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REPRODUCCION DEL ESMALTE DENTAL CARIADO A PARTIR DE DENTINA DESPROTEINIZADA

Autor: Romeo Guillén, Ana María. Director: Vennat, Elsa. Entidad Colaboradora: École Centrale Paris. RESUMEN DEL PROYECTO

I. INTRODUCCION El objeto del presente proyecto busca reproducir el esmalte de dientes con caries para probar, a través de una serie de técnicas de desproteinizado y ensayos mecánicos, su resistencia después de la infiltración de resina. Según algunos estudios, la dentina desproteinizada parece ser el medio que reproduce de la forma más fiable dicho esmalte con caries. Se trata concretamente de un estudio de la dentina bovina, debido a la gran similitud que esta presenta con la dentina humana, con el objetivo de analizar su comportamiento frente a la infiltración de resina. Este trabajo se inspira en la tesis doctoral “Estudio de los mecanismos de infiltración en medio mineral natural poroso: aplicaciones odontológicas”. Lo que se persigue con esto es el acercamiento a nuevas técnicas para el tratamiento de caries. Es por eso que primero se estudia la dentina con caries como medio mineral natural poroso, las características que presenta, y luego se pasa a la inflitración de resina en este caso Todo lo realizado en este estudio será de gran utilidad para la tesis de Maud Dennis, y por consiguiente para el acercamiento a nuevas técnicas odontológicas para el tratamiento de caries. II. METODOLOGIA

a) OBTENCION/PREPARACION DE MUESTRAS Lo primero es la obtención del esmalte cariado humano. Los dientes humanos son similares morfológica e histológicamente a los de algunos mamíferos, pero los dientes bovinos concretamente presentan algunas características especiales como son: la composición histológica y su forma anatómica, que entre otras características, los hacen ideales para su utilización como sustitutos de los dientes humanos en investigaciones sobre materiales dentales. Por tanto, debido a las dificultades a la hora de conseguir dentaduras humanas, en este estudio se usan dientes de bovino en sustitución de los humanos. [1] Con dos mandíbulas de ternero se obtienen los dientes necesarios para el posterior análisis de los mismos. Se extraen los dientes cuyo aspecto parezca adaptarse mejor

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a la formación de “rodajas”. Se pulen estos dientes en la medida de lo posible para que las muestras obtenidas tengan un contenido exclusivamente de dentina. Debido a las grietas que suelen presentar los dientes, la obtención de “rodajas” por medio de un corte perpendicular al eje del diente proporciona resultados mediocres, “rodajas” poco compactas y con muchos agujeros. Sin embargo, un corte paralelo al eje del diente produce “rodajas” conformes a lo esperado, aunque en cantidad menor.

b) OBSERVACION MEB (antes de la desproteinización del esmalte) Estas muestras o “rodajas” se observan con el Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) (Figura 1) para estudiar la estructura tubular de la dentina.

Figura 1. Imágenes obtenidas con el Microscopio Electrónico de Barrido del esmalte bovino

c) TRATAMIENTO PREVIO CON SOLUCIONES ACIDAS

d) DESPROTEINIZACION POR TRATAMIENTO TERMICO A 600ºC Y A 800º

e) OBSERVACION MEB (después de la desproteinización ) Al observar las muestras después del tratamiento térmico, se percibe que las fibras de colágeno de la dentina desaparecen dejando una sólida huella en ellas. Los cristales de hidroxiapatita de la dentina se desarrollan en torno a las fibras de colágeno y aún cuando estas son eliminadas, se puede todavía visualizar la forma de estos cristales y el lugar que ocupaban.

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f) POROSIMETRIA DE MERCURIO PARA MEDIR LA EFICACIA DE LA DESPROTEINIZACION La porosimetría de mercurio es una de las técnicas más fiables para determinar de un modo cuantitativo la estructura porosa (volumen y talla de los poros) de un material. En este caso, se trata de estimar la porosidad del diente después de la desproteinización y de medir así su eficacia. Este método consiste en medir la cantidad de mercurio que puede ser introducida en los poros de las muestras a diferentes presiones, hablamos de intrusión de mercurio. Teniendo en cuenta que para hacer ingresar el mercurio en los poros más pequeños se requiere una mayor presión, para cada presión aplicada se obtiene un volumen de mercurio ingresante. Con el valor de la presión se obtiene el tamaño de poro mediante la Ecuación de Washburn. [2] En este estudio se realizan 6 tests de porosimetría: 3 tests en muestras cocidas a 600º y 3 tests en muestras cocidas a 800º

g) ENSAYOS MECANICOS

Por último, se llevan a cabo una serie de ensayos mecánicos en las muestras bovinas para poder determinar el módulo de Young (módulo de elasticidad) y propiedades mecánicas de la dentina.

