BANDEO CROMOSOMICO

CURSO: Genética I

INTEGRANTES :

Cachi Piña IsabelitaGonzales Sánchez JoslinGonzales Seclen CristhianRamírez Ramírez WilsonZapata Díaz Javier

DOCENTES:

MSc. Cesar Guzmán VigoMag. Marco Guzmán Tello

CHICLAYO; 6 de abril del 2015

INTRODUCCIÓN

Los primeros cariotipos fueron útiles para contar los números de cromosomas, pero muchas veces las anomalías cromosómicas, como los reordenamientos equilibrados o las pequeñas deleciones cromosómicas, eran indetectables. En la década de 1970 se desarrollaron las técnicas de tinción para producir las bandas cromosómicas características de los cariotipos modernos.

Las técnicas de bandeo fluorescente, permitieron la completa individualización de los cromosomas humanos, y se pudo comprobar que el cromosoma 21 asociado al síndrome de Down, en realidad es más pequeño que el 22, pero ambos mantuvieron el número que primitivamente se les había asignado.

Cada cromosoma en las células somáticas humanas está formado por una serie de bandas continuas. Las bandas se ubican en regiones a lo largo de los brazos cromosómicos y las regiones tienen límites definidos que pueden ser los extremos de los brazos, los centrómeros y ciertas bandas.

OBJETIVOS

Conceptualizar el bandeo cromosómico y cuáles son las

bandas.

Identificar las tinciones o métodos utilizados en los diferentes

tipos de bandeos o bandas.

NOMECLATURA DE BANDEOS MORFOLÓGICOS

En relación con la nomenclatura para descubrir los diferentes bandeos

cromosómicos, se emplea un código de tres letras: la primera, indica el tipo de

bandeo utilizado, la segunda, la técnica de detección empleada y la tercera, el tipo

de tinción.

QFQ: Bandas Q por fluorescencia usando quinacrina.

GTG: Bandas G por tratamiento enzimático con tripsina utilizando Giemsa.

RFA: Bandas R por fluorescencia usando naranja de acridina.

RHG: Bandas R mediante desnaturalización térmica utilizando Giemsa.

THG: Bandas T por desnaturalización térmica empleando Giemsa.

CBG: Bandas C por hidróxido de bario utilizando Giemsa.

 

Nomeclatura de bandeos dinámicos.

GBG: Bandas G por incorporación de BrdU utilizando Giemsa.

RBA: Bandas R por incorporación de BrdU empleando naranja de acridina.

RBG: Bandas R por incorporación de BrdU utilizando Giemsa.

GB-AAu: Bandas G por incorporación de BrdU empleando anticuerpos

específicos unidos a partículas de oro coloidal.

RB-AAu: Bandas R por incorporación de BrdU usando anticuerpos específicos

unidos a partículas de oro coloidal.

Bandeo Cromosómico

Consiste en someter a los cromosomas a desnaturalizaciones, a digestión

enzimática o a ambos, seguido de una tinción con colorante específico para ADN.

Esto hace que los cromosomas se tiñan con una serie de bandas claras y oscuras.

Hay diversos tipos de bandeo:

Bandeo G

Los cromosomas son sometidos a digestión con la enzima tripsina de manera

controlada. Los cromosomas se desnaturalizan mediante calor en solución salina

(esto desnaturalizará ADN con abundantes AT) y, a continuación, se tiñen con

Giemsa que es un colorante químico que enlaza ADN. Las bandas oscuras de

tinción positiva, son las bandas G. Las pálidas son G negativas, se denominan

bandas R. Las regiones oscuras son las que se replican más tarde en la fase S y

contienen cromatina más condensada. Las bandas R suelen replicarse temprano

en la fase S y tienen menos condensada la cromatina. Los genes se concentran

sobre todo en esta banda, mientras que el ADN de las bandas G es menos activo

transcripcionalmente. Las bandas R son Q negativas.

Bandeo Q

Se tiñen los cromosomas con un colorante fluorescente que se enlaza

preferentemente a ADN abundante en AT y se observan mediante fluorescencia

UV. Las bandas fluorescentes indican los mismos segmentos que las bandas G.

