Automatización en hematología
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AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA
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AUTOMATIZACIÓN
EN HEMATOLOGÍA
AUTOMATIZACION
Mecanizar todo o la mayoría de los pasos manuales en un proceso o en
todo el procedimiento
“Es una solución que combina varios procesos en un solo sistema eficiente que elimina el riesgo de error asociado a la
operatividad humana. Las tareas intensivas en trabajo : etiquetado, manejo, preparación y almacenamiento de las
muestras, que se realizan utilizando numeroso personal, cada uno de los cuales pueden introducir errores u otros problemas, pueden ser fácilmente automatizables” 1
1 JAMES,David “Selecting appropiate automation for the lab” IDVT Sep. 2007
PROCESO
Es un conjunto de actividades
que utiliza recursos para
transformar elementos de
entrada en bienes o servicios
capaces de satisfacer las
expectativas de distintas partes
interesadas: clientes externos,
clientes internos, accionistas,
comunidad, etcétera.
PROCESO
PRINCIPALES RECURSOS
MANO DE OBRA: Protagonista de todo
proceso, por lo tanto sus actividades y
aptitudes influyen directamente en los
resultados o salidas del proceso.
MÉTODOS: Políticas, procedimientos,
normas e instrucciones que se emplean para
ejecutar un determinado trabajo.
MAQUINARIA O EQUIPO: Viene a ser el
elemento que complementa el esfuerzo del
personal en la agregación de valor. Su
adecuada calibración, correcto
mantenimiento y oportuno reemplazo
definirán apropiados niveles de precisión y
exactitud.
PROCESO
PRINCIPALES RECURSOS
MATERIALES O SUMINISTROS:
Entradas que serán
transformadas por un proceso
(materiales, partes en proceso y
la información).
MEDIO AMBIENTE: Condiciones
en las cuales se desarrolla un
trabajo: espacio, ventilación,
seguridad, iluminación, etcétera.
MEDIOS DE CONTROL:
Instrumentos o recursos utilizados
para evaluar el cumplimiento de
los requisitos establecidos.
ENFOQUE BASADO EN PROCESOS
DIVISIONES DEL PROCESO
DE ANALISIS
TOMA DE
MUESTRA
TRANSPORTE
DE LA
MUESTRA
RECEPCION
POR EL
LABORATORIO
MUESTRA PARA
ANALISIS
MUESTRA PARA
ALMACENAMIENTO
ANALISIS
CONTROL DE
CALIDAD
EMISION
DE RESULTADOS
EVALUACION DE
LOS RESULTADOS
MANTENIMIENTO
Y/O REPARACION
DEL ANALIZADOR
ORDEN DE
ANALISIS
PREPARACION
DE LA
MUESTRA
FASE
PREANALITICA
FASE
ANALITICA
FASE
POSTANALITICA
CRITERIOS PARA EVALUAR LA
AUTOMATIZACIÓN
Complejidad del nivel hospitalario
Volumen de trabajo ( Rutina y Especiales )
Visión de futuro ( Perspectivas )
Infraestructura
Recursos Económicos
Soporte Técnico Garantizado
¿PORQUÉ AUTOMATIZAR?
Reducir costos operativos
Obtener mayor eficiencia
Aumentar la productividad
Competir en un ambiente globalizado
Sobrevivir en el mercado
¿QUÉ BUSCAN LOS
LABORATORIOS HOY?
Mejor productividad y mejor calidad
Flujo de muestras mas rápido y eficiente
Reducción de costos
AUTOMATIZACIÓN
VENTAJAS
Incremento del número de pruebas realizado por
una persona en un período de tiempo
Minimiza las variaciones en los resultados
Minimiza errores de la parte manual (e.g.
