con ayuda del

agitador magnético durante un tiempo aproximado de 1 hora. Se volvieron a centrifugar

durante 45 minutos a 45.000 rpm a 4ºC, en semi ultra centrífuga refrigerada. Después de

esta última centrifugación se extrajo el sobrenadante para eliminarlo, pues solo se dejó el

pellet, ya que éste es el que contiene las enzimas, se agregaron 750 mL del buffer NaP 20

nM (pH 7.0) y se disolvió este pellet, con la finalidad de resuspenderlo. Esta solución se

agregó a las columnas por filtración en gel en columnas Sephadex G25, que previamente

habían sido lavadas con agua desionizada y dos veces con buffer NaP 20 mM , bajo las

columnas se colocó un tubo Eppendorf donde finalmente quedó la muestra (1 mL). Estos

tubos fueron tratados con un shock de N líquido y posteriormente congelados en un freezer,

a -80ºC.

En vasos de 25 mL se mezclaron 0.030 g de 1-Cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) con 5 mL

de etanol y 0.090 g de Glutatión reducido (GSH) con 5 mL de agua destilada.

Posteriormente en cubetas 1 cm cuarzo (QS) se midió un blanco, el cual consistía en 4

cubetas con 1000 µL de buffer NaP 0,1 M (pH 6.5), un control el cual consistió en preparar

una cubeta con 1100 µL de buffer NaP 0,1 M (pH 6.5), el cual se tenía la siguiente

constitución: 40 µL de GSH, 40 de CDNB, 40 µL NaP 0.1 M (pH 6.5); y la muestra, para

la cual se prepararon 3 cubetas de la misma forma que el control pero en lugar del buffer se

40

agregaron 40 µL de la muestra. Las mediciones se realizaron a una longitud de onda de 340

nm. En un espectro fotómetro multicelda temperado.

3.6.3 Determinación de Enzimas.

3.6.3.1 Catalasa (CAT).

Para la medición de Catalasa se extrajo el extracto proteico (fracción soluble) obtenido en

el paso de extracción de proteínas. Para esto se siguió el protocolo establecido por

Baudhuin et. al., (1964). Se preparó una solución buffer de NaP (50 mM, pH 7.0). En un

vaso precipitado se mezclaron 6,4 mL de este buffer y 100 µL de H2O2 (30%).

Se preparó un blanco en cubeta de cuarzo (QS) con 1000 µL de agua destilada. Un control

con 1250 µL de buffer NaP 50 mM, (pH 7.0), 100 µL de H2O2 y 25 µL de buffer. Además

de 3 réplicas para cada muestra conteniendo 1250 µL de buffer NaP 50 mM, (pH 7.0), 100

µL de H2O2 y 25 µL de la muestra correspondiente. La absorbancia se registró por 3

minutos a 240 nm.

3.6.3.2 Glutatión Reductasa (GR).

Para la determinación de esta enzima el protocolo se realizó de acuerdo a Calberg &

Mannervik, (1985). Se preparó una solución Buffer 0.1 M NaP pH (7.5), una solución

GSSG para lo cual se tomaron 0.061 g de Glutatión oxidado (GSSG) y se disolvieron en 5

ml de agua) y solución NADPH (0.008 g de NADPH en 5 ml de agua). Se utilizaron

cubetas de cuarzo 1 cm para registrar los cambios en la absorbancia a 340 nm cada 30

segundos durante 5 minutos, se midió un blanco con 850 μl del buffer, 50 μl de la solución

GSSG, 50 μl de la solución NADPH, 50 μl del buffer y 3 réplicas conteniendo cada una,

850 μl del buffer, 50 de la solución GSSG, 50 μl de la solución NADPH y 50 μl de la

muestra correspondiente.

41

3.6.3.3 Glutatión peroxidasa (GPx).

La actividad de GPx, fue determinada según Peters & Livingstone, (1996). Para este fin se

utilizó una solución buffer 0.1 NaP pH (7,5), una solución GSH (0.050 g de GSH disueltos

en 5 ml de agua), NADPH (0.008 g de NADPH en 5 ml agua), una solución de H2O2 (1.5 μl

de H2O2 en 5 ml de agua) y una solución de GSH reductasa (2322.68 μl de buffer + 270 μl

de enzima GR).

La absorbancia fue medida a 340 nm en cubetas de cuarzo durante 5 minutos a intervalos

de 30 segundos, se midió un blanco con 800 μl del buffer, 10 μl de GSH reductasa, 40 μl de

GSH, 40 μl de la solución NADPH, 10 μl de la solución de H2O2, 100 μl de buffer y

finalmente 3 réplicas, cada una con 800 μl del buffer, 10 μl de GSH reductasa, 40 μl de la

solución GSH, 40 μl de la solución NADPH, 10 μl de la solución de H2O2 y 100 μl de la

muestra correspondiente.

3.6.3.4 Glutatión-S-transferasa (GST).

(1974), se usó como sustrato 0,030 g de 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) en 5 ml de

etanol absoluto y como cosustrato se utilizó 0.090 g de Glutatión reducido (GSH) diluidos

en 5 ml de etanol. Se utilizó buffer fosfato NaH2PO4 0.1 M (pH 6.5). La absorbancia fue

medida a 340 nm en cubetas de cuarzo a 25ºC durante 5 minutos a intervalos de 30

segundos, de un blanco con 1100 μl del buffer, 40 μl de GSH, 40 μl de CDNB, 40 μl de

buffer, y 3 réplicas cada una con 1100 μl del buffer, 40 μl de GSH, 40 μl de CDNB, 40 μl

de la muestra correspondiente.

Todas las actividades enzimáticas específicas se expresan en (nkat mg-1

de proteína),

donde 1 kat se define como 1 mol de reacción del sustrato por segundo.

3.6.4 Análisis estadístico.

Todos los análisis fueron realizados con 3 réplicas por tratamiento. Siempre que los datos

presentaron normalidad, las diferencias significativas entre la actividad de los tratamientos

y el tratamiento control fueron analizadas con ANOVA de una vía. Cuando la normalidad

de los tratamientos no se cumplió, se utilizó la prueba de Kruskall-Wallis. El valor de

42

p<0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Estos análisis fueron realizados con

el software Sigmaplot 12.0.

3.7. Bioacumulación-degradación

3.7.1 Material biológico

Lemna valdiviana fue obtenida de cultivos in vitro, previamente aclimatados, desde el

Laboratorio de suelo de la Sección Agricultura de la Comisión Chilena de Energía Nuclear,

Santiago.

3.7.2 Clorpirifos-14

C

Se utilizó Clorpirifos marcado con 14

C, (Clorpirifos-14

C) con una actividad inicial de

1.05x108 dpm/mL, actividad específica de 9.25 MBq/g y una pureza superior al 95%

(Izotop, 2012). (Figura 12). El 14

C se encuentra ubicado en el grupo etilo

Figura 11. Clorpirifos marcado con 14

C, los carbonos radiactivos se encuentran marcados

con *.

3.7.3 Preparación de soluciones

Se utilizó el formulado comercial Troya 4 EC, el cual tiene como ingrediente activo un

48% p/v de Clorpirifos. El criterio utilizado para determinar la concentración a utilizar

(12.5 mg L-1

) fue que a lo largo del bioensayo de ecotoxicidad L. valdiviana no evidenció

efectos visibles, los EC50 para el contenido total de clorofila, el número de frondas y

biomasa tampoco evidenciaron efecto de inhibición a esta concentración.

43

Como se acordó medir una concentración de Clorpirifos (12.5 mg L-1

), se procedió a

preparar una única solución madre para todo el ensayo, con un volumen final de 2000 mL,

Los componentes de esta solución fueron, Clorpirifos, Clorpirifos-14

C, solución nutritiva

10X y agua destilada.

Para la preparación de la concentración de Clorpirifos (12.5 mg L-1

) se obtuvo una alícuota

de 208 µL del formulado TYA la que fue diluida en un 10% de acetona (Merck), en un

matraz aforado de 100 mL, por lo cual, la concentración de Clorpirifos fue de 1000 mg L-1

.

Se agregaron 25 mL de esta solución, a la solución madre para cada ensayo, mientras que el

volumen de solución nutritiva 10X, fue de 200 mL para cada ensayo.

El volumen de Clorpirifos-14

C que se agregó a la solución madre y la actividad de esta

solución en cada ensayo se muestran en siguiente tabla:

Tabla 6. Volumen de Clorpirifos-14

C utilizado para cada ensayo.

Ensayo Clorpirifos-14

C (mL) Actividad Clorpirifos-14

C (dpm/mL)

1 0,71 1,4x106

2 2,00 1,4x106

3 0,02 1,0x108

4 0,02 1,0x108

5 0,03 1,0x108

La bioacumulación se realizó mediante los 4 primeros ensayos, mientras que la degradación

de Clorpirifos fue determinada mediante 5 ensayos, por lo cual para el ensayo nº 5 no se

llevo a cabo exposición de L. valdiviana.

Los cálculos realizados para determinar volúmenes y concentraciones necesarias para cada

ensayo fueron hechos con la siguiente fórmula:

44

V1* C1 = V2* C2

Fórmula 4. Utilizada para el cálculo de las concentraciones y volúmenes necesarios de los

compuestos requeridos.

Donde V1: volumen de toxico a añadir; C1; concentración inicial; V2: volumen final; C2:

concentración final.

Se realizaron 3 tratamientos, por triplicado (24, 48 y 96 horas), y cada uno tenía además 3

controles negativos. El volumen final para cada vaso precipitado fue de 80 mL.

La duración de cada ensayo fue de 96 Horas. Se usó para el mantenimiento un incubador

refrigerado (SANYO modelo MIR-253) programada con una temperatura de 20°C ± 2°C,

el fotoperiodo fue de 14 horas luz/10 hrs oscuridad, la luminosidad fue dada por 4

lámparas led de 18 watts.

3.7.4 Inoculación de organismos

Para la inoculación, se pesaron 0,5 g (peso húmedo) de Lemna valdiviana y se agregó esta

cantidad de biomasa a cada vaso (Figura 12), excepto a los controles, usamos criterio de

selección al azar.

3.7.5 Determinación de actividad

La determinación de la actividad radiactiva (dpm/mL) inicial del ensayo se llevó a cabo en

el Contador de Centelleo Líquido Beckman LS 5000TD (CCL) (Figura 15. Derecha). Para

medir la actividad de la solución de Clorpirifos-14

C, se tomó una alícuota de 5 µL del

compuesto, se agregó a un vial de vidrio con tapa rosca, posteriormente se agregaron 5 mL

de líquido centelleador (Ultima Gold). El tiempo de medición de cada muestra fue de 10

minutos. A excepción de la solución madre, cada muestra fue medida 2 veces.

De la solución madre, se midieron 6 viales, para cada uno se tomó 1 mL de la solución y se

agregó a un vial de vidrio de 20 mL con tapa rosca, se agregaron 5 mL de líquido

centelleador y se midió en el CCL. Posteriormente se repitió el mismo procedimiento,

45

midiendo el sobrenadante de cada vaso, a las 24, 48 y 96 horas. Aunque solamente se

midió un vial para cada tratamiento, a diferencia de la solución madre.

Figura 12. Vasos precipitados inoculados con 0,5 g de Lemna valdiviana.

Figura 13. Diseño experimental para el ensayo de bioacumulación.

3.7.6 Determinación de bioacumulación.

Para determinar cuantitativamente la bioacumulación de Clorpirifos en las plantas, éstas

fueron extraídas de los vasos al finalizar cada tiempo de exposición (24, 48 y 96 horas),

lavadas con agua destilada, para eliminar cualquier residuo de su superficie y dejadas en

46

placas de vidrio, cuando finalizó el último tiempo de exposición fueron tratadas en el

Liofilizador CHRIS modelo DELTA 1-20KD por 24 horas (Figura 14).

Figura 14. Izquierda. Liofilizador CHRIST modelo DELTA 1-20KD. Derecha. Plantas

liofilizadas, pesadas y cubiertas de Manitol, listas para ser combustionadas.

Antes de ser combustionadas las plantas fueron pesadas en cubetas de porcelana, para

obtener el peso seco, a cada una se le agregaron 50 mg de manitol (Figura 14. Derecha).

Para combustionar las muestras de plantas, se utilizó un oxidizador biológico modelo

OX500 (Figura 15. Izquierda).

Figura 15. Izquierda. Oxidizador biológico modelo OX500. Derecha. Contador de

Centelleo Líquido, Beckman LS 5000TD.

47

Se comenzó por rotular viales de vidrio con tapa rosca, los que después de ser

combustionada la muestra contenían el 14

C en forma de 14

CO2

junto a un porcentaje de

líquido centelleador para ser medidos posteriormente en el CCL. Uno de estos viales

contenía 25 µL del estándar de Clorpirifos-14

C y 5 mL de líquido centelleador, el cual no

fue combustionado, por lo que se denominó “std s/c” (estándar sin combustionar). Además

se agregaron 25 µL de la misma solución sobre un papel absorbente en una capsula de

porcelana, el que fue quemado y se denominó “std c/c” (estándar combustionado). Además

de los estándares se quemaron 50 mg de manitol en una capsula de porcelana. De cada

muestra se obtuvo un vial para determinar su actividad en el CCL. Posteriormente los

resultados fueron ingresados a una planilla Excel donde fueron calculados los porcentajes

de bioacumulación y degración.

3.7.7 Cálculo de bioacumulación y degradación

El porcentaje de bioacumulación de Clorpirifos en cada hora de exposición (24, 48 y 96) se

determinó con la siguiente fórmula:

A = Actividad promedio total de plantas (dpm/100 mL)

B = Actividad medida en el tratamiento control (dpm/100 mL)

* 100 = % de bioacumulación

Fórmula 5. Cálculo del porcentaje de bioacumulación.

La determinación del porcentaje de degradación de Clorpirifos en los tratamientos controles

para cada tiempo de exposición (24, 48 y 96 horas) se calculó de la siguiente manera:

C = Actividad promedio de la solución madre (dpm/mL)

D = Actividad promedio medida en los controles (dpm/mL).

E = Actividad degradada (dpm/mL)

X = porcentaje de Clorpirifos degradado.

48

Fórmula 6. Calculo del porcentaje de degradación.

3.7.8 Análisis estadístico

Todos los análisis fueron realizados con 3 réplicas por tratamiento (n=3). Siempre que los

datos presentaron normalidad, las diferencias significativas entre la actividad de los

tratamientos y el tratamiento control fueron analizadas con ANOVA de una vía. Cuando la

normalidad de los tratamientos no se cumplió, se utilizó la prueba de Kruskall-Wallis. El

valor de p<0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Estos análisis fueron

realizados con el software Sigmaplot 12.0.

Se utilizó el software ToxRat®

versión 2.10 para determinar la concentración de efecto

media (EC50) que produce estimulación en las enzimas antioxidantes. Los valores de

NOEC fueron calculados mediante un análisis de comparación múltiple a través del Test de

Dunnett.

La estimación de la concentración efectiva (EC50) se calculó mediante la medida de

bondad de ajuste Chi² a 5 grados de libertad. Los valores de pendiente e intercepto

muestran la ecuación de la recta para la estimación de la dosis/efecto (y= mx+b).

Si la probabilidad (p Chi2), es menor o igual a 0,1 los datos presentan una alta dispersión

para la respuesta de dosis/función calculada.

El coeficiente r2

(0 <= r ² <= 1) da la proporción de la varianza explicada por la función

dosis/respuesta graficada. El test-F muestra el nivel de significancia entre los tratamientos,

por lo que si p (F) <= alfa seleccionado (en este caso, alfa = 0,05) la regresión muestra

resultados significativamente diferentes.

49

IV. Resultados

4.1 Bioensayos de ecotoxicicidad

Las concentraciones de exposición de Clorpirifos como ingrediente activo (i.a), que se

utilizaron en estos bioensayos fueron preparadas a partir del formulado comercial LBN.

Los resultados de EC50, LOEC (concentración más baja en la que se observa un efecto) y

NOEC (concentración en la que no se observa un efecto) para los ensayos 1 y 2, se

muestran en las Tablas 7 y 8, respectivamente.

En el ensayo 1 (Tabla 7) se observa que el parámetro más sensible fue el AF (EC50= 8,80

mg L-1

). Para el número de frondas, se obtuvo un EC50 = 16,4 mg L-1

, mientras que

biomasa fue = 9,8 mg L-1

.