Bandeo T

Identifica un subgrupo de bandas R que están concentradas sobre todo en los

telómeros. Las bandas T son las R que se tiñeron de manera más intensa.

Bandeo C

La técnica de Banda C fue descubierta por casualidad y originada en un

experimento en donde ADN satélite marcado en ratón fue hibridizado in situ con

cromosomas de ratón. En este experimento, el ADN del cromosoma fue

desnaturalizado con NaOH y renaturalizado en buffer SSC. Los sitios hibridizados

fueron detectados por autoradiografía usando coloración de Giemsa para

cromosomas. La prueba de hibridización preferencialmente fue en las regiones

centromericas de  los cromosomas.  Sin embargo también se notó que el Giemsa

coloreo otras regiones en otros cromosomas.

Esta banda se caracteriza por teñir aquellas regiones ricas en heterocromatina

constitutiva que corresponden a secuencias de ADN altamente repetitivas; se

encuentran principalmente en centrómero, telómeros y ADN satélite y en

ocasiones constricciones secundarias como son los NOR’s.

Métodos dinámicos

Se aplica sobre las células en cultivo. Uno de ellos es añadir isótopos radiactivo,

como la timidina tritiada, en un periodo temprano de la replicación, para que se

vaya añadiendo al ADN. El resultado es un patrón de bandas de replicación

temprana, que suele coincidir con las bandas R. Si se hubiese añadido la timidina

tritiada en un momento tardío de la replicación, las bandas coincidirian con las G.

Bandeo R

Al tratar a los cromosomas antes de teñirlos, con calor o productos químicos

particulares, las bandas claras y oscuras que aparecen están invertidas. Si las

bandas G y Q se tiñen mal, entonces el bandeo R se emplea para brindar un

contraste superior, permitiendo así que las bandas se lean más fácilmente. Es la

inversa del bandeo C y tiñe las regiones no centroméricas, preferiblemente a los

centrómeros.

Bandas Ag-NOR

Se conoce como bandas Ag-NOR aquella que colorea las Regiones

Organizadoras Nucleares (de ahí la nomenclatura NOR) en ocasiones son

también llamadas Banda N, su coloración es debido a la afinidad con el Nitrato de

Plata.

La Región Organizadora Nucleolar es el sitio en donde están localizados los genes

de ADNr; el nucleolo está compuesto por cinco componentes estructurales, el

centro fibrilar, el componente fibrilar, el componente granular, el intersticio

nucleolar, y  la cromatina condensada asociada.

En eucariotas el organizador nucleolar consiste de múltiples repeticiones

arregladas en tandem, de las secuencias para ARN-r 18S y 28S intercalado con

secuencias espaciadoras. Los espacios pueden ser transcritos, pero su 

transcripción nunca incluye un ribosoma maduro. Usualmente se refiere a ADN

ribosomal (ADN-r) como una repetición de genes con secciones en tamdem

arregladas y agrupadas dentro de uno o varias regiones del set de cromosomas.

Hibridación genómica comparada (CGH)

La técnica de CGH permite el rastreo de desequilibrios globales presentes en el

genoma en una única hibridación y sin necesidad de obtener células en división

(Kallionemi y col., 1992). Ha sido la primera técnica combinada de citogenética e

hibridación in situ fluorescente que ha permitido realizar un análisis global del

genoma. Aunque inicialmente se describió como una valiosa técnica para el

análisis de desequilibrios en el número de copias de ADN en tumores, en la

actualidad es de gran utilidad para el análisis de desequilibrios cromosómicos

constitucionales a partir de cualquier tipo de muestra.

Básicamente, la técnica consiste en marcar los ADNs genómicos de la muestra

problema y de un individuo control con fluorocromos distintos y cohibridarlos en

presencia de ADN Cot-1 sobre una preparación cromosómica de un individuo

normal. Las señales fluorescentes son detectadas y analizadas mediante análisis

digital haciendo uso de un software específico. De este modo podemos analizar

las regiones de copia única de cada cromosoma. A partir del análisis de un mínimo

de 10-12 metafases se obtiene el valor promedio y se generan los perfiles de

ganancias.

Hibridación ''in situ'' fluorescente (FISH)

Es una técnica citogenética de marcaje de cromosomas mediante la cual se

localiza un determinado fragmento de la secuencia de los ácidos nucleicos y pone

de manifiesto la presencia o ausencia de secuencias génicas específicas.

