HIBRIDACIÓN SOMÁTICA EN CÍTRICOS PARA LA...
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DOCTORADO EN CIENCIAS, AREA: BIOTECNOLOGIA HIBRIDACIÓN SOMÁTICA EN CÍTRICOS PARA LA OBTENCIÓN DE PORTAINJERTOS T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA PRESENTA: VÍCTOR MANUEL MEDINA URRUTIA ASESORES: DR. JUDE W. GROSSER DR. ALFONSO PESCADOR RUBIO TECOMÁN, COLIMA, MÉXICO., DICIEMBRE DE 2004 UNIVERSIDAD DE COLIMA
Transcript of HIBRIDACIÓN SOMÁTICA EN CÍTRICOS PARA LA...
DOCTORADO EN CIENCIAS, AREA: BIOTECNOLOGIA
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T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA: VÍCTOR MANUEL MEDINA URRUTIA
ASESORES:
DR. JUDE W. GROSSER DR. ALFONSO PESCADOR RUBIO
TECOMÁN, COLIMA, MÉXICO., DICIEMBRE DE 2004
UNIVERSIDAD DE COLIMA
DOCTORADO EN CIENCIAS, AREA: BIOTECNOLOGIA
HHIIBBRRIIDDAACCIIÓÓNN SSOOMMÁÁTTIICCAA EENN CCÍÍTTRRIICCOOSS PPAARRAA
LLAA OOBBTTEENNCCIIÓÓNN DDEE PPOORRTTAAIINNJJEERRTTOOSS
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA: VÍCTOR MANUEL MEDINA URRUTIA
ASESORES:
DR. JUDE W. GROSSER DR. ALFONSO PESCADOR RUBIO
TECOMÁN, COLIMA, MÉXICO., DICIEMBRE DE 2004
UNIVERSIDAD DE COLIMA
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias y las
autoridades en Oficinas Centrales, Regionales y Estatales, por permitir mi desarrollo
como profesionista y otorgarme facilidades para realizar el Programa Doctoral.
A la Universidad de Colima por abrirme las puertas a este programa Doctoral y a los
Profesores de Postgrado por la orientación, y motivación para realizar este proyecto, así
como a mis asesores Roberto lezama, Andres Rebolledo, Jaime Molina y Salvador
Guzmán por la revisión y sugerencias de la Tesis.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y a la Fundación Produce Colima por
haberse interesado en este Proyecto.
A la Universidad de Florida especialmente al Dr. Jude Grosser, Juan Chandler y Patricia
Serrano, quienes pusieron a mi disposición no solo el laboratorio, sino su ayuda
profesional y amistad para efectuar este estudio. Sin este apoyo no hubiéramos logrado
el éxito en el trabajo. Así mismo, a los colegas Oscar Olivares, G. Ananthakrishnan y
W. Guo y Karla López por sus valiosas aportaciones y atinadas sugerencias.
Mención especial merecen los compañeros de trabajo Manuel Robles, José Orozco,
Armando Rivera, Martha Calvario y Luis Antonio González a quienes realmente debo el
producto de este trabajo al brindarme todo su apoyo y cumplir en mi ausencia con
tareas y compromisos importantes durante mi estancia en Florida.
DEDICATORIA
A mí esposa Mayela Villanueva Carrillo. Esta tesis es tuya gracias a tu inquebrantable
fe y constante apoyo que se tradujeron en oxígeno puro, necesario para cumplir el
objetivo trazado.
A mis Hijos Víctor Alejandro, Marcelo Devadip y Pablo Enrique que sacrificaron
Escuelas y Amigos por seguirme y apoyarme.
A mi Madre Francisca; mis hermanos Antonio, Hilda, Silvia (q.e.p.d) y José con cariño y
admiración.
A mis amigos, compadres y compañeros de profesión, la mayoría de los cuales siempre
estuvieron al pendiente de mis progresos académicos alentándome.
A todas aquellas personas que contribuyeron de alguna manera para hacer este
proyecto realidad, esperando me disculpen por omitir involuntariamente su nombre.
A los productores de limón.
CONTENIDO
INDICE DE CUADROS............................................................................... i INDICE DE FIGURAS.................................................................................. ii RESUMEN................................................................................................... iii ABSTRACT........................................... ....................................................... Iv
I. INTRODUCCIÓN...................................................................................... 1
II. ANTECEDENTES.................................................................................... 5 2.1 Importancia de la agroindustria del limón......................................... 5 2.2 Perspectivas de la agroindustria de limón........................................ 5 2.3 La tristeza la principal amenaza del limón........................................ 5 2.4 Clasificación taxonómica de la subfamilia de cítricos....................... 6 2.5 Origen y dispersión de los cítricos.................................................... 9 2.6 Necesidades de mejoramiento de los cítricos.................................. 10 2.7 Caracteres relevantes presentes en especies de la subfamilia........ 14 2.8 Relaciones genéticas entre los cítricos............................................ 17 2.9 Mejoramiento genético clásico de los cítricos.................................. 18
2.9.1 Selección clonal................................................................................. 2.9.2 Hibridación sexual.............................................................................. 2.9.3 Mutagénesis inducida........................................................................ 2.9.4 Hibridaciones interploides..................................................................
19 19 20 21
2.10 Limitaciones de Mejoramiento Genético clásico en los cítricos...... 22 2.10.1 Heterocigosis y depresión por endogamia....................................... 2.10.2 Esterilidad e incompatibilidad sexual............................................... 2.10.3 Apomixis y poliembrionia nuclear.....................................................
2.10.4 Juvenilidad........................................................................................
22 22 23 23
2.11Mejoramiento genético de los cítricos por medio de Biotecnología 24 2.11.1 Manipulación de ploidía................................................................... 2.11.2 Transformación genética.................................................................. 2.11.3 Variación somaclonal...................................................................... 2.11.4 Hibridación somática.......................................................................
24 25 27 27
2.11.4.1 Germoplasma de Cítricos......................................................... 2.11.4.2 Embriogénesis somática.......................................................... 2.11.4.3 Aislamiento de protoplastos y regeneración de plantas........... 2.11.4.4 Métodos de fusión de protoplastos........................................... 2.11.4.5 Selección de los híbridos somáticos........................................ 2.11.4.6 Caracterización de los híbrido somáticos................................. 2.11.4.7 Ventajas de la Hibridación Somatica .......................................
28 29 30 31 34 35 38
2.12 Situación actual del mejoramiento genético de cítricos por Hibridación somática......................................................................
40
2.12.1 Mejoramiento de portainjertos de cítricos mediante hibridación somática......................................................................................................
41
2.12.1.1 Enfermedades inducidas por Phytophthora............................. 2.12.1.2 El virus de la tristeza de los cítricos......................................... 2.12.1.3 El Blight de los cítricos............................................................. 2.12.1.4 Resistencia a nemátodos......................................................... 2.12.1.5 Frío........................................................................................... 2.12.1.6 Salinidad................................................................................... 2.12.1.7 Sequía. ................................................................................... 2.12.1.8 Inundación................................................................................ 2.12.1.9 Factores agronómicos..............................................................
41 42 42 43 43 44 44 44 44
Continúa CONTENIDO ..............................
...................continuación
CONTENIDO
2.12.2 Mejoramiento de variedades de Cítricos por hibridación somática 45 2.12.2.1 Tolerancia al frío....................................................................... 2.12.2.2 Resistencia a enfermedades.................................................... 2.12.2.3 Tolerancia a plagas.................................................................. 2.12.2.4 Producción estacional de fruta................................................. 2.12.2.5 Variedades atractivas para el consumidor...............................
45 45 45 46 46
2.13 Portainjertos y variedades de cítricos genereados por Hibridación Somáticos............................................................................................
46
2.13.1 Portainjertos de cítricos híbridos somáticos (H.S)........................... 47 2.13.1.1 H. S. Intergenéricos sexualmente compatibles........................ 2.13.1.2 H. S. Intergenéricos sexualmente incompatibles..................... 2.13.1.3 H. S. Interespec. entre mandarino y otros Citrus..................... 2.13.1.4 H. S. entre especies de limón y otros cítricos..........................
48 49 51 51
2.13.2 Híbridos somáticos para obtención de variedades.......................... 52 2.14 Cihibridación de cítricos....................................................................... 63 2.15 Fusión de protoplastos en diversos cultivos........................................ 65 2.16 Conclusión........................................................................................... 69 III. MATERIALES Y METODOS.. ................................................................ 70 3.1 Localización........................................................................................... 70 3.2 Establecimiento de experimentos.......................................................... 70 3.3 Cultivo de Callo embriogénico............................................................... 70
3.3.1 Fuentes de callo embriogénico......................................................... 71 3.3.1.1 Cultivo de óvulos de frutos inmaduros...................................... 3.3.1.2 Cultivo de óvulos de frutos maduros.......................................... 3.3.1.3 Cultivos embriogénicos en suspensión......................................
71 72 72
3.4 Aislamiento y purificación de protoplastos............................................. 73 3.4.1 Intervalo de tiempo óptimo de incubación en protoplastos............... 3.4.2 Determinación de la concentración óptima de BH3......................... 3.4.3 Conc. óptima de sacarosa durante el aislamiento de protoplastos... 3.4.4. Efecto del medio de cultivo sobre el rendimiento de protoplastos durante la incubación........................................................................ 3.4.5 Efecto de la duración y velocidad de la centrifugación.....................
73 76 78
78 80
3.5 Experimentos de fusión de protoplastos................................................ 81 3.5.1 Experimento 1. Obtención de híbridos somáticos intergenéricos
entre mandarino Amblicarpa (Citrus amblycarpa Ochse) y diferentes variedades del género Poncirus trifoliata..........................
3.5.2 Experimento 2. Obtención de híbridos somáticos interespecíficos entre mandarino Amblicarpa y líneas monoembriónicas de plántulas de Pomelo (Citrus máxima Burn)........................................
3.5.3 Experimento 3. Obtención de híbridos somáticos intergenéricos entre Macrofila (Citrus macrophylla Wester) y géneros parientes de los cítricos..........................................................................................
3.5.4 Experimento 4. Obtención de híbridos somáticos interespecíficos entre Amblicarpa y especies derivadas del Cidro..............................
3.5.5 Descripción de la metodología de fusión de protoplastos.................
81
82
82
83 84
3.5.5.1 Aislamiento de protoplastos.............................................................. 3.5.5.2 Protoplastos de callo embriogénico en suspensión.......................... 3.5.5.3 Protoplastos de Hoja.........................................................................
84 84 85
Continúa CONTENIDO ..............................
...................continuación
CONTENIDO
3.5.5.3.1 Experimento 1. Trifoliados e Híbridos............................... 3.5.5.3.2. Experimento 2. Pomelos.................................................. 3.5.5.3.3 Experimento 3. Intergenéricos.......................................... 3.5.5.3.4 Experimento 4. Cidro........................................................
85 85 86 86
3.5.5.4 Purificación de protoplastos............................................................. 3.5.5.5 Fusión de protoplastos.....................................................................
86 87
3.5.6 Cultivo y regeneración de protoplastos. ......................................... 3.5.7 Selección y verificación de Híbridos Somático................................
88 90
3.5.7.1 Selección de híbridos somáticos...................................................... 3.5.7.2 Verificación de híbridos.................................................................... 3.5.7.3 Evaluación de la morfología de la hoja............................................. 3.5.7.4 Determinación del nivel de ploidía.................................................... 3.5.7.5 Marcadores genéticos.......................................................................
90 90 91 92 93
3.5.7.5.1 Extracción del ADN.......................................................... 93 3.5.7.6 Pruebas de PCR............................................................................... 3.5.7.7 Prueba de la herencia de orgánelos.................................................
94 95
3.5.8 Electróforesis..................................................................................... 97 IV. RESULTADOS..................................... .................................................. 98 4.1 Experimentos de aislamiento y purificación de protoplastos................ 98
4.1.1 Experimento 1: Intervalo de tiempo óptimo de incubación............. 4.1.2 Experimento 2: Determinación de la óptima concentración del medio de cultivo líquido.................................................................... 4.1.3 Experimento 3. Efecto del medio de cultivo sobre el rendimiento de protoplastos durante la incubación............................................. 4.1.4 Experimento 4. Concentración de sacarosa.................................... 4.1.5 Efecto del tiempo y velocidad de la centrifugación durante el proceso de purificación de protoplastos..........................................
98
99
99 100
100
4.2 Experimentos sobre fusión de protoplastos para obtención de híbridos somáticos...............................................................................
102
4.2.1 Experimento 1. Híbridos intergenéricos entre Amblicarpa y variedades de Poncirus trifoliata.....................................................
102
4.2.1.1 Recuperación y regeneración de híbridos........................................ 4.2.1.2 Morfología foliar................................................................................ 4.2.1.3 Nivel de ploidia................................................................................. 4.2.1.4 Análisis de PCR................................................................................ 4.2.1.5 Herencia de organelos. ...................................................................
102 104 104 110 113
4.2.2 Experimento 2. Híbridos somáticos interespecíficos entre mandarino, Amblicarpa y líneas de Pomelo....................................
115
4.2.2.1 Recuperación y regeneración de híbridos........................................ 4.2.2.2 Morfología foliar................................................................................ 4.2.2.3 Nivel de ploidía................................................................................. 4.2.2.4 Pruebas de PCR...............................................................................
115 116 119 121
4.2.3 Experimento 3. Híbridos somáticos entre limón Macrofila y parientes cercanos de los cítricos..................................................
123
4.2.3.1 Recuperación y regeneración de híbridos........................................ 4.2.3.2 Morfología foliar................................................................................ 4.2.3.3 Nivel de Ploidía................................................................................. 4.2.3.4 Prueba de PCR................................................................................ 4.2.4.5 Herencia mitocondrial y de cloroplastos..........................................
123 124 125 128 129
Continúa CONTENIDO ..............................
...................continuación
CONTENIDO
4.2.4 Experimento 4. Híbridos somáticos interespecíficos entre
Amblicarpa y especies derivadas del cidro.....................................
130 4.2.4.1 Recuperación y regeneración de híbridos.................................... 4.2.4.2 Morfología foliar............................................................................ 4.2.4.3 Nivel de Ploidia............................................................................. 4.2.4.4 Pruebas de PCR...........................................................................
130 131 132 132
V. DISCUSIÓN............................................................................................. 135 VI. CONCLUSIONES................................................................................... 145 VIII. BIBLIOGRAFÍA.. .................................................................................. 146
INDICE DE CUADROS
Cuadro Descripción Página
1 Taxonomía de la subfamilia Aurantioideae según Swingle y Reece (1967). 8
2 Tribus, Subtribus y géneros de la subfamilia Aurantioideae Swingle Reece (1967).Incompatibilidad sexual y por injerto y características genéticas de interés.
15
3 Híbridos somáticos intergenéricos sexualmente compatibles. Especies del género Citrus como donadores de callo. 55
4 Híbridos somáticos intergenéricos sexualmente incompatibles. Especies del género Citrus como donadores de callo Embriogénico.