En el ensayo 2 (Tabla 8) para el NF se obtuvo un EC50= 14,0, para el AF = 8,2 mg L-1

y

para biomasa 15,0 mg L-1

. Estos resultados muestran, al igual que el ensayo 1 que el

parámetro más sensible fue el área de las frondas, ya que presentó los valores más bajos; es

decir la inhibición media de este parámetro ocurría a concentraciones menores que a los

demás parámetros estudiados; en contraposición, el número de frondas fue un parámetro

poco afectado por el tóxico en ambos ensayos, ya que la inhibición media se produjo a

mayores concentraciones del plaguicida.

Los valores de NOEC y LOEC para estos tres puntos finales evaluados difieren en ambos

ensayos. En el Ensayo 1, a 4,98 mg L-1

las plantas no presentaban efecto en el NF, mientras

que en el Ensayo 2, esta concentración comenzaba a evidenciar efectos para este parámetro.

Lo mismo ocurrió para el AF, NOEC en el Ensayo 1 ocurre a 2,49 mg L-1

, mientras que en

el ensayo 2, ocurre a 0,62 mg L-1

. Para biomasa la concentración más baja a la que se

observó un efecto fue a 4,98 mg L-1

, disímil al Ensayo 1, donde ocurre a 10,0 mg L

-1. Estos

resultados estarían indicando que el área de la fronda constituyo el punto final más sensible,

en plantas expuestas a Clorpirifos, de hecho en el Ensayo 2, se comienza a observar un

efecto en la segunda concentración más baja (1,24 mg L-1

).

50


, EC50,

NOEC y LOEC para los diferentes puntos finales, obtenidos en el Ensayo 1. Los valores

indicados entre paréntesis corresponden al intervalo de confianza (95%). n.d* indica que no

fue posible la estimación del intervalo de confianza (95%).

EC50 NOEC LOEC

Número de Frondas (NF) 16,4 4,98 10,0

(12,8-20,9)

Área de frondas (AF) 8,80 2,49 4,98

(5,6-13,6)

Biomasa 9,8 4,98 10,0

n.d


, EC50,

NOEC y LOEC para los diferentes puntos finales, obtenidos en el Ensayo 2. Los valores

indicados entre paréntesis corresponden al intervalo de confianza (95%).

EC50 NOEC LOEC

Número de Frondas (NF) 14,0 2,49 4,98

(12,6-15,6)

Área de frondas (AF) 8,20 0,62 1,24

(3,9-17,1)

Biomasa 15,0 2,49 4,98

(10,5-21,6)

Las curvas entregadas por el software ToxRat (concentración-efecto) se muestran en la

Figura 16 (A, B, C, D, E y F). Las líneas punteadas a ambos lados de la función

corresponden a los intervalos de confianza (95%).

Para el NF, ambos Ensayos, 1 y 2 (A y D, respectivamente) presentaron curvas de tipo

sigmoidal, común para estos experimentos, a bajas concentraciones del xenobiótico, no se

51

observó el efecto de inhibición media, pero a medida que las concentraciones aumentaban,

este efecto aumentó exponencialmente hasta que se saturó a altas concentraciones.

Mientras que para el Ensayo 2 los datos obtenidos fueron más ajustados a la curva

evidenciando un alto r2 (0,94)

entre la concentración ensayada y el efecto de inhibición en

el NF (Tabla 9).

Respecto al área de la fronda, en el Ensayo 1, Figura B (Tabla 10), r2

fue 0,72, lo que

indicaría que el 72% de la inhibición media resultante se estaría explicado por las

concentraciones ensayadas (Figura 23). Similar tendencia se observó en el ensayo 2 (Tabla

10, Figura E).

Los resultados de biomasa se pueden observar en C y F correspondientes al ensayo 1 y 2

respectivamente. En el ensayo 2 (Figura 26) se observó que a medida que aumentó la

concentración del tóxico, la inhibición de la biomasa aumentó correlativamente (r2 = 0,81).

52

Figura 16. Curvas de concentración-efecto representando la influencia de Clorpirifos

sobre la tasa de crecimiento (inhibición) media en NF, (A), AF (B), y biomasa (C) de

Lemna valdiviana al día 7 en el Ensayo 1. D, E y F representan curvas de concentración-

efecto representando la influencia de Clorpirifos sobre la tasa de crecimiento (inhibición)

media en NF, AF, y biomasa, respectivamente de Lemna valdiviana al día 7 en el Ensayo

2.

53

Tabla 9. Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el NF en los Ensayos 1 y 2.

Parámetro Ensayo 1 Ensayo 2

Pendiente b: 3,45436 4,50684

Intercepto a: -4,19826 -5,17805

Chi2: 0,13396 0,04034

p(Chi2): 0,99967 0,99998

r2: 0,861 0,946

p(F) (df: 1;5): 0,003 0,000

Tabla 10. Parámetros del análisis de regresión PROBIT para AF en los Ensayos 1 y 2.


Pendiente b: 3,81163 2,07170

Intercepto a: -3,60148 -1,89348

Chi2: 0,29785 0,48159

p(Chi2): 0,99768 0,99278

r2: 0,720 0,735

p(F) (df: 1;5): 0,016 0,014

54

Tabla 11. Parámetros del análisis de regresión PROBIT para biomasa en los ensayos 1 y 2.

n.d: indica que no fue posible determinar este parámetro.


Pendiente b: 12,44747 2,83406

Intercepto a: -12,33832 -3,33815

Chi2: -0,00001 0,21443

p(Chi2): n.d. 0,99895

r2: 1,023 0,819

p(F) (df: 1;5): n.d. 0,005

4.1.2 Contenido Total de Clorofila (CTC)

El CTC fue calculado utilizando el promedio de clorofila total. La Figura 17 nos muestra el

CTC para el Ensayo 1, en el cual claramente se observa una estimulación de este parámetro

en las concentraciones más bajas (0,62; 1,24 mg L-1

), las cuales presentan valores de 0,89

y 0,87 mg g-¹, respectivamente, valores que superan al obtenido en el control, pero

estadísticamente no difieren con éste (p>0,05). A 2,49 mg L-1

se observa un valor cercano

al obtenido en el control negativo (0,79 mg g-¹). A partir de 4,98 mg L

-1 la curva fue

descendiente mostrando una clara inhibición, aunque a 10,0 mg L-1

el CTC (0,83 mg g-¹)

fue más alto que el control, es decir, a esta concentración también se produjo estimulación.

A 40 mg L-1

el efecto de inhibición es significativamente diferente al tratamiento control

(p<0,05). Incluso a simple vista, a las 48 horas de exposición se observó que las frondas

expuestas a 40 mg L-1

presentaban necrosis y las colonias estaban completamente

separadas, efecto conocido como absición.

En el Ensayo 2, (Figura 18), se observa que a 0,62 y 1,24 mg L-1

, el CTC es más alto

(0,99 y 0,81 mg g-¹, respectivamente) que el tratamiento control (0,79 mg g

-¹), aunque

estadísticamente no son diferentes entre sí (p>0,05). Se evidenció una inhibición de este

parámetro recién a 10,0 mg L-1

, la que aumentó hasta la concentración más alta (40 mg

L-1

); de hecho a esta concentración, pasadas 48 horas de exposición, las frondas

expuestas mostraban necrosis, al igual que lo ocurrido en el Ensayo 1 (Figura 19).

55

En ambos Ensayos, entre los 4 primeros tratamientos, incluyendo el control, y las dos

concentraciones más altas existen diferencias significativas (p<0,05), diferencias que

claramente se deben a que en las concentraciones más bajas Clorpirifos ejerce una

estimulación en la producción de clorofila mientras que a partir de concentraciones altas se

produce una inhibición de este parámetro.

Figura 17. Contenido de Clorofila Total (mg g-¹). Promedio en la exposición de Lemna

valdiviana a Clorpirifos en el Ensayo 1.

Figura 18. Contenido de Clorofila Total (mg g-¹) promedio en la exposición de Lemna

valdiviana a Clorpirifos en el Ensayo 2. Diferencias significativas (p<0,05) indicados por

*.

0,79 0,89

0,87 0,82

0,69

0,83

0,49

0,09*

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00 1,10

control 0,62 1,24 2,49 4,98 10,0 20,0 40,0

Clo

rofi

la T

ota

l (m

g·g¯

¹)

Concentración (mg L-1)

0,80 0,99

0,92 0,78

0,85

0,70 0,50

0,08*

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00 1,10

Control 0,62 1,24 2,49 4,98 10,0 20,0 40,0

Clo

rofi

la T

ota

l (m

g·g¯

¹)

Concentración (mg L-1)

56

4.1.3 EC50 para CTC

La concentración que inhibe el contenido de clorofila total en el 50% de la población

estudiada en los dos ensayos estudiados fue calculada con el software ICPIN. En ambos

ensayos la inhibición media de este parámetro se produjo a altas concentraciones (Tabla

11), lo que indicaría que la producción de clorofila en las plantas expuestas, si bien se vio

comprometida, ocurrió a altas concentraciones de Clorpirifos, en cierta forma se podría

inferir que el pesticida no produjo daño sistémico inmediato en los fotosistemas de las

plantas.

Tabla 12. Valores de EC50 calculado con el software ICPIN, para el contenido de

clorofila total (CTC) en mg L-1

, para los 2 Ensayos realizados, en Lemna valdiviana

expuesta a Clorpirifos. Valores entre paréntesis muestran los intervalos de confianza

(95%).

Ensayo EC50 (mg L-1

)

1 24,5

(22,4-27,0)

2 24,6

(22,0-26,9)

57

Figura 19. Las imágenes A, B y C muestran el tratamiento control al día 1, 2 y 7,

respectivamente. Las imágenes D, E y F muestran el tratamiento más concentrado (40 mg

L-1

) al día 1, 2 y 7, respectivamente, utilizando Lorsban (LBN).

4.2 Determinación de Biomarcadores.

4.2.1 Enzima de biotransformación (GST)

Para estos bioensayos se trabajo con concentraciones de ingrediente activo Clorpirifos a

partir del formulado comercial TYA. Respecto a GST (glutatión-S-transferasa), la actividad

de esta enzima aumentó significativamente (p<0,05) desde la concentración más baja a la

más alta (1,5 a 50 mg L-1

), (Figura 20). La función de esta enzima radica en aumentar la

solubilidad del xenobiótico para poder ser transportado fuera de la célula y fuera del

organismo, conjugando compuestos tóxicos con sustratos hidrosolubles, de manera que el

xenobiótico tenga más afinidad por el agua, y así poder eliminarlo más fácilmente. Por lo

que su aumento ocurriría en respuesta a una eventual exposición a Clorpirifos.

4.2.2 Enzimas antioxidantes

Los resultados de CAT, GR y GPx, fueron similares a GST (Figura 20), es decir, a medida

que aumentaba la concentración ensayada, el aumento de la actividad enzimática fue de

forma relativamente lineal. A partir de la concentración más baja, (0,78 mg L-1

) la

actividad aumentó significativamente (p<0,05), obteniéndose la máxima actividad en la

concentración más alta (50 mg L-1

).

En la Figura 20, se observa que a 3,1 mg L-1

existió una desviación estándar, entre las

réplicas, mayor a los demás tratamientos, esto pudo deberse a la manipulación de la

58

muestra antes de ser medida su actividad enzimática, ya que esta tendencia se evidenció en

todas las mediciones efectuadas.

Figura 20. Respuesta de GST, CAT, GR y GPx en Lemna valdiviana tras 5 días de

exposición a Clorpirifos. Los valores de actividad enzimática específica fueron expresados

en mg nkat mg-1

proteína. Diferencias significativas (p<0,05) indicados por *.

59

4.2.3 Determinación de EC50 de las actividades enzimáticas

Los resultados de EC50 (Concentración efecto en el 50% de la población estudiada) y

NOEC (concentración en la que no se observa un efecto) se muestran en la Tabla 13.

GST resultó ser el parámetro más sensible a la estimulación generada por la exposición de

la planta a Clorpirifos evidenciando EC50 a 0,48 mg L-1

, para la actividad enzimática de

GR el EC50 fue de 2,0 mg L-1

, mientras que CAT a 3,9 mg L-1

, por último GPx evidenció

EC50 a 12,1 mg L-1

. Los valores de NOEC coinciden para todos los componentes medidos

y ocurre concentraciones más bajas de las ensayadas. De acuerdo a este valor, por ende

LOEC ocurre para todas las enzimas en la concentración más baja (0,78 mg L-1

), por lo que

es partir de esta concentración que el sistema antioxidante y de biotransformación en

Lemna valdiviana comienza a activarse.

Tabla 13. Concentraciones de efecto del 50% del insecticida Clorpirifos en Lemna

valdiviana en mg L-1

, CE50, NOEC para la actividad enzimática de GST, CAT, GR y GPx.

Los valores indicados entre paréntesis corresponden al intervalo de confianza (95%)

Parámetro EC50 NOEC

GST 0,48 Bajo 0,78

(0,08-1,00)

CAT 3,91 Bajo 0,78

(2,9-5,0)

GR 2,08 Bajo 0,78

(1,25-3,03)

GPx 12,15

(8,66-18,3)

Bajo 0,78

La Figura 21 (A, B, C y D) muestra la curva de regresión entregada por el software

ToxRat. Para GST (Figura 21 A) la correlación entre las concentraciones de exposición y el

porcentaje de estimulación en la actividad enzimática es alta (r2=0,85), todos los puntos en

la curva, a excepción del control negativo se encuentran cercanos entre sí, y casi llegando a

60

la fase de latencia de la curva; de hecho la concentración más alta, está cercana al 90% de

estimulación de GST, esto podría indicar que hipotéticamente la actividad de GST se

saturaría a concentraciones de exposición sobre los 50 mg L-1

. Sin embargo para CAT, GR

y GPx, (Figura 21 B, C y D; respetivamente) se observa alta correlación entre los

tratamientos de exposición y la estimulación en la actividad enzimática, evidenciando altos

r2

(Tabla 14). En todas las figuras se evidencian puntos en la fase exponencial de la curva,

por lo que podríamos inferir que el sistema de enzimas antioxidantes actúa con todo su

potencial para hacer frente a una posible situación de estrés oxidativo generado por

Clorpirifos.

61

Figura 21. Curvas de concentración-efecto representando la influencia de Clorpirifos

sobre la actividad enzimática (estimulación) media de GST (a) CAT (b), GR (c) y GPx (d)

en Lemna valdiviana al día 5.

62

Tabla 14. Parámetros del análisis de regresión PROBIT para actividad enzimática de GST,

CAT, GR y GPx.

Parámetro GST CAT GR GPx

Pendiente b: 0,71686 0,74177 0,83904 0,42419

Intercepto a: 0,23151 -0,43905 -0,26685 -0,46001

Chi2: 0,08368 0,02752 0,06809 0,01839

p(Chi2): 0,99990 0,99999 0,99994 1,00000

r2: 0,855 0,972 0,936 0,956

p(F) (df: 1;5): 0,003 0,000 0,000 0,000

4.3 Bioacumulación y degradación de Clorpirifos.

4.3.1 Bioacumulación

Las exposiciones para medir efectos de bioacumulación y degradación del insecticida

Clorpirifos como ingrediente activo se realizaron mediante el formulado comercial TYA.

Las Figuras 22 (A, B, C y D), muestran el porcentaje de biacumulación de Lemna

valdiviana en 4 ensayos de bioacumulación, respectivamente. Las plantas fueron expuestas

a una única dosis del insecticida Clorpirifos (12,5 mg L-1

) en 3 tiempos de exposición

diferentes (24, 48 y 96 horas). En el ensayo 1, (Figura 22 A) se observa que ocurrieron

diferencias significativas (p<0,05) entre las 96 horas y los demás tratamientos, sin embargo

entre las 24 y 48 horas estas diferencias no fueron significativas (p>0,05). Para el ensayo 3

(Figura 22 C), se observa que la bioacumulación del xenobiótico fue significativa a medida

que aumentaban las horas de exposición (p<0,05).

63

Figura 22. Porcentaje de bioacumulación de Clorpirifos en Lemna valdiviana en 3 tiempos

de exposición (24,48 y 96 horas) en 4 ensayos realizados (A, B, C y D, respectivamente).

Diferencias significativas (p<0,05) indicados por: 24 h (a), 48 h (

b) y 96 h (

c) horas

respectivamente.

64

La bioacumulación promedio de todos los ensayos realizados (Figura 23) varió entre 6,9 y

16,8 %, entre las 24 y 96 horas de exposición, respectivamente.

