“ASOCIACIÓN DEL POLIMORFISMO 6986 A>G DE...
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UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS “ASOCIACIÓN DEL POLIMORFISMO 6986 A>G DE CYP3A5 Y EL NIVEL SÉRICO DE CICLOSPORINA EN PACIENTES CON TRASPLANTE RENAL” TESIS Que para obtener el grado de MAESTRÍA EN CIENCIAS MÉDICAS Presenta Médico Especialista en Nefrología, Margarita Ibarra Hernández Asesores D en C Caridad Leal Cortés Dr. Raúl López Ascencio Colima, Col., agosto del 2009
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UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
“ASOCIACIÓN DEL POLIMORFISMO 6986 A>G DE CYP3A5 Y EL NIVEL SÉRICO DE CICLOSPORINA EN PACIENTES CON TRASPLANTE RENAL”
TESIS Que para obtener el grado de
MAESTRÍA EN CIENCIAS MÉDICAS
Presenta
Médico Especialista en Nefrología, Margarita Ibarra Hernández
Asesores D en C Caridad Leal Cortés Dr. Raúl López Ascencio
Colima, Col., agosto del 2009
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UNIVERSIDAD DE COLIMA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
Colima, Col., a 17 de agosto de 2009.
Dr. Carlos Tene Director de la Facultad de Medicina Universidad de Colima
Presente. Estimado Dr. Tene:
Los abajo firmantes, asesores de la tesis: “ASOCIACIÓN DEL POLIMORFISMO 6986 A>G DE CYP3A5 Y EL NIVEL SÉRICO DE CICLOSPORINA EN PACIENTES CON TRASPLANTE RENAL”, que ha desarrollado la Médica Especialista Margarita Ibarra Hernández, hacemos constar que después de las correcciones realizadas una vez presentado el examen de premaestría realizado el 22 de Abril del año en curso y su revisión cuidadosa del documento final, ha sido aprobado para la obtención del grado de Maestra en Ciencias Médicas.
Por lo anterior consideramos pertinente que la estudiante continúe con los
trámites necesarios para su titulación. Agradecemos de antemano su atención y enviamos saludos cordiales.
________________________ ___________________
D. en C. CARIDAD A. LEAL CORTÉS DR. RAÚL LÓPEZ ASENCIO ASESOR CLINICO ASESOR BÁSICO
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DEDICATORIA Y AGRADECIMIENTOS
A Dios.
A mis padres, por su estímulo de superación desde su ejemplo, hasta su apoyo incondicional en este proyecto académico tan importante en mi vida.
A mi esposo y mis niñas, por esas horas robadas que me dieron la oportunidad de continuar con mi crecimiento profesional.
A la Universidad de Colima, por abrirme las puertas para poder realizar mis estudios de postgrado.
Muy especialmente a mis asesores y directores de Tesis. La Dra. Caridad Leal Cortés, Dr. Eliseo Portilla de Buen y al Dr. Raúl López Ascencio, por aceptarme como alumna, compartir conmigo sus experiencias académicas y científicas que contribuyeron de manera significativa en mi formación.
Los Doctores Francisco Mendoza Carrera, Ma. Guadalupe Ramirez López y Bertha Ibarra Cortés por la cuidadosa revisión de esta tesis y sugerencias que enriquecieron este trabajo.
Los Doctores M. Guadalupe Leyva, Ángeles Quintero y Guillermo García García colaboradores en el Hospital Civil de Guadalajara con quien puedo contar siempre.
A todos los maestros del CUIB por transmitirme de manera desinteresada sus enseñanzas y experiencias.
A mis compañeros de maestría, especialmente a Luis por su amistad y comentarios a lo largo de estos dos años, que facilitaron mi trabajo.
El presente trabajo se presentó en el congreso de tendencias de vanguardia en Nefrología 2008.
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ÍNDICE
ABREVIATURAS ........................................................................................................... vii
RESUMEN...................................................................................................................viii
ABSTRACT...................................................................................................................iix
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
ANTECEDENTES............................................................................................................. 2
DESCRIPCIÓN DE LOS FÁRMACOS UTILIZADOS EN TRASPLANTE ................................. 3
CICLOSPORINA .......................................................................................................... 5
FARMACOCINÉTICA Y FARMACODINAMIA .................................................................... 6
CITOCROMO P450 ...................................................................................................... 7
MONITORIZACIÓN ..................................................................................................... 8
FARMACOGENÉTICA ................................................................................................. 10
POLIMORFISMOS DEL CYP3A .................................................................................... 11
JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................... 16
PREGUNTA BÁSICA DE INVESTIGACIÓN ....................................................................... 17
TIPO DE ESTUDIO ....................................................................................................... 17
OBJETIVO GENERAL .................................................................................................... 17
OBJETIVOS PARTICULARES .......................................................................................... 17
HIPÓTESIS DE TRABAJO .............................................................................................. 17
MATERIAL Y METODOS ................................................................................................ 18
UNIVERSO DE TRABAJO ........................................................................................... 18
ASPECTOS ÉTICOS ................................................................................................... 20
TAMAÑO DE LA MUESTRA ......................................................................................... 21
GENOTIPIFICACIÓN ................................................................................................. 21
ANALISIS ESTADISTICO ........................................................................................... 30
RESULTADOS .............................................................................................................. 31
DISCUSIÓN.................................................................................................................39
PERSPECTIVAS ............................................................................................................ 41
CONCLUSIONES ........................................................................................................... 42
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 53
v
ANEXO I:
Carta de consentimiento informado para paciente receptor de trasplante renal (1) ........... 43
ANEXO I:
Carta de consentimiento informado para paciente receptor de trasplante renal (2) ........... 44
ANEXO II:
Hoja de vaciamiento de datos clínicos del paciente receptor de trasplante renal. .............. 45
ANEXO III:
Carta de consentimiento informado a donadores de sangre sanos. .................................. 46
ANEXO IV:
Hoja de vaciamiento de datos de la población general. ................................................... 47
ANEXO V :
Medicamentos que interfieren con Ciclosporina .............................................................. 48
ANEXO VI:
Glosario ....................................................................................................................... 49
ANEXO VII:
Oficio aprobatorio del Comité de Enseñanza, Investigación y Ética. ................................. 52
vi
ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS
Cuadro 1. Lista de alelos y genotipos en las diferentes poblaciones reportadas. .................. 13
Cuadro 2. Polimorfismos y ciclosporina ............................................................................. 14
Cuadro 3. Mezcla de reactivos para la PCR ........................................................................ 23
Cuadro 4. Condiciones de amplificación ............................................................................ 23
Cuadro 5. Mezcla de reactivos para la digestión del producto de PCR ................................. 24
Cuadro 6. Reactivos para la preparación del gel de poliacrilamida ...................................... 24
Cuadro 7. Preparación de Buffer de carga o jugo azul 6X ................................................... 25
Cuadro 8. Tinción con nitrato de plata. ............................................................................. 25
Cuadro 9. Definición de variables ..................................................................................... 28
Cuadro 10. Definición de variables intervinientes. .............................................................. 29
Cuadro 11. Características analizadas de los pacientes estudiados. ..................................... 33
Cuadro 12. Alelos y genotipos en población general y población estudiada para determinar el
EHW..............................................................................................................................34
Cuadro 13. Comparación del genotipo con el nivel por rango de CsA..................................35
Cuadro 14 Comparación del promedio del nivel de CsA en C2 y C0 de acuerdo a cada
genotipo........................................................................................................................36
Cuadro 15 Correlación lineal de las variables intervinientes con el nivel de CsA en C2 y C0 por
separado. ....................................................................................................................... 37
Cuadro 16 Modelo multivariado en C0 considerando los genotipos......................................38
Cuadro 17 Modelo multivariado en C0 considerando el alelo 3............................................38
Figura 1. Esquema del fragmento de los sitios de corte de la enzima DdeI..........................27
Figura 2. Asignación genotípica en el gel de poliacrilamida. ................................................ 27
Figura 3. Distribución por género de los pacientes con trasplante renal 31
Figura 4. Distribución por género de los donadores renales ................................................ 32
Figura 5. Motivo del trasplante renal ................................................................................. 32
Figura 6. Niveles por rango de CsA de acuerdo a cada genotipo.........................................35
Figura 7. Nivel de CsA promedio en C2 y C0 de acuerdo al genotipo...................................36
vii
ABREVIATURAS
A: Alanina.
ABC: Familia de genes ATP binding cassette.
ALG: Globulina anti linfocítica.
AM1: Hidroxilación del aminoácido 1.
AM4n: N-desmetilación del aminoácido 4.
AM9: Hidroxilación del aminoácido 9.
ATG: Globulina anti-timocítica.
AUC: Área bajo la curva.
CsA: Ciclosporina.
cSNP: Polimorfismo de un sólo nucleótido codificador.
CYP: Citocromo P450.
DM: Diabetes mellitus.
EHW: Equilibrio Hardy-Weinberg
G: Guanina.
GMN: Glomerulonefritis.
HAS: Hipertensión Arterial Sistémica.
HCGFAA: Hospital Civil de Guadalajara Fray Antonio Alcalde.
IL-2: Interleucina-2.
IC: Inhibidor de Calcineurina.
MDR1: Familia del genes multidrug resistant-1
NCA: Nefropatía crónica del aloinjerto.
NFAT: Factor nuclear de activación de células T.
P-gp: Glicoproteina p.
pb: Par de base
SNP: Polimorfismo de un sólo nucleótido.
TNF alfa: Factor de necrosis tumoral alfa.
V Neurogénica: Vejiga Neurogénica.
viii
RESUMEN
La ciclosporina (CsA) es uno de los fármacos más utilizados como inmunosupresores
para evitar rechazo después de un trasplante y se reconoce que tiene una amplia variabilidad
de acción entre individuos. Ciertas variantes genéticas que codifican las enzimas de los
citocromos CYP3A4 y CYP3A5 son parcialmente responsables de dicha variación.
Objetivo: Evaluar la participación del genotipo con el alelo CYP3A5*3 en el nivel de CsA
después del trasplante renal.
Métodos: 50 pacientes con primer trasplante renal y 102 individuos sanos de población
abierta fueron tipificados mediante PCR-RFLP. Los datos se obtuvieron de los expedientes
clínicos. La participación de alelos y genotipos sobre el nivel de CsA se evaluó mediante
análisis ji cuadrada.
Conclusiones: El alelo CYP3A5*3 se encuentra en una frecuencia importante en la
población mexicana pero los genotipos de riesgo: 1,3 y 3,3 no condicionan a un mayor nivel
de CsA.
Palabras clave: Trasplante renal, polimorfismo, CYP3A5, ciclosporina.
ix
ABSTRACT
Cyclosporine (CsA) is an immunosuppressive drug widely used to prevent renal
allograft rejection. It is characterized by a considerable therapeutic interindividual variability.
This variability could partially be the result of the different metabolizing activity of
polymorphisms of cytochrome enzymes CYP3A4 and CYP3A5.
Objective: To evaluate the effects of CYP3A5*3 on CsA after renal transplantation.
Methods: 50 first kidney transplant recipients and 102 healthy individuals were
genotyped by PCR-RFLP for CYP3A5*3. CsA levels were obtained from the clinical charts.
Square Ji analyses were used.
Conclusion: CYP3A5*3 allele was frequent in Mexican population and its presence on
the risk population: 1,3 y 3,3 genotype do not correspond to an increase in CsA levels.
Key words: Kidney transplantation, polymorphism, CYP3A5*3, cyclosporine.
1
INTRODUCCIÓN
Está ampliamente aceptado que la nefropatía crónica del aloinjerto (NCA) es la causa
principal de la pérdida de la función renal en trasplantes a largo plazo. Los esfuerzos
encaminados al conocimiento de la fisiopatología en años recientes han arrojado muchos
datos, en donde destaca la nefrotoxicidad producida directamente por los mismos fármacos
utilizados para el mantenimiento del injerto, especialmente los inhibidores de calcineurina
(IC): tacrolimus y ciclosporina A (CsA). El ajuste de los niveles en sangre de estos
inmunosupresores es indispensable tanto para lograr evitar rechazo al nuevo órgano y
toxicidad, ya que se reconoce que su variabilidad en el efecto farmacológico es muy amplia
entre cada individuo (20-30%). Cabe destacar, que aún logrando un nivel adecuado, los
pacientes perderán en su mayoría el injerto en la década siguiente del trasplante
principalmente debido a NCA, por lo que el conocimiento de las fuentes de variabilidad,
incluyendo la farmacogenética de los medicamentos inmunosupresores en las diferentes
poblaciones, está desarrollándose de forma importante. Los dos principales metabolizadores
de los IC pertenecen a la familia de enzimas del citocromo P450 llamadas CYP3A codificados
por genes que llevan el mismo nombre, cada uno en el brazo largo del cromosoma 7
humano. Estos son llamados: CYP3A4 y CYP3A5 y particularmente para el segundo se ha
identificado un cambio de base nitrogenada (alelo CYP3A5*3) que impide la producción de la
proteína contribuyendo a la acumulación de CsA en sangre. Este alelo se ha asociado con
alteraciones en el metabolismo de inhibidores de calcineurina en la mayoría de los estudios
en diferentes poblaciones. A través de su estudio se pretende tener un acercamiento a la
fuente de variabilidad genética que participa en el metabolismo de CsA en población
mexicana.