57
5 Híbridos somáticos interespecíficos entre mandarinos y otras especies de Citrus.
59
6 Híbridos y Cíhibridos somáticos interespecíficos de frutos ácidos con especies de Citrus.
61
7 Trabajos reportados sobre fusión de protoplastos en otras especies que no son cítricos. 66
8 Soluciones base para preparar medios de cultivo EME 0.146 M 74
9 Ingredientes a partir de soluciones base del Cuadro 11 para preparar un medio de cultivo EME 0.146 M utilizado para el crecimiento de células embriogénicas. 75
10 Soluciones base para la preparación de medios de cultivo BH3 0.6 M empleada para fusión de protoplastos. Macronutrientes, sales, azúcares-alcohol y ácidos orgánicos.
77
11 Ingredientes para preparar un medio de cultivo BH3 0.6 M para fusión de protoplastos a partir de soluciones base
79
12 Composición de la solución enzimática empleada en fusión de protoplastos. 80
13 Rendimiento de protoplastos de callo embriogénico de Macrofila y Volkameriana en diferentes medios de cultivo durante la incubación.
100
14 Tiempo de centrifugación de protoplastos de callo embriogénico de Macrofila durante la purificación. 101
15 Velocidad de centrífugación durante el proceso de purificación de los protoplastos de callo embriogénico de Macrofila. 101
16 Medio de cultivo DBA3 utilizado para el enraizado de embriones in vitro 103
INDICE DE FIGURAS
Figura Descripción Página
1 Rendimiento de protoplastos de callo embriogénico de tres portainjertos sometidos a diferentes períodos de incubación (Protoplastos• 106/ml) 98
2 Rendimiento de protoplastos de callo embriogénico de dos portainjertos: A) a diferentes concentraciones de BH3 B) a diferentes concentraciones de sacarosa durante el aislamiento (Protoplastos• 106/ml
99
3 Forma de las hojas de los Híbridos somáticos tetraploides (al centro) obtenidos de las combinaciones de mandarino Amblicarpa (Citrus amblycarpa) y dos Citranges en comparación con las hojas de los materiales parentales donadores de callo embriogénico (izquierda) y de protoplastos de hoja (derecha)
105
4
(A). Morfología de las hojas del híbrido somático Amblicarpa + Flying Dragon y sus respectivos progenitores: Amblicarpa y Flying Dragon. (B). Morfología foliar de seis híbridos somáticos. En la hilera de arriba de izquierda a derecha: Rubidoux, Carrizo, benton Sofd, Sofd (4x), C-35, Flying Dragón; Abajo: Amb. + Rubidoux, Amb. + carrizo, Amb. + Benton (4x), Amb. + Benton (6x), Amb. + Sofd (4x) (la hoja más pequeña en el centro), Amb. + C-35, Amb. + Flying Dragon y mandarino Amblicarpa (unifoliado).
106
5 Nivel de ploidía de los híbridos somáticos intergenéricos Amblicarpa + C-35 y Amblicarpa + Benton. Determinación con citometría de flujo. Partec, Münster, Alemania.
107
6 Nivel de ploidía de los híbridos somáticos intergenéricos Amblicarpa + Flying Dragon (FD) y Amblicarpa + Sofd. Determinación con citometría de flujo. Partec, Münster, Alemania.
108
7 Nivel de ploidía registrado por los diferentes híbridos somáticos Amblicarpa + Rubidoux (Rub) y Amblicarpa + Carrizo. Determinación por citometría de flujo. Partec, Münster, Alemania.
109
8
Los patrones de bandeo en las líneas 2, 3 y 4 (iniciador C-11) y 10, 11 y 12 (iniciador C – 64) corresponden a C-35, Amblicarpa + C-35 y Amblicarpa respectivamente. Mientras que en la línea 5, 6 y 7 (iniciador C-11) y 12, 14 y 15 (iniciador C-64) se ubican Amblicarpa + Benton, Benton y Amblicarpa. El marcador de referencia fue de 100 pares de bases.
110
9
Polimorfismo mostrado por los materiales Flying Dragon, Amblicarpa + Flying, Dragón y Amblicarpa ubicados en las líneas 2, 3, 4 (C-11) y también en 12, 13 y 14 (C-64) respectivamente; así como Amblicarpa + Sofd y Sofd en las líneas 5 y 6 (iniciador C-11) y 15 y 16 (iniciador C-64) respectivamente. El marcador de referencia es de 100 pares de bases (carriles 1 y 11).
112
10
Patrones de bandeo RAPD de dos híbridos intergenéricos y sus genotipos parentales. Productos amplificados por los indicadores C-11 (Gel lado izquierdo) y C – 64 (Gel lado derecho). Marcador 1 Kb (línea 1 y 8); Rubidoux (líneas 2 y 9 ); Amblicarpa + Rubidoux (líneas 3 y 10); Amblicarpa (líneas 4, 7, 11 y 14); Amblicarpa + Carrizo (líneas 5 y 12); Carrizo (líneas 6 y 13).
112
11 Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADNmt). En los híbridos somáticos Amblicarpa + C-35 (carril 3) y Amblicarpa + Rubidoux (carril 7). Los progenitores se localizan en los carriles 2, 4, 6 y 8. El marcador se ubica en el carril 5.
113
12 Detección de ADN mitocondrial (ADNmt) en los híbridos somáticos de Amblicarpa más Citranges y sus respectivos progenitores 114
13 Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADNmt) mostrado por un híbrido somático tetraploide (abajo) hexaploide (arriba)
114
14
Perfil de bandeo del ADN de cloroplastos mostrado por el mandarino Amblicarpa y variedades del género P. trifoliata así como sus híbridos somáticos: Flying Dragón (carril 2), Amb. + Flying dragon (3); Amb. (4), Benton (5); Amb. + Benton (6); Amb. (7); Sofd (8); Amb. + Sofd (9); Amb. (10); C-35 (11), Amblicarpa + C – 35 (12); Amblicarpa (13). Los pares de iniciadores utilizados fueron: TrnD-TrnT, cortar con Taq I, y gel en metaphoragarosa
115
Continúa INDICE DE FIGURAS ..............................
...................continuación
INDICE DE FIGURAS
Figura Descripción Página
15 Morfología de las hojas de las combinaciones mandarino Amblicarpa (Citrus amblycarpa) más dos líneas de Pomelo. Las hojas del centro corresponden a los híbridos somáticos. La del lado izquierdo al mandarino y la derecha al Pomelo.
117
16
Proceso de fusión y regeneración de híbridos somáticos. (A) Callo embriogénico en suspensión. Liberación enzimática de protoplastos de callo embriogénico (B) y tejido foliar (C). Anillo de protoplastos purificado del progenitor de callo (D) y de hoja (E). Inicio de fusión de protoplastos (F). Embriones somáticos en crecimiento (G). Plantas híbridas somáticas de Amblicarpa + Pomelo en medio de cultivo (H). Grupo de trabajo de laboratorio al centro el Prof. Jude Grosser (I).
118
17 Nivel de ploidia de híbridos somáticos interespecíficos entre Amblicarpa y dos línea de Pomelo Lian Pin Yau.
119
18 Nivel de ploidía de híbridos somáticos interespecíficos entre Amblicarpa y dos variedades de Pomelo Hirado Buntan Pink y Large Pink.
120
19 Perfil de bandeo mostrado por los híbridos somáticos (indicado con una flecha) de Amblicarpa (Citrus amblycarpa) + Pomelos (Citrus máxima ó C. grandis) y sus respectivos progenitores. Se utilizaron los iniciadores BDB-CC5.
122
20 Polimorfismo mostrado por híbridos somáticos de Amblicarpa + Pomelo y sus respectivos materiales parentales utilizando los iniciadores C-11 y C-64.
123
21 Morfología de tetraploide (centro) entre Macrofila (C. macrophylla) (izquierda) y Citropsis gilletiana (derecha) y materiales parentales.
125
22 Ploidía mostrada por el testigo Macrofila (pico 1) y el candidato a híbrido somático (pico 2) resultante de la combinación de Macrofila + Citrange C-35 (arriba) y la ploidía del testigo Macrofila (pico 1), limón Persa (pico 2) y Macrofila + Sofd (Pico 3) correspondiente a materiales diploides, triploides y tetraploides.
126
23
Ploidía de las combinaciones interespecíficas Macrofila + Pomelo (arriba) e intergenérica Macrofila + Citropsis gilletiana (abajo). Nótese los picos de ploidía del testigo (pico 1) y de los híbridos (pico 2) En ambos casos el pico 2 corresponde a materiales tetraploides.
127
24 Patrones de bandeo de Macrofila + Citropsis, Macrofila + Citrange C-35 y Macrofila + Pomelo Ling Pin Yau línea 8-1-99-10ª y sus respectivos progenitores. El gel del lado izquierdo corresponden a fragmentos amplificados con el iniciador C-11. En los geles del centro y lado derecho se utilizó el iniciado C-64
128
25
Perfil de distribución de ADN de mitocondrias en diferentes híbridos somáticos y sus materiales parentales. C-35 carril (1); Macrofila + C-35 Carril (2); Macrofila (3); Sofd (4); Macrofila + Sofd (5); Macrofila (6); Marcador de 100 pares de bases (7); C-35 (8); Macrofila + C-35 (9); Macrofila (10); Sofd (11); Macrofila + Sofd (12); Macrofila (13). Los perfiles en los carriles 1-6 se obtuvieron utilizando el par de iniciadores siguiente: Nad4Exon ½ y los carriles del 8-13 con 185/5ArRNA cortados con Taq I y visualizados con un gel de metaphoragarosa al 3%.
129
26 Perfil de distribución de ADN de cloroplastos en diferentes híbridos somáticos y sus materiales parentales. 1 = C-35; 2 = Macrofila + C-35; 3 = Macrofila; 4 = Sofd; 5 = Macrofila + Sofd; 6 = Macrofila; 7 = marcador 100 pares de bases.
130
27 Morfología de hojas de la combinación Amblicarpa + Volkameriana (centro) y de sus respectivos progenitores: Amblicarpa (izquierda) y Macrofila (derecha) 131
28
Ploidía del testigo Amblicarpa (pico 1) y de los híbridos somáticos (pico 2) correspondientes a las combinaciones Amblicarpa + Volkameriana (arriba) y Amblicarpa + Macrofila (abajo). Nótese que la diferencia en la ubicación entre ambos picos es del doble, lo que indica que estos corresponden a materiales diploides y tetraploides, respectivamente
133
29
Patrones de bandeo de dos híbridos somáticos y sus respectivos progenitores iniciador HVHTCC5, lado izquierdo y con el iniciador BDBTCC5 lado derecho. Volkameriana (carriles 1 y 7), Amblicarpa + Volkameriana (carriles 2 y 8), Amblicarpa (3 y 9), Amblicarpa + Macrofila (4 y 10) y Macrofila (5 y 11). Marcador 100 pb (6 y 12).
134
A B C
RESUMEN
La base genética de portainjertos de limón Mexicano [Citrus aurantifolia (Christm)
Swingle] es estrecha, lo que propicia que las plantaciones sean altamente vulnerables a
diversos problemas fitosanitarios. La hibridación somática vía fusión de protoplastos es
una alternativa de mejoramiento genético que se ha utilizado en otros cítricos para
desarrollar genotipos tetraploides con características de interés. El presente trabajo se
realizó con el fin: a) de adecuar un protocolo de fusión de protoplastos para los
portainjertos Macrofila y Amblicarpa, como prerrequisito para la hibridación somática; b)
desarrollar nuevos híbridos somáticos a partir de protoplastos de callo embriogénico de
Macrofila y Amblicarpa, combinados con protoplastos de hoja de los genotipos de
Poncirus trifoliata, Pomelo, Macrofila y Volkameriana. Los resultados indican que ambos
portainjertos requieren un protocolo diferente para lograr un elevado rendimiento de
protoplastos, el portainjerto Amblicarpa requirió menor período de incubación que
Macrofila. A su vez, este portainjerto incrementó la producción de protoplastos al
emplearse concentraciones más altas de medio de cultivo BH3 que el Amblicarpa. El
medio de cultivo BH3, resultó más idóneo que el EME y/o que la mezcla de los dos,
para ambos portainjertos. El tiempo y velocidad de centrifugación así como la
concentración de sacarosa durante la purificación, no influyeron en el rendimiento de
protoplastos. El alejamiento genético entre los géneros Citrus y Poncirus, no fue
obstáculo para desarrollar cinco nuevos híbridos somáticos intergenéricos tetraploides y
un hexaploide entre mandarino Amblicarpa y variedades de Poncirus trifoliata. Así
mismo, se obtuvieron dos nuevos híbridos somáticos entre Amblicarpa (callo
embriogénico) y dos genotipos de Pomelo (hoja). Una de cinco plantas de Macrofila +
Citropsis también se identificó como híbrido somático; Así como también Amblicarpa +
Volkameriana. Otras tres combinaciones de Amblicarpa y distintas líneas de Pomelo,
así como Macrofila + Pomelo y Macrofila más C-35 resultaron ser tetraploides mediante
pruebas morfológicas y citológicas, pero no mediante pruebas moleculares. Estos
resultados permiten ampliar al abánico de patrones disponibles para limón con
características de interés para hacer frente a problemas de VTC, Virus, Viroides,
nemátodos, tamaño de árbol y adaptación a suelos calcáreos previas evaluaciones
biológicas y agronómicas.
ABSTRACT
The genetic basis of the rootstocks for Mexican lime is very limited and this causes that
the commercial plantations of mexican lime are highly susceptible to different plant
sanitation and soil problems. The somatic hybridization via fusion of protoplasts is an
alternative of citrus breeding to develop new desirable genotypes. This study was
carried out to: a) develop a local protocol for fusion of protoplast to Macrophylla and
Amblycarpa rootstocks, as a prerequisite to somatic hybridization; b) develop new
somatic hybrids based on Macrophylla and Amblycarpa rootstocks as embryogenic
callus and Poncirus trifoliate, Pummelo genotypes, Macrophylla and Volkamer lemon as
a leaf source of protoplast. Results indicated that both Macrophylla and Amblicarpa
rootstocks required a different protocol. Amblycarpa required a shorther period of time (8
hr) for isolation in order to get the highest yield of protoplast than Macrophylla (32 hr).
During isolation, Macrophylla achieved the highest yield of protoplasts with 0.8 and 0.9
M, BH3 concentrations and Amblycarpa with 0.6 M BH3. The genetic distance between
Citrus and Poncirus genera did not affect the fusion and regeneration of new somatic
hybrids. Six new intergeneric somatic hybrids (five tetraploids and one hexaploid)
between Amblycarpa (embryogenic callus) and selections of Poncirus trifoliate (leaf
protoplasts) were obtained. Also two somatic hybrids were obtained from the
combination between Amblycarpa and Pummelo genotypes (leaf protoplasts). Some
candidate somatic hybrids between Amblycarpa and Pummelo resulted in
autotetraploids. Macrophylla + Citropsis and Amblicarpa + Volkamer lemon were also
regenerated as tetraploid somatic hybrids. These new citrus rootstocks can be of high
potential to face CTV, virus, viroids, nematode, tree size and calcareous soil problems in
the future for Mexican lime trees.