Figura 23. Bioacumulación promedio de los 4 ensayos realizados. Diferencias

significativas (p<0,05) indicados por: 24 h (a), 48 h (

b) y 96 h (

c) horas respectivamente.

4.3.2 Degradación de Clorpirifos en agua destilada

Los resultados de degradación del insecticida Clorpirifos medida en los tratamientos

controles donde había ausencia de Lemna valdiviana se puede observar desde la Figura 24

E, F, G, H e I, los que corresponden a 5 ensayos realizados, respectivamente.

En los 5 Ensayos realizados, la degradación de Clorpirifos fue evidente y creciente a

medida que avanzaban las horas de exposición, los resultados entre las 24 y 96 horas de

exposición fueron significativamente diferentes entre sí (p<0,05).

En los Ensayos 1 y 2 (Figura 24. E y F) se observó diferencias significativas entre las 24 y

48 horas (p<0,05) pero no entre las 48 y 96 horas. En los ensayos 3, 4 y 5 (Figura 24 G, H

e I) las diferencias fueron significativas entre las 24 y 96 horas, (p<0,05), no existió una

degradación significativa entre las 24 y 48 horas y tampoco entre las 48 y 96 horas de

exposición (p>0,05).

6,9bc

10,2ac

16,8ab

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

24 h 48 h 96 h

Bio

acu

mu

laci

ón

(%)

Horas de exposición

65

Figura 24. E, F, G, H e I, muestran el porcentaje de degradación de Clorpirifos en agua

destilada, en 3 tiempos de exposición. Diferencias significativas (p<0,05) indicados por: 24

h (a), 48 h (

b) y 96 h (


E F

G H

I

66

El promedio de degradación de Clorpirifos en los 5 Ensayos realizados varió entre 17,8 y

34,8%, entre las 24 y 48 horas de exposición (Figura 25). El aumento de degradación fue

significativamente diferente (p<0,05) entre los dos primeros días de exposición, y también

entre las 24 y 96 horas, pero no fue estadísticamente diferente entre las 48 y 96 horas de

exposición.

Figura 25. Degradación promedio de Clorpirifos en agua destilada. Diferencias

significativas (p<0,05) indicados por: 24 h (a), 48 h (

b) y 96 h (


Mediante otro ensayo se determinó que ya habiendo pasado 1 hora de exposición, un 3,14%

de Clorpirifos era degradado (Figura 26). A medida que aumentaban las horas de

exposición, el porcentaje de degradación también aumentó significativamente (p<0,05).

17,8bc

28,4a

34,8a

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

24 h 48 h 96 h

De

grad

ació

n (

%)


67

Figura 26. Porcentaje de degradación de Clorpirifos en diferentes tiempos de exposición.

Diferencias significativas (p<0,05) indicados por: 1 h (a), 3 h (

b), 6 h (

c), 10 (

d), 24 (

e), 48 (

f)

y 96 (g) horas respectivamente.

El promedio de porcentaje de Clorpirifos existente en el sobrenadante de los vasos que

contenían Lemna valdiviana a las 96 horas de exposición se muestra en la Tabla 15. Este

análisis se realizó con la finalidad de corroborar que al final de cada ensayo el porcentaje de

Clorpirifos final, es decir, el Clorpirifos medido en el tejido de las plantas, en los controles

y el existente en los vasos con L. valdiviana debería ser ~100%.

Este análisis nos indicó que en promedio, el porcentaje de Clorpirifos que queda en el

sobrenadante, a las 96 horas, disponible para ser bioacumulado o degradado es cercano al

50%, lo que da una señal de que posterior a este tiempo de exposición la planta

eventualmente podría seguir absorbiendo xenobiótico.

3,14defg

6,83efg 8,68fg 12,8afg

13,9abfg

31,7abcdeg

48,7abcdef

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

1 h 3 h 6 h 10 h 24 h 48 h 96 h

De

grad

ació

n (

%)


68

Tabla 15. Porcentaje de Clorpirifos en las 3 fracciones medidas y el total resultante.

% de Clorpirifos (96 horas)

degradación 34,8

Bioacumulación 16,8

Sobrenadante en vasos con L. Valdiviana 47,9

Total 99,5

69

V. Discusión

5.1 Bioensayos de ecotoxicidad

Nuestros resultados indican que entre los puntos finales medidos en Lemna valdiviana

expuesta a Clorpirifos, el área de la fronda constituyó el parámetro más sensible, (Tabla 16)

con una concentración de inhibición media promedio de 8,50 mg L-1

. Por el contrario, el

contenido de clorofila total resultó ser el punto final de menor sensibilidad (24,5 mg L-1

).

Estos resultados nos podrían indicar que si bien el crecimiento de la planta es un parámetro

afectado por la exposición de la planta a Clorpirifos, su actividad fotosintética sigue activa

incluso a altas concentraciones, lo que podría estar reflejando las características que poseen

estas plantas de acumular y tolerar cantidades significativas de tóxico sin presentar daños

severos en su estructura fisiológica. Según autores como Munkegaard y Abbaspoor (2008);

Lewis, (1995); al comparar macrófitas acuáticas con otros organismos (p.e. invertebrados

acuáticos, peces), en términos de sensibilidad a sustancias que afectan el metabolismo, las

primeras son menos sensibles y más resistentes que los segundos. El principal argumento

que estos autores plantean para sustentar estas aseveraciones, es que las plantas son

organismos sésiles por lo que no pueden escapar a condiciones ambientales desfavorables

por lo que han evolucionado diversificando sus sistemas de desintoxicación, de esta manera

las plantas son menos susceptibles a la toxicidad de contaminantes o mezclas de éstos.

70

Tabla 16. Comparación de valores de EC50 (mg L-1

) obtenidos para diferentes

parámetros, en distintos estudios.

Especie Pesticida Parámetro Tiempo de

exposición

EC50

(mg L-1

)

Autores

Lemna minor Clorpirifos Clorosis

Necrosis

Ruptura

Promedio

48 h 0,212

0,662

0,003

0,222

Iannacone

et al 2000

Myriophyllum

aquaticum

Parathion Clorofila a

Clorofila b

Carotenoides

14 días 15,6

15,7

15,0

Turgut &

Formin

(2002)

Lemna

valdviana

Clorpirifos Numero de frondas

Área de la fronda

Biomasa húmeda

Clorofila a

Clorofila b

Clorofila total

7 días 15,2

8,50

12,4

12,5

14,4

24,5

Este

estudio

Efectos como la clorosis (ausencia de pigmentación) y/o necrosis (muerte del tejido), lo

pudimos evidenciar después de 48 horas de exposición, a concentraciones de 40 mg L-1

,

resultados diferentes a los obtenidos por Iannacone et al., (2000), quienes emplearon

Lemna minor expuesta a Clorpirifos por un tiempo de 48 horas, posterior a este tiempo,

obtuvieron un EC50 promedio de 0,22 mg L-1

para clorosis, necrosis y ruptura de fronda

(Tabla 16); respecto a Clorofila a y b, nuestros resultados son similares a los obtenidos en

M. aquaticum por Turgut & Formin (2002), aunque el tiempo de exposición, ingrediente

activo y la especie en ambos estudios fueron diferentes, en ambos, el tóxico fue un

71

insecticida organofosforado, cuyo mecanismo de acción es la inhibición de

acetilcolinesterasa (Stephenson & Solomon; 2013); respecto a las especies utilizadas,

Roshon et al (1999), reportó similitud en la sensibilidad de ambos géneros expuestos a

herbicidas., en cuanto al tiempo de exposición, si hipotéticamente, aumentáramos nuestro

tiempo de exposición al doble, probablemente el efecto en inhibición de clorofila a y

clorofila b en Lemna valdiviana sean mayores, es decir, a concentraciones menores de

plaguicida, el efecto del tiempo en el grado de toxicidad fue reportado por Sobrero (2010),

quien indicó que al aumentar el tiempo de exposición de Lemna gibba a glifosato,

aumentaban los efectos fitotóxicos. Cabe señalar que el cálculo de EC50 de Clorofila a y

b, no está estipulado en la metodología de este trabajo, solo se realizó como una forma de

poder comparar este parámetro con el estudio de Turgut & Formin (2002)

Respecto al contenido de clorofila total, en las concentraciones 0,62; 1,24 y 2,49 mg L-1

se

observó una estimulación de este parámetro, fenómeno conocido como hormesis, el cual

consiste en una respuesta adaptativa de los organismos frente a una disrrupción de la

homeostasis debido a la inducción de un estrés ambiental (Sáenz et al., 2009). Este efecto

también fue documentado en microalgas (Scenedesmus quadricauda y Raphidocelis

subcapitata) expuestas a Glifosato, en las cuales se produjo una estimulación de la tasa

fotosintética a bajas concentraciones del herbicida (Sáenz et al., 2009). Cedergreen et

al.,(2007), también reportó este fenómeno en Lemna minor expuesta a Glifosato, donde

describen que a bajas concentraciones del tóxico, se produce una estimulación en el peso

seco y la tasa de crecimiento de las plantas expuestas.

Los efectos de insecticidas organofosforados en plantas acuáticas han sido reportados por

distintos autores. Peterson et al, el año 1994 describieron el efecto de inhibición en el

consumo de 14

C en Lemna minor expuestas a concentraciones de los insecticidas Carbaryl

y Carbofuran, los cuales causaban 33 y 21% de inhibición, respectivamente.

72

5.2 Biomarcadores

Esta descrito que las plantas responden al estrés generado por condiciones adversas, ya sean

de fuentes bióticas o abióticas como la contaminación de tipo orgánica y/o inorgánica, ante

estas condiciones las plantas responden generando especies reactivas de oxigeno (EROs)

para contrarrestar el desequilibrio, a nivel celular de estas especies, generado por los

contaminantes

Nuestros resultados indican que la actividad medida para Catalasa, aumentó

significativamente desde la concentración más baja 0,78 mg L-1

a las más alta 50 mg L-1

,

(p<0,05). Esta enzima constituye la principal barrera que poseen las plantas ante

situaciones de estrés oxidativo, participa en la eliminación de H2O2, generado por el

metabolismo celular, la diferencia de actividad de los tratamientos con el control, y su

rápida reacción se debe a la puesta en funcionamiento del mecanismo de defensa de la

planta frente al posible desarrollo de un estado de estrés oxidativo provocado por

Clorpirifos, Arora et al., (2002) señalan que esta enzima posee alta capacidad de reacción,

sin embargo su afinidad por el sustrato es baja, esto nos estaría señalando que la

concentración de peróxido de hidrógeno tuvo que haber sido considerable. Teisseire & Guy

(2000) también describieron un aumento de catalasa en frondas de Lemna minor expuesta a

cobre.

Respecto a glutatión peroxidasa, también se observó un aumento significativo de esta

enzima entre el control y las concentraciones ensayadas (p<0,05), esta enzima es elevada en

el citosol de las plantas, dónde CAT no es tan abundante, es en este lugar donde predomina

GPx, disminuyendo las cantidades de H2O2 (Kelly et al., 1998), o cuando la actividad de la

CAT no es suficiente para mantener niveles equilibrados de ERO.

Glutatión reductasa también evidenció diferencias significativas entre el tratamiento control

y las demás concentraciones (p<0,05). El aumento de GR fue aumentando a medida que las

concentraciones de Clorpirifos aumentaban, la máxima actividad de esta enzima se registró

a 50 mg L-1

. Una de las funciones de esta enzima, es catalizar la reducción de GSSG

(Glutatión oxidado) a GSH (Glutatión reducido), de manera que el aumento de GR supone

73

la formación de GSH restituyendo el equilibrio intracelular entre GSH y GSSG, el cual se

pierde en situaciones de estrés y elevadas actividades de GPx.

La tendencia resultante de la enzima de biotransformación GST medida en Lemna

valdiviana fue similar a la descritas anteriormente, para las enzimas antioxidantes. A partir

de la concentración más baja (0,78 mg L-1

) la actividad de esta enzima aumentó

significativamente (p<0,05) a medida que incrementaban las concentraciones de

Clorpirifos, esta tendencia resultante podría señalar que GST está involucrada directamente

en la biotransformación de Clorpirifos, aumentando la solubilidad de sustancias tóxicas

para la planta, para convertirlas posteriormente en sustancias más hidrosolubles (Figura

37). Clorpirifos tiene un coeficiente de partición octanol/agua de 5,0 (Footprint, 2014), lo

que implica que este compuesto tiene poca afinidad por el agua, por lo que el aumento de

solubilidad es necesario para su eliminación, lo que se refleja en el aumento en la acción de

enzimas de biotransformación como GST. De acuerdo a Pflugmacher (2004) la acción de

especies reactivas de oxígeno y la respuesta al estrés se encuentran en un equilibrio

dinámico entre la tasa de formación y su posterior utilización, en consecuencia, el estrés

oxidativo solo se produce cuando el nivel de estas especies excede la capacidad

antioxidante de la planta.

En insectos, incrementos de GST se han asociado con la resistencia de estos organismos a

insecticidas (Kostaropoulos et al., 2001). En juveniles de Oncorhynchus mykiss expuestos a

Clorpirifos la actividad de GST, determinó que la reacción de esta enzima es variable a lo

largo del tiempo de exposición y por ende no evidenciaron correlación entre la actividad de

esta enzima y el tiempo (Pecore, 2001).

74

Figura 27. Metabolismo de Clorpirifos catalizado por GST y P450 (Fujioka & Casida,

2007).

Las curvas resultantes para cada enzima estudiada en este trabajo presentaron un máximo

peak de actividad en la concentración más alta (50 mg L-1

), esta tendencia se debe a que

las concentraciones ensayadas no saturan el sistema de defensa de L. valdiviana, para

corroborar esta tendencia sería indicado realizar un bioensayo adhiriendo concentraciones

de Clorpirifos superiores a 50 mg L-1

; Barrera, (2015), al exponer esta especie, a efluentes

de psiculturas, evidenció que a concentraciones medias de efluente, CAT reflejaba curvas

de actividad en forma de campana, mientras que GR disminuía a medida que aumentaban la

concentraciones, evidenciando cierta saturación del sistema antioxidante.

Nuestros resultados nos estarían indicando que el sistema de detoxificación de Lemna

valdiviana es competente y efectivo. La biotransformación de Clorpirifos en la planta

podría ser eficaz al punto de que no evidenciamos daños en el crecimiento de las plantas a

bajas concentraciones de este tóxico. Está descrito que Lemna gibba metaboliza

compuestos fenolicos biotransformándolos en metabólitos menos tóxicos (Barder et al.,

1955).

Mediante los resultados que obtuvimos en los bioensayos de ecotoxicidad determinamos

que el número de frondas y el contenido de clorofila total no representaron parámetros de

75

alta sensibilidad; sin embargo, organismos como OECD, APHA, y EPA describen el

numero de frondas como altamente sensible, Valenzuela; (2013) en estudios previos

realizados con la misma especie, describió el contenido de clorofila total y el peso húmedo

como los parámetros más sensible en plantas expuestas a cromo y a cobre,

respectivamente.

En Lemnaceas, el estrés oxidativo ha sido estudiado predominantemente usando metales

como agentes estresores (Razinger et al, 2008; Teisseire & Guy, 2000). Los estudios de

biomarcadores usando organofosforados han sido, principalmente, llevados a cabo usando

peces (Oruç, 2010; Xing et al., 2012; Kavitha & Venkateswara Rao, 2007; Di Giulio et al.,

1989) e invertebrados acuáticos como especies de estudio (Steevens & Benson, 1999;).

La estimación de EC50 en bioensayos de ecotoxicidad y en la determinación de

biomarcadores en este trabajo nos arrojó que estos últimos son más susceptibles a los

efectos de Clorpirifos en la especie estudiada, debido a que su estimulación ocurrió a

concentraciones bajas del tóxico, indicando que al verse expuesta a leves cantidades de

insecticida en el ambiente de exposición, la respuesta antioxidativa de Lemna valdiviana

comienza a activarse; es probable que debido a este temprano conjunto de reacciones, la

inhibición media de parámetros relativos a crecimiento ocurrió a concentraciones más altas

de tóxico (8,5 mg L-1

).

El aumento significativo de todas las enzimas estudiadas indicaría que Clorpirifos genera

inducción de estas respuestas enzimáticas para responder al aumento en la generación de

especies reactivas de oxígeno. A su vez, el aumento en la actividad de la GST indica que la

conjugación por parte de la GST forma una vía importante de biotransformación de

Clorpirifos.