2
ANTECEDENTES
El trasplante renal se ha promovido mundialmente debido a que se considera el
tratamiento de elección para individuos que presentan insuficiencia renal crónica, no solo
porque mejora la calidad de vida, sino porque también aumenta significativamente la
sobrevida comparado con el tratamiento dialítico (Srinvas y cols., 2008 y Djamali y cols.,
2006). Además, el ahorro financiero que implica para el sector salud comparado con el
mantenimiento del paciente en diálisis, hace que cada día aumente el número de pacientes
con trasplante renal. Así por ejemplo, MacPhee y cols., en 2005 mencionaron que el costo
anual para el cuidado post-trasplante en Estados Unidos es alrededor de 50% menor
comparado con el costo del tratamiento dialítico.
Los resultados a corto y largo plazo del trasplante renal han mejorado con el tiempo
gracias a la disminución evidente del rechazo agudo, pero pese a estas mejoras en años
recientes una cantidad sustancial de injertos desarrollan disfunción progresiva y fracasan
durante la década siguiente al trasplante, aun cuando se utilicen fármacos inmunosupresores
e indispensables en dosis suficientes como para prevenir el rechazo agudo (Leichtman, 2007
y Djamali y cols., 2006).
A largo plazo, la pérdida de los injertos se debe principalmente a lesión vascular,
enfermedades malignas o infecciosas y NCA (Davies y cols., 2000). La NCA tiene diversas
causas, entre ellas: lesión por isquemia reperfusión, cantidad de nefronas funcionales al
momento del trasplante o por lesión de las mismas debido al fracaso en la terapia
inmunosupresora para el rechazo clínico o subclínico, la exacerbación de la enfermedad
preexistente y nefrotoxicidad por inhibidores de calcineurina (IC): ciclosporina o tacrolimus.
Aunque no es lo mismo NCA y nefrotoxicidad por IC, el impacto de esta última en trasplante
renal es muy importante debido al daño causado al propio órgano trasplantado, perpetuando
la NCA que con frecuencia es el preludio para la pérdida de los injertos (Nankivell y cols.,
2006; Djamali y cols., 2006 y Chapman y cols., 2005).
Cabe señalar que incluso se reporta lesión renal en trasplante de corazón, hígado y
médula ósea lesionando los riñones nativos en un 20-39% en los primeros 6 meses post-
quirúrgicos y 64% a 24 meses (Campistol y cols., 2000 y Johnson, 2000).
3
El uso de inmunosupresión diaria es obligatorio en el trasplante de órganos sólidos,
para reducir la incidencia de episodios de rechazo agudo durante la supervivencia del injerto
a corto y largo plazo. Su utilización implica la administración de por lo menos dos o más
fármacos inmunosupresores: esteroides, mielosupresores, anticuerpos monoclonales, y
alguno de los IC como se describe ampliamente en varias revisiones recientes (Gaston, 2006;
Meier-Kriesche y cols., 2006 y Srinvas y cols., 2008).
DESCRIPCIÓN DE LOS FÁRMACOS UTILIZADOS EN TRASPLANTE
ESTEROIDES: Incluye metilprednisolona, prednisona, prednisolona, etc. La mayoría de
los programas de trasplante utilizan alguno de estos fármacos por lo menos el primer año de
función del injerto tanto en la terapia de inducción como en el mantenimiento. Además en
caso de existir rechazo agudo se utiliza como tratamiento de primera elección la
metilprednisolona a altas dosis (Godman-Gilman y cols., 2006).
MIELOSUPRESORES: Uno de los primeros fármacos mielosupresores utilizados fue la
azatioprina, la cual fue desplazada por el micofenolato de mofetilo a partir de 1995, porque
mostró mayor efectividad en la disminución del rechazo agudo. El sirolimus se utiliza como
mielosupresor en algunos programas de trasplante (Godman-Gilman y cols., 2006).
ANTICUERPOS MONOCLONALES O POLICLONALES: A partir de 1987, están disponibles
varios anticuerpos policlonales como la “globulina antilinfocítica” (ALG) o la “globulina
antitimocito” (ATG) y monoclonales como los anti-CD3. Se utilizan sobre todo para pacientes
altamente sensibilizados es decir, con alto riesgo de rechazo, por ejemplo: con múltiples
transfusiones, segundos trasplantes, etc. Además se utilizan como inducción
inmunosupresora antes del trasplante, o para manejo de rechazo agudo resistente a
esteroides (Godman-Gilman y cols., 2006).
OTROS INMUNOSUPRESORES: Everolimus, que tiene un mecanismo de acción
parecido al sirolimus (Godman-Gilman y cols., 2006).
LOS INHIBIDORES DE CALCINEURINA: Donde se incluyen CsA y tacrolimus,
constituyen un pilar básico en el manejo de cualquier trasplante; tanto en la inducción pre-
quirúrgica, como en el mantenimiento post-operatorio del injerto debido a su alta eficiencia
como inmunosupresores. Los buenos resultados en su efecto dependen de lograr un nivel
4
terapéutico adecuado después del trasplante (Gaston, 2006 Leichtman, 2007 y Srinvas y
cols., 2008).
Sin embargo su uso presenta un margen terapéutico muy corto que se traduce en una
gran variabilidad en la farmacocinética entre individuos. Es decir, provoca imprecisiones en la
dosis. Por ejemplo, dos pacientes de la misma edad, sexo, y cuadro clínico pueden requerir
de dosis muy diferentes de un mismo IC y los parámetros farmacocinéticos entre los
pacientes pueden tener consecuencias clínicas graves: 1. Rechazo si no se alcanza la dosis
terapéutica o 2. Nefrotoxicidad si se sobrepasa la dosis terapéutica (Godman-Gilman y cols.,
2006)
La causa de la variabilidad farmacocinética aún no está bien entendida, pero se sabe
por ejemplo que la biodisponibilidad es más elevada en niños trasplantados lo que implica un
mayor nivel del medicamento circulante con dosis menores (Madeiros y cols.,1999). El
término de biodisponibilidad de un fármaco se refiere a la fracción del mismo que llega a la
circulación y depende de la vía de administración, absorción, distribución, metabolismo y
excreción (Perazella y Parikh, 2005). En el caso de la ciclosporina su vía de administración
principal es oral, se absorbe y distribuye por la glucoproteína p (P-gp) para finalmente
metabolizarse por CYP y excretarse en su mayor parte por vía biliar y heces como se
explicará mas adelante (Godman-Gilman y cols., 2006).
En México se reconoció clínicamente que existía mayor biodisponibilidad de CsA desde
la introducción del fármaco en el país, pero hasta 1997 Palma-Aguirre y cols., demostraron en
23 mexicanos sanos que la biodisponibilidad de CsA oral era mayor que la reportada en
estadounidenses y europeos en condiciones similares, sugiriendo la posible existencia de un
factor étnico en la farmacocinética del fármaco.
Todo lo anterior ha generado la necesidad de analizar la interacción de proteínas y
fármacos en individuos de diferentes poblaciones generando información importante para
tomar decisiones al momento de prescribir individualmente un tratamiento inmunosupresor,
especialmente en aquellos medicamentos que tienen un rango terapéutico muy corto, altos
costos y efectos adversos significativos como los IC (MacPhee y cols., 2005, 2008a; Mourad y
cols., 2008 y Cattaneo y cols., 2008).
5
CICLOSPORINA
Hace poco más de 20 años, la CsA fue introducida como un agente inmunosupresor
para prevenir el rechazo del tejido trasplantado. Es un polipéptido de 11 aminoácidos
derivado del hongo Beauveria nivea.
Su impacto en el área del trasplante ha sido enorme. Las tasas de supervivencia del
aloinjerto renal a un año sobrepasan el 90%, comparado con la tasa de supervivencia del
60% en 1980 previo a su introducción (www.usrds.org/2007/pdf/12-int.pdf). Sin embargo la
viabilidad del aloinjerto después de un año no ha mostrado una mejoría similar y el
tratamiento con CsA se asocia con una variedad de efectos secundarios que limitan su
utilidad clínica y que pueden contribuir a la pérdida del aloinjerto después del primer año,
dentro de las que destaca la NCA acelerada (Campistol y cols., 2000; Chapman y cols., 2005,
2006a; Djamali y cols., 2006; Ekberg y cols., 2007 y Leichtman, 2007).
La CsA al igual que el tacrolimus, es un compuesto lipofílico, que fácilmente difunde a
través de las membranas de la célula blanco tales como los linfocitos T. Una vez dentro de la
célula, la CsA forma un complejo con una proteína intracelular llamada ciclofilina, tal complejo
interactúa con la calcineurina para inhibir su actividad enzimática. Esta inhibición altera la
señalización normal intracelular de los linfocitos T y explica en su mayoría la eficacia de esta
droga. De manera normal, la activación del receptor del linfocito T sobre la superficie de la
célula causa un incremento del calcio citosólico, el cual vía calcio-cadmodulina lleva a la
activación de calcineurina. La calcineurina entonces defosforila numerosos sustratos fuera de
la célula que entran al núcleo y regulan la trascripción de varios genes. Un sustrato
importante de la calcineurina es el factor nuclear activador de células T (NFAT) el cual regula
la transcripción de interleucina-2 (IL-2), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y factor
estimulante de colonias granulocito-macrófago. A través de la inhibición de calcineurina y la
consecuente regulación de la expresión génica, la CsA altera la transcripción de la fase del
ciclo celular del linfocito T y protege contra el rechazo del tejido trasplantado mediado por
células. Sin embargo, la alteración de la expresión génica que sigue de la inhibición de la
calcineurina también puede iniciar una cadena de eventos que finalizan en nefrotoxicidad del
propio aloinjerto (Campistol y cols., 2000 y Djamali y cols., 2006).
6
Existe una lesión arteriolar directa de la CsA que se ha atribuido a vacuolización y
necrosis del músculo liso y endotelio, con paso de proteínas a la pared vascular que forma
depósitos nodulares y hialinos, lesión histológica que es el marcador diagnóstico de
nefrotoxicidad. Esta lesión causa obstrucción vascular y poco a poco glomeruloesclerosis
isquémica con lesión del aloinjerto (Nankivell y cols., 2006).
Desde el punto de vista clínico se han descrito varios síndromes clínicos todos
manifestados por disfunción renal en diferentes grados y a veces de forma irreversible. Todos
son difíciles de distinguir del rechazo agudo, por lo que el clínico en la mayoría de las
ocasiones está obligado a realizar biopsia del aloinjerto para diferenciar el diagnóstico de
nefrotoxicidad o rechazo (Djamali y cols., 2006).
FARMACOCINÉTICA Y FARMACODINAMIA
Debido a que la CsA es altamente lipofílica, su absorción depende de la función
gastrointestinal y secreción biliar. Un pico en su concentración ocurre dentro de las 2-6 horas
posteriores a su administración. Su eliminación varía de 8.4-19h. La variación farmacocinética
es de un 20-30% entre individuos (Godman-Gilman y cols., 2006). La absorción de CsA en el
tracto gastrointestinal es regulada por la P-gp, que es una glucoproteína de membrana
localizada a lo largo de todo el tracto gastrointestinal. Esta proteína llamada también bomba
de flujo, regula la entrada de casi todos los xenobióticos y salida de los desechos metabólicos
de la célula. La P-gp es parte de una familia de proteínas llamadas MDR1 (multidrug
resistant-1) las cuales son codificadas por la familia de genes ABC (ATP binding cassette).
Dada la función de esta proteína, se reconoce su importancia con la variabilidad de respuesta
a medicamentos observada en humanos incluyendo la CsA (Lin y Yamazaki, 2003). Una vez
que la CsA está en el torrente sanguíneo es sujeta a metabolismo, regulación de la
introducción a la célula y depuración hepática hasta en un 90% por las enzimas del citocromo
P450 (CYP), principalmente CYP3A4 y CYP3A5. Las diferencias entre la actividad de estas
proteínas, determinan el 80% de la variación interindividual de la disposición por vía oral.
Este porcentaje es diferente (66%) cuando se administra por vía intravenosa porque evita la
acción de P-gp y CYP a nivel del tracto gastrointestinal (Ultech y cols., 2006; Thervet y cols.,
2005; Hu y cols., 2006; Hesselink y cols., 2003; Yates y cols., 2003 y Von Ahsen y cols.,
7
2001). Sólo 6% de la dosis oral se excreta en la orina y únicamente 0.1% se excreta por esta
vía como fármaco inalterado (Godman-Gilman y cols., 2006).