Se puede aplicar sobre núcleos interfásicos de extensiones celulares o cortes de

tejido o directamente en cromosomas. La posibilidad de poder utilizar las técnicas

de FISH sobre células que no están dividiéndose es importante en aquellas

neoplasias con baja tasa de división celular, como en los síndromes

linfoproliferativos crónicos.

Esta técnica permite la rápida determinación de aneuploidías, microdeleciones,

duplicaciones, inversiones, así como la adjudicación de un marcador genético a un

cromosoma (cartografía genética).

Los cromosomas que son usualmente analizados por FISH son los 13, 18, 21, X e

Y, que son los más propensos a sufrir anomalías. Están relacionados a

enfermedades como el síndrome de Patau (13), el síndrome de Edwards (18), el

síndrome de Down (21), el síndrome de Turner (X) y el síndrome del superhombre

(Y), entre otros.

FISH usa segmentos de una única hebra de ADN que son tintados, etiquetados o

marcados, con moléculas fluorescentes (fluorocromos que puede ligarse a un

cromosoma específico; estos segmentos de ADN son llamados sondas.

- Las moléculas fluorescentes: son moléculas que son sometidas a un

proceso de emisión llamado fluorescencia, en el cual las moléculas son

excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las especies

excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía

en forma de fotones. Los métodos de fluorescencia se aplican mucho

menos debido al número relativamente limitado de sistemas químicos que

se pueden hacer fluorescer. La biotina o fluoresceína es una de las

moléculas fluorescentes que se utiliza en la técnica de FISH.

La técnica consiste en preparar cortas secuencias de DNA de una sola hebra, a

las cuales como ya hemos visto son llamadas sondas, que son complementarias

de las secuencias de DNA que se quieren marcar y examinar. Estas sondas se

"marcan" con moléculas fluorescentes que ya hemos definido anteriormente.

Estas sondas se hibridan o unen al DNA complementario y, como están marcadas

con moléculas fluorescentes, permiten localizar las secuencias en las que se

encuentran. A diferencia de otras pruebas utilizadas para estudiar los cromosomas

que requieren que las células se encuentren en división activa, la hibridación

fluorescente in situ puede ser llevada a cabo en células no activas.

La FISH utiliza tres tipos de sonda:

Sondas de secuencia única (locus específico): estas sondas se hibridan a

una región muy concreta o particular correspondiente a una banda

cromosómica o a un gen. Esta sonda es útil cuando se ha aislado una

pequeña parte de un gen y se quiere averiguar en qué cromosoma se

encuentra. Con estas sondas podemos visualizar alteraciones estructurales o

numéricas tanto en núcleos en interfase como en metafase. Podemos detectar

la presencia de células tumorales residuales con una anomalía característica

de estirpe o subtipo, como la t(9;22) en la leucemia mieloide crónica, la

t(15;17) que afecta al PML/RARα en la leucemia mieloide aguda.

Sondas alfoides o centroméricas: son sondas que contienen secuencias

complementarias de las secuencias repetidas que se encuentran en los

centrómeros de los cromosomas. Como pueden utilizarse sondas de

diferentes colores, cada cromosoma puede ser marcado de manera distinta,

con lo que se puede averiguar si un individuo tiene el número correcto de

cromosomas o si tiene un cromosoma extra.

Sondas para cromosomas completos: son colecciones de sondas de un

tamaño reducido, cada una de las cuales se hibrida a una secuencia diferente

a lo largo de todo un cromosoma. Utilizando estas librerías de sondas, se

puede marcar todo un cromosoma generando un cariotipo espectral. De esta

manera, se consiguen imágenes en color que permiten examinar los cariotipos

de una forma más exacta que los tradicionales cariotipos basados en bandas

más o menos oscuras. Esta técnica es particularmente útil para examinar

anormalidades cromosómicas, con estas sondas podemos detectar

alteraciones estructurales o numéricas de los cromosomas, pero sólo en

células en metafase. Es muy útil cuando tenemos cromosomas de mala

calidad.