Las diferencias de sensibilidad entre bioensayos de toxicidad y medición de biomarcadores

utilizando concentraciones de Clorpirifos como ingrediente activo, nos entrega una visión

más amplia acerca de los efectos de este xenobiótico a nivel de organismo como los son las

macrótitas acuáticas.

76

Por otra parte ambas herramientas constituyen el análisis previo para la posterior

realización de bioensayos para determinar la capacidad de bioacumulación de un

contaminante o mezcla de estos en organismos de prueba.

5.3 Bioacumulación-degradación de Clorpirifos.

5.3.1 Bioacumulación de Clorpirifos.

El uso de técnicas nucleares en la investigación agrícola han otorgado una medida

cuantitativa directa de la influencia de elementos, tales como fertilizantes y nutrientes en la

planta y en el medio ambiente. (CCHEN, 2009). Además han aportado en el desarrollo de

estudios del comportamiento de plaguicidas en el suelo. Debido a su alta sensibilidad estas

técnicas permiten medir pequeñas cantidades (trazas) de estos compuestos en diferentes

tipos de suelos y a distintas profundidades (Miranda, 2013). En organismos acuáticos

también se han realizado estudios de este tipo con macrófitas acuáticas (Hinman & Klaine,

1994).

Durante 96 horas 0,5 g de Lemna valdiviana expuesta al pesticida Clorpirifos bioacumuló

en promedio 2,1 mg L-1

de este pesticida, debido a que la concentración inicial que

utilizamos fue 12,5 mg L-1

obtuvimos cerca de 16,8% de bioacumulación del producto. Por

otra parte, cerca del 50 % del producto inicial aún se encontraba disponible para la

planta.Prasertsup & Ariyakanon (2011) utilizando Lemna minor y Pistia stratiotes

corroboraron que 5,0 g de L. minor expuesta a 0,5 mg L-1

de Clorpirifos redujo

eficientemente esta cantidad inicial a 0,1 mg L-1

, lo que correspondería a un 20% de

bioacumulación, cifra cercana a la obtenida en este trabajo. Olette et al (2008) detectaron

que Lemna minor fue más efectiva que otras especies para remover Cu y pesticidas como

Flazasulfuron y Dimetomorf.

Hinman & Klaine (1994) reportaron bioacumulación de los plaguicidas Atrazina, Lindano

y Clordano utilizando el isotópo radiactivo 14

C en la macrófita acuática Hydrilla

verticillata. Evidenciaron la traslocación de estos compuestos desde las raíces a los demás

compartimentos de las plantas, sin embargo, al igual que en nuestros resultados la

77

concentración medida en los tejidos del organismo expuesto siempre fue menor que la

concentración medida en el medio acuático de exposición.

Eventualmente Lemna valdiviana podría servir como fitorremediadora en ambientes

acuáticos contaminados con Clorpirifos. La capacidad de remoción de residuos y nutrientes

es una capacidad descrita con anterioridad para las macrófitas acuáticas (Zaalishvili et al.,

2000). Esta característica la han hecho una herramienta prominente e idónea para la

fitorremediación de ecosistemas contaminados con metales pesados, plaguicidas orgánicos

e inorgánicos, contaminantes orgánicos, entre otros; (Olette et al., 2011; Prasertsup &

Ariyakanon., 2011; Megateli et al., 2009; Olette et al., 2008; Gao et al., 2000).

5.3.2 Degradación de Clorpirifos.

En promedio, la degradación del Clorpirifos, fue de 34,8% a las 96 horas de exposición. El

aumento de degradación fue significativamente diferente (p<0,05) entre las 24 y 96 horas

de exposición. Debido a que utilizamos agua destilada se podría afirmar que la

degradación microbiana en estos ensayos no jugó un rol determinante, sin embargo,

considerando que la solución madre estaba compuesta de medio nutritivo, igual podría

haber participado en un porcentaje mínimo de esta degradación. Todos los vasos de

exposición fueron cubiertos con film plástico, por lo que la pérdida del producto por

evaporación constituye un efecto casi nulo; por ende, el principal factor de degradación al

que podemos atribuir este resultado es al efecto ejercido por la luz o fotodegradación.

Como la luz de exposición utilizada en nuestro estudio no corresponde a los instrumentos

idóneos utilizados para estudios de fotolisis, evidentemente existe una limitación

importante al momento de comparar nuestros resultados con otros estudios, sin embargo

no podemos dejar de considerar que la luz constituyó la principal vía de degradación de

Clorpirifos en nuestro estudio, Muhamad (2012) uso diferentes radiaciones para determinar

la fotolisis de Clorpirifos en el agua, usando luz visible concluyo que un porcentaje cercano

al 0,5% y 7 % de Clorpirifos era degradado, posterior a 1 y 6 horas de exposición,

respectivamente, Barceló et al (2008) usando longitudes de onda gama entre 300 y 800 nm,

radiación muy cercana a la efectuada por la luz natural, comprobaron que la fotolisis de este

compuesto es bastante rápida y se mantuvo 15% y 5% del compuesto original después de

78

30 y 60 minutos de irradiación, respectivamente, sin embargo usaron temperaturas de 44ºC,

lo que podría aumentar el porcentaje de degradación

En los tratamientos que contenían una capa de L. valdiviana cubriendo la superficie, la

degradación medida en el sobrenadante siempre fue menor que la existente en los controles

donde no existían plantas. Considerando que la capa de plantas fue uniforme sobre toda la

superficie, se puede atribuir esta diferencia en la degradación a la atenuación de la luz

ejercida por la capa vegetal. Roof (1982) determinó que la capa vegetal sobre el suelo

ejerce atenuación en la luz incidente lo que provoca que las tasas de fotolisis en esta

matriz, fueran más lentas que en agua destilada.

Es necesario considerar que la tendencia de degradación de Clorpirifos en agua natural es

enormemente variable y no es erróneo presumir que debe ser diferente a la efectuada en

agua destilada enriquecida con medio nutritivo. Liu et al (2000) determinó que además del

pH, la hidrólisis de Clorpirifos en aguas naturales, está dada por la influencia de las

concentraciones de cobre, entre otros componentes del agua natural, componentes que

necesitan ser evaluados a medida que puedan surgir como predictores independientes para

evaluar el destino de los plaguicidas en el ambiente, además es necesario medir la fotolisis

y la degradación microbiana. Una conclusión similar obtuvieron Pehkonen & Zhang

(2002), según estos autores la degradación de Organofosforados en aguas naturales está

determinada por factores como la intensidad de luz solar, fuentes y concentraciones de

ácidos húmicos y fúlvicos, concentración de nitrato (fuente común de radicales OH en

aguas naturales), y la presencia de otros compuestos en el agua (carbonatos e iones

bicarbonato).

Para corroborar la acción que ejerce la luz en la degradación de Clorpirifos, sería necesario

realizar ensayos con las mismas condiciones empleadas en los controles de los ensayos

realizados en este trabajo, pero en total oscuridad, posteriormente comparar los resultados

obtenidos en ambos ensayos.

El uso de distintos formulados comerciales en este estudio nos ayudó a comprender que la

acción de las sustancias coadyuvantes del producto también ejercen un efecto importante

79

en la toxicidad del producto, no pudimos medir estos efectos en forma directa, pero al

utilizar concentraciones de ingrediente activo para ambos productos observamos efectos

distintos en las mediciones. En los bioensayos de ecotoxicidad usando LBN, (con rangos

de concentraciones entre 0,62 y 40 mg i.a L-1

(i.a. = ingrediente activo)) los resultados

entregados por el software ToxRat, daban cuenta de la existencia de inhibición en

diferentes parámetros, mientras que utilizando TYA (0,78-50,0 mg i.a L-1

) no se

obtuvieron resultados de inhibición. Respecto a la bioacumulación de Clorpirifos, partimos

utilizando LBN, pero no se obtuvieron tendencias de bioacumulación similares a lo largo

del tiempo, esta situación la atribuimos a que la composición de este polvo contiene arcilla,

la que debido a su porosidad, es un tipo de suelo que tiene gran capacidad de retención de

compuestos (Racke et al., 1996), además Clorpirifos tiene mayor afinidad por los

sedimentos (Koc=8498; Junod et al., 2009) por lo que creemos Clorpirifos (12,5 mg L-1

)

estaba poco disponible en la fase acuosa para ser bioacumulado por las plantas. Debido a

que al utilizar TYA, si se evidenciaron tendencias claras en la bioacumulación,

determinamos utilizar el mismo compuesto para la determinación de biomarcadores.

Sobrero (2010) determinó que el formulado comercial Roundup®

provocaba mayor

inhibición de crecimiento en Lemna gibba que su principio activo Glifosato.

El principal metabolito de Clorpirifos es el 3,5,6-Tricloropiridinol (TCP). Este compuesto

es más persistente, soluble y móvil que el compuesto parental y, por tanto, se transfiere

fácilmente a la fase acuosa (Barceló et al., 1993). Cáceres et al (2007) comparó la toxicidad

de Clorpirifos y TCP, de cada uno y también combinados, en Daphnia carinata usando

agua natural y agua destilada enriquecida con medio de cultivo para Daphnia, los

resultados de su investigación sugieren que Clorpirifos y TCP pueden interactuar sinérgica,

aditiva o antagónicamente, resultando en un aumento o una disminución en la toxicidad

global de la mezcla en comparación con el compuesto individual, además concluyeron que

la comunidad microbiana en aguas naturales juega un rol determinante en la degradación de

estos compuestos lo que influye en su consecuente toxicidad en las aguas receptoras. Estos

autores recomiendan que estudios como estos, incluyendo productos de degradación y su

interacción con el ambiente acuático, sean considerados al momento de la creación o

modificación de directrices para la calidad de aguas. Sin embargo estos compuestos tienen

80

mayor polaridad que los compuestos parentales y por tanto, la extracción, la detección

requiere de metodología de análisis compleja y de alto costo (Narváez et al., 2012).

La ausencia de estudios a nivel regional, que incluyan el análisis de metabolitos, produce

un sesgo importante en la información disponible de las consecuencias de los pesticidas y

sus derivados en el ambiente.

5.4 Consideraciones

Es fundamental razonar que el manejo inadecuado de pesticidas no solo afecta la salud

humana, sino que indudablemente puede llevar al menoscabo de la calidad del aire, el suelo

y el agua, afectando a la flora y la fauna. Es por esto que en países desarrollados, como

Estados Unidos (Federal Insecticide, Fungicide, and Rodenticide Act, 1988 y Pesticide

Registration Improvement Act, 2003) y la comunidad Europea (Directiva 91/414), desde

principios de la década del 90, han establecido procedimientos administrativos, que

incluyen la evaluación de riesgo ecológico, ambiental y humano en los procesos de registro

y autorización del uso de agroquímicos, de hecho en EE.UU, el uso del insecticida

Clorpirifos a nivel casero fue prohibido. En Chile, el aumento en la cantidad de

ingredientes activos conlleva que el proceso de autorización y control del manejo de los

agroquímicos sea complejo y demande un alto volumen de información y caracterización

de sus efectos sobre el medio ambiente. En base a esto, en el año 2006 se publicó una

consultoría solicitada por el ministerio de Agricultura, las conclusiones de ésta, radican en

la carencia y dispersión de la información sobre la aplicación de metodologías de

evaluación de riesgo por uso de plaguicidas, además no se disponen de bases de datos

estructuradas que permitan la consulta e intercambio de información relativa a cultivos,

suelos, clima y plaguicida. Es particularmente relevante el alto costo que significa el

acceso a los datos climáticos, que se traduce en una limitación a los modelos que pueden

ser aplicados, además existe falta de información referente a la erodabilidad de los suelos,

lo que dificulta la determinación del movimiento superficial de los plaguicidas (Jerez et al.,

2006).

81

VI. Conclusiones

Distintos efectos toxicológicos provocados por el insecticida Clorpirifos a nivel de

organismo fueron estudiados utilizando la especie endémica Lemna valdiviana. El EC50

calculado para distintos parámetros indicó que el área de la fronda fue el punto final más

sensible, mientras que el número de frondas, biomasa y por último el contenido de clorofila

total, fueron los parámetros menos sensibles al tóxico. Mediante el uso de biomarcadores

determinamos que este pesticida genera estrés oxidativo en las plantas estudiadas, las que

expuestas por 5 días, generaron un aumento significativo en la actividad de las enzimas

catalasa, GR, GPx. La enzima de biotransformación GST que a partir de la concentración

más baja ensayada mostró una elevada actividad específica respecto a los controles, nos

indica que por un lado que la GST constituye una vía importante de detoxificación de

Clorpirifos en Lemna valdiviana y este sistema de biotransformación aún sigue actuando

con eficiencia a concentraciones de ingrediente activo Clorpirifos de 50 mg L-1

.

Se corroboró, mediante técnicas isotópicas, que Lemna valdiviana después de 96 horas,

expuesta a una concentración inicial de 12,5 mg L-1

de Clorpirifos, incorpora 2,1 mg L-1

a

sus tejidos, mientras que durante el mismo tiempo de exposición 4,4 mg L-1

del compuesto

inicial son degradados.

Se concluye que Clorpirifos, si bien genera estrés oxidativo e inhibición media en el

crecimiento de Lemna valdiviana, esta especie es capaz de reaccionar frente al daño

oxidativo causado. Incluso, plantas expuestas a dosis medianamente altas, dentro del rango

estudiado, son capaces de bioacumular este compuesto.

Este estudio puede ratificar preliminarmente que Lemna valdiviana es una especie nativa

factible de ser usada para efectuar fitorremediación en ambientes acuáticos contaminados

con este tipo de pesticidas.

82

VII. Recomendaciones

Se espera que las herramientas de análisis, utilizadas de forma complementaria en este

trabajo de tesis (bioensayos de ecotoxicidad, biomarcadores y técnicas isotópicas) puedan

constituir parámetros de análisis importantes para el desarrollo de metodologías que

aporten en el estudio de efectos ecotoxicológicos que provocan los plaguicidas en el

ambiente.

La visión futura de este estudio es analizar efectos de pesticidas comúnmente utilizados en

la agricultura chilena en ambientes acuáticos naturales, así como sus vías de degradación y

los efectos que estos compuestos de degradación pueden generar en la flora y fauna

expuesta a este tipo de xenobióticos.

Se espera que se realicen estudios similares y/o complementarios con más frecuencia y con

el fin de generar bases de datos para el apoyo de la creación de normativa medioambiental,

que desemboquen en la protección de los cuerpos de agua y su biota asociada, expuestos a

contaminación constante.

83

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92

IX. Anexo

Tabla 17. Propiedades fisicoquímicas de Clorpirifos. (Footprint, 2014)

Tabla 18. Propiedades técnicas de los dos compuestos comerciales utilizados. (AFIPA,

2005)

Ingrediente

activo

Peso

molecular

(g/mol)

Presión de

vapor

(mPa)

25ºC

Solubilidad

en agua 20ºC

(mg l-1)

Solubilidad

en solventes

orgánicos

20ºC (mg l-1)

Coeficiente

Octanol-agua

(Log Kow)

Punto

de

fusión

(ºC)

Vida

media

en agua

(Días)

Vida

media

en suelo

(Días)

Clorpirifos 350,89 1,43 1,05 4000000 5,01x104 41,5 58,1 113-

135,5

Troya 4 EC Lorsban 10D

Ingrediente activo Clorpirifos Clorpirifos

Nombre químico 0,0-dietil-0-3,5,6-tricloro-2-

piridil-fosforotioato

0,0-dietil 0-(3,5,6 tricloro 2 piridil) fosforotioato

Grupo químico Organofosforado Organofosforado

Concentración y

formulación

480g/L EC (concentrado

emulsionable)

10% DP (polvo)

Modo de acción Contacto, ingestión, inhalación Contacto, ingestión, inhalación

Fabricante/Formulador Agrícola Nacional S.A.C.e.i Dow AgroSciences U.S.A

Distribuidor en Chile ANASAC Dow AgroSciences Chile U.S.A

Toxicidad Grupo II. Producto

moderadamente peligroso

LD 50 producto comercial:

Dermal > 4.000 mg/kg

Oral > 400 mg/kg

Grupo IV. Producto que normalmente no ofrece

peligro.