1
I. INTRODUCCIÓN
El uso de portainjertos de cítricos está ampliamente difundido en las principales
regiones productoras de cítricos del país. Sin embargo, el número de especies
utilizadas como portainjerto en las diferentes variedades es reducido. En el caso de la
naranja (Citrus sinensis), toronja (Citrus paradisi), mandarina (Citrus reticulata) y limón
Persa (Citrus latifolia) el portainjerto más utilizado es naranjo agrio (Citrus aurantium L)
el cual se encuentra en el 90% de las plantaciones; mientras que Macrofila (Citrus
macrophylla) es el más utilizado en las plantaciones de limón mexicano con un 81%
(Rocha-Peña y Lee, 2000; Coelim, 2002).
El hecho de depender de un solo portainjerto en las plantaciones, incrementa el riesgo
de daño por enfermedades desvastadoras como el virus de la tristeza de los cítricos
(VTC), gomosis, nemátodos, blight, declinamiento repentino entre otras (Newcomb,
1978; Del Valle-Valdez, 1997). Aparte de que un portainjerto no siempre se adapta
aceptablemente a las distintas condiciones de clima y suelo que prevalecen en las
diferentes regiones productoras. Además, hay que tomar en cuenta que los
portainjertos controlan características hortícolas importantes tales como: el tamaño del
árbol, tolerancia a frío, tamaño de fruta, rendimiento y calidad de fruta, entre otras, las
cuales son determinantes para hacer de la citricultura un negocio rentable (Castle,
1987).
Por lo tanto, se requiere ampliar la base genética de portainjertos con el objeto contar
con un mayor número de nuevos genotipos que contengan a su vez características que
les permitan hacer frente al mayor número de problemas posible.
Para ampliar la base genética es necesario implementar un programa de mejoramiento
genético de portainjertos. El mejoramiento por métodos convencionales como la
hibridación sexual, presenta barreras tales como la esterilidad e incompatibilidad
sexual, alta heterocigosis, elevada apomixis y poliembrionía y largo período juvenil, las
cuales impiden ó dificultan la obtención de portainjertos con características deseables
(Grosser y Gmitter, 1990 a). Para el mejoramiento genético por selección de mutantes
2
naturales se requiere estudiar minuciosamente grandes poblaciones de árboles en edad
productiva, lo cual en portainjertos es un tanto inusual (Castle et al., 1993); la
mutagenesis inducida con agentes mutágenos tales como rayos gamma o rayos X, ha
sido poco estudiada en el caso de portainjertos debido a que los cambios provocados
son muy aleatorios. El mejoramiento por medio de transformación genética tiene
implicaciones metodológicas complicadas y por este medio es posible introducir una
sola característica específica a la vez, por ejemplo en naranjo agrio se busca incorporar
tolerancia a tristeza (Gutiérrez, et al., 1997). Por lo tanto, la hibridación somática vía
fusión de protoplastos, constituye la alternativa de mejoramiento genético con mayor
viabilidad, no solo porque permite superar las barreras de mejoramiento por hibridación
sexual antes mencionadas, sino que además, con esta metodología es posible
incorporar el genoma completo de dos materiales diploides, y producir otro individuo
tetraploide que lleva en paquete mayor número de características deseables y por lo
tanto una mayor base genética (Grosser y Gmitter, 1990 a; Ollitrault et al., 1996 b).
Desde que apareció el primer reporte sobre fusión de protoplastos en cítricos
(Ohgawara et al., 1985) con esta técnica biotecnológica se han venido obteniendo
nuevos patrones y variedades con mejores características en diversos laboratorios del
mundo (Grosser et al., 2000; Ollitrault et al., 1998; Kobayashi et al., 1988).
Sin embargo, para tener éxito con la hibridación somática mediante la fusión de
protoplastos, como prerrequisito se requiere contar con protocolos eficientes de
embriogénesis somática y de fusión de protoplastos (Torres, 1989; Bengochea y Dodds,
1986). En la literatura no existen reportes de estudios al respecto para los portainjertos
Macrofila y Amblicarpa, los cuales se han seleccionado para realizar el presente trabajo
en base a su excelente comportamiento como portainjertos de limón Mexicano (Medina-
Urrutia, 1996) y limón Persa (del Valle-Valdez, 1997).
De ahí que resulte necesario realizar estudios para determinar las condiciones de
aislamiento, incubación, medios de cultivo y condiciones de purificación para optimizar
el rendimiento de protoplastos a partir de callo embriogénico de los portainjertos
Macrofila y Amblicarpa y con ello aumentar la posibilidad de obtener mayor número de
híbridos somáticos en base a estos dos portainjertos.
3
Para preservar la agroindustria del limón mexicano, es necesario contar con
combinaciones variedad-portainjerto que reúnan las siguientes características:
tolerancia a tristeza y otros virus y viroides; así como gomósis y nemátodos, tolerancia a
suelos calcáreos y a sequía y que además sean de crecimiento achaparrante.
Independientemente de que los portainjertos puedan contener tolerancia a tristeza, esta
característica debe ser incorporada directamente a la variedad, debido a que esta
especie es la más sensible a esta enfermedad. Por ello los estudios para generar
variedades de limón tolerantes a tristeza mediante transformación genética están en
marcha (Robles – González, et al., 2004).
En el caso de los portainjertos, con este trabajo se pretende iniciar un programa de
mejoramiento genético por fusión de protoplastos para ampliar la base genética de
portainjertos, con el fin de que se tengan materiales que en un solo individuo reúnan el
mayor número de características deseables que permitan hacer frente a los desafíos
actuales y futuros. Y en este caso se han seleccionado a los portainjertos Macrofila y
Amblicarpa para utilizarlos como modelo.
EL PROBLEMA
Se desconoce la capacidad que tienen Macrofila y Amblicarpa como progenitores de
callo embriogénico para producir protoplastos y que factores durante el aislamiento e
incubación son los que mayor influencia ejercen sobre la producción de protoplastos.
Así mismo, tampoco se conoce la capacidad de respuesta de cada portainjerto para
regenerar híbridos somáticos en fusiones con otros cítricos que tienen diferente grado
de compatibilidad o parentesco.
LA PREGUNTA CIENTÍFICA
¿Que factores durante el aislamiento e incubación de protoplastos son los que ejercen
mayor influencia sobre la producción de protoplastos de los progenitores Macrofila y
Amblicarpa; y si la eficiencia en la producción de híbridos somáticos será igual entre
Macrofila y Amblicarpa con otras especies y géneros de cítricos?.
4
LA HIPÓTESIS
Las condiciones de aislamiento y purificación empleados en otros cítricos no ejercen
influencia sobre la producción de protoplastos y por tanto afectan de igual manera a los
dos materiales Macrofila y Amblicarpa.
La eficiencia en la producción de híbridos somáticos de Macrofila y Amblicarpa
utilizados como donadores de protoplastos de callo embriogénico es la misma y no
depende de su grado de parentesco ó compatibilidad sexual con las otras especies y
géneros de cítricos utilizadas como donadores de protoplastos de hoja.
OBJETIVOS
• Determinar el efecto del tiempo de aislamiento, y medio de cultivo, sobre el
rendimiento de protoplastos en callo embriogénico de los portainjertos Macrofila y
Amblicarpa.
• Conocer el potencial de producción de híbridos somáticos intergenéricos e
interespecíficos del patrón Amblicarpa con variedades de Pomelo (Citrus
máxima) y Poncirus trifoliata; y de Macrofila con Citrus máxima, Poncirus
trifoliata y Citropsis gilletiana.
5
II. ANTECEDENTES
2.1 Importancia de la agroindustria del limón
Hasta el año 2001, en México se cultivaron poco más de 95,000 ha de limón mexicano
las cuales produjeron alrededor de 1’200,000 ton de fruta; de esta cantidad
aproximadamente el 34% de la fruta se procesó en 100 empaques para su
comercialización en fresco en diferentes mercados del país, y el resto se destinó a la
industria para la extracción de aceite esencial el cual tiene mercado de exportación
(Coelim, 2002; González-Sanchez y Silva-Echevarria, 2003; Medina-Urrutia, 2004). En
torno a esta cadena agroalimentaria conformada por 9,500 productores, numeroas
empresas y prestadores de servicios, cerca de 100 empaques, 28 industrias y gran
cantidad de comerciantes, laboran más de 35,000 familias en el País. Las cifras
anteriores ubican a México como el principal productor de este cítrico y el más
importante exportador de aceite esencial (González-Sánchez y Silva-Echevarria, 2003;
Coelim, 2002).
2.2 Perspectivas de la agroindustria de limón
Otros países importantes productores de limón son la India (30,000 ha) y Perú (18,000
ha); de ellos, el más serio competidor es Perú que también exporta a E. U importantes
cantidades de aceite destilado, y que cuenta con condiciones de clima y suelo
apropiadas para su expansión, además de que en ese país la producción por hectárea
es similar a la que se obtiene en México, pero a un menor costo de producción, por lo
que la rentabilidad en Perú tiende a ser más alta (Ginocchio, 2003). Se anticipa que en
los próximos años México continúe creciendo con plantaciones nuevas en estados
como Michoacán, Guerrero, Sinaloa y Colima, a un ritmo mayor que en Perú. Por lo
tanto, se estima que México podría continuar posicionado como el más importante
productor de aceite esencial en el mundo (Medina-Urrutia, 2004).
2.3 La tristeza la principal amenaza del limón
A pesar de la importancia del limón en el mundo, esta agroindustria se encuentra
amenazada por la tristeza de los cítricos, la enfermedad más destructiva que ha
causado la muerte de millones de árboles de cítricos en las regiones donde se ha
6
presentado de manera endémica (Orozco-Santos, 1994; Rocha-Peña y Lee, 2000;
Rocha-Peña et al., 1995). La tristeza se encuentra presente de manera asintomática en
la mayoría de regiones productoras de cítricos y hasta la fecha se han identificado 6
aislados de los cuales dos parecen ser severos mientras que cuatro resultaron ser
suaves (Isidron-Herrera, et al., 2001). Hasta ahora esta enfermedad ha sido dispersada
por el hombre al movilizar plantas de cítricos de áreas infectadas a regiones libres. Sin
embargo, el pulgón café de los cítricos principal vector de las razas de tristeza, se
encuentra presente en Veracruz y se anticipa que en poco tiempo infectará los árboles
de limón en la Costa del Pacífico. El limón Mexicano es la especie de cítricos más
sensible a tristeza y por tanto la que tiene mayor riesgo de ser afectada, aún cuando se
injerte sobre patrones tolerantes, lo que ocasionaría grandes pérdidas en el campo y
consecuentemente un colapso de la agroindustria del limón, afectando el patrimonio de
miles de familias. Además de la variedad de limón mexicano, también el portainjerto
Macrofila que es utilizado en más del 80% de las plantaciones, también es sensible a
esta enfermedad (Coelim, 2002). Por lo tanto, la manera de hacer frente a esta
enfermedad tan destructiva y eliminarla de forma definitiva es desarrollando una
combinación patrón-injerto que sea resistente. Esto es posible lograralo mediante
mejoramiento genético utilizando como herramienta la biotecnología, por un lado
introduciendo genes de resistencia a la variedad de limón vía transformación genética
Peña et al., 1995 a, 1995 b; Robles–González et al., 2004 y obteniendo un portainjerto
con características de resistencia al VTC y a otros problemas fitosanitarios, hortícolas y
de suelos vía fusión de protoplatos (Grosser et al., 2000; Ollitrault et al.,1996 b).
2.4 Clasificación taxonómica de la subfamilia de cí tricos
Aurantioideae. Los cítricos y géneros relacionados pertenecen a la familia Rutaceae
subfamilia Aurantioideae. En el Cuadro 1, se muestran las tribus, subtribus y géneros,
perteneceientes a la subfamilia Aurantioideae, según la clasificación de Swingle y
Reece (1967). La subfamilia está dividida en dos tribus Clausenaeae (árboles con frutos
citroides remotos muy remotos) y Citreae (árboles con frutos citroides y cítricos), cada
una de ellas con 3 subtribus.
El género Citrus, que según esta clasificación cuenta con 16 especies, pertenece a la
subtribu 2 de la tribu Citreae. La taxonomía del género Citrus ha despertado
7
controversias por la disparidad de criterios aplicados por los distintos autores para
otorgar el rango de especie. Los dos principales sistemas taxonómicos son el de
Swingle y Reece (1967), que reconoce 16 especies dentro del género, y el de Tanaka
(1961), que incluye 157 especies. La primera aproximación es posiblemente más
cercana a la realidad, pero la segunda resulta más práctica desde un punto de vista
agronómico.
Otros sistemas de clasificación consideran únicamente a las especies reconocidas. La
clasificación consignada por Ortiz (1985), basada en las modificaciones propuestas por
Carpenter y Reece (1969), propone agrupar a los cítricos cultivados en ochos grupos
bien definidos, atendiendo a sus características agronómicas: 1) cidros (Citrus medica
L.); 2) limoneros (C. limon (L) Burm F.); 3) limas, entre los que destacan el limón
mexicano (C. aurantifolia (Christm) Swingle) y la lima Rangpur (C. limonia Osb);
4) mandarinos, al cual pertenecen las satsumas (C. unshiu (Mak.) Marc.) y los
clementinos (C. clementina Hort. Ex Tan.), el mandarino común (C. reticulata Ten.) y el
mandarino “Cleopatra” (C. reshni Hort. Ex Tan.); 5) naranjos agrios (C. aurantium L.);
6) naranjos dulces (C. sinensis (L.) Osb.); 7) toronjos (C. paradisi Macf.) y 8) pomelos
(C. grandis (L.) Osb; ó Citrus máxima).
Estudios, basados en caracteres morfológicos (Barret y Rhodes, 1976), en metabolitos
secundarios (Scora y Kumamoto, 1983; Scora y Mallik, 1970), patrones de restricción
de ADN mitocondrial (Green et al.,1986; Vardi, 1988), isoenzimas (Torres et al., 1978;
1996b; Ollitrault, 1990), RFLPs (polimorfismos en la longitud de los fragmentos de
restricción) (Roose, 1988), RAPDs (polimorfismos de ADN amplificado aleatoriamente)
(Luro et al., 1992) y cantidad de ADN nuclear (Ollitrault y Michaux, 1992), indican que el
género Citrus tiene tres especies básicas: el pomelo, el cidro y el mandarino (C.
reticulata (L.) Blanco), a partir de las cuales y por medio de hibridaciones se han
obtenido todas las especies de cítricos. Recientemente éste concepto ha ganado
soporte adicional de varios estudios basados en términos bioquímicos y molecualres
entre las que se incluyan las isoenzimas (Herrero et al., 1996 a); y los microsatélites
(Fang y Roose, 1997; Fang, et al., 1998).
8
Cuadro 1. Taxonomía de la subfamilia Aurantioideae según Swingle y Reece
(1967).
Tribu Subtribu Género
1.