CITOCROMO P450
En la biotransformación de la mayoría de los fármacos conocidos actualmente,
incluidos los inmunosupresores intervienen sistemas enzimáticos localizados principalmente
en el retículo endoplasmático liso del hígado (fracción microsomal), aunque también en
menor cantidad en intestino, riñón y pulmón por medio de dos reacciones químicas:
EN LA FASE I: Los sistemas enzimáticos convierten el fármaco original en un
metabolito más polar por oxidación, reducción o hidrólisis y se lleva a cabo por
monooxigenasas y por medio de isoenzimas llamadas CYP las cuales intervienen
importantemente en el metabolismo de fármacos inmunosupresores.
EN LA FASE II: Reacciones de conjugación o síntesis, que implican la unión del fármaco
con un sustrato endógeno como glucuronato, sulfato, acetato o un aminoácido.
La CsA es biotransformada en más de 30 metabolitos, los principales son tres, dos
llamados AM1 (hidroxilación del aminoácido 1) y AM4n (N-desmetilación del aminoácido 4)
producido por CYP3A4. El tercero, el AM9 (hidroxilación del aminoácido 9) lo produce tanto el
CYP3A4 como el CYP3A5. Estos metabolitos representan los primeros en el camino del
metabolismo del fármaco (Dai y cols., 2004; 2006ª).
El sistema CYP es la familia de enzimas activas más estudiada y es responsable de la
biotransformación y metabolismo oxidativo de muchas moléculas. La clonación y
secuenciación han revelado la existencia de 57 genes funcionales y 58 pseudogenes en el
humano (www.imm.ki.se/CYPalleles/2008). Los genes se agrupan de acuerdo a la similitud de
su secuencia en un gran número de familias y subfamilias. Se reconoce que las familias 1 a la
3 son las involucradas principalmente en el metabolismo de xenobióticos. CYP3A es la que
más se expresa y que se involucra en el metabolismo de aproximadamente 50% de los
fármacos que se utilizan en el área clínica y se conoce que es la familia de citocromos que
más participa en el metabolismo de los inhibidores de calcineurina (Godman-Gilman y cols.,
2006).
CYP3A consiste en cuatro isoenzimas principales, codificadas cada una por un gen con
el mismo nombre: CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43. La isoforma CYP3A4 es la más
8
abundante y se expresa en hígado y epitelio intestinal, mientras que el CYP3A5 se expresa de
forma más variable en hígado y riñón. Esto depende aparentemente de la variación de
ancestros raciales. Se sabe que las isoformas de CYP3A5 constituyen al menos un 50% del
total del CYP3A en algunos individuos, particularmente los que poseen el alelo CYP3A5*1
(Williams y cols., 2003).
El CYP3A7 se expresa principalmente durante la vida fetal y finalmente el CYP3A43,
descrito recientemente, se expresa en próstata y testículos pero su contribución al
metabolismo de fármacos es todavía desconocida (Joy y cols., 2007; Daly y cols., 2006;
Gaston, 2006; Dai y cols., 2004, 2006a y Hesselink y cols., 2003).
Los cuatro genes del CYP3A se encuentran localizados en el brazo largo del cromosoma
7 en el humano (7q21.1). Además se ha reportado la existencia de dos pseudogenes:
CYP3AP1 y CYP3AP2 importantes en el metabolismo de fármacos. En estos genes y
pseudogenes se han identificado un cúmulo de variaciones que dan lugar o no a proteínas
con diferencias de función, ya sea en su capacidad de expresión, interacción con el fármaco o
sin efecto alguno (Ulecht y cols., 2006; Daly y cols., 2006 y Thervet y cols., 2005).
Una de las principales limitaciones con el uso de los IC en la práctica médica es que en
su farmacocinética intervienen muchos factores que contribuyen a la gran variabilidad de su
respuesta tales como los ya mencionados y otros como los polimorfismos de CYP y P-gp
expresados en el donador renal, dieta, edad, enfermedades concomitantes e interacción con
otros fármacos (Joy y cols., 2007, Godman-Gilman y cols., 2006).
MONITORIZACIÓN
La monitorización de CsA incluye la medición del nivel circulante 12h después de la
primera dosis y justo antes de la siguiente por métodos de inmunoensayo y es llamada C0.
Aproximadamente a partir de 1999 empezaron a aparecer estudios actualmente validados
que muestran que la medición exactamente a las 2h después de la toma o C2, ofrece
beneficios clínicos importantes como el control de hipertensión arterial, hiperlipidemia y
protección sobre la nefrotoxicidad debido a su mejor relación con la exposición más alta o
tóxica del fármaco por medio de un mejor cálculo del área bajo la curva o AUC (Madeiros y
cols., l999, Perner, y cols., 2002, Citterio y cols., 2005 y Büchler y cols., 2005, 2006ª). Es
9
importante mencionar que en cada centro de trasplante la dosis y los rangos terapéuticos de
CsA varían dependiendo del protocolo hospitalario el cual es estructurado con base en la
experiencia y recursos del centro (Gaston, 2006). Algunos, sobre todo en países desarrollados
utilizan anticuerpos mono o policlonales para inducción (pretrasplante) y posterior a la cirugía
utilizan un IC de mantenimiento. En otros (como la mayoría en México), la inducción se
realiza utilizando la misma inmunosupresión oral que servirá posteriormente de
mantenimiento (Leichman, 2007). Gaston en el 2006 realizó una revisión de los diferentes
protocolos de inmunosupresión que incluyen CsA en diferentes centros de trasplante renal
reportando una dosis media de 9(+-3) mg/kg/24h dividido en 2 dosis. Además, encontró que
los rangos terapéuticos de C0 se mantienen en promedio en 450 ng/dl (variando de 100-450
ng/dl). Por otro lado, para C2 Citterio y cols., en 2005, en un estudio de seguimiento de 110
pacientes durante 40 meses manteniendo niveles de C2 entre 800 y 1000 ng/dl encontraron
menores efectos adversos comparados con C0 y sin riesgo agregado para rechazo. En el
Hospital Civil Fray Antonio Alcalde se utilizan 4mg/kg/para inducción la noche antes de la
cirugía y 8mg/kg/día de mantenimiento dividida en dos dosis actualmente manteniendo
niveles de C2 entre 800-1200 ng/dl los primeros 6 meses posterior al trasplante y antes de la
utilización de C2, se mantuvieron los niveles de C0 entre 150-300 ng/dl como se encuentra
documentado en el manual de procedimientos del Departamento de Nefrología en el Hospital
Civil Fray Antonio Alcalde (Experiencia de Jalisco).
Aún logrando una concentración adecuada del fármaco, no se garantiza la protección
completa contra rechazo o toxicidad, lo que confirma la heterogeneidad en la farmacodinamia
y farmacocinética. Los avances recientes en la definición de los factores genéticos que
impactan éstos dos aspectos de los fármacos, permitirán en el futuro individualizar la dosis de
acuerdo al genotipo del paciente. Basados en esta estrategia, se podría alcanzar la
concentración del medicamento más rápidamente después del trasplante no solamente
considerando los niveles séricos, sino ajustándolo según la capacidad metabólica del paciente
de acuerdo con sus características genéticas; lo que probablemente también podrá permitir
predecir qué individuos estarían en riesgo de fallas en el tratamiento o bien toxicidad por el
fármaco y elegir individualmente un régimen de tratamiento (McPhee y cols., 2005, 2008a;
Mourad y cols., 2008; Cattaneo y cols., 2008; Phillips y Van Bebber, 2006 y Kalow, 2006).
10
FARMACOGENÉTICA
En el 2001 se publicó en las revistas Science y Nature el primer borrador del “Genoma
Humano” (GH) que reveló la existencia de entre 30,000-40,000 genes y aproximadamente
3,200 millones de pares de bases (pb). Se cuenta con un mapa de alrededor de l.4 millones
de polimorfismos de un solo nucleótido o SNP´s a lo largo del genoma, 60,000 de los cuales
(aprox 3%) se encuentran dentro de regiones codificadoras o exones. Estos cambios de
secuencia se encuentran presentes a lo largo del genoma humano en promedio cada 1331
bases, lo que quiere decir que cada individuo difiere precisamente de otro aproximadamente
cada 1331 bases. Los SNP´s a diferencia de otro tipo de marcadores genéticos como los
microsatélites, tienen una tasa menor de mutación por lo que pueden ser utilizados en
estudios de genética de poblaciones para entender fenómenos de migración y evolución. La
variabilidad fenotípica individual, así como la susceptibilidad o la resistencia individual a
distintas enfermedades se fundamentan primordialmente en las diferencias de descendencia
existentes en el DNA en sitios o nucleótidos específicos, así como en menor grado, en la
presencia de pequeñas inserciones, deleciones, secuencias repetidas o rearreglos
cromosómicos (Kruglayak y Nickerson, 2001 y Tusié-Luna, 2001).
Estudios previos reportados en la revista Nature Genetics en 1999 han encontrado
alrededor de cuatro SNP´s codificadores (cSNP´s) por gen. Esta observación, junto con las
nuevas estimaciones, sugieren que en el genoma humano existen cerca de 30,000 genes, así
como cerca de 3,000,000 de SNP´s de los cuales aproximadamente 120,000 son cSNP´s. De
estos, 40% se esperaría que cambien un aminoácido con potenciales consecuencias
fenotípicas como los citocromos hepáticos (Kruglayak y Nickerson , 2001).
El Internacional SNP Map Working Group a partir de 2001 ha propuesto identificar los
SNP´s o las combinaciones que tienen consecuencias funcionales para el efecto de fármacos
y es el objetivo de la farmacogenética moderna así como la preocupación por contar con los
reglamentos suficientes para el uso de esa información aplicada en el humano (Phillips y Van
Bebber, 2006).
Godman-Gilman y cols., (2006) recalca la importancia de que la variabilidad en la
respuesta farmacológica individual depende de una compleja relación entre el medio
11
ambiente y factores genéticos. Debido a que es impráctico analizar todos los polimorfismos
en estudios de asociación, es importante seleccionar polimorfismos que estén probablemente
asociados con el fenotipo fármaco-respuesta. Para ello, existen dos categorías:
1. Los que no alteran la función de la proteína expresada (por ejemplo: alguna enzima
que metaboliza el fármaco o el receptor del fármaco) pero, el polimorfismo solamente se
relaciona con el alelo que produce una función alterada. Estos polimorfismos son
biomarcadores para el fenotipo fármaco-respuesta.
2. Los que intervienen en el fenotipo por causar una función alterada. Por ejemplo los
SNP´s que probablemente cambien un aminoácido y que resulte en una proteína no funcional
o con función reducida. Estos son los polimorfismos ideales para realizar estudios de
asociación.
Con la gran cantidad de SNP´s descubiertos se requieren métodos computacionales
para predecir las consecuencias de los SNP´s. Para ello se han desarrollado algoritmos
predictivos para identificar el riesgo potencial de un aminoácido sustituido. Sin embargo, la
farmacogenética en este momento es poco utilizada en la práctica clínica debido a la
necesidad de más evidencia que implique los polimorfismos en el cuidado clínico del paciente.
Debido a la alta probabilidad de error tipo I en estudios de asociación fenotipo/genotipo, será
necesaria la replicación de los hallazgos clínicos (Godman-Gilman y cols., 2006, Heather y
Clayton, 2005 y Hattersley y McCarthy 2005).
POLIMORFISMOS DEL CYP3A
CYP3A4
Ha quedado claro en múltiples estudios in vitro con microsomas hepáticos (Thörn y
cols., 2004; Dai y cols., 2004, 2006ª y Niwa y cols., 2007) que la expresión de CYP3A4 se
relaciona con la concentración de CsA y Tacrolimus en el tejido. Sin embargo, los diferentes
estudios que buscan la posible relación entre los polimorfismos de CYP3A4 con los niveles de
IC en sangre de pacientes e individuos sanos son confusos. El más estudiado en la
farmacogenética de inmunosupresores es el llamado CYP3A4*1B cuya tasa de transcripción in
vitro es más alta, lo que teoricamente resulta en una expresión elevada de proteína y una
12
mayor actividad enzimática, su posible efecto in vivo ha sido discutido, ya que no ha sido
comprobado en todos los grupos estudiados probablemente porque su frecuencia es baja en
las diferentes poblaciones, 6-8% incluyendo mexicanos (Ultecht y cols., 2006; Thervet y cols.,
2005, Reyes-Hernández y cols., 2004, 2008ª).
CYP3A5
Del gen CYP3A5 se conocen algunas variantes en las regiones codificadoras,
especialmente en los exones 7 y 11, tales como CYP3A5*2, CYP3A5*3, CYP3A5*4,
CYP3A5*6, CYP3A5*8, CYP3A5*9 y CYP3A5*10. También se han detectado SNP´s en los
intrones, algunos de los cuales afectan el empalme del RNA alterando la función de la
proteína. Ejemplos de estas variantes son los alelos CYP3A5*3 y CYP3A5*6. El CYP3A5*3 es
uno de los polimorfismos más estudiados en relación al metabolismo de los IC. Es un cambio
de adenina (A) por guanina (G) en la posición 6986 (6986 A>G) del gen provocando la
retención de parte del intrón 3. Este cambio de base a su vez lleva al corrimiento del marco
de lectura originando un codón de terminación y con ello la terminación prematura de la
proteína. Así el alelo con una A en la posición 6986 (llamado alelo CYP3A5*1) codifica una
proteína CYP3A5 normal, mientras que el gen con una G en la misma posición (alelo
CYP3A5*3) da lugar a una proteína corta no funcional (NO funcional significa que no
metaboliza). Solo los individuos con el alelo CYP3A5*1 producen enzimas funcionales a un
nivel significativo, arriba de un 50% del contenido hepático del CYP3A (Williams y cols.,
2003). Sin embargo es notable que en la mayoría de las poblaciones analizadas en diferentes
estudios, el alelo mutado (6986G o CYP3A5*3) es el de mayor frecuencia y no el silvestre
(6986A o CYP3A5*1) como se muestra en el Cuadro 1.