LD 50 producto comercial:

Dermal > 4.000 mg/kg

Oral > 2.000 mg/kg

Autorización SAG 1496 1465

93

Figura 28. A, B, C y D muestran colonias de Lemna valdiviana expuesta a 40 mg L-1

de

Clorpirifos como ingrediente activo, utilizando LBN como compuesto formulado a 0, 2 y 7

días respectivamente. Mientras que D, E, y F, muestran los efectos de TYA en la misma

especie usando 50 mg L-1

de ingrediente activo Clorpirifos, a los 0, 2 y 7 días

respectivamente.

94

Tabla 19. Estimación diaria de crecimiento (NF, AF (cm2) y Biomasa inicial y final (mg) en Lemna valdiviana expuestas al

insecticida Clorpirifos en el Ensayo 1.

Tratamiento Tiempo 0 hrs 24 hrs Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 peso neto

peso (mg) frondas Área frondas Área

Área corregida frondas Área

Área corregida frondas Área frondas Área frondas Área frondas Área frondas área

Área corregida

Control1 17,5 20 0,9 27 1,0 0,1 33 1,06 0,18 36 1,42 40 1,5 43 1,68 46 1,2 2,0 56 2,27 1,4 28,3

Control2 17,5 20 0,9 26 1,0 0,1 32 1,14 0,27 40 1,46 44 1,9 45 2 53 1,1 2,0 53 2,18 1,3 23,2

Control3 17,5 20 0,7 27 1,0 0,2 33 1,20 0,46 40 1,39 41 1,5 42 1,75 50 1,4 2,1 53 2,51 1,8 22,6

Control4 17,5 20 0,8 28 1,0 0,2 35 1,23 0,39 40 1,59 43 1,6 47 1,88 50 1,5 2,4 52 2,14 1,3 21,5

Control5 17,5 20 0,9 28 1,0 0,2 35 1,23 0,38 40 1,57 41 1,6 45 1,95 51 1,6 2,5 61 2,65 1,8 33,8

Control6 17,5 20 0,9 27 1,0 0,1 33 1,14 0,26 39 1,52 40 1,8 42 1,84 50 1,5 2,4 57 2,45 1,6 18,5

C1R1 17,5 20 0,8 26 1,0 0,2 32 1,23 0,38 40 1,54 43 1,7 43 1,84 49 1,2 2,0 53 2,26 1,4 21,6

C1R2 17,5 20 0,9 26 1,1 0,2 32 1,24 0,32 39 1,42 40 1,9 43 1,89 49 1 1,9 50 2,06 1,1 20,8

C1R3 17,5 20 0,9 28 1,0 0,1 35 1,14 0,20 40 1,7 40 1,8 44 1,85 55 1,4 2,3 55 2,28 1,3 29,5

C2R1 17,5 20 1,0 26 1,0 0,0 31 1,01 0,03 39 1,49 40 1,8 44 2,05 50 1,3 2,3 61 2,63 1,6 27

C2R2 17,5 20 0,9 28 1,0 0,1 36 1,14 0,27 39 1,19 40 1,8 42 1,94 47 1,4 2,3 56 2,09 1,2 27,6

C2R3 17,5 20 0,9 29 1,0 0,1 37 1,16 0,27 40 1,75 41 2,0 45 2,14 47 1,2 2,0 49 2,10 1,2 26,7

C3R1 17,5 20 0,9 29 1,1 0,2 38 1,25 0,34 40 1,64 41 2,1 42 1,7 44 1,1 2,0 52 2,47 1,6 27,5

C3R2 17,5 20 0,9 28 1,1 0,2 36 1,21 0,31 40 1,57 43 2,1 43 2,34 48 1,1 2,0 58 2,34 1,4 29,7

C3R3 17,5 20 0,9 29 1,0 0,1 38 1,15 0,24 38 1,22 41 1,9 45 2,34 48 1,4 2,3 52 2,22 1,3 25,5

C4R1 17,5 20 1,0 28 1,2 0,2 35 1,36 0,33 40 1,78 42 1,8 43 1,78 47 1,1 2,1 52 2,06 1,0 27,3

C4R2 17,5 20 1,0 28 1,1 0,1 35 1,24 0,28 39 1,82 42 2,2 47 2,29 48 1,2 2,2 57 2,55 1,6 34,7

C4R3 17,5 20 1,0 25 1,2 0,1 30 1,31 0,28 41 1,57 39 2,0 45 2,27 50 1,4 2,4 54 2,33 1,3 27,2

C5R1 17,5 20 0,9 26 1,0 0,1 31 1,12 0,20 31 1,22 38 2,1 42 2,23 49 1,2 2,1 43 1,33 0,4 7,80

C5R2 17,5 20 1,0 28 1,1 0,1 35 1,20 0,19 36 1,35 38 1,4 38 1,51 42 0,6 1,6 42 1,78 0,8 8,50

C5R3 17,5 20 1,0 27 1,0 0,0 34 1,01 0,02 37 1,26 37 1,5 40 1,43 38 0,6 1,6 39 1,44 0,5 9,50

C6R1 17,5 20 0,8 21 0,8 0,0 22 0,88 0,10 23 1 28 1,2 37 1,31 38 0,8 1,6 38 0,61 -0,2 -2,30

C6R2 17,5 20 0,9 22 0,9 0,0 24 0,87 -0,04 23 0,9 28 0,8 28 0,86 28 -0 0,7 31 0,85 -0,1 1,50

C6R3 17,5 20 0,9 21 0,9 0,0 22 0,88 -0,01 25 1,03 29 0,9 29 0,93 28 -0 0,7 28 0,78 -0,1 -6,10

C7R1 17,5 20 0,9 20 0,6 -0,3 20 0,22 -0,69 20 0 20 0,0 20 0 20 -1 0 20 0 -0,9 -3,50

C7R2 17,5 20 0,9 20 0,5 -0,4 20 0,06 -0,83 20 0 20 0,0 20 0 20 -1 0 20 0 -0,9 -6,00

C7R3 17,5 20 1,0 20 0,5 -0,5 20 0,00 -0,97 20 0 20 0,0 20 0 20 -1 0 20 0 -1,0 -5,10

95

Tabla 20. Resultados obtenidos de la medición de clorofila a y b mediante la medición de

absorbancia a 3 longitudes de onda (647, 664 y 665 nm) en Lemna valdiviana expuesta a

Clorpirifos. Ensayo 1.

Tratamientos longitudes de onda (nm) volumen

(ml) peso (mg)

Chl a (mg g¯¹)

Chl b (mg g¯¹)

Chl Total (mg g¯¹)

Chl a/Chl b 647 664 665

CONTROL

0,21 0,56 0,56 3 45,8 6,53 1,69 8,23 3,86

0,32 0,82 0,81 3 40,7 9,49 2,75 12,2 3,44

0,31 0,79 0,78 3 40,1 9,13 2,59 11,7 3,52

0,30 0,75 0,75 3 39 8,73 2,55 11,3 3,42

0,32 0,81 0,82 3 51,3 9,51 2,63 12,1 3,62

C1 mg/L

0,34 0,85 0,84 3 39,1 9,78 2,94 12,7 3,33

0,30 0,76 0,76 3 38,3 8,83 2,57 11,4 3,44

0,33 0,85 0,84 3 47 9,83 2,78 12,6 3,53

C2 mg/L

0,35 0,88 0,88 3 44,5 10,24 3,00 13,2 3,41

0,34 0,86 0,85 3 45,1 9,96 2,93 12,9 3,40

0,34 0,84 0,84 3 44,2 9,74 2,91 12,7 3,35

C3 mg/L

0,35 0,87 0,87 3 45 10,09 3,07 13,2 3,28

0,34 0,87 0,86 3 47,2 10,06 2,91 13,0 3,46

0,29 0,72 0,72 3 43 8,39 2,42 10,8 3,47

C4 mg/L

0,27 0,67 0,66 3 44,8 7,71 2,36 10,1 3,26

0,32 0,82 0,81 3 52,2 9,47 2,76 12,2 3,43

0,27 0,67 0,67 3 44,7 7,79 2,31 10,1 3,37

C5 mg/L

0,20 0,48 0,48 3 25,3 5,57 1,90 7,5 2,93

0,21 0,51 0,51 3 26 5,92 1,94 7,9 3,05

0,17 0,42 0,42 3 27 4,87 1,48 6,3 3,29

C6 mg/L

0,07 0,17 0,17 3 15,2 1,96 0,57 2,5 3,41

0,08 0,20 0,20 3 19 2,31 0,70 3,0 3,32

0,06 0,15 0,15 3 11,4 1,69 0,48 2,2 3,54

C7 mg/L

0,01 0,02 0,02 3 14 0,27 0,00 0,3 -155,12

0,02 0,05 0,05 3 11,5 0,62 0,14 0,8 4,50

0,00 0,01 0,01 3 12,4 0,16 -0,04 0,1 -4,02

96

Tabla 21. Estimación diaria de crecimiento (NF, AF (cm2) y Biomasa inicial y final (mg) en Lemna valdiviana expuestas al

insecticida Clorpirifos en el ensayo 2.

Tratamiento Tiempo 0 hrs 24 hrs día 2 día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7

peso (mg) frondas Área frondas Área





Área corregida frondas Área frondas área

Área corregida

peso final (mg)

Control1 12,3 20 0,88 27 0,97 0,09 33 1,06 0,18 36 1,42 0,54 40 1,5 0,7 43 2,0 1,2 47 1,7 2,56 46 2,27 1,39 46

Control2 12,3 20 0,87 26 1,01 0,14 32 1,14 0,27 40 1,46 0,59 44 1,9 1 45 2,0 1,1 54 2 2,92 53 2,18 1,31 41

Control3 12,3 20 0,74 27 0,97 0,23 33 1,20 0,46 40 1,39 0,65 41 1,5 0,8 42 2,1 1,4 50 2 2,70 50 2,51 1,77 40

Control4 12,3 20 0,84 28 1,04 0,2 35 1,23 0,39 40 1,59 0,75 43 1,6 0,8 47 2,4 1,5 49 1,4 2,28 50 2,14 1,3 39

Control5 12,3 20 0,85 28 1,04 0,19 35 1,23 0,38 40 1,57 0,72 41 1,6 0,8 45 2,5 1,6 47 1,6 2,43 51 2,65 1,79 51

Control6 12,3 20 0,88 27 1,01 0,13 33 1,14 0,26 39 1,52 0,64 40 1,8 0,9 42 2,4 1,5 57 1,7 2,54 50 2,45 1,57 36

C1R1 12,3 20 0,88 27 0,97 0,09 34 1,06 0,19 40 1,54 0,67 40 1,9 1 40 1,6 0,7 45 1,2 2,11 56 2,42 1,54 38

C1R2 12,3 20 0,85 26 0,89 0,04 32 0,93 0,08 39 1,46 0,61 39 1,8 0,9 43 2,0 1,1 48 1,2 2,04 57 2,54 1,69 38

C1R3 12,3 20 0,94 29 1,11 0,17 37 1,29 0,35 38 1,67 0,73 44 1,9 1 48 2,3 1,4 52 1,5 2,49 61 2,81 1,87 46

C2R1 12,3 20 0,97 29 1,28 0,31 37 1,59 0,62 39 1,51 0,55 41 1,8 0,8 42 1,9 0,9 47 1 2,02 52 2,46 1,49 37

C2R2 12,3 20 0,86 28 0,99 0,13 36 1,12 0,25 39 1,43 0,57 39 1,4 0,6 39 1,4 0,6 41 1,3 2,20 51 1,86 1 31

C2R3 12,3 20 0,95 29 1,08 0,13 37 1,20 0,26 40 1,67 0,72 42 1,9 1 42 1,7 0,8 47 1,4 2,31 53 2,39 1,45 44

C3R1 12,3 20 0,92 28 1,04 0,12 36 1,16 0,24 40 1,45 0,53 41 1,9 1 42 2,1 1,2 48 1,3 2,24 57 2,82 1,9 36

C3R2 12,3 20 0,82 28 1,02 0,2 35 1,22 0,4 39 1,37 0,55 40 1,6 0,8 42 1,7 0,9 48 1,2 2,04 53 2,36 1,54 34

C3R3 12,3 20 0,89 29 1,10 0,21 37 1,31 0,43 40 1,49 0,6 40 1,8 0,9 48 1,8 0,9 48 1,2 2,07 57 2,47 1,58 43

C4R1 12,3 20 0,77 29 0,94 0,17 38 1,11 0,34 39 1,41 0,65 43 1,7 0,9 44 1,5 0,8 46 1,3 2,06 50 2,19 1,43 32

C4R2 12,3 20 0,96 29 1,14 0,18 37 1,32 0,35 40 1,62 0,66 43 1,7 0,7 43 1,9 0,9 47 1 1,98 57 2,27 1,3 39

C4R3 12,3 20 0,95 27 1,03 0,08 33 1,11 0,16 35 1,42 0,47 38 1,5 0,6 39 1,5 0,6 46 1,1 2,07 48 2,00 1,05 34

C5R1 12,3 20 0,96 29 1,05 0,09 37 1,14 0,18 39 1,47 0,51 40 1,3 0,4 39 1,6 0,6 39 1 1,92 43 1,51 0,56 30

C5R2 12,3 20 1,05 25 1,12 0,07 30 1,20 0,15 35 1,27 0,23 38 1,6 0,5 38 1,2 0,2 39 0,6 1,63 44 1,52 0,47 30

C5R3 12,3 20 1,11 29 1,22 0,12 38 1,34 0,23 40 1,4 0,29 40 1,6 0,5 40 1,5 0,4 43 0,5 1,58 43 1,75 0,64 30

C6R1 12,3 20 0,95 23 1,06 0,12 25 1,18 0,24 25 1,12 0,17 26 1,1 0,2 27 1,1 0,1 29 -0 0,89 26 0,81 -0,13 25

C6R2 12,3 20 0,91 21 0,96 0,04 22 1,00 0,09 27 1,03 0,11 26 1 0 27 0,9 0,0 28 0,2 1,06 26 0,86 -0,06 20

C6R3 12,3 20 0,96 22 0,98 0,02 24 1,00 0,04 24 1,05 0,09 24 1,1 0,1 24 1,0 0,1 27 0,2 1,20 25 0,88 -0,08 17

C7R1 12,3 20 0,9 20 0,51 -0,39 20 0,12 -0,8 20 0 -0,9 20 0 -0,9 20 0,0 -0,9 20 -1 0,00 20 0 -0,9 13

C7R2 12,3 20 0,83 20 0,53 -0,3 20 0,23 -0,6 20 0 -0,83 20 0 -0,8 20 0,0 -0,8 20 -1 0,00 20 0 -0,83 12

C7R3 12,3 20 0,95 20 0,72 -0,23 20 0,48 -0,5 20 0 -0,95 20 0 -0,9 20 0,0 -0,9 20 -1 0,00 20 0 -0,95 13

97

Tabla 22. Resultados obtenidos de la medición de clorofila a y b mediante la medición de

absorbancia a 3 longitudes de onda (647, 664 y 665 nm) en Lemna valdiviana expuesta a

Clorpirifos. Ensayo 2.