Para localizar las secuencias de interés, la sonda debe hibridar con la secuencia

de ADN de la muestra. El primer paso consiste en desnaturalizar las moléculas de

ADN (separar las hebras complementarias de la estructura en doble hélice del

ADN), tanto la de la sonda como la de la muestra de estudio. Para ello elevamos

la temperatura hasta 70 ºC - 80 ºC, o variamos el pH, y de este modo se rompen

los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas del ADN.

Después se hibrida la sonda con su región complementaria del ADN de la

muestra, se incuban a 37 ºC la sonda de interés con la muestra, y por

complementariedad de las bases se une la sonda de interés con la región

complementaria del ADN de la muestra. Con un microscopio de fluorescencia se

observan las señales de la sonda.

Esta metodología es útil para cuantificar aberraciones numéricas. Otra aplicación

de la FISH es en el seguimiento de pacientes con un transplante alogénico de

distinto sexo. Así, si utilizamos sondas centroméricas para los cromosomas

sexuales, tendremos una información rápida del porcentaje de células del donante

y células residuales del receptor.

La FISH, como complemento de la citogenética convencional, puede ser de

utilidad diagnóstica y pronóstica en el estudio de las neoplasias hematológicas.

Ambas metodologías tienen limitaciones y ventajas. La citogenética requiere que

las células del clon neoplásico se estén dividiendo. Cuando los cromosomas son

de mala calidad su interpretación es dudosa. Se analizan pocas células y tiene

una baja sensibilidad. Por el contrario la FISH se puede utilizar sobre núcleos en

interfase y sobre células en metafase, pudiendo analizarse más células que con la

citogenética, siendo además una técnica con mayor sensibilidad. La información

que nos aporta la técnica de FISH está limitada al reordenamiento buscado, es

decir a la sonda utilizada. Sin embargo, con la citogenética tenemos información

de todos los cromosomas. La técnica de FISH tiene un mayor coste que la

citogenética.

Aplicaciones

Bueno algunas aplicaciones ya se han mencionado anteriormente en el texto, no

obstante tal vez algunos se mencionaran nuevamente. Esta técnica ha resultado

ser muy útil en el campo de la medicina reproductiva, con aplicación en el

diagnóstico genético preimplantatorio (DGP). Resulta una forma muy precoz de

diagnóstico que, apoyándose en las técnicas de reproducción asistida, posibilita el

estudio de embriones antes de ser transferidos al útero materno y, por

consiguiente, antes de que se lleve a cabo la implantación embrionaria.

Para el análisis de anomalías cromosómicas embrionarias, tanto numéricas como

estructurales, puede utilizarse la técnica DGP-FISH. Para este fin se requiere una

biopsia embrionaria, mediante la cual se extrae una célula del embrión en cultivo

"in vitro". Seguidamente, se procesa la muestra de tal manera que quede fijado el

núcleo en interfase y se hibrida con sondas específicas para el estudio

cromosómico de la patología que se sospecha pueda estar presente en el

embrión.

Entre las anomalías cromosómicas que pueden ser analizadas, caben citarse:

Anomalías numéricas:

- Alteraciones en cromosomas sexuales: Alta frecuencia de mosaicismo

en pacientes implica que, en muchos casos, sólo se den defectos leves en

el desarrollo. Gran relevancia en Medicina Reproductiva por ir asociado, en

mayor o menor grado, a problemas de fertilidad. Tales son los casos

de síndrome de Klinefelter, trisomía X y monosomía X.

- Edad materna avanzada, aborto de repetición de causa desconocida

y/o fallo de implantación: Más de la mitad de los casos son debidos a

alteraciones en los cromosomas 13, 16, 18, 21, 22, X e Y. En estos casos,

la selección de aquellos embriones normales para los cromosomas citados,

aumenta las probabilidades de conseguir una gestación a término.

- Factor masculino grave: Con este estudio embrionario, se pueden evitar

las alteraciones cromosómicas surgidas en la descendencia de aquellos

grupos de pacientes con calidad seminal baja y que tienen que recurrir a

la técnica de microinyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI).