pipeteo)
Usa menos muestra y reactivo por cada prueba
AUTOMATIZACIÓN
LIMITACIONES
Metodología varía con el tipo de instrumento
Costo del equipo, mantenimiento, CC
Personal debe conocer operatividad y
cuidados de rutina
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Sangre total con anticoagulante EDTA K2 (K3)en
tubo al vacío
ELEMENTOS CELULARES
PRINCIPIOS BÁSICOS
Impedancia electrónica
Radiofrecuencia
Dispersión óptica
IMPEDANCIA ELECTRÓNICA
(PRINCIPIO COULTER)
Electrodo interno
Electrodo externo
Flujo del diluyente
Vacío regulado
Cubeta
de conteo
Micro orificio
Diámetro apertura aprox. 4mm
1 pulso =
1 partícula
DISCRIMINACION DE PULSOS
a = Ruido Eléctrico
b = Discriminador bajo
c = Separación de
células grandes y
pequeñas
a b
c
Señal células grandes
Señal células
pequeñas
60 70 80 90 100 110 120 fl
Pilas: Células son
agrupadas con similar tamaño
de pulso.
La Pila con el mayor número
de células es el 100% de altura
relativa.
Eje X = tamaño celular
Eje Y= número de células
HISTOGRAMAS
RADIOFRECUENCIA
( impedance)
Conductividad (RF) – proporcional
a la densidad interior de la célula
(gránulos y núcleo)
DISPERSIÓN ÓPTICA
Desvía la luz
•Cel. en solución corren a través de una
celda de cuarzo
•Enfoque hidrodinámico (líquido
envolvente, “flujo laminar”)
•Enfoque del láser
•Análisis por computadora de los grupos
(citogramas)
ABBOTT - MAPSS
(MULTI ANGLE POLARIZED SCATTER
SEPARATION)
Numeración
Tamaño
Complejidad del núcleo
Láser ARGON
7°
0°
90°, Polarizado
PMT2
Complejidad
del citoplasma
Granulaciones
Eosinófilos
90° ,Depolarizado
PMT1
Parte Inf. (fija)
Pipeta
VÁLVULA DE
SEGMENTACIÓN
Parte Int. (movible)
Parte sup. (fija)
VÁLVULA DE
SEGMENTACIÓN
Parte sup. (fija)
Parte Inf. (fija)
Pipeta
Parte Int. (movible)
Parte Int. (movible)
Parte sup. (fija)
Parte Inf. (fija)
Pipeta
VÁLVULA DE
SEGMENTACIÓN
SEPARACIÓN DE LA
MUESTRA
12µl (WBC) 4 µl (RBC)
6 µl (Hb)
DILUCIÓN - RBC
Bomba del diluyente
Cámara de mezcla
4 µl (RBC)
DILUCIÓN WBC - HGB
12µl (WBC)
6 µl (HGB)
Bomba del Diluyente
Bomba de HGB
Canal WBC
Celda HGB
Stromatolyser-3WP
Sulfolyser
Mixing- Chamber 1:500
Sam
ple
Roto
r Valv
e
(SRV)
RBC Channel 1:25.000
40 µl
2,0 ml Cellpack
Stromatolyser-3WP
Sulfolyser
Mixing- Chamber 1:500
Sam
ple
Roto
r Valv
e
(SRV)
WBC Channel 1:250
1,0 ml
0,5 ml
6 µl
Cellpack
Stromatolyser-3WP
Sulfolyser
Mixing- Chamber 1:500
Sam
ple
Roto
r Valv
e
(SRV)
Hgb Photometer 1:500
3 µl 1,0 ml
0,5 ml
Cellpack
HISTOGRAMA WBC
Discriminadores
posicionados en el
pico y valle para
separar las células
Células clasificadas
como: Neutrofilos,
Linfocitos y Mixtas
(M, E y B)
Altura
rela
tiva
LD T1 T2 UD
Células mixtas
(Monos, Eos y
Basos)
Células grandes
(neutrófilos)
Células pequeñas
(linfocitos)
MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA
• RBC son lisados (amonio cuaternario, ferricianuro, etc.), permite la
liberación de Hb CianMetHb
• Una parte de la dilución de los WBC pasa a una cubeta
espectrofotométrica para la medición a 540 nm
• Existen otros métodos libres de cianuro, donde ocurre lísis de los
RBCs seguido de la formación de un complejo imidazol-hemoglobina
que posee un pico de absorción a 540 nm.
Fuente luminosa LED
C. de medición
Filtro
Foto-detector
• Aglutininas frías:
• Bajos contajes de RBC y altos MCV pueden ser causados
por las aglutininas de los hematíes. Si están presentes,
también el hematocrito y los MCHCs pueden ser también
incorrectos.