Tratamientos longitudes de onda (nm) volumen

(ml) peso (mg)

peso (g) Chl a (mg

g¯¹) Chl b (mg g¯¹)

Chl Total (mg g-1)

Chl a/Chl b 647 664 665

CONTROL

R1 0,21 0,56 0,56 3 45,8 0,05 6,53 1,69 8,23 3,86

R2 0,32 0,82 0,81 3 40,7 0,04 9,49 2,75 12,24 3,44

R3 0,31 0,79 0,78 3 40,1 0,04 9,13 2,59 11,73 3,52

R4 0,30 0,75 0,75 3 39 0,04 8,73 2,55 11,28 3,42

R5 0,32 0,81 0,82 3 51,3 0,05 9,51 2,63 12,14 3,62

R6 0,27 0,70 0,82 3 36 0,04 8,90 1,90 10,80 4,68

C1 mg/L

R1 0,31 0,78 0,77 3 37,8 0,04 9,04 2,69 11,72 3,36

R2 0,35 0,89 0,88 3 38 0,04 10,30 3,06 13,35 3,37

R3 0,40 1,00 1,00 3 45,5 0,05 11,62 3,46 15,08 3,36

C2 mg/L

R1 0,30 0,75 0,75 3 36,5 0,04 8,69 2,56 11,25 3,39

R2 0,25 0,62 0,62 3 30,5 0,03 7,21 2,24 9,45 3,22

R3 0,36 0,90 0,85 3 44,4 0,04 10,18 3,16 13,34 3,23

C3 mg/L

R1 0,23 0,59 0,58 3 36 0,04 6,81 2,00 8,81 3,40

R2 0,29 0,74 0,73 3 34,2 0,03 8,54 2,54 11,08 3,36

R3 0,24 0,60 0,60 3 43,3 0,04 6,93 2,03 8,96 3,41

C4 mg/L

R1 0,25 0,61 0,60 3 32 0,03 7,00 2,20 9,20 3,18

R2 0,28 0,68 0,68 3 39 0,04 7,90 2,41 10,31 3,27

R3 0,27 0,66 0,65 3 34 0,03 7,58 2,49 10,07 3,04

C5 mg/L

R1 0,18 0,44 0,44 3 30,2 0,03 5,13 1,67 6,80 3,06

R2 0,19 0,46 0,46 3 29,5 0,03 5,30 1,71 7,00 3,10

R3 0,19 0,46 0,46 3 29,8 0,03 5,36 1,70 7,06 3,14

C6 mg/L

R1 0,11 0,27 0,26 3 25 0,03 3,05 0,98 4,04 3,10

R2 0,09 0,22 0,22 3 19,8 0,02 2,50 0,90 3,40 2,77

R3 0,10 0,25 0,24 3 17,4 0,02 2,82 0,93 3,76 3,02

C7 mg/L

R1 0,01 0,02 0,02 3 13,1 0,01 0,23 0,07 0,30 3,36

R2 0,01 0,02 0,02 3 12,2 0,01 0,21 0,08 0,29 2,80

R3 0,01 0,02 0,02 3 12,6 0,01 0,27 0,11 0,38 2,36

98

Tabla 23. Medición de la actividad enzimática de GST, en Lemna valdiviana después de 5

días de exposición a Clorpirifos.

Tratamiento Réplica absorbancia (nm) dE Tratamiento Réplica absorbancia (nm) dE

control 1

Blank 0,57

3.1 mg/L

Blank 0,57

R1 0,63 0,06 R1 0,73 0,16

R2 0,63 0,06 R2 0,72 0,15

R3 0,63 0,06 R3 0,73 0,16

control 2

Blank 0,57

6.25 mg/L

Blank 0,56

R1 0,63 0,06 R1 0,74 0,18

R2 0,62 0,06 R2 0,74 0,18

R3 0,62 0,05 R3 0,73 0,18

control 3

Blank 0,56

6.25 mg/L

Blank 0,57

R1 0,63 0,07 R1 0,75 0,19

R2 0,62 0,06 R2 0,75 0,18

R3 0,62 0,06 R3 0,75 0,18

control 4

Blank 0,56

6.25 mg/L

Blank 0,57

R1 0,63 0,07 R1 0,73 0,17

R2 0,62 0,06 R2 0,74 0,18

R3 0,62 0,05 R3 0,74 0,17

control 5

Blank 0,55

12.5 mg/L

Blank 0,58

R1 0,62 0,07 R1 0,77 0,19

R2 0,61 0,06 R2 0,77 0,19

R3 0,61 0,05 R3 0,77 0,20

0.78 mg/L

Blank 0,57

12.5 mg/L

Blank 0,57

R1 0,65 0,07 R1 0,77 0,21

R2 0,66 0,08 R2 0,77 0,21

R3 0,66 0,09 R3 0,77 0,20

0.78 mg/L

Blank 0,57

12.5 mg/L

Blank 0,57

R1 0,67 0,10 R1 0,77 0,21

R2 0,66 0,09 R2 0,77 0,20

R3 0,66 0,09 R3 0,78 0,21

0.78 mg/L

Blank 0,57

25 mg/L

Blank 0,58

R1 0,66 0,08 R1 0,80 0,22

R2 0,66 0,09 R2 0,80 0,22

R3 0,67 0,10 R3 0,79 0,21

1.5 mg/L

Blank 0,55

25 mg/L

Blank 0,58

R1 0,70 0,15 R1 0,80 0,22

R2 0,70 0,14 R2 0,79 0,21

R3 0,69 0,14 R3 0,79 0,21

1.5 mg/L

Blank 0,56

25 mg/L

Blank 0,58

R1 0,70 0,14 R1 0,79 0,21

R2 0,70 0,14 R2 0,80 0,21

R3 0,70 0,14 R3 0,80 0,22

1.5 mg/L

Blank 0,56

50 mg/L

Blank 0,58

R1 0,71 0,15 R1 0,81 0,23

R2 0,71 0,15 R2 0,81 0,23

R3 0,70 0,14 R3 0,81 0,23

3.1 mg/L

Blank 0,56

50 mg/L

Blank 0,58

R1 0,72 0,15 R1 0,80 0,23

R2 0,71 0,15 R2 0,82 0,24

R3 0,72 0,16 R3 0,80 0,23

3.1 mg/L

Blank 0,57

50 mg/L

Blank 0,58

R1 0,73 0,16 R1 0,81 0,23

R2 0,73 0,16 R2 0,81 0,23

R3 0,72 0,15 R3 0,81 0,22

99

Tabla 24. Resultados de la medición de la actividad enzimática de Catalasa, en Lemna

valdiviana después de 5 dias de exposición a Clorpirifos.

Tratamiento Réplicas abs (nm) dE Tratamiento Réplicas abs (nm) dE

control 1

Blank 0,52

3.1 mg/L

Blank 0,52

R1 0,58 0,06 R1 0,61 0,09

R2 0,57 0,05 R2 0,61 0,08

R3 0,58 0,06 R3 0,60 0,08

control 2

Blank 0,52

6.25 mg/L

Blank 0,52

R1 0,60 0,08 R1 0,60 0,07

R2 0,60 0,09 R2 0,59 0,07

R3 0,57 0,05 R3 0,59 0,07

control 3

Blank 0,52

6.25 mg/L

Blank 0,52

R1 0,58 0,06 R1 0,59 0,07

R2 0,58 0,06 R2 0,60 0,08

R3 0,59 0,07 R3 0,60 0,08

control 4

Blank 0,53

6.25 mg/L

Blank 0,52

R1 0,58 0,05 R1 0,61 0,09

R2 0,58 0,05 R2 0,60 0,08

R3 0,58 0,06 R3 0,60 0,08

control 5

Blank 0,52

12.5 mg/L

Blank 0,52

R1 0,58 0,06 R1 0,62 0,09

R2 0,60 0,08 R2 0,62 0,10

R3 0,59 0,07 R3 0,62 0,10

0.78 mg/L

Blank 0,53

12.5 mg/L

Blank 0,52

R1 0,58 0,06 R1 0,60 0,08

R2 0,58 0,06 R2 0,60 0,08

R3 0,59 0,07 R3 0,61 0,08

0.78 mg/L

Blank 0,53

12.5 mg/L

Blank 0,52

R1 0,60 0,07 R1 0,62 0,10

R2 0,60 0,08 R2 0,60 0,08

R3 0,59 0,07 R3 0,60 0,09

0.78 mg/L

Blank 0,52

25 mg/L

Blank 0,53

R1 0,59 0,07 R1 0,65 0,12

R2 0,58 0,07 R2 0,66 0,13

R3 0,59 0,07 R3 0,65 0,13

1.5 mg/L

Blank 0,52

25 mg/L

Blank 0,53

R1 0,59 0,07 R1 0,66 0,12

R2 0,60 0,07 R2 0,65 0,12

R3 0,59 0,07 R3 0,66 0,13

1.5 mg/L

Blank 0,52

25 mg/L

Blank 0,53

R1 0,59 0,07 R1 0,64 0,11

R2 0,59 0,07 R2 0,64 0,11

R3 0,60 0,08 R3 0,63 0,10

1.5 mg/L

Blank 0,53

50 mg/L

Blank 0,53

R1 0,61 0,08 R1 0,66 0,13

R2 0,59 0,07 R2 0,66 0,12

R3 0,60 0,07 R3 0,66 0,13

3.1 mg/L

Blank 0,52

50 mg/L

Blank 0,53

R1 0,59 0,07 R1 0,66 0,13

R2 0,59 0,07 R2 0,68 0,15

R3 0,59 0,08 R3 0,66 0,14

3.1 mg/L

Blank 0,52

50 mg/L

Blank 0,53

R1 0,59 0,07 R1 0,67 0,13

R2 0,59 0,07 R2 0,66 0,13

R3 0,58 0,06 R3 0,66 0,13

100

Tabla 25. Resultados de la medición de la actividad enzimática de GR, en Lemna

valdiviana después de 5 días de exposición a Clorpirifos

Tratamiento Réplicas abs (nm) dE Tratamiento Réplicas abs (nm) dE

control 1

Blank 0,53

3.1 mg/L

Blank 0,52

R1 0,57 0,04 R1 0,59 0,07

R2 0,56 0,04 R2 0,59 0,07

R3 0,56 0,03 R3 0,59 0,07

control 2

Blank 0,52

6.25 mg/L

Blank 0,52

R1 0,55 0,03 R1 0,60 0,07

R2 0,56 0,04 R2 0,60 0,08

R3 0,56 0,04 R3 0,59 0,06

control 3

Blank 0,52

6.25 mg/L

Blank 0,52

R1 0,56 0,04 R1 0,59 0,07

R2 0,56 0,04 R2 0,59 0,07

R3 0,56 0,04 R3 0,60 0,08

control 4

Blank 0,52

6.25 mg/L

Blank 0,53

R1 0,56 0,03 R1 0,59 0,06

R2 0,56 0,04 R2 0,60 0,07

R3 0,56 0,04 R3 0,60 0,07

control 5

Blank 0,52

12.5 mg/L

Blank 0,53

R1 0,56 0,04 R1 0,61 0,08

R2 0,56 0,04 R2 0,60 0,07

R3 0,56 0,04 R3 0,60 0,07

0.78 mg/L

Blank 0,53

12.5 mg/L

Blank 0,53

R1 0,57 0,04 R1 0,60 0,07

R2 0,56 0,03 R2 0,60 0,08

R3 0,57 0,04 R3 0,61 0,08

0.78 mg/L

Blank 0,53

12.5 mg/L

Blank 0,52

R1 0,57 0,05 R1 0,60 0,08

R2 0,57 0,04 R2 0,61 0,08

R3 0,57 0,04 R3 0,61 0,09

0.78 mg/L

Blank 0,53

25 mg/L

Blank 0,53

R1 0,57 0,04 R1 0,62 0,09

R2 0,57 0,05 R2 0,62 0,09

R3 0,57 0,04 R3 0,62 0,09

1.5 mg/L

Blank 0,52

25 mg/L

Blank 0,53

R1 0,57 0,05 R1 0,61 0,08

R2 0,57 0,05 R2 0,60 0,08

R3 0,57 0,05 R3 0,61 0,09

1.5 mg/L

Blank 0,52

25 mg/L

Blank 0,52

R1 0,58 0,05 R1 0,63 0,11

R2 0,58 0,05 R2 0,62 0,11

R3 0,58 0,06 R3 0,63 0,11

1.5 mg/L

Blank 0,53

50 mg/L

Blank 0,52

R1 0,58 0,05 R1 0,63 0,11

R2 0,58 0,05 R2 0,63 0,11

R3 0,58 0,05 R3 0,63 0,12

3.1 mg/L

Blank 0,52

50 mg/L

Blank 0,52

R1 0,58 0,06 R1 0,63 0,12

R2 0,58 0,06 R2 0,63 0,11

R3 0,58 0,06 R3 0,63 0,12

3.1 mg/L

Blank 0,52

50 mg/L

Blank 0,52

R1 0,58 0,06 R1 0,63 0,11

R2 0,58 0,06 R2 0,63 0,11

R3 0,58 0,06 R3 0,63 0,11

101

Tabla 26. Medición de la actividad enzimática de GPx, en Lemna valdiviana después de 5

días de exposición a Clorpirifos.

Tratamiento Réplica abs (nm) dE Tratamiento Réplica abs (nm) dE

control 1

Blank 0,29

3.1 mg/L

Blank 0,27

R1 0,49 0,20 R1 0,51 0,24

R2 0,49 0,20 R2 0,51 0,24

R3 0,49 0,20 R3 0,50 0,24

control 2

Blank 0,28

6.25 mg/L

Blank 0,27

R1 0,50 0,22 R1 0,50 0,23

R2 0,50 0,22 R2 0,50 0,24

R3 0,50 0,22 R3 0,50 0,24

control 3

Blank 0,29

6.25 mg/L

Blank 0,28

R1 0,50 0,22 R1 0,50 0,22

R2 0,51 0,22 R2 0,49 0,22

R3 0,51 0,22 R3 0,50 0,23

control 4

Blank 0,29

6.25 mg/L

Blank 0,28

R1 0,52 0,23 R1 0,50 0,22

R2 0,52 0,23 R2 0,51 0,23

R3 0,51 0,22 R3 0,50 0,22

control 5

Blank 0,28

12.5 mg/L

Blank 0,28

R1 0,51 0,23 R1 0,52 0,24

R2 0,51 0,24 R2 0,52 0,24

R3 0,52 0,24 R3 0,51 0,23

0.78 mg/L

Blank 0,29

12.5 mg/L

Blank 0,28

R1 0,53 0,24 R1 0,51 0,23

R2 0,52 0,23 R2 0,52 0,24

R3 0,51 0,23 R3 0,51 0,23

0.78 mg/L

Blank 0,28

12.5 mg/L

Blank 0,28

R1 0,52 0,24 R1 0,52 0,24

R2 0,53 0,25 R2 0,52 0,23

R3 0,52 0,24 R3 0,52 0,24

0.78 mg/L

Blank 0,28

25 mg/L

Blank 0,28

R1 0,52 0,24 R1 0,52 0,24

R2 0,53 0,25 R2 0,52 0,24

R3 0,52 0,24 R3 0,51 0,24

1.5 mg/L

Blank 0,27

25 mg/L

Blank 0,27

R1 0,53 0,26 R1 0,52 0,25

R2 0,53 0,26 R2 0,52 0,25

R3 0,52 0,25 R3 0,52 0,25

1.5 mg/L

Blank 0,27

25 mg/L

Blank 0,27

R1 0,52 0,25 R1 0,52 0,25

R2 0,52 0,25 R2 0,52 0,24

R3 0,52 0,25 R3 0,52 0,24

1.5 mg/L

Blank 0,27

50 mg/L

Blank 0,28

R1 0,52 0,25 R1 0,52 0,25

R2 0,52 0,25 R2 0,52 0,24

R3 0,52 0,25 R3 0,52 0,25

3.1 mg/L

Blank 0,28

50 mg/L

Blank 0,27

R1 0,51 0,23 R1 0,52 0,25

R2 0,50 0,23 R2 0,52 0,24

R3 0,51 0,23 R3 0,52 0,24

3.1 mg/L

Blank 0,28

50 mg/L

Blank 0,28

R1 0,49 0,21 R1 0,52 0,24

R2 0,49 0,21 R2 0,52 0,24

R3 0,48 0,20 R3 0,52 0,24

102

Tabla 27. Valores calculados de GST para la exposición de Lemna valdiviana a Clorpirifos.