Clauseneae
(frutos citroides
remotos y muy
remotos)
1. Micromelinae (frutos
citroides muy remotos) Micromelium
2. Clauseninae (frutos
citroides remotos)
Glycosmis (x)
Clausena (x,y)
Murraya 3. Merrillinae (frutos citroides
remotos de gran tamaño) Merrillia
2.
Citreae (frutos
citroides y
cítricos)
1. Triphasiinae (frutos
citroides menores)
Grupo Wenzelia Wenzelia
Monanthocitrus
Oxanthera
Grupo Triphasia Merope(x)
Tripashia(x)
Grupo Luvunga Pamburus(x)
Luvunga
Paramingnya
2. Citrinae (frutos cítricos)
A:
Frutos cítricos
primitivos
Severinia (y, w, z)
Pleiospermium(x)
Burkillanthus (x)
Limnocitrus(x)
B:
Frutos cercanos a
los cítricos
Hesperothusa(z)
Citropsis(y, z)
Atalantia(x, y)
Fortunella(y, z, w)
C:
Frutos cítricos
verdaderos
Eremocitrus(z)
Poncirus(y, z, w)
Clymenia(z)
Microcitrus(z, w)
Citrus(y, z, w)
3. Balsamocitrinae (frutos
citroides de piel dura)
Swinglea(z)
Aegle (x, z)
Afraegle(x)
Aeglopsis(x)
Balsamocitrus
Feronia(x, y)
Feroniella(z) Tomado de: Louzada y Grosser, 1994
(x) Limitada compatibilidad por injerto con Citrus (y) Algo de éxito en Hibridación somática con Citrus (z) Compatibilidad por injerto con Citrus (z) Algo de éxito en hibridación sexual con Citrus
9
Las especies C. halimii B., C. Stone (Stone et al., 1974) y C. tachibana (Mack) Tan., se
consideran también como especies básicas debido a caracteres morfológicos,
fisiológicos, bioquímicos y moleculares (Cameron y Soost, 1982; Herrero et al., 1996 a,
b; Luro et al., 1992; Scora y Kumamoto, 1983). El número total de especies del resto de
los géneros de la subfamilia Aurantioideae asciende a 187. Casi todas ellas son
árboles o arbustos de hoja perenne, excepto los tres géneros monoespecíficos
Poncirus, Aegle y Feronia, tres especies del género Clausena y una del género
Murraya, y poseen flores generalmente blancas y muy fragantes. Muchos géneros
producen frutos de color verde, amarillo o naranja, y con numerosas glándulas de
aceite.
La subtribu Citrinae, que incluye al género Citrus, aglutina 13 géneros que difieren
mucho del resto de géneros de la subfamilia por sus frutos jugosos con vesículas de
zumo en la pulpa, carácter que no se ha encontrado en otras plantas de la familia
Rutaceae ni en ninguna otra planta superior.
2.5 Origen y dispersión de los cítricos
Los cítricos son originarios de una área que se extiende desde las faldas del Himalaya
en India a la China Central y las Islas Filipinas por el este y Birmania, Tailandia,
Indonesia, Nueva Guinea, noreste de Australia y Nueva Caledonia por el sudeste
(Cameron y Soost, 1976; Gmitter y Hu, 1990; Spiegel y Vardi, 1984; Swingle, 1943;
Scora, 1975; Webber et al., 1967; Swingle y Reece, 1967; Iwamasa, 1977).
Olivares-Fuster (1998), cita que algunos autores consideran que su centro de origen
está en las zonas montañosas del sur de China y noreste de la India, mientras que
otros consideran que se originaron en el noreste de la India y Birmania. Las especies
actualmente cultivadas posiblemente se originaron en uno de los centros de diversidad
de plantas cultivadas propuestos por Vavilov (1951): el naranjo dulce y el mandarino en
el centro chino, y el naranjo agrio, el cidro, el limonero, el pomelo y la lima en el centro
indo-malayo.
Los cítricos se introdujeron a América por Cristóbal Colón en 1493, el cual trajo semillas
de naranjo, limonero y cidro a Haití, y desde aquí se extendieron a México en 1518. El
10
establecimiento de estos cultivos en Brasil se realizó hacía la mitad del siglo XVI, la
introducción en Florida entre 1515 y 1565 y en California hacía 1769. Las especies de
Naranja, limón y pomelo llegaron a Sudáfrica a mitad del siglo XVII y a Australia a final
del siglo XVIII (1788).
El comercio mundial era ya importante durante la segunda mitad del siglo XIX, y desde
entonces ha ido creciendo en volumen, número de variedades y países productores y
consumidores. El desarrollo del conocimiento en torno a los cítricos ha permitido la
evolución de las técnicas de cultivo, un mejor control de las enfermedades y la
selección de variedades nuevas y mejor adaptadas posibilitando el mantenimiento de
un elevado nivel de desarrollo de la citricultura mundial.
2.6 Necesidades de mejoramiento de los cítricos
Los cítricos se cultivan en distintas zonas tropicales y subtropicales del mundo y en una
gran diversidad de suelos y condiciones climáticas, por lo que están sometidos a
diferentes condiciones de estrés tales como: suelos ácidos, alcalinos ó salinos,
inundaciones y sequías, heladas y altas temperaturas; además están expuestos a
muchas plagas y enfermedades causadas por hongos, bacterias, spiroplasmas,
fitoplasmas, virus y viroides.
Algunas enfermedades están presentes en la mayoría de las regiones cítricolas y
causan grandes pérdidas lo que restringe el potencial de uso de determinados
patrones. Entre las enfermedades importantes sobresalen la gomosis, producida por el
hongo Phytophthora sp. (Timmer y Menge, 1988) y la tristeza de los cítricos (VTC),
producida por un closterovirus que se transmite por diferentes especies de pulgones
(Bar-Joseph y Marcus, 1989; Garnsey y Lee, 1988). Otras enfermedades están
restringidas a ciertas regiones productoras, por ejemplo el Huanglongbing (“greening”)
producido por la bacteria Liberobacter asiaticum y transmitido naturalmente por
Diaphorina citri, que es el principal factor limitante de la citricultura del sudeste asiático.
Otra bacteriosis conocida como la clorosis variegada, causada por la bacteria Xylella
fastidiosa y transmitida por cicadélidos, fue detectada por primera vez en Brasil en 1987
y actualmente está causando la muerte de miles de árboles en este país (Oliveira et al.,
2000).
11
Otro problema de la citricultura moderna es la reducida disponibilidad de fruta para
satisfacer las exigencias de calidad de los mercados, las cuales son distintas para la
industria y para el consumo en fresco. Los mercados de los países desarrollados
demandan frutos cada vez de mayor calidad, que son difíciles de producir debido a la
falta de variedades adecuadas o a la imposibilidad de cultivar los genotipos de alta
calidad en muchas áreas debido a su susceptibilidad a diversos factores bióticos y
abióticos. En consecuencia, a pesar de la variabilidad genética existente, el número de
patrones y variedades disponibles para cultivarse en cada una de las diferentes
regiones citricolas es limitado, por lo que la producción no está bien adaptada a las
demandas del mercado y en consecuencia el beneficio económico para los agricultores
se reduce de manera importante.
La solución a esta problemática requiere la realización de programas de mejoramiento
genético de patrones y variedades con objetivos específicos para las distintas regiones
de cultivo. Los países productores que tienen un mercado de exportación, para
mantenerse competitivos, requieren de la disponibilidad de variedades y patrones de
calidad, dada la importancia del consumo y exportación de fruta fresca. Por lo tanto, las
variedades representan sin ninguna duda la principal prioridad de los citricultores en
Países desarrollados como España, Japón, Estados Unidos y Africa del Sur. La
competencia en los mercados está aumentando de forma espectacular en los últimos
años debido a distintos factores, entre los que se puede citar la aplicación de mejores
técnicas de producción, la mayor eficacia y rapidez de los medios de transporte
marítimo a largas distancias y la apertura de los mercados como consecuencia de los
acuerdos para lograr una más libre comercialización.
Es conveniente, contar con una base genética a partir de la cual se puedan iniciar
programas de Mejoramiento. Así por ejemplo, el banco de germoplasma del IVIA en
España dispone de plantas libres de patógenos de todas las variedades españolas de
interés comercial y de las principales variedades extranjeras (Navarro, 1992, 1994;
Navarro et al., 1975; 1988). A partir de este banco de germoplasma, los viveros han
suministrado a los agricultores cerca de 65 millones de plantas desde 1982, lo que
supone unas 135,000 hectáreas y más del 50% de la citricultura española.
12
A pesar de la aparentemente amplia colección de variedades disponibles para la
propagación comercial en todo el mundo, existen lagunas importantes en algunos
grupos de especies, por lo que varios países como España, Estados Unidos, Africa del
Sur, Israel, Australia y Brasil entre otros, han considerado necesario abordar programas
de investigación para la obtención de nuevas variedades. Entre las características
importantes que debe reunir una variedad de cítricos para el consumo en fresco en se
señalan las siguientes: a) elevada producción; b) época de maduración adecuada; c)
color de fruto atractivo; d) tamaño de fruto relativamente grande, e) facilidad de pelado;
f) fácil separación de segmentos; g) sabor y textura agradables; h) buena aptitud para la
manipulación y el transporte; i) ausencia de semillas. Este último aspecto es
absolutamente esencial, ya que el consumidor de los países importadores no acepta
variedades con semillas (Olivares-Fuster, 1998).
Los patrones también presentan una importante problemática en la citricultura mundial,
dado que deben reunir necesariamente las siguientes características: a) tolerancia al
virus de la tristeza y otros viroides; b) tolerancia a Phytophthora sp. y nemátodos; c)
adaptación a suelos con elevados contenidos de caliza; d) producción de fruta de
aceptable calidad en la variedad injertada; e) elevada producción de semillas con alta
poliembrionía; f) buen crecimiento en vivero; g) facilidad en la plantación y crecimiento
posterior en los huertos de los agricultores; h) tolerancia a problemas de suelo de
manera que permita abarcar una superficie de cultivo más amplia (Castle, 1987; Castle,
et al., 1993).
Evidentemente es muy difícil reunir todas estas características en un solo patrón. Entre
los diversos patrones tolerantes a tristeza utilizados en el mundo tan solo los citranges
Troyer y Carrizo (C. sinensis x Poncirus trifoliata (L.) Raf.) y el citrumelo Swingle (C.
paradisi x P. trifoliata L. Raf) y el mandarino Cleopatra se han utilizado de manera
extensiva como portainjerto de naranjos y mandarinos. Entre ellos, el citrange Carrizo y
el Citrumelo Swingle ha dado resultados globales muy superiores al resto y en la
actualidad se usan en la mayoría de las nuevas plantaciones de España y Estados
Unidos (Castle 1987; Olivares-Fuster,1998).
13
Las variedades de cítricos sobre citrange Carrizo y Citrumelo Swingle desarrollan fruta
de buena calidad y presentan un comportamiento agronómico aceptable, pero no se
adaptan a suelos salinos o calcáreos con elevado contenido en caliza activa (Castle, et
al., 1993; Del Valle-Valdéz, 1997; Medina-Urrutia, 1996). Independientemente de los
problemas específicos que pueda presentar su empleo, no es conveniente basar la
citricultura de cualquier región en un solo patrón. En el caso de la aparición de una
nueva enfermedad, si el portainjerto es sensible, aquella podría causar una verdadera
catástrofe. De hecho, en diversas regiones se observa la muerte de algunos árboles
aislados que puede ocurrir de manera paulatina o repentina que sólo podrían explicarse
por la utilización de patrones fuera de tipo ó por la presencia de algún patógeno
desconocido.
Dentro del género Citrus existen otros patrones que presentan características
agronómicas de gran interés, pero con inconvenientes específicos que hacen que su
utilización sea muy limitada. Por ejemplo, el naranjo agrio es posiblemente el patrón
más importante por su amplia adaptación a diversas condiciones del medio ambiente y
por su excelente comportamiento hortícola, pero su gran sensibilidad a tristeza ha
propiciado que comience a entrar en desuso (Rocha-Peña, et al.,1995; Castle, et al,
1993) en todo el mundo. El Alemow ó Macrofila (Citrus macrophylla Wester), promueve
una elevada y rápida entrada en producción y se adapta muy bien a suelos salinos y
con elevado contenido en caliza, pero su susceptibilidad a tristeza restringe su empleo
para los cítricos dulces (Medina-Urrutia, 1996; Newcomb, 1978). Además de que induce
un menor contenido de sólidos solubles en frutos de naranjo Valencia (Pérez et al.,
2000). El mandarino Cleopatra es tolerante a tristeza y se adapta bien a suelos
calcáreos, pero su crecimiento y entrada en producción en muy lenta (Castle, et al.,
1993). La lima Rangpur tiene una excelente adaptación a condiciones de sequía, pero
induce frutos de calidad inadecuada para el consumo en fresco (Castle, 1987). Por
tanto, sería muy importante desarrollar nuevos genotipos que logren aglutinar los
caracteres deseables de diversos patrones ya conocidos.
Por otra parte, existen parientes de los cítricos que conservan en su genoma
características de interés para el mejoramiento de portainjertos. Así por ejemplo
algunos parientes de cítricos son resistentes o tolerantes a enfermedades y fisiopatías.
14
La posible utilización de este germoplasma para la obtención de nuevos patrones es un
objetivo de importancia prioritaria a mediano y largo plazo. La anterior problemática
planteada debería intentar resolverse mediante amplios programas de mejoramiento
genético que salvo contados países, no se han realizado. Hace unos años en España,
Africa del Sur y Estados Unidos se realizaron una serie de trabajos de hibridación
sexual que les ha permitido obtener nuevos patrones que ahora están bajo evaluación
agronómica y hortícola (Forner y Alcaide, 1993). Recientemente, se han iniciado
programas de mejoramiento basados en la selección asistida por marcadores
moleculares (MAS) (Herrero et al., 1996 a, b; Mestre et al., 1997 a, b) y en técnicas
biotecnológicas (Navarro et al., 1997).
Las biotecnologías basadas en el cultivo de tejidos in vitro y en la ingeniería genética
presentan grandes posibilidades para el mejoramiento genético de los cítricos, ya que
permitirán superar algunos de los problemas que no se han superado con los métodos
tradicionales de mejoramiento y ofrecen nuevas posibilidades que no se han abordado
hasta ahora.
2.7 Caracteres relevantes presentes en especies de la subfamilia
Aurantioideae . Existen pocos estudios sobre los caracteres de interés que poseen las
especies de géneros afines a los cítricos para el mejoramiento. Generalmente no se
aprecia su valor para emplearse como variedades, pues no poseen frutos de interés
comercial y tampoco se valora su empleo directo como patrones de cítricos (excepto en
el caso del Poncirus trifoliata) (Carpenter y Furr, 1962). Sin embargo, es innegable que
existe una gran variabilidad genética en estas especies, la mayoría son silvestres y la
importancia que reviste la posible incorporación del acervo genético mantenido en estas
especies de cítricos, para su utilización en programas de mejoramiento genético es muy
grande. (Grosser et al., 1996 d; Motomura et al., 1997).