Este comportamiento es contrario a lo observado en otros genes y pudiera tener
diversas interpretaciones, desde que sea reflejo de un proceso de fijación de una mutación ya
sea en beneficio o perjuicio de la capacidad metabolizadora del individuo, hasta que el alelo
*3 sea el silvestre y no el mutado. Conforme se obtenga información de las diferentes
poblaciones en el mundo se llegará a la interpretación correcta.
13
Cuadro 1. Lista de alelos y genotipos en las diferentes poblaciones reportadas.
Población
n
Alelo *1 %
Alelo*3 %
Genotipo *1/*1
%
Genotipo *1/*3
%
Genotipo *3/*3
%
Referencia
Caucásicos 50 6 94 0 12 88 Haufroid y cols., 2004 Bélgica
Caucásicos 399 9 91 1.5 14 85 Kreutz y cols., 2004 Alemania Caucásicos 106 5 95 1.9 6.6 92 Anglicheau y cols., 2004 Francia
Caucásicos 204 8 91 0.9 15 84 Sinues y cols., 2007 España
Caucásicos 87 17 83 4.6 25 72 Hesselink y cols., 2004 Holanda
Chinos 106 22 78 5 32 62 Hu y cols., 2006 China Mestizos Centroamérica 232 24 77 3 41 56
Sinues y cols., 2007 Nicaragua y El Salvador
En México se desconoce la frecuencia del polimorfismo, el único antecedente es del
estudio realizado en el Hospital St. George de la Universidad de Londres, Inglaterra en el que
el dato aparece como observación no publicada con una frecuencia de 30% del alelo
CYP3A5*1 en un grupo de mexicanos (MacPhee, I.A.M. y cols.,. 2004).
Algunos investigadores han encontrado que el alelo CYP3A5*3 se ha asociado con
alteraciones en la farmacocinética y farmacodinamia del tacrolimus principalmente en
caucásicos, pero la asociación con CsA ha sido más cuestionable (Mourad y cols., 2008;
MacPhee y cols., 2008, Ultech y cols., 2006; Dai y cols., 2006; Eng y cols., 2006; Daly y cols.,
2006 Thervet y cols., 2005 y Hesselink y cols., 2003, 2004a;).
En el Cuadro 2, se muestra un resumen de algunos estudios de asociación de
polimorfismos en CYP3A4 y CYP3A5 con CsA. De ellos, en algunos hubo efecto del fármaco
en presencia del alelo CYP3A5*3 en estado homocigoto, como por ejemplo el estudio de
farmacocinética llevado a cabo por Min Di y cols., en 2004 en 16 individuos sanos (11 de
origen afro americano) que describieron como el AUC (ng/h/ml) de la CsA fue
significantemente mayor en el grupo de individuos homocigotos para el alelo 3
(CYP3A5*3/3), la mayoría caucásico, comparado con los individuos homocigotos para el alelo
1 (CYP3A5*1/1) en su mayoría afro americanos, y la depuración del fármaco menor en el
grupo de homocigotos del alelo 3, comparado con los homocigotos del alelo 1. En 2006 Eng y
cols., en población china y malaya encontraron relacionada la menor dosis de CsA requerida
para alcanzar el nivel deseado en pacientes con CYP3A5*3 junto con el pseudogen
14
CYP3AP1*3. En ese mismo año Hu y cols., y Qiu y cols., en 2008 reportaron en población de
origen chino menor dosis requerida para alcanzar el nivel deseado a una semana post
trasplante renal en presencia de CYP3A5*3.
Cuadro 2. Polimorfismos y ciclosporina
C = caucásicos. Af = Africanos. As= Asiáticos. AUC= Area bajo la curva (por sus siglas en inglés
ETNICIDAD n Genes estudiados Variable y tipo de estudio Conclusión del estudio Referencia
80% C,
10% Af.
10% As.
110 CYP3A4*1B, CYP3A5*3 y
MDR1
C0 retrospectivamente mide
el nivel a 3 y 12 meses post
cirugía
No relevante Hesselink y cols., (2003).
Holanda.
60% Af
40% C
10 CYP3A5*3 y MDR1 Estudio de farmacocinética no
compartamental con el
programa computacional
NONMEM en pacientes con al
menos 6 meses post cirugía.
Depuración aumentada en
C3435T CC y No relevante
para 3A5*3
Yates y cols., (2003).
U.S.A.
100% C 106 CYP3A5*3 y MDR1 Estudio de farmacocinética no
compartamental por
estimación Beyesiana.
No relevante Anglicheau y cols., (2004).
Francia.
100% C 50 CYP3A5*3, CYP3AP1*3 y
MDR1
C0 corte transversal
evaluando el ajuste de dosis
para llegar al nivel deseado.
No relevante Haufroid V y cols., (2004).
Bélgica.
69% Af
31% C
16 Sanos CYP3A5*3 Estudio de farmacocinética no
compartamental con el
programa computacional
WinNonLin.
AUC mayor y depuración
disminuida en homocigotos
CYP3A5*3, con ascendencia
africana.
Min D y cols., (2004).
U.S.A.
100% C 399 CYP3A5*3 C0 retrospectivo evaluando el
ajuste de dosis para legar al
nivel deseado.
No relevante Kreutz y cols., (2004).
Alemania.
100% Chinos 106 CYP3A5*3, CYP3A4*18 y
MDR1
C0 retrospectivo evaluando el
ajuste de dosis para llegar al
nivel deseado dentro de la
primera semana post cirugía.
Menor dosis requerida en
homocigotos CYP3A5*3.
Hu YF y cols., (2006). China.
78% Chinos,
10% Malayos
7% Hindúes
5% Otros
59 CYP3A5*3 y CYP3AP1*3 C0 retrospectivo a 1,3 y 6
meses post cirugía evaluando
el requerimiento de dosis para
llegar al nivel deseado.
Menor dosis requerida en
presencia del alelo
CYP3A5*3 y CYP3AP1*3
juntos.
Eng y cols., (2006)
Malasia.
100% Chinos 103 CYP3A5*3, CYP3A4*18 y
MDR1: C1236T
G2677T/A
C3435T
C0 y C2 retrospectivo
evaluando el ajuste de dosis
para llegar al nivel deseado a
1m post qx.
C0 mayor y menos dosis
requerida en homocigotos
CYP3A5*3.
C0 mayor y menos dosis
requerida en MDR1:CAC.
C0 y C2 menor y mayor
dosis requerida
CYP3A4*18B.
Qiu y cols., (2008) China.
100% C 73 CYP3A5*3,
CYP3A4 rs464643C>T
CYP3A7*1C y MDR1
C0 retrospectivo evaluando el
ajuste de dosis para llegar al
nivel deseado a 1,3,6 y 12m
post qx.
C0 mayor en presencia de
CYP3A5*3 a los 3 y 12m.
C0 menor en CYP3A4
rs464643C>T.
C0 menor en CYP3A7*1C a
12m.
Crettol y cols., (2008) Suiza.
15
En la mayoría de los estudios en caucásicos como los de Hesselink y cols., en 2003,
Yates y cols., en 2003 y en el año 2004 los de Anglicheau y cols., Haufroid y cols., y Kreutz y
cols., no se identificó asociación del polimorfismo CYP3A5*3 con el nivel de CsA.
La discrepancia entre la asociación de algunos polimorfismos relacionados con las dosis
requeridas de medicamento no ha sido bien entendida, por un lado en presencia del alelo
CYP3A5*3 en asiáticos requieren menor dosis de CsA para alcanzar los niveles séricos
deseados, mientras que en caucásicos no se ha encontrado tal asociación a pesar de
encontrar en mayor frecuencia el alelo (entre 80 y 92%). Por otro lado en africanos existe
una mayor AUC y menor depuración. La interpretación se complica aún más por la cantidad
de factores que pueden afectar la respuesta a medicamentos y que no son homogéneos en la
mayoría de los estudios realizados. (Thörn y cols., 2004; Lemahieu y cols., 2004, MacPhee y
cols., 2005; Ingeborg y cols., 2005; Ultecht y cols., 2006; Büchler y cols., 2006; y Joy y cols.,
2007).
16
JUSTIFICACIÓN
Para tratar de mantener el riñón trasplantado en óptimas condiciones se han utilizado
fármacos como la CsA o tacrolimus. Ambos son un pilar básico para evitar rechazo. Sin
embargo cualquiera de estos fármacos per se puede ser tóxico e incluso causar daño al
mismo injerto, por lo que el ajuste de la dosis y la monitorización del nivel en sangre es
indispensable.
Existen evidencias de que la presencia de ciertos polimorfismos tienen influencia sobre
la acción de los inhibidores de calcineurina, donde destaca el alelo CYP3A5*3. Sin embargo,
en la práctica médica se ha observado que la farmacocinética y farmacodinamia de la CsA se
ve afectada por diversos factores como la edad, género, etnia, etc. además de los genéticos
que contribuyen a la gran variabilidad de los efectos propios del fármaco. A pesar de toda la
variabilidad farmacológica difícil de controlar, el tratamiento óptimo se logrará sólo cuando el
médico conozca todas las fuentes de variación en la respuesta a los fármacos
(farmacocinética, farmacodinamia y farmacogenética) y cuando el régimen de dosificación se
diseñe sobre la base de los mejores datos disponibles para la prescripción de cada
medicamento.
Hasta el momento no existen estudios de farmacogenética con los IC en población
mexicana aún cuando se ha reportado que existe la posibilidad de encontrar diferencias en la
biodisponibilidad de CsA en mexicanos reportado por Palma-Aguirre y cols en 1997, que
pudiera interpretarse como mayores niveles en sangre y que la participación de polimorfismos
en los genes que codifican las enzimas metabolizadoras como los de la familia CYP3A5
puedan explicar este hallazgo.
El paciente trasplantado debe utilizar CsA como parte de su tratamiento cuyos niveles
son vigilados para el ajuste de dosis, dada esta característica se consideró como el modelo
“natural” para el estudio, asegurando la factibilidad del proyecto, sin exponer a mayor riesgo
al paciente que el inherente en su tratamiento.
17
PREGUNTA BÁSICA DE INVESTIGACIÓN
¿El genotipo con el alelo CYP3A5*3 se asocia a el nivel sérico de CsA en pacientes con
trasplante renal?
TIPO DE ESTUDIO
Descriptivo, transversal y analítico.
OBJETIVO GENERAL
1. Determinar la asociación del genotipo 1,1, 1,3 y 3,3 con el nivel sérico de ciclosporina
en pacientes con trasplante renal.
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Determinar las frecuencias alélicas y genotípicas de CYP3A5 en pacientes con trasplante
renal y población general de referencia.
2. Determinar la asociación del genotipo: 1,1, 1,3 y 3,3 con el nivel sérico de CsA en
pacientes con trasplante renal.
HIPÓTESIS DE TRABAJO
El genotipo 1,3 y 3,3 se asocia con el aumento del nivel sérico de CsA en pacientes con
trasplante renal.
18
MATERIAL Y METODOS
UNIVERSO DE TRABAJO
1. Pacientes:
Individuos con primer trasplante renal, atendidos en el departamento de Nefrología del
Hospital Civil de Guadalajara Fray Antonio Alcalde (HCGFAA) que aceptaron participar
(ANEXO I).
Criterios de inclusión:
a) Pacientes de cualquier edad con primer trasplante de riñón, sin transfusión
sanguínea reciente, operados entre diciembre de l996 y octubre de 2008 y que
aceptaron participar.
b) Pacientes con al menos un mes de seguimiento post-trasplante que incluyera
medición confiable de los niveles de CsA iniciales con registro de otros medicamentos
prescritos con el fin de ajustar aquellos que se conoce que afectan la farmacocinética
de CsA, así como datos generales del donador (ANEXO V).
Criterios de no inclusión:
a) Falta de registro de niveles de CsA circulante.
b) Pacientes con función hepática anormal o trastornos de absorción gastrointestinal en
el momento de la medición de CsA.
Protocolo de manejo en los pacientes con trasplante renal en el HCGFAA:
a) Inducción (premedicación): La noche anterior a la cirugía se indica CsA a 4mg/kg.
b) Mantenimiento: Se continúa con 8mg/kg/24h dividido en dos tomas (8 y 20h)
monitorizando niveles séricos posteriores al trasplante dentro de las primeras semanas,
siempre y cuando el injerto se encuentre funcionando adecuadamente (depurando azoados).