• Pueden presentarse en la mononucleosis infecciosas y en las
infecciones por mycoplasma (neumonía).
• Si se observan RBC aglutinados en el frotis de sangre
periféricas, calentar la muestra a 37°C, mezclarla y analizarla
mientras esté caliente.
FUENTES DE ERROR
• RBC fragmentados o microcíticos:
• Pueden causar conteos bajos de RBC y pueden dar
un aviso en el conteo de las plaquetas puesto que se
vuelven muy cercanas al tamaño de las plaquetas y
pueden originar un histograma plaquetario anormal.
• Acúmulo de plaquetas y satelitosis:
• Esto causa un conteo falsamente disminuido de las
plaquetas y se puede confirmar revisando el frotis.
Siempre tratar de examinar el borde del frotis cuand
se tienen contajes bajos de plaquetas.
• Plaquetas gigantes:
• Se aproximan al tamaño de un hematíe.
Pueden causar que la cola derecha del
histograma permanezca elevada y pueda
verse a la izquierda del histograma de los
RBC.
RBC Nucleados:
Estos pueden interferir con los WBC en
algunos instrumentos y ser contados como
leucocitos(linfocitos)
• Cualquier elemento que pueda causar turbidez
e interferir con el método espectrofotométrico.
• Como ejemplos: Alto contaje de WBC, lipemia y
hemoglobinas resistentes a la lisis (Hb S y C)
FUENTES DE ERROR EN LA MEDICIÓN DE
LA HEMOGLOBINA
• HISTOGRAMA RBC
– Histograma normal de 36- 360 fl – (24- 36 fl ) Aviso puede deberse:
1- RBC fragmentos
2- WBC fragmentos
3- Plaquetas gigantes
4- Microcitos
– Desviación a la derecha:
- Leucemia
- Anemia Macrocítica
- A. Megaloblastica
– Desviación a la izquierda:
- Anemia microcítica
– Bimodal
- Aglutininas frías
- Anemia Megaloblástica con transfusión.
- A. Sideroblástica.
– Trimodal
- Anemia con transfusión.
• HISTOGRAMA PLAQUETAS
– Histograma normal de 2-20 fl.
• 0-2 fL
– Burbujas de aire
– Polvo
– Ruido eléctrico
• > 20 fL
– Microcitos
– Scishtocitos
– Fragmentos WBC
– Plaquetas gigantes
– Aglutinación
Luz dispersada frontal
( Volumen Celular )
Luz dispersada lateral
(Estructura celular interna)
WBC
Canal WBC/Baso
Baso
Side scatter
Fo
rwa
rd s
catt
er
RBC ghost
Mono
Canal Diff
Side scatter
Lymph Neut + Baso
RBC ghost
Flu
ore
scen
ce
Eo
Canal DIFF
DISPERSIÓN LATERAL
(Estructura Celular Interna)
FL
UO
RE
SC
EN
CIA
(in
form
ac
ión
de
l R
NA
/ D
NA
)
LINFOCITOS
MARCAJE DE CD4/CD8
BECKMAN COULTER
• Principios de Medición
– Medición directa:
• RBC – Impedancia
• WBC - Impedancia, enfoque
hidrodinámico
• Plaq. – Impedancia (2-20 fl)
• Hb – Cianometamoglobina modificado
(525 nm)
• MCV – media del volumen de RBC
(histograma)
– Medición indirecta:
• Hct, MCHC, y MCH (calculados)
– RDW y MPV (CV de sus respectivos
histogramas)
– WBC Diferencial
• VCS – volumen, conductividad,
dispersión
– Reticulocitos
• Coloración Supravital (nuevo azul de
metileno)
• VCS
SYSMEX
• Principios de Medición
– Medición directa:
• RBC – Impedancia, enfoque hidrodinámico
• WBC – Impedancia, enfoque hidrodinamico
• Platelets –Impedancia, enfoque hidrodinamico
• Hb – SLS-Hb (555 nm) (oxihemoglobina + sodio lauril sulfato)
• Ht – Detección de pulsos acumulativos
– Medición indirecta:
• MCV, MCHC y MCH (calculados)
– RDW y MPV(CV de sus respectivos histogramas)
– WBC Diferencial
• Detección con DC/RF
• Emplea lísis diferencial
– Reticulocitos
• Colorante Supravital (Aramina O)
• Detección Fluorescente
ABBOTT
• Principios de Medición
– Medición directa:
• RBC – Impedancia
• WBC – Dispersión óptica (primaria), Impedancia (secondaria)
• Plaquetas – Impedancia (2-30 fl)
• Hb – Cianomethemoglobina modificada (540 nm)
• MCV – volumen medio de RBC (histograma)
– Medición Indirecta:
• Hct, MCHC y MCH (calculados)
– RDW (valor relativo equivalente al CV)
– WBC Diferencial
• MAPSS
– Reticulocitos
• Coloración proprietaria
• Dispersión Multiángulo
• Detección Fluorescente
SIEMENS • Principios de Medición
– Medición directa:
• RBC – Enfoque hjdrodinámico, láser de bajo y alto ángulo
• WBC - Enfoque hjdrodinámico, dispersión óptica y absorpción
• Platequetas – Enfoque hidrodinámico, láser de ángulo bajo y alto(1-60 fL)
• H¡b – Cianomethemoglobina modificada (546 nm)
• MCV – volumen medio de RBC (histograma)
– Medición indirecta:
• Ht, MCHC y MCH (calculados)
– RDW y MPV (CV de sus respectivos histogramas)
– WBC Diferential
• VCS – volumen, conductividad, dispersión
– Reticulocitos
• Coloración Supravital (Oxazina 750)
• Dispersión óptica de bajo y alto ángulo
Pentra 120 Retic Horiba-ABX
Sysmex XT-4100i
CELL-DYN RUBY
Abbott Laboratories
LH 780
Beckman Coulter
CELL-DYN 3700
ADVIA 2120
SIEMENS
LH 1500 Series Automation Beckman Coulter
CELL-DYN WorkCell Abbott Laboratories
MANTENIMIENTO
• Limpieza diaria
• Conteo del lecturas de fondo
• Chequeos electrónicos
• Comparar los modos abierto y cerrado
(usando muestra normal)
• Correr controles (dentro de lo límites
especificados)
ASEGURAR FUNCIONAMIENTO
ADECUADO
1. Chequear los contenedores de reactivo:
Verificar cantidad suficiente
Verificar fecha de vencimiento
No deben visualizarse precipitados, ni
turbidez ni mostrar un color inusual
Conecciones adecuadas entre el
instrumento y los contendedores
2. Chequear contenedor de desecho:
Capacidad suficiente
Conecciones adecuadas
3. Realizar inicio diario
4. Verificar que exista una aceptable:
Reproducibilidad
Arrastre
Resultados de control
ASEGURAR FUNCIONAMIENTO
ADECUADO
HEMOSTASIA = BALANCE
plaquetas
Coagulación Fibrinólisis
Organismo
Hemorragia Trombosis
FASES DE LA HEMOSTASIA
• Hemostasia primaria
formación de un trombo plaquetario
• Coagulación o hemostasia secundaria
formación de un trombo de fibrina
• Fibrinólisis
rotura del coagulo de fibrina
Factores procoagulantes Factores anticoagulantes FXI
I FXIIa FXI
FXIa
FIX
FIXa FIXa
FXa
FVIIIa
FX
FVa
FII TROMBINA
Fibrinógeno Fibrina
FT
FVIIa
AT
PCa
PS
TFPI
Si hay déficit, HEMORRAGIA Si hay déficit, TROMBOSIS
CASCADA DE LA COAGULACIÓN
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Plasma con anticoagulante citrato trisódico
Na3C6H5O7 . 2H20 al 0.109 mol/L (3.2%)
Sangre venosa recolectada en un tubo
con citrato de sodio a una proporción de 1:10
( 1 parte de citrato y 9 partes de sangre).
Tiempo de compresión no mayor a 60 seg. Un
tiempo mayor puede elevar los valores de
fibrinógeno.