A continuación en el Cuadro 2 se sintetizan las características específicas de estas
especies que podrían ser de interés para un programa de mejoramiento genético de los
cítricos. En ese mismo cuadro se indica la compatibilidad para posible hibridación
sexual y compatibilidad por injerto, que presentan los diferentes géneros parientes en
relación con el género Citrus.
15
Cuadro 2. Tribus, Subtribus y géneros de la subfami lia Aurantioideae ( Swingle y Reece, 1967). Compatibilidad sexual y
por injerto y características genéticas de interés.
Género (X) Compatibilidad (Y)
Características Genéticas Referencias Sexual Injerto
Tribu Clausenae: Subtribu Clauseninae
Glycosmis ? -- Resistente a VTC y a Phyllocnistis citrella Heppner, 1993 Jacas et al., 1997
Clausena ? -- Resistente a Tylenchulus semipenetrans Baines et al., 1960
Murraya ? ? Resistente a nemátodo de los cítricos y tolerante al “greening”; tolerante a VTC y Phyllocnistis
Baines et al., 1960; Nito y Akihama, 1990; Heppner, 1993;
Jacas et al., 1997. Tribu Citreae: Subtribu Triphasiinae
Wenzelia ? ? ? -- Monanthocitrus ? ? ? -- Oxanthera ? ? ? -- Merope ? -- Adaptación a suelos salinos Bitters et al., 1969 Tripashia ? -- Resistencia a tristeza Bitters et al., 1969 Pamburus ? -- ? -- Lavunga ? ? ? -- Paramingnya ? ? ? --
Tribu Citreae: Subtribu Citrinae
Severinia -- + Resistencia al frio, tolerancia a salinidad y a Boro, resistente al nemátodo de los cítricos, tolerante a phytophtora, control del tamaño del árbol.
Cooper, 1961; Bitters et al., 1969.
Pleiospermium -- -- ? Baines et al., 1969; O’Bannon y
Ford, 1977; Carpenter y Furr, 1962; Del Valle et al., 1981.
Burkillanthus -- -- ? -- Limnocitrus -- -- ? --
Hesperothusa -- + ? -- continúa Cuadro 2.....................
16
Cuadro 2. Tribus, Subtribus y géneros de la subfami lia Aurantioideae ( Swingle y Reece, 1967). Compatibilidad sexual y por injerto y características genéticas de interés. (continuación)
Género (X) Compatibilidad (Y)
Características Genéticas Referencias Sexual Injerto
Fruto s Cítricos Cercanos
Citropsis -- + Resistente a Phytophthora y Radopholus citrophilus (similis)
Ford y Feder, 1960, 1961; Bitters et al., 1977; Del Valle et al, 1991.
Atalantia -- + Resistente al frío y suelos húmedos y adaptación a suelos calcáreos, resistente a VTC
Baines et al., 1960; Campbell, 1979; Bitters et al., 1969; Mestre, et al., 1997.
Frutos Cítricos Verdaderos
Fortunella + + Resistente al frío, amplia dormancia, resistencia a razas de VTC; tolerante a Phytophthora
Mestre et al., 1997; Carpenter y Furr, 1962.
Eremocitrus + + Tolerante a sequía, bajas temperaturas y salinidad Carpenter y Furr, 1962; Barret, 1985; Goell, 1969.
Poncirus + + Resistente al VTC, Resistente a Phytophthora y a Tylenchulus semipenetrans, resistente a Xiloporosis, Psorosis.
Hutchison et al., 1972, Grim y Hutchison, 1973, 1977; Broadbent,
1969; Yoshida et al., 1983; Garnsey et al., 1987; Bar-Joseph y Marcus, 1989.
Clymenia -- + Control tamaño del árbol Bitters et al., 1977
Microcitrus + + Resistente a sequía y a inundación, resistente a Radopholus citrophilus (Burrowing) y a Phytophtora Control del tamaño del árbol
Carpenter y Furr,1962; Bitters et al., 1969; Broadbent,1969; Feder y Ford,
1957; O’Bannon y Ford, 1977; Feder y Ford, 1957.
Citrus + + Control del tamaño del árbol Tribu Citreae: Subtribu Balsamocitrinae
Swingle ? + Resistente a Phytophthora; resistente a razas de VTC.
Venning et al., 1957; Del Valle et al., 1981; Garnsey et al, 1987.
Aegle -- + Resistencia a VTC Yoshida, 1996; Garnsey, 1984. Afraegle ? -- Resistente a Nematodos Baines et al., 1960
Aeglopsis ? -- Resistente a Nematodos Baines et al., 1960 Balsamocitrus ? ? Resistente a Nematodos Baines et al., 1960
Feronia ? -- Resistente a VTC, Tolerante a sequía Yoshida, 1996 Ferionella ? + Resistente a VTC Yoshida, 1996
(x): Swingle y Reece, 1967; (y): Grosser y Gmitter, 1990 C; Louzada y Grosser, 1994. SIGNOS: (--) Incompatible; (+) Compatible (?) No hay información.
17
2.8 Relaciones genéticas entre los cítricos
De acuerdo con Herrero et al., (1996 a, 1996 b), el camino apropiado para aumentar la
producción y calidad de los cítricos de manera sustentable es mediante la protección y
utilización eficiente de los recursos genéticos. En un intento por contribuir a un mayor
entendimiento de las relaciones genéticas entre el género Citrus y parientes cercanos,
se estudiaron mediante electróforesis, los patrones de variación aloenzimática en 198
variedades pertenecientes a 54 especies de Citrus y 13 genéros parientes de los
cítricos. Así se encontró que las especies de Citrus se distribuyeron en tres grupos:
naranja, mandarina, limón-acido y Pomelo. El portainjerto Poncirus trifoliata se localizó
lejos del genéro Citrus, pero estuvo conectado a ese genéro a través del Fortunella sp.
Los autores encontraron que el método de distancias genéticas y agrupamiento de
especies vecinas en racimos, resultaron eficaces para agrupar las especies y a futuro
dirigir la investigación en la búsqueda de genes de interés hacía los grupos de cítricos
que más convengan. Posteriormente, se construyeron mapas de relacipnes genéticas a
partir de híbridos de Citrus aurantium X Poncirus trifoliata C. volkameriana X P. trifoliata
autopolinizado (Ruíz y Asins, 2003).
Fang y Roose (1997), utilizaron el método de marcadores moleculares conocido como
secuencia intersimple repetida (ISSR) para distinguir diferencias entre las muestras de
94 árboles de 68 variedades de cítricos. La mayoría de estos cultivares están tan
cercanamente relacionados dentro de cada uno de los 6 grupos estudiados, que
resultan difícil distinguir por otras técnicas que no sean moleculares. Entre los
portainjertos fue posible distinguir 4 de 5 Citranges. La huella ISSR de Troyer y Carrizo
fue idéntica. El material Carrizo Kuharske que se caracteriza por tener mayor
resistencia a nemátodos que otras accesiones de Carrizo, tuvo una huella ISSR única.
Federeci et al (1998), por medio de RFLP examinaron las relaciones filogenéticas entre
88 accesiones pertenecientes a 45 especies de Citrus, tres híbridos y seis géneros
cercanos, así como también 32 accesiones de Citrus y 3 Microcitrus utilizando análisis
de RAPD. Los resultados indicaron que C. maxima estuvo afiliado a las papedas C.
hongheensis y C. latipes. En tanto que C. medica, se asoció con C. indica al considerar
únicamente la tasa no híbrida, ó con las limas y limones y sus parientes cuando se
consideran todas las especies. Las mandarinas no mostraron grupos fuertes entre ellos,
18
ni con otras especies. Así que los resultados demostraron que algunas accesiones
probablemente fueron ubicadas en sitios erróneos. En estudios realizados en limón
verdadero (Citrus limon L.) fue posible separar genotipos de esta especie utilizando
citometría de flujo y marcadores moleculares RAPD (Ianelli et al., 1998), así como
también mediante el empleo de microsatélites y 7 pares de inicadores (Cristofani et al.,
2003).
Recientemente Nicolosi et al., 2000, al utilizar 262 marcadores RAPD, 14 SCAR y
marcadores de ADNcp, determinaron que de cuatro géneros parientes de los cítricos, el
género Fortunella está filogenéticamente cercano; en tanto que Microcitrus, Eremocitrus
y Poncirus están distantes. En este estudio se encontró dentro del género Citrus las
especies C. medica y C. indica fueron los más distantes de otros Citrus y géneros
parientes. Los portainjertos Macrofila y Volkameriana, al igual que el limón Mexicano y
limón Verdadero se ubicaro en el grupo de la Cidra, en tanto que los portainjertos tipo
mandarino, junto con otras variedades formaron el grupo de mandarinos. Por medio de
marcadores moleculares los autores determinaron que Macrofila y limón Mexicano
provienen de un híbrido entre la Cidra y C. micrantha, en tanto que los ancentros del
naranjo agrio son el Pomelo y el mandarino, y los del mandarino se origiaron de una
fuerte contribución de mandarinos y débil de naranjos dulces.
En una revisión sobre la taxonomía de los cítricos y basados en los estudios con los
marcadores moleculares ISSR, Microsatélites y DNA-RAPD se llegó a la conclusión de
que las especies verdaderas del género Citrus son solamente tres: Cidro, Mandarino y
Pomelo y los demás son biotipos cultivados (Moore, 2001). De esta manera, este autor
llega a la conclusión de que a pesar de existr variedades de naranja, limón, limas y
toronjas que se han diseminado por todo el mundo, la base genética es muy estrecha.
2.9. Mejoramiento genético clásico de los cítricos
Los principales países productores de cítricos emprendieron programas de
mejoramiento con el fin de aportar soluciones a diversos problemas desde finales del
siglo pasado (Soost y Cameron, 1975).
19
Las líneas de mejoramiento que tradicionalmente se han empleado para el desarrollo
de nuevos genotipos son: 1) la selección clonal, 2) la hibridación sexual, 3) la
mutagénesis inducida y 4) la manipulación de la ploidía.
2.9.1 Selección clonal
Este procedimiento es el que más éxitos ha brindado en el desarrollo de nuevos
cultivares de cítricos. Muchas de las variedades cultivadas han surgido de la selección
de mutaciones espontáneas, que son relativamente frecuentes en los cítricos (Hodgson,
1967). En España la selección clonal ha dado origen principalmente a variedades de
naranja del grupo Navel, y mandarinos del grupo de los Clementinos y Satsumas (Bono
et al., 1996).
Las especies en la que se ha logrado el mayor número de variedades clonales en el
mundo son la mandarina, naranja y toronja. Las características de interés para la
selección de nuevas líneas de estas especies han sido: alto rendimiento, maduración
de fruta temprana ó tardía y mejor calidad de fruta (Gmitter et al., 1992).
2.9.2 Hibridación sexual
Los programas de hibridación sexual, combinados con la selección natural y la
selección artificial realizada por el hombre, han posibilitado la evolución dirigida del
género Citrus hacía la obtención de nuevos genotipos (Scora, 1975; Barrett y Rhodes,
1976; Gmitter y Hu, 1990).
Alguno de los éxitos conseguidos mediante polinización controlada fueron la obtención
de los híbridos intergenéricos limequats (Fortunella x C. aurantifolia); citranges (C.
sinensis x Poncirus trifoliata) y citrumelos (C. paradisi x P. trifoliata). El objetivo de
estas hibridaciones fue la incorporación del carácter tolerancia al frío desde el P.
trifoliata a especies del género Citrus. Se consiguió dicha transferencia con la
recuperación de híbridos sexuales fértiles, pero las inadecuadas características de los
frutos hicieron que los híbridos resultaran inapropiados para su uso como variedades
comerciales. Sin embargo, algunos genotipos como los citranges Troyer y Carrizo y el
Citrumelo Swingle mostraron excelentes características como patrones, por su
tolerancia a la tristeza y la producción de fruta de calidad, por lo que ahora se utilizan
20
ampliamente en diversas zonas citrícolas, (Savage y Gardner, 1965; Gmitter et al.,
1992; Castle, 1987).
La hibridación sexual también permitió la obtención de híbridos interespecíficos que
posteriormente han tenido un cierto impacto como variedades comerciales, tal es el
caso de los híbridos tipo mandarino como el Kara (C. unshui x C. nobilis), Nova [C.
clementina x (C. paradisi x C. tangerina)] o Fortune (C. clementina x C. tangerina) y de
algún tangelo como el Minneola (C. paradisi x C. tangerina).
2.9.3 Mutagénesis inducida
La mutagénesis inducida tiene interés cuando se pretende variar uno o pocos
caracteres negativos de una variedad (Micke et al., 1987; Spiegel, 1989). La búsqueda
de variación genética mediante tratamiento mutagénico de semillas o de yemas
axilares, se aplicó para generar variabilidad, pero se obtuvo una progenie sexual de
escaso interés y/o de difícil selección (Hearn, 1986).
La irradiación de semillas de clones de Pomelos ha permitido la obtención de distintas
variedades sin semillas son aceptación comercial (Henzs, 1977; Spiegel y Vardi, 1989).
La irradiación de semillas de limón Mexicano género una población variable de
genotipos entre las cuales sobresalieron algunos por producir árboles sin espinas y
otros con fruta prácticamente sin semillas (Robles-González, 1993; 2003). La
producción de frutos sin semillas tras la irradiación, es probablemente resultado de las
aberraciones cromosómicas ocurridas como consecuencia de la rotura de cromosomas
seguida de un apareamiento asimétrico de los extremos truncados (Froneman et al.,
1996).
También se han realizado ensayos de mutagénesis de yemas y ápices con el objetivo
de evitar el largo período juvenil de los cítricos, pero la obtención de quimeras
(mutaciones que no se expresan en las células de la línea germinal de la planta) ha
limitado su aplicación (Broetjes y Van Harlen, 1985).
A pesar de ello, actualmente se sigue aplicando esta tecnología de mejoramiento,
sobre todo de mandarinos, en Israel (Vardi et al., 1996) y Sudáfrica (Froneman et al.,
21
1996) y limón Mexicano ó lima Key en México (Robles-González, 2003), donde
emplean la irradiación con rayos gamma o con rayos X, lambda a pequeña escala.
2.9.4 Hibridaciones interploides
Los materiales cítricos autotetraploides obtenidas por cruzas sexuales a partir de
materiales diploides, tienen interés para desarrollar genotipos triploides, los cuales
producen plantas de fruto sin semilla (Krug y Bacchi, 1943).
La mayoría de triploides inducidos se han generado al utilizar tetraploides naturales
encontrados entre las plantas nucelares de los grupos más importantes de cítricos
(Cameron y Frost, 1968), pero también se pueden inducir mediante el tratamiento in
vitro de yemas axilares con colchicina (Barret, 1974; Oiyama y Okudai, 1986), aunque la
mayoría no tienen valor por ser citoquimeras.