• Nanoindentación • Ensayo brasileño

o Ensayo de tracción por flexión o Ensayo de tracción por hendimiento o Ensayo de tracción directa

III. RESULTADOS

De los seis tests de porosimetría realizados (Tabla 2) se obtienen los siguientes resultados:

Porosidad (%) 600º 800º T1 54,96 53,02 T2 53,8 51,69 T3 55,05 50,31

Tabla 2. Tests de porosimetría

La porosidad es por lo tanto muy similar para las dos temperaturas, sin embargo la porosimetría confirma lo que se remarca durante la observación microscópica (MEB): el diámetro medio de los poros a 600º (0.027 !!) es muy inferior al diámetro medio de los poros a 800º (0,10 !!). De este modo, la temperatura de cocción influye fuertemente en la estructura porosa resultante (Gráfico 3 y Gráfico 4).

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Gráfico 3. Resultado de la porosimetría en una muestra cocida a 600º y a 800º

Gráfico 4. Talla de los poros en la muestra

En conclusión, aunque la porosidad final de las muestras sea la misma, la temperatura del tratamiento térmico tiene una gran influencia en la estructura porosa del material después de la desproteinización.

! Porosimétrie au mercure pour mesurer l’efficacité de la déprotéinisation

La porosimétrie au mercure est l’une des techniques les plus fiables pour déterminer de manière quantitative la structure poreuse (volume et taille des pores) d’un matériau. Il s’agit dans ce cas d’estimer la porosité de la dent après déprotéinisation et de mesurer ainsi l’efficacité de cette déprotéinisation. Cette méthode est basée sur la mesure de la quantité de mercure qui peut-être insérée dans les pores de l’échantillon à différentes pressions, on parle d’intrusion du mercure. L’accumulation de pression est essentielle à l’analyse : un certain temps est toujours nécessaire pour atteindre un certain équilibre lors du remplissage des pores. C’est ce temps qui varie en fonction du diamètre, de la forme et de la complexité du réseau de pores et qui va donc permettre de les déterminer. On a réalisé 6 tests de porosimétrie :

3 tests sur des échantillons cuits à 600º 3 tests sur des échantillons cuits à 800o

Résultats Porosité (%) 600º 800º T1 54,96 53,02 T2 53,8 51,69 T3 55,05 50,31 La porosité est donc similaire aux deux températures, cependant la porosimétrie confirme ce qui avait déjà été remarqué lors de l’observation microscopique : le diamètre moyen des pores à 600º (0.027 !") est très inférieure à celui à 800º (0,10 !"). La température de cuisson influence donc fortement la structure poreuse résultante Ci-dessus, les courbes correspondant à ces essais de porosimétrie pour chacune des températures.

0,00E+00!5,00E502!1,00E501!1,50E501!2,00E501!2,50E501!3,00E501!3,50E501!4,00E501!4,50E501!

0,0!

0,0!

0,1!

0,1!

0,2!

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0,6!

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2,3!

4,4!

8,3!

1,6!

3,1!

5,9!

0,0!

1,7!

Intrusion)cumulée)(m

L/g))

Pression)(MPa)))

Résultat)de)la)porosimétrie)sur)l'échantillon)cuit)à)600º)et)à)800º)

600º!800º!

La relation entre la pression mesurée P et le diamètre des pores d vient donnée par :

! = !− 4!!!!"#$! avec !! = 485 mN/m (tension de surface) et != 130, il s’agit des paramètres de réglage par défaut de la machine. Les courbes confirment donc les remarques faites précédemment. La taille des pores pour l’échantillon traité à 800º est soit très petite (0,44 µm), soit très grande (100 µm) alors que l’échantillon traité à 800º présente des pores d’environ 0,12 µm. En conclusion, bien que la porosité finale des échantillons traités soit la même, la température du traitement thermique a une grand influence sur la structure poreuse du matériaux après déprotéinisation.