ALMACENAMIENTO DE LAS
MUESTRAS
Las muestras deben mantenerse a temperatura
ambiente (18 – 25°C). El almacenamiento en hielo
o en la nevera puede provocar la activación de los
factores VII y XII.
Estabilidad de las muestras (18 – 25°C) :
TP : 8 horas
APTT : 4 horas (terapia con heparina 2 horas)
Factores : 4 a 8 horas
CONGELAMIENTO DE LAS
MUESTRAS
Los plasmas libres de plaquetas se pueden
alicuotar y congelar.
El congelamiento se debe realizar tan pronto
como sea posible, de preferencia a –80°C;
es suficiente a –20°C si es por un período
corto ( 6 meses PT y APTT; 3 meses TT y
Factores).
Las muestras se deben descongelar a 37° C
por 15 minutos y sólo una vez.
PRUEBAS DE LABORATORIO
RUTINA
PT
APTT
T. TROMBINA
FIBRINÓGENO
ESPECIALES
FACTORES
TROMBOSIS
LA – AC. ANTICARDIOLIPINA
PROTEÍNA C
PROTEÍNA S
APC – R
ANTITROMBINA
FIBRINÓLISIS
DÍMERO D
PLASMINÓGENO
TPA (Activ.Plasm.Tisular)
PAI – 1 (Inhib.Act. Plasm.)
MÉTODO MANUAL
Detección por aparición del coágulo
MÉTODO MECÁNICO
Método del garfio de Koller
MÉTODO MECÁNICO
Método KC Amelung
Billa de metal estacionaria
MÉTODO
FOTOMÉTRICO
SISTEMA DE DETECCIÓN BASADO
EN LA VISCOSIDAD
La detección está basada en el incremento de la viscosidad del
plasma analizado.
El incremento de la viscosidad es medido a través del movimiento
de la billa de metal
Cuando se añade el reactivo,
inmediatamente se inicia la detección.
El cronómetro inicia la medición cuando la
billa inicia la oscilación de derecha a izquierda.
Cuando el coágulo aparece, la viscosidad se incrementa
y la amplitud disminuye.
MÉTODO
Coagulométrico: formación de fibrina
Fibrinógeno ----------------> Fibrina
Tiempo de Coagulación : Tiempo empleado
para detectar la formación de fibrina.
TROMBINA
turbidimetría
ANÁLISIS CENTRÍFUGO
Pipeteo automático de
muestra + reactivo.
Mezcla por centrifugación
Nefelometría hasta 1200
lecturas por cada
determinación (ej. TP)
Sistema Centrífugo
Reactivo
Muestra
Rotor
MÉTODO
• Cromogénico: incremento de color
Peptido-pNa ---------------> Peptido + pNa
ENZIMA
Color (Sust. Cromogénico)
Sustratos Cromogénicos
Luz transmitida
Cubeta de reacción Fuente de luz
405 nm
Detector 180º
MÉTODO
• Inmunológico: incremento de la turbidez
Plasma + reactivo de látex--> aglutinación
Reacción del antígeno presente en el plasma
con anticuerpo (unido a las partículas de
látex) específico al analito a estudiar.
turbidimetría
Reacción inmunológica
Luz transmitida
Cubeta de reacción Fuente de luz
671/405 nm
Detector 180º
Partículas de Latex con
anticuerpo sensible al
Dímero-D
Las partículas de látex se aglutinan, la
suspensión tiene mas absorbancia
INMUNOTURBIDIMETRIA INMUNOENSAYO TURBIDIMÉTRICO
Dímero-D ▬ Dímero-D +
Tiempo
CURVA DE REACCIÓN INMUNOTURBIDIMÉTRICA
Delta
Medida de la turbidez inicial y de la turbidez final
producida por la aglutinación de las partículas de
latex
Turbidez
(mAbs)
Inicial
Final
SIEMENS BCS XP
STA – COMPACT
STA – COMPACT
STA – COMPACT
ACL ELITE PRO
Fluídrica • Botella de 1 L de solución de
lavado/referencia con sensor nivel y medición de líquido en tiempo real.
• 2 dilutores de pistón para dispensado y aspiración de muestras/reactivos.
Inlet
T- Line
Centrifuga
Destapador
Outlet
Conexiones
Hematología Stockyard