Muestra dE dE dE dt (min) V (uL) e (Lt mmol-1 cm-1 proteína)

V de muestra (uL) C (ug ul-1)

z (nKat mg-1 proteina)


z (nKat mg-1 proteina) Promedio DE promedio

Control 1 0,06 0,06 0,06 5 1220 9,6 40 1,95 0,34 0,33 0,33 0,33

0,01 0,33

Control 2 0,06 0,06 0,05 5 1220 9,6 40 1,89 0,34 0,31 0,30 0,32

Control 3 0,07 0,06 0,06 5 1220 9,6 40 1,92 0,37 0,34 0,32 0,35

Control 4 0,07 0,06 0,05 5 1220 9,6 40 1,95 0,36 0,30 0,29 0,32

Control 5 0,07 0,06 0,05 5 1220 9,6 40 1,99 0,36 0,30 0,28 0,31

C1R1 0,07 0,08 0,09 5 1220 9,6 40 1,51 0,52 0,58 0,61 0,57

0,06 0,64 C1R2 0,10 0,09 0,09 5 1220 9,6 40 1,47 0,70 0,67 0,68 0,68

C1R3 0,08 0,09 0,10 5 1220 9,6 40 1,42 0,63 0,66 0,71 0,67

C2R1 0,15 0,14 0,14 5 1220 9,6 40 1,35 1,15 1,14 1,11 1,13

0,03 1,10 C2R2 0,14 0,14 0,14 5 1220 9,6 40 1,38 1,07 1,06 1,05 1,06

C2R3 0,15 0,15 0,14 5 1220 9,6 40 1,40 1,11 1,11 1,08 1,10

C3R1 0,15 0,15 0,16 5 1220 9,6 40 1,31 1,24 1,22 1,27 1,24

0,35 1,44 C3R2 0,16 0,16 0,15 5 1220 9,6 40 0,91 1,87 1,86 1,79 1,84

C3R3 0,16 0,15 0,16 5 1220 9,6 40 1,32 1,27 1,21 1,27 1,25

C4R1 0,18 0,18 0,18 5 1220 9,6 40 1,16 1,63 1,62 1,61 1,62

0,03 1,62 C4R2 0,19 0,18 0,18 5 1220 9,6 40 1,18 1,68 1,64 1,64 1,65

C4R3 0,17 0,18 0,17 5 1220 9,6 40 1,15 1,56 1,62 1,60 1,59

C5R1 0,19 0,19 0,20 5 1220 9,6 40 1,13 1,75 1,79 1,83 1,79

0,15 1,96 C5R2 0,21 0,21 0,20 5 1220 9,6 40 1,07 2,04 2,04 1,98 2,02

C5R3 0,21 0,20 0,21 5 1220 9,6 40 1,06 2,07 2,04 2,10 2,07

C6R1 0,22 0,22 0,21 5 1220 9,6 40 0,96 2,42 2,41 2,34 2,39

0,10 2,49 C6R2 0,22 0,21 0,21 5 1220 9,6 40 0,88 2,61 2,57 2,55 2,58

C6R3 0,21 0,21 0,22 5 1220 9,6 40 0,90 2,45 2,52 2,55 2,51

C7R1 0,23 0,23 0,23 5 1220 9,6 40 0,83 2,92 2,91 2,86 2,90

0,04 2,92 C7R2 0,23 0,24 0,23 5 1220 9,6 40 0,82 2,90 3,06 2,91 2,96

C7R3 0,23 0,23 0,22 5 1220 9,6 40 0,84 2,92 2,91 2,85 2,89

103

Tabla 28. Valores calculados de Catalasa para la exposición de Lemna valdiviana a Clorpirifos.

Muestra dE dE dE dt (min) V (uL) e (Lt mmol-1 cm-1 proteína) V buffer preparado (uL) C (ug ul-1) z (nKat mg-1 proteina) z (nKat mg-1 proteina) z (nKat mg-1 proteina) Promedio DE promedio

Control 1 0,06 0,05 0,06 3 1375 0,04 25 1,95 259,9 208,3 238,6 235,6

41,6 273,3

Control 2 0,08 0,09 0,05 3 1375 0,04 25 1,89 341,7 383,0 232,1 318,9

Control 3 0,06 0,06 0,07 3 1375 0,04 25 1,92 274,0 282,0 309,8 288,6

Control 4 0,05 0,05 0,06 3 1375 0,04 25 1,95 214,5 210,2 245,8 223,5

Control 5 0,06 0,08 0,07 3 1375 0,04 25 1,99 263,5 338,6 297,4 299,9

C1R1 0,06 0,06 0,07 3 1375 0,04 25 1,51 311,4 322,0 369,2 334,2

44,4 385,1 C1R2 0,07 0,08 0,07 3 1375 0,04 25 1,47 419,7 453,0 374,8 415,8

C1R3 0,07 0,07 0,07 3 1375 0,04 25 1,42 406,5 386,9 422,6 405,4

C2R1 0,07 0,07 0,07 3 1375 0,04 25 1,35 455,0 465,1 419,9 446,7

4,0 444,1 C2R2 0,07 0,07 0,08 3 1375 0,04 25 1,38 419,8 411,2 487,4 439,5

C2R3 0,08 0,07 0,07 3 1375 0,04 25 1,40 492,5 417,4 428,9 446,3

C3R1 0,07 0,07 0,08 3 1375 0,04 25 1,31 481,8 469,6 509,6 487,0

56,5 536,0 C3R2 0,07 0,06 0,06 3 1375 0,04 25 0,91 649,3 585,1 559,1 597,8

C3R3 0,09 0,08 0,08 3 1375 0,04 25 1,32 544,7 537,6 487,1 523,1

C4R1 0,07 0,07 0,07 3 1375 0,04 25 1,16 548,2 486,6 521,0 518,6

54,7 569,0 C4R2 0,07 0,08 0,08 3 1375 0,04 25 1,18 536,3 568,0 579,5 561,3

C4R3 0,09 0,08 0,08 3 1375 0,04 25 1,15 643,9 619,5 618,1 627,2

C5R1 0,09 0,10 0,10 3 1375 0,04 25 1,13 702,8 721,4 746,1 723,4

48,1 691,2 C5R2 0,08 0,08 0,08 3 1375 0,04 25 1,07 641,0 599,2 667,7 636,0

C5R3 0,10 0,08 0,09 3 1375 0,04 25 1,06 788,1 655,0 699,6 714,2

C6R1 0,12 0,13 0,13 3 1375 0,04 25 0,96 1064,7 1179,0 1135,6 1126,5

100,7 1116,4 C6R2 0,12 0,12 0,13 3 1375 0,04 25 0,88 1200,4 1178,2 1256,2 1211,6

C6R3 0,11 0,11 0,10 3 1375 0,04 25 0,90 1040,4 1017,0 975,8 1011,1

C7R1 0,13 0,12 0,13 3 1375 0,04 25 0,83 1326,1 1269,1 1325,0 1306,7

70,3 1349,7 C7R2 0,13 0,15 0,14 3 1375 0,04 25 0,82 1385,5 1509,0 1397,8 1430,8

C7R3 0,13 0,13 0,13 3 1375 0,04 25 0,84 1350,1 1288,3 1296,4 1311,6

104

Tabla 29. Valores calculados de GR para la exposición de Lemna valdiviana a Clorpirifos.

Muestra dE dE dE dt (min) V (uL) e (Lt mmol-1

cm-1 proteína) V buffer

preparado (uL) C (ug ul-1)




Promedio DE promedio

Control 1 0,04 0,04 0,03 5 1000 6,41 50 1,95 0,21 0,19 0,17 0,19

0,01 0,21

Control 2 0,03 0,04 0,04 5 1000 6,41 50 1,89 0,19 0,23 0,21 0,21

Control 3 0,04 0,04 0,04 5 1000 6,41 50 1,92 0,23 0,20 0,21 0,22

Control 4 0,03 0,04 0,04 5 1000 6,41 50 1,95 0,19 0,20 0,21 0,20

Control 5 0,04 0,04 0,04 5 1000 6,41 50 1,99 0,20 0,21 0,21 0,21

C1R1 0,04 0,03 0,04 5 1000 6,41 50 1,51 0,26 0,24 0,27 0,25

0,04 0,30 C1R2 0,05 0,04 0,04 5 1000 6,41 50 1,47 0,32 0,31 0,28 0,30

C1R3 0,04 0,05 0,04 5 1000 6,41 50 1,42 0,33 0,34 0,32 0,33

C2R1 0,05 0,05 0,05 5 1000 6,41 50 1,35 0,37 0,41 0,39 0,39

0,02 0,39 C2R2 0,05 0,05 0,06 5 1000 6,41 50 1,38 0,41 0,38 0,42 0,40

C2R3 0,05 0,05 0,05 5 1000 6,41 50 1,40 0,37 0,35 0,38 0,37

C3R1 0,06 0,06 0,06 5 1000 6,41 50 1,31 0,48 0,50 0,47 0,48

0,10 0,57 C3R2 0,06 0,06 0,06 5 1000 6,41 50 0,91 0,70 0,69 0,66 0,68

C3R3 0,07 0,07 0,07 5 1000 6,41 50 1,32 0,53 0,57 0,52 0,54

C4R1 0,07 0,08 0,06 5 1000 6,41 50 1,16 0,66 0,69 0,57 0,64

0,03 0,62 C4R2 0,07 0,07 0,08 5 1000 6,41 50 1,18 0,59 0,62 0,67 0,63

C4R3 0,06 0,07 0,07 5 1000 6,41 50 1,15 0,58 0,59 0,61 0,59

C5R1 0,08 0,07 0,07 5 1000 6,41 50 1,13 0,70 0,64 0,66 0,66

0,07 0,74 C5R2 0,07 0,08 0,08 5 1000 6,41 50 1,07 0,72 0,74 0,77 0,74

C5R3 0,08 0,08 0,09 5 1000 6,41 50 1,06 0,75 0,83 0,84 0,81

C6R1 0,09 0,09 0,09 5 1000 6,41 50 0,96 0,95 0,93 0,97 0,95

0,15 1,05 C6R2 0,08 0,08 0,09 5 1000 6,41 50 0,88 0,95 0,91 1,03 0,96

C6R3 0,11 0,11 0,11 5 1000 6,41 50 0,90 1,23 1,22 1,22 1,22

C7R1 0,11 0,11 0,12 5 1000 6,41 50 0,83 1,36 1,34 1,46 1,39

0,04 1,41 C7R2 0,12 0,11 0,12 5 1000 6,41 50 0,82 1,46 1,42 1,47 1,45

C7R3 0,11 0,11 0,11 5 1000 6,41 50 0,84 1,40 1,40 1,35 1,38

105

Tabla 30. Valores calculados de GPx para la exposición de Lemna valdiviana a Clorpirifos.

Muestra dE dE dE dt (min) V (uL) e (Lt mmol-1

cm-1 proteína) V buffer

preparado (uL) C (ug ul-1)




Promedio DE promedio

Control 1 0,20 0,20 0,20 5 1000 6,41 100 1,95 0,53 0,54 0,54 0,54

0,03 0,59

Control 2 0,22 0,22 0,22 5 1000 6,41 100 1,89 0,61 0,62 0,60 0,61

Control 3 0,22 0,22 0,22 5 1000 6,41 100 1,92 0,59 0,60 0,60 0,60

Control 4 0,23 0,23 0,22 5 1000 6,41 100 1,95 0,61 0,61 0,59 0,60

Control 5 0,23 0,24 0,24 5 1000 6,41 100 1,99 0,61 0,61 0,62 0,61

C1R1 0,24 0,23 0,23 5 1000 6,41 100 1,51 0,83 0,80 0,79 0,81

0,04 0,85 C1R2 0,24 0,25 0,24 5 1000 6,41 100 1,47 0,86 0,88 0,85 0,86

C1R3 0,24 0,25 0,24 5 1000 6,41 100 1,42 0,87 0,90 0,89 0,89

C2R1 0,26 0,26 0,25 5 1000 6,41 100 1,35 0,99 0,99 0,96 0,98

0,03 0,95 C2R2 0,25 0,25 0,25 5 1000 6,41 100 1,38 0,94 0,96 0,94 0,94

C2R3 0,25 0,25 0,25 5 1000 6,41 100 1,40 0,91 0,92 0,94 0,93

C3R1 0,23 0,23 0,23 5 1000 6,41 100 1,31 0,92 0,90 0,92 0,91

0,15 1,01 C3R2 0,21 0,21 0,20 5 1000 6,41 100 0,91 1,20 1,19 1,16 1,18

C3R3 0,24 0,24 0,24 5 1000 6,41 100 1,32 0,95 0,94 0,93 0,94

C4R1 0,23 0,24 0,24 5 1000 6,41 100 1,16 1,06 1,07 1,08 1,07

0,04 1,02 C4R2 0,22 0,22 0,23 5 1000 6,41 100 1,18 0,98 0,96 1,00 0,98

C4R3 0,22 0,23 0,22 5 1000 6,41 100 1,15 1,02 1,03 1,01 1,02

C5R1 0,24 0,24 0,23 5 1000 6,41 100 1,13 1,11 1,11 1,07 1,10

0,03 1,13 C5R2 0,23 0,24 0,23 5 1000 6,41 100 1,07 1,11 1,16 1,12 1,13

C5R3 0,24 0,23 0,24 5 1000 6,41 100 1,06 1,15 1,15 1,16 1,15

C6R1 0,24 0,24 0,24 5 1000 6,41 100 0,96 1,31 1,32 1,30 1,31

0,09 1,40 C6R2 0,25 0,25 0,25 5 1000 6,41 100 0,88 1,46 1,48 1,50 1,48

C6R3 0,25 0,24 0,24 5 1000 6,41 100 0,90 1,42 1,40 1,41 1,41

C7R1 0,25 0,24 0,25 5 1000 6,41 100 0,83 1,54 1,52 1,55 1,54

0,03 1,53 C7R2 0,25 0,24 0,24 5 1000 6,41 100 0,82 1,56 1,54 1,54 1,55

C7R3 0,24 0,24 0,24 5 1000 6,41 100 0,84 1,49 1,51 1,50 1,50

106

Figura 29. Curva de calibración para la determinación de LD y LC de Clorpirifos

(Miranda, 2013).

Tabla 31. Límites de detección (LD) y cuantificación (LC) determinado para Clorpirifos,

en el equipo Contador de Centelleo Líquido (Beckman LS 5000 TD). (Miranda, 2013).

Plaguicida LD (ug ml

-

1)

LC

(ug ml-1

) Ecuación de la recta R

2

Clorpirifos 0,01

0,03

y= 826,4 + 29,10 0,999

0

500

1000

1500

2000

2500

0 1 2 3 Ac

tivid

ad

(d

pm

mL

-1)

Concentración (mg mL-1)

107

Tabla 32. Planilla Excel que presenta los datos ingresados y los resultados de bioacumulación y degradación de Clorpirifos en el

ensayo 1.

Peso de las Lemnas al comenzar el ensayo

Peso humedo Peso lemnas liofilizadas % materia seca % de Humedad

Replicas 24 horas 48 horas 96 horas 24 horas 48 horas 96 horas 24 horas 48 horas 96 horas 24 horas 48 horas 96 horas

gr gr gr gr gr gr % % % % %

R1 0,5 0,5 0,5 0,0172 0,0188 0,021 3,44 3,76 4,2 96,6 96,2 95,8

R2 0,5 0,5 0,5 0,0192 0,0185 0,0215 3,84 3,70 4,3 96,2 96,3 95,7

R3 0,5 0,5 0,5 0,0156 0,0183 0,0204 3,12 3,66 4,08 96,9 96,3 95,9

Promedio 3,47 3,71 4,2 96,5 96,3 95,8

Des Est 0,36 0,05 0,11 0,36 0,05 0,11

CV (%) 10,4 1,4 2,6 0,4 0,1 0,1

Lecturas de solucion madre (Dpm)

Vial 1 Vial 2 Vial 3 Vial 4 Vial 5 Vial 6 Promedio desv. Est, C.V (%)

dpm/mL

955 913 924 923 946 936 932,1 15,8 1,70

108

Continuación Tabla 32.

degradacion de los controles (SIN LEMNAS)

Actividad (dpm/mL) degradación (%)

inicial Replicas 24 48 96 24 h 48 h

96 h

dpm/ml dpm/ml %

933

R1 806 604 720 13,6 35,2 22,8

794 608 679 14,9 34,8 27,2

R2 774 690 647 17,1 26,1 30,6

762 706 686 18,3 24,3 26,4

R3 788 745 693 15,5 20,2 25,7

807 750 697 13,5 19,6 25,3

promedio 788 684 687 15,5 26,7 26,3

desv. Est 18 64 24 1,9 6,89 2,57

CV(%) 2,3 9,4 3,5 12,3 25,8 9,8

Dpm/100 ml totales

78845 68366 68709

actividad sobrenadante Lemna (dpm/mL) Clorpirifos en el sobrenadante (%)

inicial réplicas

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

dpm/mL dpm/ml %

933 R1

711 621 512 76,2 66,6 54,9

728 617 510 78,0 66,2 54,7

R2

700 587 496 75,0 62,9 53,2

672 591 508 72,1 63,3 54,5

R3

681 573 512 73,0 61,4 54,9

691 584 524 74,1 62,6 56,2

promedio 697 595 510 74,7 63,8 54,7

desv. Est 20,3 19,6 9,1 2,17 2,10 0,97

CV(%) 2,9 3,3 1,8 2,91 3,29 1,78

Dpm/100 ml

totales 69700 59535 51032

109


Peso de lemnas para combustionar Actividad lemnas combustionadas

(dpm/100mL) act. lemnas- act. Manitol (dpm/100 mL) Dpm * factor correccion

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

gr gr gr dpm dpm dpm dpm dpm dpm dpm dpm dpm

R1 0,0172 0,0188 0,021 4804 6493 8791 4703 6392 8691 4800 6523 8869

R2 0,0192 0,0185 0,0215 5202 5948 9264 5102 5847 9163 5206 5968 9351

R3 0,0156 0,0183 0,0204 3612 6179 8346 3512 6079 8245 3584 6204 8415

promedio 0,0173 0,0185 0,0210 desv. Est 0,0018037 0,000251661 0,000550757

CV(%) 10,4 1,4 2,6

Determinacion del Factor de correccion del Oxidizador Factor

Repeticiones promedio Dpm-manitol

1,021 Manitol 98 103 101

S/comb 23451 21408 22430 22329

C/comb 21030 22930 21980 21879

Bioacumulacion de Clorpirifos

Dpm totales considerando biodegradacion 78845 68366 68709 Absorcion (%)

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

Replicas Dpm totales Lemnas liofilizadas bioacumulación (%)

R1 4800 6523 8869 6,09 9,54 12,91

R2 5206 5968 9351 6,60 8,73 13,61

R3 3584 6204 8415 4,55 9,07 12,25

promedio 4530 6232 8879 5,7 9,1 12,9

des es 844 228 382 1,07 0,41 0,68

CV(%) 18,6 3,65 4,31 18,6 4,47 5,27

bioacumulacion (%) De 12,5 mg clorpirifos/L bioacumulo

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

5,7 9,1 12,9 0,7 1,14 1,6

110


ensayo 2.