En caso de disfunción retardada del injerto se cambia la inmunosupresión (dependiendo de
los recursos en ese momento) hasta que el injerto depure azoados (creatinina sérica entre 2
y 3mg/dl), reiniciando CsA a 8mg/kg/24h con su respectiva monitorización en los días
mencionados. En el HCGFAA se mantuvieron hasta 2003 los rangos de C0 de 150 a 300mg/ml
los primeros 6 meses después del trasplante, pero a partir de ese año se inició la medición de
19
niveles de C2 que se han mantenido entre 800 y 1200mg/ml durante los primeros 6 meses
después de la cirugía.
c) Todos los pacientes reciben un mielosupresor: azatioprina 2mg/kg/24 h hasta el año
2000 cuando fue posible utilizar micofenolato de mofetilo 2g/24 h que se prescribe hasta la
fecha.
d) Todos los pacientes reciben esteroides: metilprednisolona 1g la noche antes de la
cirugía y posteriormente prednisona 1mg/kg sin exceder 80mg/día, disminuyendo la dosis a
0.2mg/kg/día hasta llegar a 10mg, dosis que permanece el resto del primer año
postrasplante.
e) Todos los pacientes reciben esquema preventivo para infecciones: trimetoprim +
sulfametoxazol 800/160mg/48h durante 6 meses. Nistatina en gotas tres veces al día en
enjuagues por 1 mes y Aciclovir 5mg/kg de acuerdo a función renal tres veces al día o
ganciclovir 5mg/kg de acuerdo a función renal dos veces al día dependiendo de sus
serologías para citomegalovirus durante 3 meses.
f) Antihipertensivos: En caso de ser necesario se indica de primera línea un fármaco
calcio antagonista (verapamilo o nifedipina) y se puede ir combinando con fármacos alfa o
beta antagonista dependiendo de la evolución clínica.
g) Diuréticos: Solo en caso necesario se indica furosemida dependiendo de la evolución
clínica.
h) Antiácidos: En caso de ser necesario se indica omeprazol como primera línea o
ranitidina en caso de que no se cuente con el recurso dentro del hospital.
i) Analgésicos: Se prescribe de forma intravenosa durante la estancia hospitalaria:
dipirona o clonixinato de lisina dependiendo de los recursos de la institución en ese momento
y al alta se puede incluir paracetamol.
De estos medicamentos, solo se ha identificado que el verapamilo y la prednisona
interactúan con la proteína CYP3A5 alterando el metabolismo de acuerdo al Anexo V.
2. Población de referencia:
Se captaron individuos sanos de la población abierta que acudieron a donar sangre al
Banco de Sangre del HCGFAA y que aceptaron participar en el proyecto (ANEXO III). Esta
población se utilizó para determinar la frecuencia del alelo CYP3A5*3 en habitantes de la
región de influencia del hospital.
20
3. Niveles de CsA:
El nivel de CsA fue medido en todos los pacientes por el mismo laboratorio de
referencia en sangre total, con el equipo de inmunoensayo AxSYM System calibrado de
acuerdo a las recomendaciones del proveedor (Abbot Diagnostic Laboratories) y verificando
en cada análisis el control de calidad.
ASPECTOS ÉTICOS
Todos los pacientes participaron de manera voluntaria en el proyecto dando su
consentimiento informado por escrito.
El proyecto se consideró sin riesgo agregado ya que el paciente no se sometió a ningún
procedimiento adicional a la toma rutinaria de 3-5ml de sangre para vigilancia de la función
del injerto. Esta muestra fue obtenida por personal entrenado del laboratorio clínico y el
paciente ya conocía las molestias derivadas de la punción venosa.
Los resultados del proyecto de investigación no se dieron a conocer a los pacientes ya
que no hay un beneficio directo ni inmediato, como se les explicó cuando se solicitó su
participación en el estudio.
Todos los datos obtenidos se manejaron con código para asegurar la confidencialidad
de los datos y evitar sesgos en las tipificaciones.
Ya que este proyecto es parte de una línea de investigación en trasplante, se le hizo
saber al paciente que el DNA obtenido se almacenaría a -70°C y dada su característica podría
utilizarse en otros proyectos de la línea. Esto se le explicó en la carta de consentimiento
solicitando su anuencia para ello (ANEXO I).
Las dudas derivadas del proyecto fueron resueltas al paciente a través de los médicos
nefrólogos colaboradores del proyecto en el HCGFAA.
El proyecto fue aprobado por el Comité de Enseñanza, Investigación y Ética HCGFAA,
con fecha del 30 de mayo de 2007, en el Oficio No. 1314/07 con Registro No. 025/07 (Anexo
VII).
La presente investigación cumplió con los requisitos del Reglamento de la Ley General
de Salud en Materia de Investigación para la Salud (publicada en el Diario Oficial de la
21
Federación el 03 de febrero de 1983) y se da cumplimiento a los artículos 13 y 14, del Título
Segundo y de acuerdo al artículo 17 de la misma ley.
El manejo de los pacientes y la información derivada del estudio se adecuaron a los
lineamientos de la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial sobre Principios
Éticos para las Investigaciones Médicas en Seres Humanos en los artículos 18, 19, 20, 21 y 22
y todas sus modificaciones hasta el momento.
TAMAÑO DE LA MUESTRA
Estudio exploratorio no probabilístico de casos consecutivos (por conveniencia)
Pacientes. Se captaron 101 pacientes que fueron trasplantados entre mayo de 1996 y
octubre de 2008, solo 50 tuvieron los datos clínicos completos.
Población de referencia. Se captaron 102 individuos sanos como referencia para
obtener las frecuencias alélicas y genotípicas de población general.
GENOTIPIFICACIÓN
Cuando el paciente acudió a la consulta rutinaria para vigilancia del injerto, se tomaron
3 a 5ml de sangre periférica anticoagulada con EDTA. Una vez obtenido el consentimiento
informado se obtuvieron leucocitos de esta muestra y se realizó la extracción de DNA
genómico después de lisar las células y precipitar las proteínas según Miller y cols., 1988. La
tipificación de los polimorfismos de CYP3A5 se realizó mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y corte con la enzima de restricción DdeI (PCR-RFLP), como se ha descrito
previamente (Fukuen y cols., 2002).
El procedimiento completo se describe a continuación:
I) Extracción del DNA
A partir de 3-5 ml de sangre periférica anticoagulada con EDTA se obtuvieron los
leucocitos y se realizó la extracción de DNA genómico después de lisar las células y precipitar
las proteínas con sales según Miller y cols., 1988.
22
1.- La muestra de sangre se trató con una solución hipotónica para obtener el paquete
de leucocitos añadiendo 2 volúmenes de NH4Cl 0.144M y NH4HCO3 0.01M para lisar los
eritrocitos, se centrifugó 15 minutos a 2500 rpm. Se decantó el sobrenadante y se repitió la
lisis hasta obtener el paquete de leucocitos libre de hemoglobina y eritrocitos.
2.- Se resuspendió el paquete de leucocitos en 3 ml de buffer de lisis (Tris 10 mM,
NaEDTA 2 mM y NaCl 400 mM), se agregaron 200 uL de SDS al 10% y 500 uL de proteínasa
K (Proteínasa K 1 mg/ml en SDS al 10% y Na2EDTA 2 mM). Se incubó a 37ºC toda la noche o
a 68ºC durante 1 hora y se añadió 1 ml de NaCl 6M, se agitó durante 1 minuto y se
centrifugó durante 15 minutos a 10,000 rpm
3.- El sobrenadante se pasó a un tubo limpio y se añadieron 2 volúmenes de etanol
frío, se agitó suavemente hasta que apareció el DNA (una hebra blanquecina)
inmediatamente se transfirió a otro tubo que ya tiene 1 ml de etanol al 70% y se centrifugó
durante 1 minuto a 10,000 rpm. El lavado se repitió 2 veces mas con etanol al 70%, el último
lavado se realizó con etanol absoluto.
Se decantó el etanol y se dejó secar al aire libre por unos minutos (para permitir la
evaporación del resto de etanol).
4.- El DNA se resuspendió en un volumen apropiado (200 – 1000 uL) de buffer (tris 10
mM, EDTA 0.2 mM, a pH de 8.0) y se agitó a temperatura ambiente hasta que el paquete se
resuspendió totalmente.
La muestra obtenida se cuantificó mediante espectrofotometría 260 nm y a 280 nm. La
relación entre ambos resultados (DNA/proteínas) debió ser de 1.5 a 2.0 para determinar que
existía mínima contaminación con proteínas.
II) Amplificación de un segmento del intrón 3 del gen CYP3A5 que contiene el cambio 6986
A>G.
La tipificación se realizó mediante PCR a partir de una alícuota de DNA y los iniciadores
específicos (Cuadro 3).
Iniciadores para CYP3A5 6986A>G.
Primer F: 5’CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTCTCA3’
Primer R: 5’CCACGAAGCCAGACTTTGAT3’
23
Cuadro 3. Mezcla de reactivos para la PCR
Reactivo Volumen
Agua Destilada 12.85 µL
Buffer 10X 2.0 uL
MgCl2 (25 mM) 0.8 uL
dNTP´s (mezcla de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) 3.2 uL
Iniciador Sentido 1.0 uL
Iniciador Antisentido 1.0 uL
DNA Taq polimerasa 0.08 uL
DNA 1.0 uL (50 ng/uL)
Volumen final 20uL
La PCR se llevó acabo utilizando las siguientes condiciones de amplificación (Cuadro 4):
Cuadro 4. Condiciones de amplificación
Programa de PCR para CYP3A5 Temperatura
(ºC)
Tiempo
1. Desnaturalización inicial 95 ºC 4 min
2. Desnaturalización 95 ºC 30 seg
2. Alineamiento de los iniciadores 57 ºC 30 seg
3. Extensión o Polimerización 72 ºC 30 seg
4. Repetir desde el paso 2 (ciclos) 39 veces
5. Extensión final 72 ºC 5 min
6. Fin
III.- Corte con enzimas de restricción
Para la identificación de los alelos de CYP3A5, se utilizó la enzima DdeI la cual
reconoce la secuencia 5’CTNAG…3’ y 3’GANTC…5’. Una alícuota del producto de PCR se
sometió a digestión con 10 U de la enzima. Como control de digestión se utilizó el DNA del
plásmido pUC19 el cual contiene 6 sitios de corte para la enzima DdeI. La mezcla de reacción
para llevar acabo la digestión es la siguiente (Cuadro 5).
24
Cuadro 5. Mezcla de reactivos para la digestión del producto de PCR
Reactivos Volumen
Agua destilada 11 uL
Buffer 10X 2 Ul
Enzima 2 uL
Producto de PCR 5 uL
Incubar en baño María a 37ºC durante toda la noche
Volumen final 20uL
Para verificar la digestión y asignar los alelos encontrados se realizó electroforesis en
geles de poliacrilamida al 6% teñidos con plata.
IV) Electroforesis en geles de poliacrilamida.
Antes de preparar la solución de acrilamida/bis-acrilamida se acomodaron las placas de
vidrio del mismo grosor y anchura, dos espaciadores hechos de un material flexible pero
resistente cuya función es determinar el grosor del gel. Luego se acomodó un peine para
definir los carriles en donde se coloca la muestra. Los vidrios ensamblados se colocan en una
bolsa de plástico y luego en un soporte que se utiliza como prensa que ejerce presión y
mantiene fijo todo el sistema. La solución de poliacrilamida, se mezcló por inversión y se
vació inmediatamente entre los vidrios antes de que polimerizara. Se dejó a temperatura
ambiente por 15 a 30 minutos. La solución de poliacrilamida se preparó como se muestra en
Cuadro 6.
Cuadro 6. Reactivos para la preparación del gel de poliacrilamida
Reactivo Volumen
TBE 10X 3.5 ml
Acrilamida (29:1) al 40% 5.25 ml
Agua destilada 26 ml
PSA 10% 300 uL
TEMED 30 uL
Volumen final 35 ml
25
Antes de colocar la muestra en el gel, se mezclaron 2 uL de producto de PCR ó 6 uL de
producto de digestión y 1.5 uL de jugo de azul 6X en el gel que ya se encontraba montado en
la cámara de electroforesis. Se cargó el gel con las muestras no digerida y digerida, de tal
forma que se verificó que hubo producto de PCR (muestra no digerida) y se realizó la
asignación alélica (muestra digerida). También se corrió el control de digestión pUC19 para
verificar el funcionamiento de la enzima. El corrimiento se realizó a 200 volts durante 1.5 h.
Cuadro 7. Preparación de Buffer de carga o jugo azul 6X
Reactivo Concentraciones
Azul de bromofenol 0.25% p/v
Xilencianol 0.25% p/v
Glicerol 30.0% v/v
Los fragmentos de PCR y productos de la digestión se visualizaron después de teñir el
gel con nitrato de plata. El procedimiento de tinción con nitrato de plata se muestra en el
Cuadro 8.