La hibridación interploide para la generación de triploides ha sido intentada tanto con
hibridaciones 2n x 4n (Esen y Soost, 1971; Esen et al., 1978; Oiyama et al., 1981),
como 4n x 2n (Cameron y Burnett, 1978; Esen et al., 1978). La hibridación entre
genotipos diploides monoembriónicos, como parental femenino, con polen de
autotetraploides se utiliza para evitar el problema de la poliembrionía nucelar. Las
variedades “Oro Blanco” y “Melogold” se obtuvieron mediante la hibridación sexual entre
un pomelo poliembriónico autotetraploide y un pomelo monoembriónico diploide (Soost
y Cameron, 1980, 1985).
También se han descrito triploides naturales espontáneos (Krug y Bacchi, 1943)
surgidos ocasionalmente en cruzas de genotipos 2n x 2n y que en algunos casos
representaban hasta el 5% de la progenie (Cameron y Frost, 1968; Esen y Soost,
1971). El origen de estos embriones triploides no está claro, pero existen evidencias
que indican que se producen después de la fecundación de un ovocito no reducido (2n)
por un gameto (n) y que el fenómeno no parece estar influenciado por el progenitor
masculino (Esen y Soost, 1971). Además se comprobó que las semillas que contenían
embriones triploides tenían un tamaño entre 1/3 y 1/6 menor que las semillas con
embriones diploides.
22
La utilización de este tipo de cruzamientos en programas de mejoramiento presenta
limitaciones importantes, como el bajo cuajado de los frutos en algunos cruzamientos, el
aborto de la mayoría de las semillas y la escazes de parentales tetraploides de calidad.
2.10 Limitaciones de Mejoramiento Genético clásico en los cítricos
Queda claro que hasta el momento los cultivares más ampliamente empleados en las
principales áreas productoras del mundo se han obtenido por la selección de
mutaciones somáticas expontáneas (Vardi, 1992). Ello es fundamentalmente debido a
los impedimentos biológicos relacionados con la biología reproductiva de las especies
del género Citrus y de géneros afines, que dificultan los procesos de mejoramiento. A
continuación se describen los impedimentos comunes.
2.10.1 Heterocigosis y depresión por endogamia
En una revisión sobre este tema se índica que la mayoría de los cítricos son altamente
heterocigóticos y hay una carencia general de información y entendimiento del control
genético de las características importantes (Soost y Cameron, 1975; Grosser y Gmitter,
1990a) . En consecuencia las cruzas hechas entre parientes complementarios con
frecuencia fallan al tratar de producir las recombinaciones esperadas en la progenie
híbrida, o se produce una progenie débil, no saludable como resultado de la depresión
de mejoramiento (Barret y Rhodes, 1976; Swingle y Reece, 1967).
2.10.2 Esterilidad e incompatibilidad sexual.
El problema de incompatibilidad sexual entre especies y géneros de cítricos es muy
común debido a la esterilidad del polen y/o del óvulo en muchos genotipos . En algunas
especies e híbridos interespecíficos de cítricos se ha observado un sistema de auto
incompatibilidad e incompatibilidad cruzada (Soost, 1969; Ton y Krezdorn, 1966). Esta
incompatibilidad impide la realización de algunas hibridaciones potencialmente útiles,
que podrían ser exitosas. Las especies del género Citrus pueden ser cruzadas
sexualmente con especies de los géneros parientes más cercanos, pero no así los
parientes más distantes, que poseen también características agronómicas deseables y
que consecuentemente no se pueden aprovechar (Iwamasa et al., 1988; Swingle y
Reece, 1967; Sykes, 1988; Barret, 1977).
23
2.10.3 Apomixis y poliembrionia nucelar
Muchas especies del género Citrus tienen reproducción asexual por semilla, o apomixis
de origen nucelar y de tipo facultativo. Este modo de reproducción propicia la
producción de semillas poliembriónicas (Cameron et al., 1959; Cameron y Frost, 1968;
Soost y Cameron, 1975) que contribuyen al enmascaramiento de las relaciones
taxonómicas, los patrones de herencia y las compatibilidades sexuales entre las
distintas especies de cítricos. Sin embargo, el más obvio y crítico efecto, de la
embrionia nucelar, es que las hibridaciones realizadas bajo condiciones controladas
usando clones poliembriónicos como parientes maternos, frecuentemente producen una
escaza ó nula progenie, requerida para la selección de genotipos de interés como para
realizar estudios genéticos. Por otra parte, son pocos los parentales monoembriónicos
que producen únicamente embriones cigóticos y que pueden ser empleados para crear
poblaciones segregantes, lo que limita el reservorio genético que puede ser empleado
como parentales maternos (Grosser y Gmitter, 1990a).
La apomixis facultativa, aunada a la esterilidad y la depresión de mejoramiento, hacen
extremadamente difícil generar poblaciones segregantes de progenie vigorosa, lo
suficientemente grandes para lograr una selección y avance genético significativo. Para
crear poblaciones segregantes pueden usarse los parientes monoembrionicos, que
producen solo plántulas cigóticas, pero el número de estos parientes es pequeño, lo
que límita drásticamente el pool de material parental útil (Grosser y Gmitter, 1990 a).
2.10.4 Juvenilidad
Las plantas de cítricos propagadas por semilla y la progenie obtenida mediante
cruzamientos presentan un largo período juvenil antes de la primera floración (Soost y
Cameron, 1975), que además viene acompañado por la presencia de espinas, hábito
de crecimiento vertical y gran vigor, por lo que la evaluación de los híbridos requiere
muchos años y es muy costosa (Hansche, 1983).
La juvenilidad conlleva largos períodos entre generaciones, lo que dificulta
enormemente la tarea de evaluación de los posibles logros obtenidos en los programa
de mejoramiento y dificulta la realización del número de retrocruzamientos necesarios
para identificar los caracteres de interés en la progenie.
24
2.11 Mejoramiento genético de los cítricos por medi o de Biotecnología
Con el apoyo de la biotecnología se abren nuevas expectativas de mejoramiento
genético para superar algunas de las limitaciones descritas anteriormente.
Las alternativas de interés en que actualmente se trabajan en diversas regiones
citricolas son: 1. Manipulación de la ploidía; 2. Transformación genética; 3. Variación
somaclonal y 4. Hibridación somática
Para incursionar en estas estrategías biotecnológicas ha sido necesario previamente en
cada una de ellas poner a punto los protocolos de técnicas de cultivo de células y
tejidos de plantas en condiciones in vitro con el fin da hacer más fácil su manipulación y
aumentar la probabilidad de éxito (Spiegel y Vardi, 1984). De ninguna manera las
técnicas biotecnológicas sustituyen los métodos tradicionales de mejoramiento, de
hecho una combinación de ambas contribuirá a lograr avances más significativos.
2.11.1 Manipulación de ploidía
Los cítricos como regla general son diploides (2n=2x=18), aunque como ya se dijo se
han observado ó inducido algunos genotipos poliploides (Gmitter et al., 1992). Mediante
cultivo de tejidos también es posible generar cítricos con diferente nivel de ploidía. El
principal interés se centra en la obtención de triploides que producen frutos sin semilla,
los cuales tienen gran aceptación en el mercado (Krug y Bacchi, 1943; Soost y
Cameron, 1969). Sin embargo, también la obtención de aploides y tetraploides ha
despertado interés como parte de un proceso para lograr diploides ó poliploides
mejorados (Gmitter et al., 1992).
Entre las estrategias utilizadas para la generación directa ó indirecta de genotipos
poliploides bajo condiciones in vitro se incluyen: tratamientos de tejidos con colchinia
(Gmitter y Moore, 1986; Gmitter et al., 1990; Wu y Mooney, 2002), rescate de tejidos
triploides a partir de semillas abortadas de frutos originados de hibridación sexuales
(Gmitter y Moore, 1986; Gmitter et al., 1990, 1992); ginogenesis que consiste en
polinizar pistilos bajo condiciones in vitro (Germana y Chiancone, 2001); inducción de
mitosis durante la fusión de protoplastos (Ye et al., 1992) e hibridación somática
25
(Chandler et al., 2000; Grosser et al., 2000). Este último será abordado con mayor
amplitud más adelante.
Se ha logrado obtener plantas autotetraploides no quiméricas de naranjo dulce y
tangelo Orlando (Gmitter y Ling et al., 1992) y de Tangor (Wu y Mooney, 2002),
mediante el cultivo de óvulos in vitro en presencia de Colchinia. Sin embargo, este
método es considerado errático y en muchos cultivares no proporciona los resultados
esperados (Gmitter, citado por Grosser et al., 2000). Es posible recuperar plántulas
triploides débilmente desarrolladas mediante el uso de microinjerto (Gmitter et al.,
1992). En apoyo a lo anterior, De Pascuale et al. (1999), describen una técnica de
microinjerto para regenerar plantas de cítricos de difícil crecimiento in vitro.
El cultivo de endospermo también puede emplearse para producir triploides híbridos ya
que este es un tejido híbrido que surge de la fusión de un gameto masculino con dos
núcleos polares del parental femenino (Fahn, 1974). Por su parte Wang y Chang
(1978), lograron la regeneración de una plántula triploide a partir del endospermo; y
Gmitter et al., (1990), obtuvieron 4 plantas triploides híbridas a partir del cultivo in vitro
de endospermo y que luego llevaron al suelo. La limitación de esta técnica es su
bajisimo rendimiento y gran laboriosidad (Jaskanai et al., 1996) y en la práctica no se
emplea en programas de mejoramiento.
2.11.2 Transformación genética
Esta técnica de mejoramiento genético permite la incorporación de características
específicas de interés, codificadas por uno ó pocos genes, en genotipos élite, sin
alterar el resto de las características, lo cual es difícil de lograr con otros métodos de
mejoramiento convencional (Gmitter et al., 1992; Fillati, 1990). Paradójicamente los
genes que han resultado de utilidad para incorporar resistencia contra herbicidas,
insectos y enfermedades en algunas plantas son de origen viral ó de bacterias. La
inserción del gen de la cubierta proteica del virus dentro del genoma de las plantas,
proveerá protección contra la infección viral y expresión de síntomas (Gmitter et al.,
1992). En España Peña et al. (1995 a, 1995 b), desarrollaron un protocolo eficiente para
la transformación de plantas de cítricos con Agrobacterium. En un reporte reciente,
Peña y Navarro, (2000), indican que el vector más utilizado para introducir los genes de
26
interés es la bacteria Agrobacterum tumefaciens, aunque también se han utilizado los
métodos de Polietilen glicol, electroporación y bombardeo de partículas. En un inicio,
para la transformación se utilizaron células en suspensión y protoplastos de callo
embriogénico, lográndose poco éxito de regeneración (Kobayashi y Uchimiya, 1989).
Vardi et al. (1990), consignaron la regeneración de la primer planta transgénica de
cítricos a partir de protoplastos de limón Rugoso usando como vector al Polietilen glicol.
Diversos investigadores han intentado la transformación utilizando otros tejidos entre
los que se incluyen células embriogénicas, segmentos de epicotilo, segmentos
internodales y tejido maduro (Peña y Navarro, 2000; Ghorbel et al., 1998). A pesar del
gran esfuerzo a nivel mundial, los casos donde se ha tenido éxito con la regeneración y
cultivo de las plantas de cítricos transgénicas son escazos. A la fecha se han
incorporado genes virales que podrían conferir resistencia contra la tristeza a
variedades y portainjertos de cítricos (entre ellos al limón mexicano); tolerancia a
Phytophthora en plantas de naranjo dulce Pineapple, al introducirse el gen PR con una
proteína antifúngica aislada del tomate; mayor tolerancia a salinidad por la introducción
del gen HAL 2 aislado de Saccharomyces cerevisiae en plantas de citrange Carrizo y
también la introducción de los genes LFY y AP1 responsables de la floración obtenidos
de Arabidopsis thaliana a plantas de Citrange Carrizo (Peña y Navarro, 2000). Otros
logros en árboles son: modificación de la lignina y celulosa de la madera,
fitoremediación, reducción de la juvenilidad, entre otros (Peña y Seguín, 2001).
Recientemente Fleming et al., (2000), desarrollaron un método alternativo no
destructivo para la transformación del naranjo dulce (Citrus sinensis L. Osbeck) que
consiste en introducir un plasmido marcador de ADN que produce una fluorescencia
color verde al reaccionar con el genes introducido para la transformación. Esto facilita
grandemente la identificación de células, embriones y plántulas transformadas bajo
condiciones in vitro. De acuerdo con Moore (2001), la base genética en cítricos es aún
estrecha y por lo tanto hace atractivo el mejoramiento genético por transformación
genética.
Algunos autores coinciden en señalar que a pesar de la resistencia de los
ambientalistas en Europa, se debe continuar explorando el uso de técnicas modernas
transgénicas que presenta grandes oportunidades para solventar los problemas
27
actuales y futuros; Sin embargo, aunque los riesgos de que ocurra una polución
genética son muy bajos, se debe trabajar bajo las más estrictas medidas de seguridad y
propiciar a futuro el intercambio de fuentes genéticas entre biotecnologos y genetistas
clásicos para crear nuevas variedades éxitosas (Williamson, 2002; Jauhar, 2001).
2.11.3 Variación somaclonal
Bajo condiciones in vitro las plantas pueden experimentar cambios, que son conocidos
como variación somaclonal, la cual se define como la variación genética que es
inducida durante el proceso de cultivo de tejidos. Esta variación es otra alternativa de
mejoramiento genético que en cítricos ha sido poco explotada, pero que tiene un gran
potencial. Utilizando una población de 2000 árboles de variedades de naranja cvs.
Hamlim y Valencia, propagados por cultivo de tejidos en Florida, se han encontrado
varios genotipos de interés por su calidad de fruta y época de cosecha temprana y
tardía (Grosser et al., 1996 a; Grosser et al., 1997).
2.11.4 Hibridación somática
El esquema de mejoramiento genético por hibridación somática se basa en la fusión de
protoplastos aislados de callo nucelar embriogénico con protoplastos del mesófilo de las
hojas (Vardí y Spiegel, 1982; Ohgawara et al., 1985; Kobayashi y Ohgawara, 1988).
Este esquema se fundamenta en la capacidad que presentan algunas especies de
cítricos para producir líneas celulares embriogénicas de origen nucelar a partir del
cultivo in vitro de óvulos obtenidos de frutos inmaduros. Partiendo de estos callos
nucelares, que pueden mantenerse in vitro mediante subcultivos mensuales en medios
sin hormonas, es posible la regeneración de plantas completas via embriogénesis
somática. Así mismo, los protoplastos obtenidos de estos callos nucelares mantienen
esta capacidad embriogénica hasta desarrollar plantas, con lo que se puede establecer
un sistema protoplasto – planta a partir de ellos (Grosser y Gmitter, 1990a).
El mesofilo de las hojas es un tejido frecuentemente utilizado en otros sistemas para el
aislamiento de protoplastos y regeneración de plantas. Sin embargo, en cítricos, es
poco probable regenerar plantas a partir del cultivo de protoplastos aislados de las
hojas (Grosser y Gmitter, 1990a). Así la regeneración de híbridos somáticos de cítricos
28
después de la fusión de protoplastos de hoja y de callo embriogénico se logra por
totipotencia ó capacidad que tiene el callo embriogénico para regenerar plantas
completas.