Anomalías estructurales:

Surgen espontáneamente, en la mayoría de los casos, como consecuencia

de un fallo de meiosis durante la oogénesis o espermatogénesis, en los

casos en que los padres presentan cariotipos normales. Algunas veces,

algún miembro de la pareja puede ser portador de una anomalía estructural

equilibrada, que podría transmitir a su descendencia. De esta manera, por

medio del estudio genético específico de embriones de la pareja portadora,

podrían distinguirse aquellos embriones desequilibrados cromosómicamente

de los equilibrados. Una vez hecha esta selección de embriones, podrían

transferirse con total tranquilidad al útero materno los embriones que no

presentan la alteración génica. Para detectar translocaciones recíprocas se

aplica un FISH en metafase usando sondas teloméricas y centroméricas, de

manera que la ausencia de una señal del telómero indica que existe una

translocación, indistinguible con un FISH en interfase.

Una aplicación adicional del FISH en interfase es obtener mayor información sobre

la organización de los cromosomas en el núcleo interfásico (los llamados territorios

cromosómicos).

Además de ser útil para realizar diagnósticos preimplantatorios, el FISH tiene

aplicación en medicina para detectar enfermedades y determinar el pronóstico de

las mismas, así como para evaluar la remisión de algunas enfermedades, como el

cáncer. Con FISH es posible diagnosticar enfermedades incapaces de ser

detectadas por otros métodos tradicionales que implicaban el análisis de

cromosomas en metafase. Además su utilización es mucho más sencilla que los

métodos citogenéticos más habituales, los cuales requieren células en división, así

como un mayor esfuerzo en tiempo y trabajo para la preparación manual y análisis

de las muestras.

También puede utilizarse para la detección directa de patógenos a partir de sangre

o restos de tejidos de un paciente. Esto supone una gran ventaja teniendo en

cuenta que muchos microorganismos no son cultivables en condiciones de

laboratorio.

El FISH también se usa para comparar genomas de dos especies biológicas y

deducir relaciones evolutivas. Asimismo, se puede usar en el área de la Ecología

Microbiana para identificar microorganismos dentro de un biofilm (ecosistema

microbiano organizado), así como para observar su distribución y localización

dentro del biofilm o realizar ensayos de co localización utilizando sondas de

distinto color para cada microorganismo.

CONCLUISONES

El bandeo cromosómico consiste en someter a los cromosomas a

desnaturalización o digestión enzimática o ambos, seguido de una tinción con un colorante especifico de ADN, haciendo que los cromosomas se tiñan en una serie de bandas, tanto claras como oscuras.

Hay diferentes tipos de bandas:- Bandas Q- Bandas G- Bandas R- Bandas T- Bandas C- Bandas NOR

Las tinciones o métodos de las bandas son:

- Bandas Q = tinción con quinacrina- Bandas G = tinción con Giemsa- Bandas R = varios métodos - Bandas T = varios métodos - Bandas C = tinción con Giemsa/ extracción de ADN y proteínas.- Bandas NOR = tinción con plata (Ag).

Las bandas cromosómicas han permitido formar mapas caracterizando

especies demostrando que cambios en estos patrones se pueden expresar como una mutación la que puede producir la muerte, pérdida de capacidad reproductiva o generar una enfermedad hereditaria.

BIBLIOGRAFIA

1. Juan Ramon Lacadena. CITOGENÉTICA. 1° Ed. Marzo 1996. EDITORIAL COMPLUTENSE. Madrid- España.

2. Jorde Carey Bamshad. GENÉTICA MÉDICA. 4°Ed. 2010. EDITORIAL ELSEVIER. España

3. 3http://datateca.unad.edu.co/contenidos/203023/MATERIAL_EN_LINEA/

CURSO%20203023/CIOTGENETICA%20APLICADA%20AL

%20MEJORAMIENTO/leccin_17_bandeo_cromosmico.html

4. http://morfocitologia.blogspot.com/2009/12/citogenetica-y-bandeo-

cromosomico-la.html

http://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan%201997/temarios/671111d-

archivos/fundamentos/SEMINARIO%203.PDF

http://www.iqb.es/monografia/fichas/ficha033.htm

http://www.biocancer.com/journal/1379/422-hibridacion-in-situ-fluorescente-fish

http://es.wikipedia.org/wiki/Hibridaci%C3%B3n_fluorescente_in_situ

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/001317.htm

http://es.wikipedia.org/wiki/Biopel%C3%ADcula