Cuadro 8. Tinción con nitrato de plata.
Reactivos Tiempo
1. Solución fijadora (Etanol absoluto al 10% y Ácido Acético al 0.5%). 5-7 min
2. Plata al 0.2% en solución fijadora. 3-10 min
3. Enjuagar con agua destilada 2 o 3 veces o hasta para quitar el exceso de plata.
4. Solución reveladora (NaOH al 3% y formol al 0.5%). Agitar constantemente
hasta que aparezcan las bandas.
5. Descartar la solución reveladora, enjuagar brevemente y poner nuevamente
solución fijadora.
5-10 minutos
6. Colocar los geles sobre un papel filtro para retirar el exceso de agua que tienen y
secar.
26
V) Asignación alélica
Fukuen S y cols., (2002) desarrollaron un método para la detección más sencilla del
polimorfismo 6986 A>G mediante la obtención de un fragmento de PCR de 200 pb y corte
con la enzima de restricción DdeI (Figura 1). Para lograrlo ellos diseñaron un oligonucleótido
forward que lleva una Citosina (base 22 subrayada) en el extremo 3’ de la secuencia: 5'-CTT
TAA AGA GCT CTT TTG TCT CTC A-3’. Cuando este oligonucleótido se alinea con el ADN
templado que lleva una G (de individuos con el alelo CYP3A5*3) se genera un sitio de corte
para la enzima de restricción DdeI (CTNAG) ya que la G se complementa con la C del
oligonucleótido.
Cuando el fragmento de 200 pares de bases es sometido a digestión con la enzima
DdeI se obtienen 3 fragmentos: 107, 71 y 22 pb. Estos tres fragmentos se generan debido a
que además de la mutación en la base 22, existe un sitio constitutivo de corte para la enzima
en la base 129, de tal manera que siempre habrá un fragmento de 71 pb, pero el fragmento
de 129 se cortará en uno de 107 y 22 pb solo si está presente la mutación (Figura 1).
Cuando el ADN templado lleva una A (alelo CYP3A5*1), el fragmento de 200 pb al corte con
la enzima generará solo los fragmentos de 129 y 71 pb.
Con este procedimiento solo se identifica el cambio A>G en la posición 6986, otras
variaciones en éste gen no pueden se identificadas con esta estrategia ya que solo se analiza
la porción del gen desde el nucleótido 6956 al nucleótido 7155 (es decir 200 pb) con los
oligonucleótidos mencionados.
En la figura 2 se muestra un gel de poliacrilamida con la asignación genotípica en 3
individuos diferentes como ejemplo.
27
Figura 1. Esquema del fragmento de los sitios de corte de la enzima DdeI.
80
102
174
587
298
434458
257-267
129
107
71
129
107
71
200
71
3/3 1/3 1/1
22
1/1 = Homocigoto Silvestre (129 y 71)1/3 = Heterocigoto (129,107,71, 22)3/3 = Homocigoto Mutado (107, 71, 22)
M = marcador de peso molecular pUC18-Hae IIISd = sin digerirD = digeridoCd = control de digestión (ADN pUC 19)
M
Sd D
Cd
22 22
Figura 2. Asignación genotípica en el gel de poliacrilamida.
Nt 6956
Primer F Primer R
Nt 7155
fragmento de 200 pb
6986 A>G
Sitio DdeI
Sitio de corte DdeI
constitutivo
DNA genómico
Alelo Silvestre (6896A)
129 pb
71 pb
107 pb
22 pb
71 pb Alelo Mutado (6986G)
Exón 3 Exón 4
Corte con DdeI
Sitio DdeI
Sitio DdeI
PCR
28
OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES
Cuadro 9. Definición de variables
Tipo de
Variable
Definición operacional Naturaleza Nivel de medición Unidades
Dependiente:
Primer nivel de
CsA medido entre
los días 1-15
después de la
primera dosis del
fármaco de
acuerdo a C2 o
C0.
Rango objetivo de C0
definido como el nivel de
CsA total en sangre tomado
a las 12h después de la
dosis nocturna y justo antes
de la dosis matutina vía oral
medido por inmunoensayo
AxSYM System: 150-300
ng/ml (Ekberg, 2008).
o
Rango objetivo de C2
definido como el nivel de
CsA total en sangre tomado
a las 2 h después de la
dosis vía oral medido por
inmunoensayo AxSYM
System: 800-1200 ng/ml
(Citterio y cols, 2005).
Cualitativa Nominal:
- CsA dentro del rango
objetivo C0 150-300
ng/ml o C2 800-1200
ng/ml.
- CsA por debajo del
rango objetivo C0=
<150 ng/ml o
C2=<800 ng/ml.
- CsA por arriba del
rango objetivo C0=
>300 ng/ml o C2=
>1200 ng/ml.
0= CsA dentro
del rango
objetivo.
1= CsA por
debajo del rango
objetivo.
2= CsA por arriba
del rango
objetivo.
Independiente:
CYP3A5
Genotipo 1,1, 1,3 o 3,3 de
acuerdo al alelo CYP3A5*1
o CYP3A5*3 en el gel de
poliacrilamida determinada
con la presencia de una
adenina o una guanina en
la posición 6986.
Cualitativa. Nominal por PCR-
RFLP.
0= Genotipo 1,1
1= Genotipo 1,3
2= Genotipo 3,3
29
Cuadro 10. Definición de variables intervinientes.
Variable
interviniente
Definición operacional Naturaleza Nivel de medición Unidades
Consumo de
medicamentos
Administración de verapamilo
y/o prednisona
Cuantitativa Continua mg/kg/24h
Género donador Femenino o masculino Cualitativa Nominal Dicotómica
Género receptor Femenino o masculino Cualitativa Nominal Dicotómica
Edad donador Años cumplidos del donador Cuantitativa Discreta Años
Edad receptor Años cumplidos del receptor Cuantitativa Discreta Años
Función renal Depuración de creatinina
calculada por la fórmula
Cockcroft-Gault (Schrier y
Gottschalk, 1997)
Cuantitativa Discreta ml/min
Tiempo isquemia
caliente
Minutos transcurridos desde el
pinzamiento de la arteria renal
del donador, hasta la perfusión
completa del órgano con la
solución preservadora de
órganos.
Cuantitativa Discreta Minutos
Tiempo isquemia
fría
Minutos transcurridos desde la
perfusión completa del organo
con la solución preservadora
hasta su irrigación completa de
sangre del receptor al despinzar
la arteria iliaca.
Cuantitativa Discreta Minutos
Dosis de CsA Cantidad de CsA que recibe el
paciente en 24h
Cuantitativa Discreta mg/kg/24h
30
ANALISIS ESTADISTICO
Las frecuencias alélicas y genotípicas se determinaron mediante conteo directo a partir
de los genotipos observados y se utilizó prueba Ji cuadrada (Guizar-Vázquez JJ, 2001) para
verificar que la población estudiada cumpliera con el equilibrio Hardy-Weinberg (EHW).
Se buscaron diferencias en las frecuencias alélicas entre los grupos poblacionales y la
reportada en nuestro estudio con el programa Arlequín.
En el programa SPSS versión 10.0 utilizando la prueba Kruskal Wallis se realizó la
comparación del promedio del nivel de CsA medidos en C2 (n=35) o C0 (n=15) de acuerdo a
cada genotipo (1,1, 1,3 y 3,3). La formación de estos 2 grupos fue debida a que los rangos
objetivos (rango esperado) no son comparables (para C2 el rango esperado es de 800-1200
ng/dl, y para C0 es de 150-300 ng/dl). Así mismo se realizó Ji cuadrada para rango objetivo
de CsA, rango bajo y rango alto con cada genotipo. Las variables intervinientes y el nivel de
CsA se analizaron mediante correlación lineal simple. En todos los casos se determinó
normalidad de los datos e igualdad de varianzas; en aquellos en que estuvieron ausentes, se
llevó a cabo la prueba alterna correspondiente. Para ajuste de variables confusoras se utilizó
un modelo multivariado en el programa STATA versión 7.0. Las gráficas se elaboraron con el
programa SIGMA Plot versión 7.0 y Excel versión 2003. Se consideró una p <0.05
estadísticamente significativa.
31
RESULTADOS
De las listas de pacientes trasplantados y vigentes en la consulta de Nefrología del
HCGFAA, se captaron en total 101 pacientes que recibieron un trasplante entre 1996 y
octubre del 2008 y sus respectivos donadores. Solo 50 pacientes tuvieron los datos clínicos
de interés completos. También se tipificaron 102 individuos de la población general como
referencia poblacional, esto es requisito en todo estudio de asociación genética para tener
referencia del comportamiento del gen en cuestión en la población (población general) de
donde provienen los sujetos de estudio (pacientes trasplantados).
Los datos demográficos de los pacientes se muestran en las Figuras 3-5 y las
características clínicas consideradas para el análisis estadístico multivariado en el Cuadro 11.
Datos demográficos de los pacientes
Los pacientes que más se someten a trasplante son del género masculino (74%) como
se muestra en la Figura 3.
Distribución por género de los pacientes
74%
26%
Figura 3. Distribución por género de los pacientes con trasplante renal (n=50)
Masculino
Femenino
32
Es más frecuente la donación de riñón de donador vivo que la de donador cadavérico
(72 y 28% respectivamente) resaltando que el 54% fueron donadores del género femenino
(Figura 4) y 38% específicamente a receptores del género masculino.
Distribución por género de los donadores
46%
54%
Figura 4. Distribución por género de los donadores renales (n=50).
La principal causa de la insuficiencia renal (Figura 5) que motivó el trasplante fue de
origen desconocido en 38 pacientes (76%).
0
20
40
60
80
%
1
Causa
Causa de IRC
Desconocido HAS DM Poliquistosis
DM y HAS V Neurogénica GMN
Figura 5. Motivo del trasplante renal (n=50)
Femenino
Masculino
33
Cuadro 11. Características analizadas de los pacientes estudiados.
n=50 Media DE n
Nivel C2 mg/ml 630.89 386.74 35
Nivel C0 mg/ml 301.11 226.75 15
Edad del receptor (años) 32.84 15.35 50
Tiempo isquemia fría (min) 170.51 207.81 47
Tiempo isquemia caliente (min) 4.14 8.62 46
Depuración de creatinina (ml/min) 65.59 21.58 50
Dosis de CsA mg/kg/24h 4.82 1.72 50
Dosis de prednisona mg/kg/24h 0.62 0.20 50
Dosis de verapamilo mg/kg/24 1.71 1.86 50
Edad del donador (años) 31.80 12.88 50
DE= Desviación estándar
Frecuencias alélicas y genotípicas en población general y pacientes
Las muestras de población general y las de los pacientes se tipificaron y se obtuvieron
las frecuencias alélicas y genotípicas por conteo directo. La frecuencia del alelo CYP3A5*1
(considerado el silvestre) fue de 0.353 y 0.380 en población general y pacientes
respectivamente. La distribución de los genotipos en la población general cumple con las
expectativas del EHW (Cuadro 12). Esto no se observó en el grupo de pacientes
trasplantados, con una deficiencia de heterocigotos, respecto a lo esperado (p<0.05). El alelo
CYP3A5*3 fue el más frecuente (0.647 en población general y 0.620 en pacientes), como se
ha observado en la mayoría de las poblaciones como en la caucásica y asiática en donde la
frecuencia de este alelo es hasta de un 95% y 78% respectivamente, a diferencia de la
población de ascendencia africana en la que solo la presenta el 30-48% de los individuos
(Thervet y cols., 2005, MacPhee y cols., 3005, Daly y cols., 2006 y Hu y cols., 2006).
Además, cuando se compararon las frecuencias alélicas CYP3A5*1 y CYP3A5*3 reportadas en
las diferentes poblaciones se encontró mayor similitud con la población mestiza de
Centroamérica (datos no mostrados).
34
Cuadro 12. Alelos y genotipos en población general y población estudiada
para determinar el EHW
Genotipos Observados Esperados χχχχ2 p
Población General
n=102
1,1 16 p2*n=13
1.68 >0.05 1,3 40 2pq*n=46
3,3 46 q2*n=43
Pacientes n=50
1,1 13 p2*n=7
13.03 *<0.001 1,3 12 2pq*n=24
3,3 25 q2*n =19
* No existe equilibrio genético (EHW) en la población de pacientes. Frecuencia alelo 1 (p) en Población General: [(16x2)+40]/204 = 0.353. Frecuencia alelo 2 (q) en Población General:[(46x2)+40]/204 = 0.647. Frecuencia alelo 1 (p) en Pacientes: [(13x2)+12]/100 = 0.380. Frecuencia alelo 2 (q) en Pacientes: [(25x2)+12]/100 = 0.620.
Participación de las variables clínicas y los genotipos de CYP3A5 en el
nivel de CsA
Al dividir los pacientes por genotipo, encontramos la presencia del genotipo 3,3
en mayor proporción (52%) y además la mayoría de los niveles de CsA se encontraban en
nivel bajo (58%) como se muestra en la figura 6.