De acuerdo con Grosser y Gmitter (1990 a); y Olivares-Fuster (1998), para iniciar un
programa de mejoramiento genético en cítricos mediante fusión de protoplastos se
requiere lo siguiente:
1) Contar con especies que posean las características agronómicas de interés para
un programa de mejoramiento.
2) Tener callos nucelares embriogénicos de al menos uno de los genotipos que se
desea fusionar,
3) Usar métodos eficaces para el aislamiento de protoplastos de calidad a partir de
callo nucelar y de hoja,
4) Desarrollar protocolos de regeneración a partir de protoplastos de callo
embriogénico de las especies de interés.
5) Contar con protocolos de fusión de protoplastos adaptados a las condiciones de
trabajo y a las especies vegetales de interés y que presenten una elevada
frecuencia de formación de heterocariones viables,
6) Obtener protocolos que posibiliten la regeneración de híbridos somáticos a partir
de esos protoplastos fusionados.
2.11.4.1 Germoplasma de Cítricos: Para desarrollar un programa de mejoramiento
genético amplio es imprescindible disponer de un banco de germoplasma que contenga
los genotipos de interés. En Estados Unidos y España se dispone de bancos de
germoplasma de Cítricos con más de 300 genotipos. En el caso de España se cuenta
con alrededor de 40 especies del género Citrus y 45 genotipos de 32 especies
correspondientes a 17 géneros de la subfamilia Aurantioideae, además con la
particularidad de que todos estos materiales están libres de patógenos transmitidos por
injerto. Los genotipos seleccionados se han saneado mediante la técnica de
microinjerto in vitro de ápices caulinares (Navarro et al., 1975, 1981), y los introducidos
de otros países se han mantenido en una Estación de Cuarentena de Cítricos sometida
a una técnica de cuarentena in vitro (Navarro et al., 1988, 1997) que impide la
29
introducción de nuevos patógenos. Generalmente los bancos de germoplasma constan
de dos colecciones de plantas: una que se encuentra establecida en campo y otra
cultivada en el interior de invernaderos protegidos con malla antiinsectos para evitar su
recontaminación.
Debido al elevado costo y las dificultades que implica el mantenimiento de las plantas
vivas, en algunos países se han desarrollado sistemas de crioconservación en
nitrógeno líquido de diversos tejidos (Pérez, 1995), como alternativa al modo tradicional
de conservación. Sin embargo, los mejores resultados se han obtenido con callos
embriogénicos obtenidos de plantas mantenidas en el banco de germoplasma a partir
del cultivo de óvulos de frutos inmaduros (Pérez, 1995; Pérez et al., 1997, 1998). De
estas líneas se mantiene una colección por duplicando en un tanque de nitrógeno
líquido y en un congelador eléctrico 5 -150°C (Nava rro et al., 1997).
La existencia y disponibilidad de este banco de germoplasma posibilita el desarrollo de
programas amplios de mejoramiento genético basados en distintas tecnologías, entre
ellas la hibridación somática vía fusión de protoplastos.
2.11.4.2 Embriogénesis somática. Smith y Drew, 1991 definen el témino de
embriógnesis somática como el desarrollo de embriones bajo condiciones in vitro a
partir de estructuras de origen somático, no célular. Aunque se le considera como una
técnica avanzada de micropropagación (Litz y Gray, 1992), la embriogénesis somática
tiene una gran aplicación en fusión de protoplastos, transformación genética y
conservación de germoplasma; presenta la ventaja de que no requiere procedimientos
costos y complicados para su manejo (Ling e Iwamasa, 1997). Los callos embriogénicos
de cítricos de obtienen bajo condiciones in vitro al desarrollarse los tejidos nucelares
extraídos a partir de semillas de frutos inmaduros (Vardi et al., 1986; Ling e Iwamasa,
1997); ó de explantes disectados de estilo/estigma (Carimi et al., 1998) obtenidos de
frutillo pequeños de diferentes especies de cítricos. Este último es el método que ha
recibido mayor atención. Por lo general los medios de cultivo empleados para la
embriogénesis son el MT (Murashige y Tucker, 1969), el MS (Murashige y Skoog, 1962)
ó el de Bitters (Bitters et al., 1970). Además del tipo de tejido para aumentar la
eficiencia en la regeneración de plantas a partir del callo embriogénico, se han
30
empleado complementos del medio de cultivo a base de reguladores de crecimiento
2,4-D y Bencil Adenina (BA) (Ling e Iwamasa, 1997), ácido naftalen acetico (ANA) y
Bencil adenino purina (BAP), y fuentes de carbono como el extracto de malta (Ling e
Iwamasa, 1997), sacarosa (Carimi, et al., 1999).
La obtención de líneas celulares embriogénicas es un proceso largo y errático (Grosser
y Gmitter, 1990 a) y el cultivo de óvulos únicamente puede comenzarse durante un
corto período de la primavera, que es variable para cada región y cultivar (Ploper et al.,
1997). En algunos genotipos, es imprescindible cultivar gran número de óvulos para
asegurar la evolución de alguno de ellos y la obtención de callo nucelar en cantidad
suficiente para su empleo en experiencias de mejoramiento, lo cual requiere períodos
de 1½ a 2 años. Por ejemplo, del limón Volkameriano (C. volkameriana), se cultivaron
2000 óvulos y únicamente uno de ellos evolucionó para dar lugar a callo nuclear
(Olivares-Fuster, 1998).
Lo anterior constituye un verdadero obstáculo para la aplicación a gran escala de
programas de mejoramiento basados en la fusión de protoplastos, pues esta tecnología
se basa en la disponibilidad de líneas celulares con capacidad embriogénica.
Se ha desarrollado con éxito un sistema para la crioconservación de líneas celulares
embriogénicas de cítricos (Pérez, 1995; Pérez et al., 1997, 1998), lo que constituye un
modo alternativo de conservación de estos recursos filogenéticos y evita los problemas
asociados a su mantenimiento. La utilización de material crioconservado facilitaría
enormemente el desarrollo de programas de mejora basados en técnicas
biotecnológicas, especialmente la fusión de protoplastos.
2.11.4.3 Aislamiento de protoplastos y regeneración de plantas. El primer
aislamiento controlado y repetible de protoplastos fue realizado por Cocking (1960) y
desde entonces se han aislado protoplastos mediante digestión enzimática en
numerosas especies y a partir de muy distintos tejidos vegetales (hojas, primordios
foliares, cotiledones, pétalos, peciolos, ápices caulinares, yemas florales, raíces, frutos,
coleóptilos, hipocotilos, tallos, capas de aleurona de semillas de cereales, nódulos
radiculares, polen o células madre de microesporas, callos o cultivos celulares en
31
suspensión) (Bajaj, 1989 a, 1989 b, 1993 a, 1993 b, 1994, 1996). Así mismo se han
establecido sistemas de regeneración de plantas a partir de protoplastos en muy
diversas especies (Roest y Gillisen, 1989, 1993).
En los cítricos, el establecimiento de un sistema de obtención de protoplastos y
regeneración de plantas fue abordado con éxito una vez que se dispuso del sistema de
regeneración de plantas completas a partir de callos embriogénicos de origen nucelar
(Button y Bornman, 1971; Kochba et al., 1972). En 1975 Vardi et al., consignaron el
aislamiento y cultivo de protoplastos de cítricos a partir del callo nucelar de naranjo
dulce “Shamouti” obtenido por Kochba et al, (1972). Posteriormente se logró la primera
regeneración de plantas a partir de protoplastos de una especie leñosa de naranjo
dulce (Vardi, 1977; Galun et al., 1977). Durante los años siguientes se logró la
regeneración de plantas a partir de protoplastos en otras especies de cítricos, como el
naranjo agrio, limón verdadero, mandarinos y el híbrido Tangor (Vardi, 1981; Vardi et
al., 1982).
Para la regeneración de plantas de cítricos a partir de protoplastos, se ha partido de
callos y células de origen nucelar. Los intentos de regeneración de planta a partir de
protoplastos de hoja de cítricos han sido infructuosos (Grosser y Chandler, 1987),
habiéndose observado la regeneración de pared y algunas divisiones, pero nunca el
establecimiento de callo, ni la regeneración de plantas (Galiana, 1995). Esto último se
ha conseguido solamente cuando se cultivaron protoplastos de hoja junto a protoplastos
de callo de origen nucelar en experiencias de fusión. Sin embargo al caracterizar las
plantas regeneradas se demostró que éstas poseen el genoma mitocondrial del
parental embriogénico, por lo que en realidad se trata de híbridos (Tusa et al., 1990;
Saito et al., 1993 a).
2.11.4.4 Métodos de fusión de protoplastos. Los métodos para inducir la fusión de
protoplastos vegetales se basan en las propiedades de agentes químicos o condiciones
físicas para variar el potencial de membrana de las células. Los agentes químicos más
empleados son el polietilénglicol (PEG) (Kao y Michayluk, 1974), el polivinil alcohol
(Nagata, 1978), el dextrano, el dimetilsulfóxido (DMSO) y los iones calcio, o la
combinación de varios de ellos (Olivares-Fuster, 1998). De entre los parámetros físicos
32
que pueden ser modificados para conseguir la fusión de las membranas plasmáticas de
dos células puestas en contacto, se encuentran el pH, la temperatura, el potencial
osmótico del medio o la fuerza centrífuga (Gleba y Sytnik, 1984; Pelletier y Chupeau,
1984).
El conocimiento de los fenómenos fisiológicos que posibilitan la fusión de las
membranas biológicas ha permitido combinar parámetros físicos y químicos,
empleándose conjuntamente el PEG, el DMSO, la presencia de iones calcio y un
elevado pH (Grosser et al., 1990).
Un avance importante en la fusión química lo proporcionaron los estudios de Kao y
Saleem (1986), que determinaron que el efecto tóxico del PEG comercial, era debido en
parte, a la presencia de impurezas, de carácter ácido, que afectaban a la viabilidad de
los protoplastos, y que pueden eliminarse mediante la desionización del PEG con
resinas de intercambio iónico.
Como alternativa para conseguir la fusión controlada de gran número de protoplastos
son los métodos de electrofusión (Zimmermann y Scheurich, 1981; Bates y
Hasenkampf, 1985), basados en el empleo de cámaras de fusión y fuentes eléctricas,
los cuales se aplican actualmente con éxito en muchos sistemas vegetales.
El método más conocido de electrofusión de protoplastos se basa en la utilización de
una fuente eléctrica que proporciona tanto corriente alterna como pulsos de corriente
continua. El método consiste en resuspender los protoplastos en un medio de baja
conductividad y situarlos entre los electrodos de la cámara de fusión que permite
someterlos a la acción de un campo eléctrico de corriente alterna de elevada
intensidad, en el que los protoplastos se mueven por dielectroforesis hasta disponerse
unos junto a otros en hilera, formando lo que se denomina “cadenas de perlas”. A
continuación, la aplicación de un pulso corto de corriente contínua, da lugar a la
formación de poros reversibles en los puntos de contacto de las membranas
plasmáticas de las células, posibilitando así la fusión de protoplastos con las
intensidades de campo eléctrico y el tiempo de duración de los pulsos (Bates et al.,
1987; Tempelaar y Jones, 1985; Merhle et al., 1990).
33
Así mismo, se ha empleado la acción conjunta de campos eléctricos y agentes físico-
químicos como PEG (Vela, 1996), iones calcio (Tempelaar et al., 1987) o DMSO (Nea y
Bates, 1987). El PEG a bajas concentraciones se emplea como agente aglutinante,
pues permite aumentar la superficie de contacto entre los protoplastos, por lo que se
emplea antes del tratamiento de electrofusión. Los iones calcio actúan a nivel de la
fusión facilitando la adhesión de las células y estabilizando las membranas (Tempelaar
et al., 1987) ya que neutralizan las cargas superficiales y reducen la fluidez de la
membrana (Gleba y Sytnik, 1984), aunque también se ha señalado que elevadas
concentraciones de iones calcio puede influir negativamente en el proceso de
electrofusión (Nea y Bates, 1987).
Estudios comparativos indican que la electrofusión en determinados sistemas, presenta
ventajas en relación a la quimiofusión por su simplicidad, su reproducibilidad y la
posibilidad de ejercer un control más directo y preciso sobre los parámetros de fusión, lo
cual permite obtener un mayor número de fusiones simples (Bates et al., 1987).
El primer trabajo de obtención de un híbrido somático de cítricos por electrofusión fue
descrito por Ohgawara et al. (1985), quienes produjeron un híbrido alotetraploide
intergenérico mediante la fusión de protoplastos de callo embriogénico de naranjo
“Trovita” (C. sinensis) con protoplastos de mesófilo de hoja de Poncirus trifoliata.
Posteriormente se han descrito otros híbridos somáticos, tanto interespecíficos (Grosser
et al., 1992; Kobayashi y Ohgawara, 1988; Tusa et al., 1990) como intergenéricos
(Grosser et al., 1996 d; Kobayashi y Ohgawara, 1988; Mourao, 1995), así como la
obtención de híbridos mediante el sistema donante-receptor (Vardi et al., 1987). En los
Cuadros 3, 4, 5 y 6, se presentan algunos de los híbridos somáticos que se han
obtenido a partir de fusiones químicas o eléctricas.
En la fusión de protoplastos de cítricos el grupo americano, dirigido por el Dr. J.
Grosser, viene utilizando con éxito la fusión química mediante la combinación de PEG,
DMSO, elevado pH y presencia de iones calcio, habiendo conseguido hasta la fecha la
regeneración de más de 100 híbridos somáticos distintos (Grosser et al, 1996 c;
Grosser et al., 2000). El grupo japonés que inicialmente empleó la fusión química con
PEG, se ha inclinado posteriormente por la electrofusión (Hidaka y Omura, 1992;
34
Yamamoto y Kobayashi, 1995), habiendo incluso desarrollado una cámara propia de
electrofusión (Hidaka et al., 1995). El grupo francés, dirigido por el Dr. Ollitrault, inició su
programa de hibridación somática con la adaptación del método químico de fusión
basado en el PEG, pero al no conseguir resultados positivos optó por la electrofusión
empleando una cámara plana de doce electrodos en paralelo (Ollitrault et al., 1996 b).
Los rendimientos obtenidos en cada laboratorio son similares y en general no se puede
afirmar que alguno de los protocolos utilizados sea superior a otro, sino que cada grupo
ha elegido el procedimiento de hibridación somática más eficiente para emplearlo de
forma rutinaria a sus condiciones de trabajo y considerando el distinto material vegetal
utilizado.
2.11.4.5 Selección de los híbridos somáticos. Para lograr desarrollar un programa de
hibridación somática éxitoso, es necesario aplicar esquemas para la identificación y
selección de las plantas híbridas y distinguir los progenitores que no se fusionaron y los
productos de autofusión. La selección de híbridos somáticos a nivel celular es muy
complicada si no se dispone de marcadores (colorantes, mutantes) que no son fáciles
de obtener en plantas leñosas. Así pues, el hecho de que uno de los progenitores no
tenga capacidad de regeneración simplifica la selección de los híbridos, la cual se dirije
únicamente a detectar los homocariontes del progenitor embriogénico y los protoplastos
no fusionados del mismo (Waara y Glimelius, 1995).