III. Essais mécaniques Bien que finalement non réalisés sur les échantillons bovins, ci-dessous la description théorique des essais mécaniques classiques permettant la détermination du module de Young et des propriétés mécaniques de la dentine.

o Nano indentation [5]

Principe : on presse un objet de grande dureté et de géométrie connue (pyramide à trois faces : Berkovich) contre la surface du matériau à tester. On parle de nano indentation quand la charge mise en jeu est inférieure à 1 N.

0,00E+00!

2,00E502!

4,00E502!

6,00E502!

8,00E502!

1,00E501!

1,20E501!

1,40E501!

Intrusion)(mL/g))

taille)des)pores)(nm))

Tailles)des)pores)dans)l'échantillon)

600º!800º!

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IV. CONCLUSIONES

Este proyecto se aproxima por tanto a nuevos tratamientos de las caries con infiltración de resina. Se reproduce de la manera más precisa posible los dientes con caries de los humanos y se realizan sobre ellos una serie de pruebas cuyos resultados ayudarán a Maud Denis en sus tesis doctoral. En cuanto a los ensayos mecánicos para hallar las propiedades de la dentina, se encuentran en internet una serie de datos muy similares a los obtenidos experimentalmente comparando los dientes bovinos con los humanos (Tabla 5) , como se puede distinguir en la tabla de abajo. [3] UTS (MPa) Módulo de Young (MPa) Dentina humana 93,8 ± 11,1 19,3 ± 5,4* Dentina bovina 90,6 ± 18,9 14,7 ± 5,9 Dentina humana desmineral. 29,6 ± 5,9 0,25 ± 0,7 Dentina bovina desmineral. 26 ± 11 0,26 ± 0,12

Tabla 5. Tabla comparativa ensayos mecánicos entre dentina humana y bovina.

Del mismo modo, a través de los tratamientos térmicos para la desproteinización , se observa un cierto comportamiento de la dentina que servirá de mucha ayuda para la futura búsqueda de nuevos tratamientos odontológicos. Este trabajo, además de que pone en práctica ciertas aptitudes y conocimientos mecánicos, posee un gran vínculo con la rama de la medicina y la investigación, lo cual aporta un atractivo y un interés suplementario para cualquier persona humana.

V. REFERENCIAS

[1] Elsa Vennat, n.d. Dentin: my review. (Description et propriétés mécaniques de la de dentine) [2] Porosimétrie au mercure, n.d. France scientifique (http://www.france- scientifique.fr/produits/caracterisation-des-poudres-et-des-surfaces/porosimetrie- au-mercure.html ) [3] Sano, H., Ciucchi, B., Matthews, W.G., Pashley, D.H., 1994. Tensile Properties of Mineralized and Demineralized Human and Bovine Dentin. J DENT RES 73, 1205–1211. (Comparaison des propriétés mécaniques entre la dentine bovine et humaine avant et après déminéralisation)

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REPRODUCTION OF THE DENTAL ENAMEL WITH CAVITIES THROUGH DENTIN DEPROTEINIZED

Author: Romeo Guillén, Ana María. Director: Vennat, Elsa. Collaborating Entity: École Centrale Paris. PROJECT SUMMARY

I. INTRODUCTION The purpose of this project seeks to reproduce the enamel of teeth with cavities to prove, through a series of techniques of deproteinization and mechanical tests, its resistance after resin infiltration. According to some studies the deproteinized dentin seems to be the medium that reproduces in the most reliable way that enamel with caries. This is particularly a study of bovine dentin, due to the great similarity that this presents to human dentin, with the aim to analyze their behavior against resin infiltration. This project is based on the doctoral thesis "Study of the mechanisms of infiltration into porous natural mineral medium: dental applications." What is sought in this work is the approach to new techniques for the treatment of caries. That's why the dentine with caries is studied as a natural mineral porous medium before analyzing its performance with the infiltration of resin. Everything done in this study will be useful for the dissertation of Maud Dennis, and thus for the approach to new techniques for treating dental caries.