35
Genotipo CYP3A5
3,31,31,1
Núm
ero
de p
acie
ntes
20
10
0
Nivel por rango
bajo
esperado
alto
Figura 6. Niveles por rango de CsA de acuerdo a cada genotipo
Al analizar los genotipos de acuerdo a los niveles de CsA integrados en rango objetivo, rango
bajo o rango alto no se encontró asociación entre el genotipo y el rango como se muestra en
el Cuadro 13.
Cuadro 13. Comparación del genotipo con el nivel por rango de CsA
Genotipo Bajo Esperado Alto Total
1,1 8 3 2 13
1,3 4 1 6 11
3,3 17 6 3 26
Total 29 10 11 50 χχχχ2 = 8.84 p= 0.065
Como ya se mencionó los rangos esperados no son equivalentes en C2 y C0, de tal forma que
separando cada grupo de pacientes nuevamente se buscó asociación de los genotipos de
CYP3A5 sobre el nivel de CsA, comparando el valor promedio del nivel en C2 y C0 (35 y 15
respectivamente) mediante la prueba Kruskal Wallis. Como se observa en la figura 7 y en el
Cuadro 14 ningún genotipo condicionó el nivel del inmunosupresor.
8
4
17 8
6
1
3
6
2 3
36
Genotipo vs C0
1,1 1,3 3,3
C0
0
100
200
300
400
500
600
Genotipo vs C2
Nivel de CsA en función del genotipo
1,1 1,3 3,3
C2
0
200
400
600
800
1000
n.s.
Figura 7. Nivel de CsA promedio en C2 (n=35) y C0 (n=15) de acuerdo al genotipo.
Cuadro 14 Comparación del promedio del nivel de CsA en C2 y C0 de acuerdo a cada
genotipo.
Prueba de Kruskal Wallis.
Nivel de CsA Genotipo CYP3A5
n Rango promedio
C2 1,1 7 14.86 1,3 5 20.20 3,3 23 18.48 Total 35
C0 1,1 6 6.67 1,3 6 10.33 3,3 3 6.00 Total 15
Nivel en C2
Nivel en C0
p 0.62 0.25
n=7 n=5 n=23
n=6 n=6 n=3
37
Al realizar la regresión lineal simple para relacionar directamente el nivel de CsA con cada una
de las diferentes variables clínicas intervinientes en función de los genotipos 1,3 y 3,3 (de
riesgo) reveló que para C2 se presenta influencia sobre el nivel si el donador es femenino y
en el nivel de C0, influye la edad del receptor, el consumo de prednisona y verapamilo
(Cuadro 15).
Cuadro 15 Correlación lineal de las variables intervinientes con el nivel de CsA en C2 y C0 por
separado.
n=50 Genotipo
con
alelo 3
Edad
receptor
Receptor
femenino
Isquemia
fría
Isquemia
caliente
Función
Renal
Dosis
de CsA
Pred Verap Edad
donador
Donador
femenino
C2
(n=35)
r=0.09
p=0.58
r=0.03
p=0.85
r=-0.18
p=0.29
r=-0.22
p=0.21
r=0.30
p=0.09
r=-0.32
p=0.07
r=-0.06
p=0.69
r=-0.22
p=0.19
r=0.24
p=0.15
r=0.22
p=0.18
r=0.36
p=0.04
C0
(n=15)
r=0.08
p=0.77
r=0.59
p=0.02
r=0.20
p=0.45
r=0.05
p=0.86
r=0.07
p=0.79
r=-0.12
p=0.66
r=-0.46
p=0.07
r=-0.53
p=0.03
r=0.65
p=0.00
r=-0.04
p=0.86
r=0.07
p=0.80
Correlación de Spearman
En virtud de que los genes no actúan solos, sino como parte de una vía metabólica compleja
donde influyen múltiples factores, como se hizo evidente en las pruebas de correlación
separando los niveles C2 y C0, se analizaron en conjunto las variables clínicas intervinientes
mediante modelos multivariados. Los modelos resultantes significativos aparecieron solo en el
grupo de C0 y se muestran en los Cuadros 16 y 17.
Los datos en C0 en el modelo multivariado considerando cada genotipo (1,1, 1,3 y 3,3)
hicieron evidente la participación del genotipo 1,3 en la acumulación del inmunosupresor
aumentando 323 ng/ml el nivel de CsA. La edad del receptor y el género del donador también
formaron parte del modelo y en conjunto con la isquemia caliente y la edad del donador se
explica el 97% del comportamiento de los niveles de CsA en C0.
38
Cuadro 16. Modelo multivariado en C0 considerando los genotipos.
C0 (n=13) Coeficiente de regresión b p Intervalo de confianza 95%
Genotipo CYP3A5*1/3 323.33 0.00* 242.80-403.86
Donador femenino 663.87 0.00* 512.17-815.58
Edad del receptor (años) 17.23 0.00* 13.85-20.64
Edad del donador (años) -16.67 0.00* -21.55--11.79
Isquemia caliente (min) 46.23 0.00* 32.81-59.65
(r2=0.97, p=0.00).
En este modelo todas las variables influyen importantemente en el nivel de C0 incluyendo el genotipo heterocigoto.
Cuadro 17. Modelo multivariado en C0 considerando el alelo 3.
C0 (n= 13) Coeficiente de regresión b p Intervalo de confianza 95%
Alelo CYP3A5*3 143.79 0.01 40.94-246
Edad del receptor (años) 7.3 0.00 3.22-11.39
Verapamilo (mg/kg/24h) 92.5 0.00 61.86123.14
Isquemia fría (min) -1.1 0.00 -1.7--0.52
(r2=0.93, p=0.00).
En este modelo el comportamiento de los niveles de CsA en C0 se explica por la participación del propio alelo 3 además de la
edad del receptor, verapamilo e isquemia fría.
Como se puede apreciar en el modelo multivariado considerando el alelo de riesgo (1,3
y 3,3) encontramos de forma persistente que la que la edad del receptor y si toma
verapamilo se elevará el nivel del fármaco aumentándolo 7ng/ml por cada año del receptor y
93ng/ml si toma el fármaco. Se observa de forma interesante que el propio alelo CYP3A5*3
aumenta el nivel en 144ng/ml así como el tiempo de isquemia fría disminuye 1ng/ml por cada
minuto que pasa.
39
DISCUSIÓN
Los pacientes con capacidad genética de producir más cantidad de proteína CYP3A5
presentan ventajas con respecto a los que tienen menor capacidad para metabolizar la CsA a
través de este citocromo (CYP3A5*1 vs CYP3A5*3). En este estudio el alelo CYP3A5*3 se
encuentra en mayor proporción en la población estudiada. Este es el alelo que no producirá
proteína CYP y por lo tanto podría considerarse que los individuos que portan éste alelo
podrían acumular el IC con facilidad.
El hallazgo principal en este estudio es que los portadores del genotipo de riesgo:
CYP3A5*1,3 Y 3,3 no muestran asociación con el aumento de los niveles de CsA.
El que exista asociación del polimorfismo CYP3A5*3 en diversos estudios en población
china considerando la medición C0, pero no sea consistente en caucásicos como se puede
observar en el cuadro 2 (Hu YF y cols., 2006, Eng y cols., 2006 y Qiu y cols., 2008) o en los
hallazgos de nuestro estudio pudiera reflejar la participación de otros genes que también
participan en el metabolismo o transporte del fármaco como CYP3A4, CYPCA7, MDR1, etc., y
posiblemente tendrán en conjunto implicaciones clínicas importantes en individuos con
trasplante renal (Goodman-Gillman y cols., 2006 Kapelyukh y cols., 2008, Gottlieb, 2008). Es
muy probable que en un futuro cercano el conocimiento de estos factores genéticos
considerando todos los genes en conjunto mas los factores ambientales permitirán una
prescripción del fármaco particularizando el tratamiento en cada paciente antes del
trasplante.
Cabe señalar, que este estudio es el primero en México que incluye la determinación
de las frecuencias alélicas y genotípicas de CYP3A5. La información previa dada a conocer por
MacPhee y cols., 2004 de una universidad Londinense sobre la frecuencia del alelo CYP3A5*1
en mexicanos, es comparable con la frecuencia encontrada en nuestra población (30% contra
36.6% de este estudio). Además las frecuencias de la población mexicana en nuestro estudio
son comparables con la población mestiza de Centroamérica.
Se ha especulado que en México existen diferencias de estructura poblacional en las
regiones norte, centro y sur del país (Gorodezky y cols., 2001). Sin embargo algunos estudios
considerando individuos originarios de zonas urbanas grandes de los estados de Nuevo León
40
(Cerda-Flores y cols., 2002), Jalisco y D.F. (Leal y cols., 2005) ponen en duda esta idea. En
esos trabajos no se demuestran diferencias si se considera solo la población mestiza y este
comportamiento pudiera ser el mismo en otras zonas urbanas del país. De acuerdo con la
historia clínica de los pacientes estudiados en este trabajo, todos son mestizos mexicanos y
esto asegura que no existe subestructura poblacional. Por ello consideramos que los datos
obtenidos aquí podrían extrapolarse a otros grupos mestizos urbanos del país.
La distribución de los genotipos de la población general cumple con las expectativas del
EHW (Cuadro 12), esto no se observó en el grupo de pacientes, ya que hubo una deficiencia
de heterocigotos (p<0.001). Es decir, el alelo CYP3A5*3 se encontró en mayor proporción
que lo esperado por azar, esto podría significar que hay una segregación preferencial del
alelo mutado como se ha observado en la población centroamericana, caucásica y asiática
(Thervet y cols., 2005, MacPhee y cols., 2005, Daly y cols., 2006 y Yong-Fang Hu y cols.,
2006). Si este comportamiento tiene algún significado evolutivo es motivo de otros estudios.
Los resultados de este estudio confirman que los pacientes que más se trasplantan en
Jalisco son los que cuya causa de la insuficiencia renal es de origen desconocido y los del
género masculino (García y cols., 2005).
41
PERSPECTIVAS
Se hace evidente la participación de variables clínicas en el nivel de CsA, ya que la sola
presencia de las variantes genotípicas no explicaron la variación en los niveles de CsA, por lo
tanto otros factores como estado nutricional, soluciones de preservación, genotipo del
donador, etc. posiblemente también sean relevantes para mantener en los rangos blanco el
inmunosupresor. De acuerdo a los resultados es recomendable continuar con la realización de
este tipo de estudios no sólo en un número de muestra mayor y en individuos sanos con
estudios formales de farmacocinética y farmacodinamia, así como en otros tipos de trasplante
que se llevan a cabo en nuestra región y en nuestro país. Más aún, que el conocimiento de la
información genética de un candidato a trasplante sea considerado en un futuro dentro de la
batería de estudios requeridos para su realización sugiriendo incluso estudios de asociación
con un cálculo de tamaño de muestra estimado de 66 casos y 131 controles de acuerdo a los
datos obtenidos en este estudio y utilizando el programa PAWE para el cálculo
(http://linkage.rockefeller.edu/pawe/pawe.cgi).
Como ya se mencionó existen otros genes que participan en el metabolismo y
depuración de los inmunosupresores como los de la familia MDR además de otros dentro de
la propia familia CYP, los cuales son candidatos a considerar en estudios posteriores a fin de
contar con un panorama más completo que permita comprender de manera más clara e
integradora a la farmacocinética de los inmunosupresores utilizados en trasplante. Cuanto
mayor sea la información que se tenga de un paciente que va a ser trasplantado, mayor será
la probabilidad de asegurar la sobrevida de injerto y en consecuencia mayor y mejor la
calidad de vida del paciente trasplantado.
42
CONCLUSIONES
1. Los genotipos con la presencia del alelo CYP3A5*3 no participan en el incremento del
nivel de CsA en la población con trasplante renal de Hospital Civil de Guadalajara Fray
Antonio Alcalde.
2. La frecuencia del alelo CYP3A5*3 en población mexicana es similar a la reportada en
centroamericanos y significativamente menor que la reportada en caucásicos.
3. Es posible que la edad del receptor y el género femenino pudieran participar junto con
la presencia del alelo CYP3A5*3 en el aumento del nivel de CsA en C0.