Peso de las Lemnas al comenzar el

ensayo

Peso humedo Peso Lemnas liofilizadas % materia seca

Replicas 24 horas 48 horas 96 horas 24

horas 48

horas 96 horas 24 horas 48 horas 96 horas

gr gr gr gr gr gr % % %

R1 0,5 0,5 0,5 0,0247 0,0194 0,0341 4,94 3,88 6,82

R2 0,5 0,5 0,5 0,0188 0,0246 0,034 3,76 4,92 6,8

R3 0,5 0,5 0,5 0,0195 0,0283 0,0337 3,90 5,66 6,74

Promedio 4,20 4,82 6,79

Des Est 0,64 0,89 0,04

CV (%) 15,3 18,6 0,6

Lecturas de solucion inicial (Dpm)

1 2 3 4 5 6 Promedio desv. Est, C.V (%)

dpm/mL

1090 1058 1070 1068 1081 1071 1073,4 11,1 1,04

degradación de los controles (sin lemnas)

actividad (dpm/mL) degradación (%)

inicial Replicas

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

dpm/ml dpm/ml dpm/ml dpm/ml % % %

1073 R1

963 908 945 10,2 15,36 11,97

960 885 940 10,5 17,55 12,39

R2 958 890 785 10,7 17,01 26,84

984 915 813 8,3 14,74 24,26

R3

937 813 822 12,6 24,24 23,39

935 820 808 12,9 23,58 24,74

promedio 956 872 852 10,9 18,7 20,6

desv. Est 18,2 44,4 71,0 1,7 4,13 6,62

CV(%) 1,91 5,09 8,34 15,6 22,1 32,2

Dpm/100 ml totales 95619 87178 85193

111


degradación de sobrenadante Lemna

Actividad sobrenadante Lmna (dpm/mL) Clorpirifos en el sobrenadante (%)

Actividad inicial Réplicas

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

dpm/ml dpm/ml dpm/mL dpm/ml % % %

1072,906167 R1

809 722 539 75,4 67,3 50,2

788 704 546 73,5 65,7 50,9

R2

816 694 544 76,0 64,7 50,7

782 687 520 72,8 64,1 48,5

R3

780 633 518 72,7 59,0 48,3

785 641 531 73,2 59,7 49,5

promedio 793 680 533 73,9 63,4 49,7

desv. Est 15,3 35,5 11,9 1,4 3,30 1,11

CV(%) 1,92 5,21 2,24 1,9 5,21 2,24

Dpm/100 mL

79325 68025 53315

Peso de lemnas para combustionar actividad lemnas combustionadas

(dpm/100 mL) Actividad lemnas- actividad Manitol Dpm * factor correccion

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

Replicas gr gr gr dpm dpm dpm dpm dpm dpm dpm dpm dpm

R1 0,0247 0,0194 0,0341 6068 7045 10896 5968 6944 10796 6090 7087 11018

R2 0,0188 0,0246 0,034 4727 7439 13272 4627 7339 13172 4722 7490 13443

R3 0,0195 0,0283 0,0337 4911 7501 13150 4810 7401 13049 4909 7553 13318

Promedio 0,0210 0,0241 0,0339

desv. Est 0,00322335 0,0044710

2 0,0002

08 CV(%) 15,3 18,6 0,6

112




1,021 Manitol 98 103 101

S/comb 23451 21408 22430 22329

C/comb 21030 22930 21980 21879

Bioacumulación de Clorpirifos


24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

Dpm totales Lemnas liofilizadas bioacumulación (%)

6090 7087 11018 6,37 8,13 12,93

4722 7490 13443 4,94 8,59 15,78

4909 7553 13318 5,13 8,66 15,63

promedio 5240 7377 12593 5,5 8,5 14,8

des es 742 206 1115 0,78 0,29 1,60

CV(%) 14,2 2,80 8,85 14,2 3,42 10,84

Bioacumulación (%) De 12,5 mg clorpirifos/L bioacumulo

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

5,5 8,5 14,8 0,7 1,1 1,9

113


ensayo 3.


Peso humedo Peso Lemnas liofilizadas % materia seca

Replicas 24 horas 48 horas 96 horas 24 horas 48 horas 96 horas 24 horas 48 horas 96 horas

gr gr gr gr gr gr % %

R1 0,5 0,5 0,5 0,0212 0,0217 0,0338 4,24 4,34 6,76

R2 0,5 0,5 0,5 0,0207 0,0242 0,0342 4,14 4,84 6,84

R3 0,5 0,5 0,5 0,021 0,0258 0,0321 4,20 5,16 6,42

Promedio 4,19 4,78 6,7

Des Est 0,05 0,41 0,22

CV (%) 1,2 8,6 3,3

Actividad de la solución madre (1 mL+5 mL de liquido centelleador x vial)


Marcaje

1000 dpm/ml

vial dpm/ml

1 1420

2 1429

3 1404

4 1382

5 1436

6 1385

Promedio 1409

Desviación estándar 22,9

CV (%) 1,63

dpm/100 mL 140918,6

114

calculo degradación de controles (sin Lemna)

actividad de los controles (dpm/mL) degradación (%)

inicial Replicas

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h


1409,186 R1 1074 1004 960 23,8 43,2 31,8

1078 991 980 23,5 41,7 30,5

R2

1052 944 863 25,4 33,0 38,8

1086 955 878 22,9 32,2 37,7

R3

1229 880 845 12,8 37,6 40,0

1229 867 846 12,8 38,5 40,0

promedio 1125 940 895 20,2 37,7 36,5

desv. Est 81,4 21,8 59,5 5,77 4,43 4,22

CV(%) 7,23 2,32 6,65 28,6 11,8 11,6

Dpm/100 mL 112463 94004 89526

actividad sobrenadante Lemna Clorpirifos en el sobrenadante (%)

actividad inicial Replicas

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

dpm/ml dpm/ml dpm/ml % % %

1409,186 R1

905 801 609 64,2 56,8 43,2

942 822 605 66,8 58,3 43,0

R2

952 820 612 67,6 58,2 43,4

949 814 604 67,4 57,8 42,8

R3

1024 803 640 72,7 57,0 45,4

1021 804 643 72,5 57,0 45,6

promedio 966 811 619 68,5 57,5 43,9

desv. Est 47,3 9,2 17,9 3,4 0,65 1,27

CV(%) 4,9 1,1 2,9 4,9 1,14 2,90

Dpm/100 mL 96551,0 81069,5 61882,8


115

Peso seco (g) de lemnas Actividad Lemnas (dpm/100 mL) act. Lemna- act. Manitol Dpm * factor correccion

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h


R1 0,0212 0,0217 0,0338 8839 10872 19262 8747 10779 19170 8869 10930 19438

R2 0,0207 0,0242 0,0342 9764 12109 16952 9671 12017 16859 9807 12185 17095

R3 0,021 0,0258 0,0321 7874 13001 116* 7782 12909 23 7891 13090 24*

promedio 0,021 0,024 0,033

desv. Est 0,000 0,002 0,001

CV(%) 1,2 8,6 3,3 *

Recuadros en amarillo representan una muestra que no fue combustionada.



1,014 Manitol 92 92 92

S/comb 4579 4631 4605 4513

C/comb 4557 4528 4543 4450

Bioacumulación de clorpirifos


24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

Replicas Dpm totales Lemnas

liofilizadas Bioacumulación (%)

R1 8869 10930 19438 7,89 11,63 21,71

R2 9807 12185 17095 8,72 12,96 19,10

R3 7891 13090 0 7,02 13,92

promedio 8856 12068 18267 7,9 12,8 20,4

des es 958 885 9183 0,85 1,15 1,85

CV(%) 10,8 7,3 50,3 10,8 9,0 9,1

Bioacumulación (%)

De 12,5 mg clorpirifos/L bioacumulo

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

7,9 12,8 20,4 0,1 1,6 1,7

116


ensayo 4.


Peso humedo Peso seco % materia seca

Replicas

24 horas

48 horas

96 horas

24 horas

48 horas 96 horas 24 horas 48 horas 96 horas

gr gr gr gr gr gr % % %

R1 0,5 0,5 0,5 0,02 0,0219 0,0337 4,00 4,38 6,74

R2 0,5 0,5 0,5 0,024 0,0214 0,0349 4,80 4,28 6,98

R3 0,5 0,5 0,5 0,0218 0,0235 0,035 4,36 4,70 7

Promedio 4,39 4,45 6,9

Des Est 0,40 0,22 0,14

CV (%) 9,1 4,9 2,1


1 2 3 4 5 6 Promedio desv. Est, C.V (%)

dpm/mL

1417 1379 1407 1382 1389 1378 1392 16,3 1,17

117


degradación clorpirifos en controles

actividad medida en los controles (dpm/mL)

degradación (%)

inicial Replicas

24 48 96 24 hrs 48 hrs 96 hrs


1391,9303 R1

1023 872 858 26,5 37,4 38,4

996 868 837 28,4 37,6 39,9

R2

962 1249 752 30,9 10,3 46,0

975 1253 745 29,9 10,0 46,4

R3 998 908 831 28,3 34,8 40,3

1005 914 824 27,8 34,3 40,8

promedio 993 1011 808 28,6 27,4 42,0

desv. Est 21,8 186,9 47,3 1,6 13,4 3,40

CV(%) 2,19 18,50 5,85 5,5 49,0 8,1

Dpm/100 mL 99335 101062 80800

Actividad sobrenadante lemna (dpm/mL) Clorpirifos en sobrendante (%)

actividad inicial Replicas

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

dpm/ml dpm/ml dpm/ml % % %

1391,930333 R1

863 757 127 62,0 54,4 9,1

872 778 126 62,6 55,9 9,0

R2

864 773 570 62,1 55,5 40,9

885 748 585 63,6 53,8 42,0

R3

911 741 557 65,5 53,2 40,0

916 759 568 65,8 54,5 40,8

promedio 885 759 422 63,6 54,5 30,3

desv. Est 23,4 14 229 1,68 1,01 16,5

CV(%) 2,64 1,85 54,3 2,64 1,85 54,3

Dpm/100 mL 88512 75928 42189

118


Peso seco Lemnas Actividad lemnas (dpm/100 mL) Actividad Lemna- actividad Manitol Dpm * factor correccion

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h


R1 0,02 0,0219 0,034 8207 12516 13995 8108 12416 13895 8655 13253 14833

R2 0,024 0,0214 0,035 8338 7319 14556 8238 7219 14457 8794 7706 15432

R3 0,0218 0,0235 0,035 7547 9805 17915 7448 9706 17816 7950 10360 19018

promedio 0,0219 0,0223 ###### desv. Est 0,0020033 0,0011 7E-04

CV(%) 9,1 4,9 2,1

Determinacion del Factor de correccion del Oxidizador Factor Repeticiones promedio Dpm-manitol

1,067

Manitol 100 100

S/comb 24932 24086 24031 24059 23959

C/comb 22607 22525 22565 22545 22445

bioacumulación de clorpirifos

Dpm totales considerando biodegradacion 99335 101062 80800 Bioacumulación (%)

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

Dpm totales Lemnas liofilizadas (%)

8655 13253 14833 8,71 13,11 18,36

8794 7706 15432 8,85 7,63 19,10

7950 10360 19018 8,00 10,25 23,54

promedio 8466 10440 16427 8,5 10,3 20,3

des es 452 2265 1848 0,46 2,75 2,80

CV(%) 5,34 21,7 11,2 5,34 26,6 13,8

Bioacumulación (%)

De 12,5 mg Clorpirifos/L bioacumulo

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

8,5 10,3 20,3 0,1 1,3 2,5

119

Tabla 36. Cálculos correspondientes a porcentaje de bioacumulación de Clorpirifos y mg L-1

de

Clorpirifos bioacumulados por Lemna valdiviana en los 4 ensayos realizados.

Ensayo Bioacumulación (%) Bioacumulación (mg L-1)

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

1

6,09 9,54 12,9 0,76 1,19 1,61

6,60 8,73 13,6 0,83 1,09 1,70

4,55 9,07 12,2 0,57 1,13 1,53

2

6,37 8,13 12,9 0,80 1,02 1,62

4,94 8,59 15,8 0,62 1,07 1,97

5,13 8,66 15,6 0,64 1,08 1,95

3

7,89 11,6 21,7 0,99 1,45 2,71

8,72 13,0 19,1 1,09 1,62 2,39

7,02 13,9 0,88 1,74

4

8,71 13,1 18,4 1,09 1,64 2,29

8,85 7,63 19,1 1,11 0,95 2,39

8,00 10,3 23,5 1,00 1,28 2,94

Promedio 6,91 10,2 16,8 0,86 1,27 2,10

DE 1,54 2,17 6,07 0,19 0,27 0,76

C.V (%) 22,3 21,3 39,4 22,3 21,3 39,4

120

Tabla 37. Cálculos correspondientes a porcentaje de degradación de Clorpirifos y mg L-1

de

Clorpirifos degradados en los 5 ensayos realizados.

Ensayo Degradación (%) Degradación (mg L-1)

24 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h

1

13,6 35,2 22,8 1,36 3,52 2,28

14,9 34,8 27,2 1,49 3,48 2,72

17,1 26,1 30,6 1,71 2,61 3,06

18,3 24,3 26,4 1,83 2,43 2,64

15,5 20,2 25,7 1,55 2,02 2,57

13,5 19,6 25,3 1,35 1,96 2,53

2

10,2 15,4 12,0 1,02 1,54 1,20

10,5 17,5 12,4 1,05 1,75 1,24

10,7 17,0 26,8 1,07 1,70 2,68

8,27 14,7 24,3 0,83 1,47 2,43

12,6 24,2 23,4 1,26 2,42 2,34

12,9 23,6 24,7 1,29 2,36 2,47

3

23,8 43,2 31,8 2,38 4,32 3,18

23,5 41,7 30,5 2,35 4,17 3,05

25,4 33,0 38,8 2,54 3,30 3,88

22,9 32,2 37,7 2,29 3,22 3,77

12,8 37,6 40,0 1,28 3,76 4,00

12,8 38,5 40,0 1,28 3,85 4,00

4

26,5 37,4 38,4 2,65 3,74 3,84

28,4 37,6 39,9 2,84 3,76 3,99

30,9 10,3 46,0 3,09 1,03 4,60

29,9 10,0 46,4 2,99 1,00 4,64

28,3 34,8 40,3 2,83 3,48 4,03

27,8 34,3 40,8 2,78 3,43 4,08

5

25,1 30,7 47,6 3,14 3,84 5,95

25,0 31,5 46,5 3,12 3,94 5,82

5,99 26,8 48,7 0,75 3,35 6,09

5,61 27,5 48,9 0,70 3,43 6,11

9,85 37,2 50,5 1,23 4,65 6,31

12,0 36,3 49,7 1,49 4,53 6,22

Promedio 17,8 28,4 34,8 1,9 3,0 3,7

DE 7,79 9,43 11,03 0,81 1,06 1,47

C.V (%) 43,7 33,2 31,7 43,5 35,2 39,5

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