II. METHODOLOGY

a) SAMPLE EXTRACTION AND PREPARATION Human teeth are morphologically and histologically similar to those of mammals. Particularly bovine teeth have some special features such as: histological composition and its anatomical shape, which among other features make them ideal for use as substitutes for teeth humans in research on dental materials. Therefore, due to the difficulty of getting human teeth, in this study bovine teeth are used in replacement of human teeth. [1]

With two teeth calf jaws we obtain the amount of teeth needed for the subsequent analysis. Those teeth whose appearance seems best adapted to the formation of "slices" are extracted. These teeth are polished to the extent possible so that the samples obtained contain exclusively dentin.

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Since teeth usually present cracks, obtaining "slices" through a cut perpendicular to the tooth axis provides mediocre results and "slices" little compact with many holes. However, a cut parallel to the tooth axis produce "slices" conformed to expectations, although in smaller amounts.

b) SEM OBSERVATION (before the enamel deproteinization) These samples or "slices" are observed with the Scanning Electron Microscope (SEM) (Figure 1) to study the tubular structure of dentin.

Figure 1. Images of the bovine enamel obtained with the Scanning Electron Microscope (SEM)

c) PRE-TREATMENT WITH ACID SOLUTIONS

d) DEPROTEINIZATION BY HEAT TREATMENT AT 600º AND 800º

e) SEM OBSERVATION (after deproteinization )

By observing the samples after the heat treatment, it is perceived that the collagen fibers of the dentin disappear leaving a solid mark therein. The hydroxyapatite crystals of dentin develop around the collagen fibers and even when these fibers are removed, you can still see the shape of these crystals and the place they used to occupy.

f) MERCURY POROSIMETRY TO MEASURE THE EFFECTIVENESS OF THE

DEPROTEINIZATION Mercury porosimetry is one of the most reliable techniques for determining in a quantitative way the porous structure ( pore volume and size ) of a material. In this case, the aim is to estimate the porosity of the tooth after deproteinization and thus

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the effectiveness of this deproteinization. This method is based on measuring the amount of mercury which can be inserted into the pores of the samples at different pressures, talking about mercury intrusion. Taking into account that in order to make the mercury enter the smaller pores, a greater pressure is required and for each pressure applied a volume of mercury is obtained. With the pressure value and the Washburn equation the pore size is calculated. [2] In this study, 6 porosimetry tests are performed: 3 tests in samples cooked at 600 ° and 3 tests in samples cooked at 800 °.

g) MECHANICAL TESTING

Finally, a serie of mechanical tests are conducted in the bovine samples in order to determine the Young's modulus (modulus of elasticity) and some mechanical properties of the dentin.

• Nanoindentation • Brazilian test

o Tensile test by flexion o Tensile test by splitting o Direct tensile test

III. RESULTS

From the six porosimetry tests performed (Table 2), the following results are obtained: Porosity (%) 600º 800º T1 54,96 53,02 T2 53,8 51,69 T3 55,05 50,31

Table 2. Porosimetry tests

The porosity is therefore very similar for the two temperatures, however porosimetry confirms what stresses during the microscopic observation (SEM): the average pore diameter at 600º (0.027 µ!) is far below the average diameter of the pores at 800 ° (0.10 µ!). Thus, the baking temperature strongly influences on the resulting porous structure. (Figure 3. and Figure 4.)

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Figure 3. Porosimetry results on the sample cooked at 600º and 800º

Figure 4. Pore size in the sample

In conclusion, although the final porosity of the samples is the same, the heat treatment temperature has a great influence on the pore structure of the material after its deproteinization.

! Porosimétrie au mercure pour mesurer l’efficacité de la déprotéinisation

La porosimétrie au mercure est l’une des techniques les plus fiables pour déterminer de manière quantitative la structure poreuse (volume et taille des pores) d’un matériau. Il s’agit dans ce cas d’estimer la porosité de la dent après déprotéinisation et de mesurer ainsi l’efficacité de cette déprotéinisation. Cette méthode est basée sur la mesure de la quantité de mercure qui peut-être insérée dans les pores de l’échantillon à différentes pressions, on parle d’intrusion du mercure. L’accumulation de pression est essentielle à l’analyse : un certain temps est toujours nécessaire pour atteindre un certain équilibre lors du remplissage des pores. C’est ce temps qui varie en fonction du diamètre, de la forme et de la complexité du réseau de pores et qui va donc permettre de les déterminer. On a réalisé 6 tests de porosimétrie :