43
ANEXO I: Carta de consentimiento informado para paciente receptor de trasplante renal (1)
FORMA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA PARTICIPAR EN PROYECTOS EN EL PROYECTO
“ASOCIACIÓN DEL POLIMORFISMO CYP3A5, EN EL NIVEL SÉRICO DE CICLOSPORINA EN LOS PACIENTES CON TRASPLANTE RENAL DEL HOSPITAL CIVIL DE GUADALAJARA FRAY ANTONIO
ALCALDE”. No. Oficio del consejo de Etica: 1314/07
La presente es para hacer manifiesto que:
Me han invitando a que participe en un proyecto de investigación que consiste en determinar algunas variantes de genes, para saber si existe una combinación particular de estas variantes que tenga alguna influencia en el resultado del trasplante. Acepto que la autorización para obtener mi DNA es altruista y no obtendré beneficio directo alguno. Se me ha explicado que la información que se obtenga, no tendrá ninguna utilidad directa para mi tratamiento, pero en el futuro podría ayudar a que los procedimientos de trasplante sean de mayor beneficio, para la administración y manejo de medicamentos en los pacientes con algún trasplante. Me queda claro que toda información referente a mi persona se mantendrá en estricta confidencialidad. Estoy conciente de que mi participación es voluntaria y consiste sólo en autorizar que se me tome una muestra de sangre (aproximadamente 5-10 ml) para obtener mi DNA, la obtención de la muestra será mediante punción venosa y no representa un riesgo mayor. Al mismo tiempo, me ha sido explicado que si me niego a donar mi DNA no habrá ninguna consecuencia para la atención que el Hospital ofrezca a mi persona, mis familiares o conocidos. Se me entregará una copia de esta forma para mi archivo personal. Manifiesto que he hablado con alguno de los investigadores resolviendo a satisfacción todas mis dudas y queda abierta la posibilidad de resolver cualquier otra duda que exista en el futuro a los siguientes teléfonos: En el Hospital Civil, a la Dra. Margarita Ibarra Hernández al el teléfono 3614-5501 o 3614-7501 ext.273 o 272.
44
ANEXO I: Carta de consentimiento informado para paciente receptor de trasplante renal (2)
Código de Muestra_______________
FORMA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA PARTICIPAR EN PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN DE TRASPLANTE
LUGAR Y FECHA _______________________________________________________________________ _______________________________________ _____________________________ Nombre, firma y teléfono del participante o de su Nombre y firma del Investigador Tutor Responsable _______________________________________ ______________________________ Testigo (Nombre y Firma) Nombre y puesto de la persona Que obtuvo el consentimiento Estoy de acuerdo además, que si existiera sobrante de mi muestra pueda ser utilizado en proyectos futuros de investigación una vez que éstos sean aprobados por los comités de ética del HCGFAA, quedando la información de mi persona en estricta confidencialidad. ________________________________________ Nombre y firma del participante o de su Tutor
45
ANEXO II: Hoja de vaciamiento de datos clínicos del paciente receptor de trasplante renal.
CODIGO: Fecha: TEL.
Antecedentes de extranjeros en la familia:
ALELOS CYP3A5:
HLA-R: HLA-D:
Edad: Sexo: Fecha Trasplante:
Causa IRC: Isquemia fría: Isquemia caliente:
Sol. de Preservación: No. de Rechazos:
Fechas de Rechazo y/o toxicidad
Creatinina en el momento
Inmunosupresión
1m
3 m
6 m
1a o más
Características
1 m
3 m
6 m
1ª o más
Datos en relación a CsA
Gluc Creat Colest TG Nivel de CsA Peso
5-15 días
1º mes
3º mes
6º mes
1 año o más
Fecha
Otras Complicaciones
Reclasificación x biopsia
DONADOR
Edad: Sexo: Relación con el receptor:
46
ANEXO III: Carta de consentimiento informado a donadores sanos.
HOSPITAL CIVIL DE GUADALAJARA “FRAY ANTONIO ALCALDE ”
DEPARTAMENTO DE NEFROLOGIA Calle Hospital 278, S.H., Quinto piso de la Torre de Especialidades. CP 44280. Guadalajara, Jal.
Tels: 36145501 y 36147244 ext 272 y 273 No. Oficio del consejo de Etica: 1314/07
CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO DONADORES SANOS P ARA PROYECTOS DE
TRASPLANTE La presente es para hacer manifiesto que: He sido invitado a donar mi material genético (DNA) como muestra de población abierta que servirá como referencia para diversos estudios sobre enfermedades que existen en la región occidente de México. Se me ha explicado que el análisis de este material no servirá para identificar alguna enfermedad o padecimiento que tenga en este momento, sólo será útil para fines de comparación poblacional. Tengo claro que la muestra donada NO será identificada con mi nombre, de modo que su identidad será anónima, por lo que entiendo que tanto los investigadores como yo no tendremos posibilidad de conocer mis resultados en particular. Estoy conciente de que mi participación es voluntaria y consiste sólo en autorizar que el sobrante de la muestra de mi sangre que obtuvo el Banco de Sangre sea utilizada para obtener mi DNA. Este DNA será almacenado sin que se sepa a quién pertenece. Acepto que la autorización para obtener mi DNA es altruista y no obtendré beneficio directo alguno. Al mismo tiempo, me ha sido explicado que si me niego a donar mi DNA no habrá ninguna consecuencia para la atención que el Hospital ofrezca a mi persona, mis familiares o conocidos. Manifiesto que se me han explicado satisfactoriamente los alcances y objetivos de mi donación. Lugar y fecha: ______________________________________________________________ Nombre y firma del participante Investigador Responsable Dra. Margarita Ibarra Hernández Hosp. Civil “Fray Antonio Alcalde” _________________________________________ _________________________ Investigador Responsable Testigo (Nombre y Firma) D en C Caridad A. Leal Cortés Centro de Investigación Biomédica de Occidente Copia para el investigador Copia para el participante
47
ANEXO IV: Hoja de vaciamiento de datos de la población general.
HOSPITAL CIVIL DE GUADALAJARA “FRAY ANTONIO ALCALDE ”
DEPARTAMENTO DE NEFROLOGIA Calle Hospital 278, S.H., Quinto piso de la Torre de Especialidades. CP 44280.
Guadalajara, Jal. Tels: 36145501 y 36147244 ext 272 y 273
Formato Para Colección De Datos para DONADORES SANOS
Número de muestra: Fecha:____________________________________ Título del Proyecto_______________________________________________________________ Antecedentes de padres o abuelos extranjeros _______________________________________________________________________________ Iniciales del Nombre:_______________________________________________________________ Lugar de Nacimiento_______________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ Sexo_________________ Edad__________ PADRE Lugar de Nacimiento ________________________________________________________ Origen Abuelo Paterno: __________________Origen Abuela Paterna:_______________________ MADRE Lugar de Nacimiento________________________________________________________ Origen Abuelo Materno______________Origen Abuela Materna____________________________ OBSERVACIONES_______________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ALELO CYP3A5:_______________________________________________________________________
48
ANEXO V : Medicamentos que interfieren con Ciclosporina
LISTA DE MEDICAMENTOS QUE INTERFIEREN CON EL METABO LISMO DE CICLOSPORINA
Inhiben CYP 450 – disminuyen mtabolismo – aumentan niveles de CyA: Bloqueadores de canales de calcio: Diltiazem. Nicardipina. Verapamilo. Antimicóticos: Fluconazol. Itraconazol. Ketoconazol. Antibióticos: Claritromicina. Eritromicina. Quinupristina/Daldopristina. Glucocorticoides: Metilprednisolona. Fármacos gastrointestinales: Metoclopramida. Otros: Alopurinol. Bromocriptina. Colchicina. Danazol. Amiodarona. Inducen CYP450 – aumentan metabolismo – disminuyen niveles de CyA: Antibióticos: Rifampicina. Nafcilina. Anticonvulsivantes: Carbamacepina. Fenobarbital. Fenitoína. Otros: Ocreotido. Ticlopidina. Orlistat. St. John`s Wort.
Current and Evolving Immunosuppressive Regimens in Kidney Transplantation. Gaston R.S. Am J Kidney Diseases 2006; 47 (4), Suppl 2: S3-S21.
49
ANEXO VI: Glosario del proyecto polimorfismos de citocromo P450 y ciclosporina
ALELO : Uno de los pares de genes que ocupa un locus en el cromosoma. Cada gen tiene dos alelos. CODON: Triplete de tres nucleótidos, en una molécula de DNA o RNA, que son decodificados por el ribosoma a un AA específico (CAT, TAG, GAT, etc). C0: Nivel de Ciclosporina medido a las 12 h posterior a la toma.
C2: Nivel de Ciclosporina medido a las 2 h posterior a la toma.
DIPLOIDE: Estado de la célula o de un organismo que contiene un set de cromosomas de cada padre pero las células sexuales (óvulo y espermatozoide) son haploides. EQUILIBRIO GÉNICO: Se dice de una población cuando la frecuencia de los homocigotos y heterocigotos va de acuerdo con la ley de Hardy Weinberg. Para averiguarlo se analizan los resultados que arroja una investigación de campo (X2). EUPLOIDE: Estado de la célula o de un organismo que tiene íntegros todos sus cromosomas (Ploid), excluyendo los cromosomas sexuales. Ejem: humano tiene 46 cromosomas. FARMACOCINETICA: Parte de la farmacología que estudia el paso de los medicamentos por el organismo. FARMACODINAMIA: Parte de la farmacología que estudia el efecto del fármaco (acción) en el organismo. FARMACOGENÉTICA: Es el estudio de las bases genéticas (fenotipo-genotipo) de una familia de genes en el individuo que interfieren en la “variabilidad de respuesta” al utilizar fármacos, permitiendo así una medicina personalizada. FARMACOGENÓMICA: Es el estudio de las bases genéticas (fenotipo-genotipo) de varias familias de genes que interfieren en la “variabilidad de respuesta” al utilizar fármacos, permitiendo así una medicina personalizada. FENOTIPO: Es la manifestación física del organismo: Todas las partes físicas como los átomos, moléculas, células, estructuras, metabolismo, tejidos, órganos, reflejos, comportamiento, etc. Todo lo que es parte de la estructura observable. FRECUENCIA ALELICA: Numero total de alelos de un gen (ejemplo del CYP3A5: *3 o *1 en una población específica). FRECUENCIA GENOTIPICA: Numero de combinaciones de alelos de algún tipo, dando homocigotos o heterocigotos (ejemplo del CYP3A5: Homocigoto *3/*3, Heterocigoto *1/*3 y Homocigoto *1/*1).
50
GENOMA: Es el grupo completo de secuencias del material genético de un organismo. Incluye la secuencia de cada cromosoma además del DNA in los organelos. GENOTIPO: Es la maquinaria celular para producir un resultado físico. Es la información heredable internamente codificada y que lo tiene cada organismo vivo. Es la información que se utiliza como instrucciones para formar y mantener una criatura viva. Se localiza en la célula por medio de un lenguaje codificado para controlar desde la formación de proteínas en macromoléculas hasta la regulación del metabolismo y síntesis. No siempre se expresa como fenotipo, pero tiene la posibilidad de heredarse. HAPLOTIPO: Combinación de polimorfismos o cambios de alelos posibles de los polimorfismos en una región particular del cromosoma. LEY DE HARDY WEINBERG: Cuando la composición genética de una población permanece en equilibrio mientras no actúe la selección natural ni ningún otro factor y no se produzca ninguna mutación. Es decir, la herencia mendeliana, por sí misma, no engendra cambio evolutivo. Se utiliza en genética de poblaciones. Afirma que tras una generación de apareamiento al azar, las frecuencias de los genotipos de un locus individual se fijarán en un valor de equilibro particular. En una población con apareamientos al azar, las frecuencias alélicas permanecen constantes de generación en generación y las frecuencias genotípicas están en función de la frecuencias alélicas. LIGAMIENTO (Linkage): Describe la tendencia de genes que serán heredados en conjunto, como resultado de su localización en el mismo cromosoma, se mide por el porcentaje de recombinación entre loci. LOCI: Plural de locus LOCUS: Es la posición en un cromosoma en el cual un gen en particular reside. El locus puede ser ocupado por cualquier alelo del gen. MUTACION: Cualquier cambio heredable en la secuencia de DNA de un organismo. NUCLEOTIDO: La unidad estructural de los ácidos nucleicos compuesta de base nitrogenada (purina o pirimidina), un azúcar (ribosa o desoxirribosa) y un grupo fosfato. PIRIMIDINAS: Citocina, Timina y Uridina en el RNA porque ahí no hay timina. PLOIDÍA: Es el número de set cromosómico homólogo en la célula. Pueden variar dependiendo de cada organismo. POLIMORFISMO: Cuando la frecuencia del alelo en la población es más del 1% SIN causar enfermedad. Se refiere a la ocurrencia simultánea en la población de genomas que muestra variaciones en algunas posiciones. Describe cambios del DNA que afectan la restricción del patente o la secuencia.
51
PSEUDOGEN: Parte inactiva del gen (Producto de la evolución) sin función codificadora pero puede reconocer secuencias similares con los genes funcionales existentes. PURINAS: Adenina y Guanina RFLP: Restriction Fragment Length Ploymorphism (Polimorfismos de longitud para fragmentos de restricción. XENOBIÓTICO: Toda sustancia química exógena que, incorporada al organismo vivo a determinada concentración, produce en virtud de su estructura química a través de mecanismos bioquímicos, alteraciones de la fisicoquímica celular, que pueden ser transitorias o permanentes, siempre incompatibles con la salud y en algunos casos con la vida.
52
ANEXO VII: Oficio aprobatorio del Comité de Enseñanza, Investigación y Ética.
Documento aprobatorio del proyecto “Asociación de los polimorfismos CYP3A5, en el nivel
sérico de ciclosporina en los pacientes con trasplante renal del HCGFAA” con fecha de mayo 30, 2007, Oficio No. 1314/07
53
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