3 tests sur des échantillons cuits à 600º 3 tests sur des échantillons cuits à 800o

Résultats Porosité (%) 600º 800º T1 54,96 53,02 T2 53,8 51,69 T3 55,05 50,31 La porosité est donc similaire aux deux températures, cependant la porosimétrie confirme ce qui avait déjà été remarqué lors de l’observation microscopique : le diamètre moyen des pores à 600º (0.027 !") est très inférieure à celui à 800º (0,10 !"). La température de cuisson influence donc fortement la structure poreuse résultante Ci-dessus, les courbes correspondant à ces essais de porosimétrie pour chacune des températures.

0,00E+00!5,00E502!1,00E501!1,50E501!2,00E501!2,50E501!3,00E501!3,50E501!4,00E501!4,50E501!

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Intrusion)cumulée)(m

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Pression)(MPa)))

Résultat)de)la)porosimétrie)sur)l'échantillon)cuit)à)600º)et)à)800º)

600º!800º!

La relation entre la pression mesurée P et le diamètre des pores d vient donnée par :

! = !− 4!!!!"#$! avec !! = 485 mN/m (tension de surface) et != 130, il s’agit des paramètres de réglage par défaut de la machine. Les courbes confirment donc les remarques faites précédemment. La taille des pores pour l’échantillon traité à 800º est soit très petite (0,44 µm), soit très grande (100 µm) alors que l’échantillon traité à 800º présente des pores d’environ 0,12 µm. En conclusion, bien que la porosité finale des échantillons traités soit la même, la température du traitement thermique a une grand influence sur la structure poreuse du matériaux après déprotéinisation.

III. Essais mécaniques Bien que finalement non réalisés sur les échantillons bovins, ci-dessous la description théorique des essais mécaniques classiques permettant la détermination du module de Young et des propriétés mécaniques de la dentine.

o Nano indentation [5]

Principe : on presse un objet de grande dureté et de géométrie connue (pyramide à trois faces : Berkovich) contre la surface du matériau à tester. On parle de nano indentation quand la charge mise en jeu est inférieure à 1 N.

0,00E+00!

2,00E502!

4,00E502!

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8,00E502!

1,00E501!

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Intrusion)(mL/g))

taille)des)pores)(nm))

Tailles)des)pores)dans)l'échantillon)

600º!800º!

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IV. CONCLUSIONS

This project therefore approaches to new treatments for teeth cavities with resin infiltration.

The decayed teeth of humans are reproduced as precisely as possible, some mechanical tests are performed on these teeth and their results will help Maud Denis with her doctoral thesis. Regarding these results, on the Internet there are some similar figures comparing both teeth (human and bovin teeth). (Table 5). [3]

UTS (MPa) Young’s modulus (MPa) Human dentine 93,8 ± 11,1 19,3 ± 5,4* Bovine dentine 90,6 ± 18,9 14,7 ± 5,9 Human dentine demineral. 29,6 ± 5,9 0,25 ± 0,7 Bovine dentine demineral. 26 ± 11 0,26 ± 0,12

Table 5. Comparison table of some mechanical tests made with human dentin and with bovine dentin.

Similarly, after the heat treatment for deproteinization, it is noticed a certain behavior of the dentin that will be very helpful for future findings of new dental treatments This work, in addition to embodying certain skills and mechanical knowledge, has a great bond with the branch of medicine and research, which provides an attractive and an additional interest to any individual.

IV. REFERENCES

[1] Elsa Vennat, n.d. Dentin: my review. (Description et propriétés mécaniques de la de dentine) [2] Porosimétrie au mercure, n.d. France scientifique (http://www.france- scientifique.fr/produits/caracterisation-des-poudres-et-des-surfaces/porosimetrie- au-mercure.html ) [3] Sano, H., Ciucchi, B., Matthews, W.G., Pashley, D.H., 1994. Tensile Properties of Mineralized and Demineralized Human and Bovine Dentin. J DENT RES 73, 1205–1211. (Comparaison des propriétés mécaniques entre la dentine bovine et humaine avant et après déminéralisation)

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