El esquema empleado es simple: los protoplastos de origen nucelar, como uno de los
progenitores tienen la capacidad de dividirse, formar callo y regenerar plantas, y los
protoplastos del mesófilo de hojas del segundo progenitor, no forman callo ni regeneran
plantas. La capacidad embriogénica se encuentra bajo el control de genes dominantes,
que se expresan en los productos de fusión, en los que al menos los protoplastos de un
progenitor proceden de callo o células embriogénicas, permitiendo así la recuperación
de los híbridos (Grosser y Gmitter, 1990 a, 1990 b).
Dentro de este esquema también es deseable reducir o eliminar la embriogénesis de
los homocariones y de los protoplastos de callo sin fusionar. Para ello que se han
desarrollado distintas aproximaciones. Ohgawara et al. (1985), consiguieron inhibir casi
35
totalmente la embriogénesis somática en los protoplastos procedentes del callo nucelar
de naranjo “Trovita” empleando un medio con 0.6 M de sacarosa. El empleo de cultivos
embriogénicos en suspensión, en comparación al cultivo de los callo sobre medio
sólido, también ha resultado adecuado a fin de evitar la embriogénesis del parental de
callo después de la fusión (Grosser, 1994), pues al parecer, las células en cultivo
líquido manifiestan una gran actividad mitotíca y aunque retengan su potencial
embriogénico éste no se expresa en tales condiciones de cultivo. Esta inhibición
epigenética de la capacidad embriogénica parece aumentar con la edad del cultivo en
suspensión, aunque es posible que al someter las células al proceso de fusión pueda
desencadenar la expresión de la embriogénesis somática (Grosser y Gmitter, 1990 a).
De cualquier modo, el procedimiento de selección empleado en cítricos aún es empírico
ya que no se controlan adecuadamente las condiciones que favorezcan el desarrollo
únicamente de los heterocariones. Esto dificulta la puesta a punto de procedimientos de
fusión que permitan recuperar de forma eficiente los híbridos somáticos, especialmente
cuando la respuesta embriogénica después de la fusión no es la esperada. Las
diferencias morfológicas entre los protoplastos de callo y los de mesófilo facilitan
únicamente el estudio de la fase más temprana de la fusión, la formación del
heterocarión. En estas circunstancias, sería deseable disponer de marcadores visuales
que permitiesen realizar un seguimiento de todas las fases de la fusión, desde la
formación del heterocarión hasta la regeneración de la planta híbrida, lo que facilitaría
enormemente la puesta a punto de protocolos eficientes de fusión de nuevos genotipos
(Olivares-Fuster, 1998).
2.11.4.6 Caracterización de los híbrido somáticos. Los híbridos somáticos
desarrollan una morfología vegetativa intermedia entre los dos parentales, un número
de cromosomas tetraploide aditivo y una complementación a nivel de marcadores
genéticos. Sin embargo, ninguna de estas características por sí sola proporciona
suficiente confirmación, pues cada una de ella presenta limitaciones que podrían dar
lugar a la determinación de falsos híbridos (Grosser y Gmitter, 1990 b).
Las diferencias morfológicas existentes entre los cítricos y las especies de géneros
relacionados, así como dentro del género Citrus, facilitan la identificación visual de sus
36
híbridos somáticos. Los caracteres bajo el control de genes dominantes o codominantes
se expresan claramente en los híbridos somáticos, particularmente en combinaciones
completas. Así la morfología de la hoja, el tamaño y forma del pecíolo o el contorno y
grosor foliar ayudan a la identificación temprana de posibles plantas híbridas, ya que
suelen presentar una morfología foliar y un tamaño de las alas del pecíolo intermedios a
los de sus parentales, además un aumento en el nivel de ploidía propicia un incremento
en el grosor de la hoja, un color más oscuro de la misma y su redondeamiento (Grosser
y Gmitter, 1990 a).
La determinación del número de cromosomas en las plantas regeneradas se ha
realizado habitualmente mediante la observación al microscopio de preparaciones de
células en metafase a partir de segmentos de raíz teñidos con distintos colorantes. Se
ha recomendado la tinción con hematoxylina (Grosser y Gmitter, 1990 a) y la tinción con
orceína (Oiyama, 1981), pero la preparación de las muestras y el conteo de
cromosomas es un procedimiento lento, tedioso y que requiere práctica, lo que limita la
evaluación de un número elevado de muestras.
También se ha descrito la determinación del índice de ploidía mediante medidas
microdensitométricas de la luz absorbida por núcleos teñidos con el reactivo de Feulgen
(Bennet y Smith, 1976), que a pesar de ser un buen procedimiento citoquímico para
cuantificar el ADN nuclear, puede dar lugar a errores y proporcionar resultados
inadecuados (Bennet y Smith, 1976).
La citrometría de flujo, que inicialmente fue desarrollada para la investigación médica,
se está aplicando cada vez más en la determinación de la cantidad de ADN en núcleos
de células vegetales. Esta técnica permite realizar una estimación del volumen en
función de la intensidad de fluorescencia de núcleos o células aisladas, y cuando se
realiza una tinción específica de ADN, permite cuantificar el contenido de ADN en las
células. Con esta técnica es posible analizar un gran número de núcleos en pocos
segundos y procesar así un elevado número de muestras en poco tiempo, por lo que es
un método excepcionalmente rápido, fácil, sensible, además de que proporciona una
mayor exactitud estadística que los análisis clásicos de ploidía (Ollitrault y Michaux,
1992).
37
Para confirmar el carácter híbrido de las plantas obtenidas después de una fusión de
protoplastos, se ha empleado la electroforesis en geles de agarosa de diferentes
sistemas isoenzimáticos (Grosser et al., 1989; Kobayashi y Ohwagara, 1988; Torres et
al., 1978). Sin embargo, el análisis de isoenzimas en Citrus presenta algunas
desventajas debidas fundamentalmente a su bajo nivel de polimorfismo, pues el número
de alelos para los sistemas isoenzimáticos comúnmente empleados es muy limitado, y
muchos híbridos intraespecíficos y algunos interespecíficos no pueden ser distinguidos
de los progenitores.
Los progresos en el ámbito de la biología molecular permiten analizar directamente la
composición genética de los híbridos somáticos. Uchimiya et al. (1983), demostraron
que el análisis con endonucleasas de restricción de un gen del ARN ribosómico nuclear
(ADNr) permitió la identificación de híbridos somáticos de Nicotiana, por lo que el
análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción del ADN (ribosomal) (ADNr-
RFLP) fue aplicado posteriormente para la caracterización de híbridos somáticos de
Citrus, mediante el análisis de alta resolución de ADNr utilizando sondas de ARNr
marcadas con biotina (Ohwagara et al., 1991; Miranda et al., 1997; Moringuchi et al.,
1997; Motomura et al., 1997), lo que constituye un método preciso y directo de
verificación del carácter híbrido de la progenie de muchos cítricos, incluyendo los
híbridos somáticos.
El desarrollo de las técnicas de amplificación del ADN mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), ha permitido aplicar técnicas incluso más sencillas y rápidas
para el análisis de genomas de plantas. Uno de éstas es la denominada RAPD
(“Random amplified polymorphic DNA”), que en principio se empleó para establecer
relaciones taxonómicas y mapear el genoma de algunas especies de plantas (Kennard
et al., 1994; Landr et al., 1994; Novy et al., 1994; Thormann et al., 1994), y
posteriormente se adaptó para la confirmación de híbridos somáticos de papa
(Takemori et al., 1994). En cítricos estos marcadores fueron empleados para el mapeo
de su genoma (Cai et al., 1994), y más recientemente se han adaptado para diferenciar
plantas nucelares zigóticas y para confirmar los híbridos somáticos obtenidos de entre
todas las plantas regeneradas (Grosser et al., 1996 c; Mourao, 1995).
38
Con la constante evolución de técnicas de análisis genómico se abre la posibilidad de
buscar nuevos marcadores más potentes y sencillos para la verificación de los híbridos
somáticos. Miranda et al. (1997), describieron alteraciones cromosómicas en células
mitóticas de híbridos somáticos de limón Rugoso y mandarino Ponkan, siendo esta la
primera y única vez que se ha publicado este tipo de irregularidades en híbridos
somáticos de cítricos. No se conocen estudios de la integración parcial del ADN
parental en los híbridos, ni de recombinaciones cromosómicas o de expresión de genes
de los parentales en los híbridos a pesar de que este tipo de estudios básicos podrían
ilustrar procesos importantes ocurridos durante el establecimiento del híbrido somático.
2.11.4.7 Ventajas de la hibridación somática frente a la hibridación sexual. La
hibridación somática vía fusión de protoplastos ha abierto nuevos horizontes para el
mejoramiento genético de los cítricos. La combinación de esta técnica con los métodos
convencionales ofrece la posibilidad de superar algunas de las barreras naturales
propias de la biología reproductiva de los cítricos y que tradicionalmente han limitado el
mejoramiento (Grosser y Gmitter, 1990a). Recordemos que las limitantes a
mejoramiento incluyen: la heterocigosis y depresión por endogamia, esterilidad e
imcompatibilidad sexual, apomixis y poliembrionía; juvenilidad y otras. En seguida se
presenta información que pone de manifiesto las ventajas de la hibridación somática
sobre la hibridación sexual.
Mediante el establecimiento de un sistema apropiado donador-receptor por fusión de
protoplastos es posible generar un amplio espectro de híbridos somáticos para estudios
de relaciones taxonómicas de los cítricos con otros géneros y superar estas barreras.
El genoma de los cloroplastos así como el de las mitocondrias (plastoma y condrioma,
respectivamente), juegan un papel importante en la determinación de algunos
caracteres de interés, ya que al estar estrechamente relacionados con la producción de
energía, están vinculados directamente con el crecimiento de la planta o la
productividad de la misma (Medgyesy, 1994), y pueden determinar caracteres genéticos
tan interesantes como la resistencia a toxinas, a herbicidas, la tolerancia a bajas
temperaturas o la esterilidad masculina (Medgysey et al., 1986). Además, la heterosis
39
núcleo/citoplasma puede tener un papel determinante en el vigor de los híbridos
(Srivastana, 1983).
De este modo la hibridación somática puede superar la apomixis facultativa, y producir
híbridos de parientes poliembriónicos, que son difíciles o imposibles de producir de
manera natural.
Los estudios sobre la herencia de organelos del citoplasma mediante los esquemas
clásicos de mejoramiento, implica programas de retrocruzamientos muy largos para
llegar a conseguir la transferencia de caractéres citoplasmáticos de unas especies a
otras (Kihara, 1982; Tsunewaki, 1988). La fusión de protoplastos permite la creación de
plantas con nuevas combinaciones, y recombinaciones de orgánelos citoplasmásticos
(híbridos) (Vardi et al., 1986, 1987) y por tanto abordar tales programas de
mejoramiento de una forma más sencilla.
La incorporación de alelos que se caracterizan por acortar la fase juvenil en otras líneas
de germoplasma de Citrus, podría mejorar la respuesta a la selección y la eficiencia
general en programas de mejoramiento genético (Hansche, 1983). Presumiblemente,
esto podría completarse a través de algunos ciclos de hibridación sexual y por selección
recurrente en base a precocidad, siempre que no existan barreras para la hibridación
sexual. Sin embargo, con la hibridación somática se puede reducir el largo período
juvenil de los cítricos y evitar el impedimiento en el avance genético. Actualmente se
han estado evaluando híbridos somáticos de C. aurantifolia “Key” + C. sinensis
“Valencia” (Grosser et al., 1989) para corroborar si la duración de la fase juvenil de este
híbrido somático es similar a los progenitores limón Key (18-24 meses), y la naranja
Valencia (5 años ó más), ó intermedia entre ambas especies.
Existen otras consecuencias genéticas que resultan al usar fusión de protoplastos para
generar nuevas formas de híbridos Citrus. Una de ellas es que el progenitor debe ser
potencialmente embriogénico “in vitro”. Esto reduce el pool de progenitores disponible
para hibridación somática. Otra es que los híbridos somáticos pueden fallar en producir
flores normales ó desarrollar flores infértiles, especialmente los híbridos que combinen
al género Citrus con parientes distantes. También, los pares de cromosomas
40
preferenciales pueden inhibir la recombinación genética dentro de los híbridos
somáticos. Una tercera consecuencia de hibridación sexual, consiste en que al realizar
cruzas regresivas de híbridos de amplio rango con el género Citrus para eliminar
características negativas, se pueden producir tetraploides; si estos se logran hibridizar
con los diploides, se producirán triploides infértiles. Los triploides podrían ser de valor
comercial porque originan fruto sin semillas, aunque su utilidad para lograr nuevos
avances genéticos será mínima. Finalmente la hibridación sexual elimina la oportunidad
de obtener segregación y recombinación, lo que significa que con cualquier par de
progenitores se puede producir solo una combinación híbrida. Es decir, no se producen
rangos en los caracteres de variación sobre los cuales se pueda aplicar presión de
selección. Los métodos de cibridación (Vardí et al., 1987) y fusión con rayos gamma
(Bates et al 1987; Gleba et al 1988), puede ayudar a superar algunas de estas
consecuencias, pero a expensas de reducir la oportunidad de intercambiar genes.
Hasta el momento, los alotetraploides de cítricos obtenidos parecen superar la falta de
vigor asociada tradicionalmente con los autotetraploides de cítricos (Grosser, 1993; Lee
y Phillips, 1988). De hecho, los híbridos somáticos interespecíficos de plantas juveniles
del limón Key (similar al limón mexicano) + naranja dulce Valencia tienen una tasa de
crecimiento comparable al limón Rugoso, uno de los portainjertos de cítricos más
vigorosos. En consecuencia el mejoramiento genético a través de hibridación somática,
presenta la ventaja sobre la hibridación sexual, de que se realiza una combinación de
progenitores complementaria directamente, sin pérdida significativa de vigor en la
mayoría de los casos propiciando una expresión aditiva de características dominantes
en los híbridos (Grosser y Gmiter, 1990 a).
2.12 Situación actual del mejoramiento genético de cítricos por hibridación
somática
El futuro de los cítricos depende del desarrollo de nuevos genotipos que seán capaces
de tolerar problemas fitosanitarios, adaptarse a condiciones ambientales adversas y
que produzcan fruta de aceptable calidad para su consumo en fresco y para su
procesamiento industrial. No hay duda de que la biotecnología contribuirá grandemente
al logro de este objetivo. Sin embargo, es claro que la producción de nuevas variedades
41
y portainjertos de cítricos dependerá en gran medida del esfuerzo conjunto de
biotecnológos y genetistas clásicos.
2.12.1 Mejoramiento de portainjertos de cítricos me diante hibridación somática
El desarrollo de patrones de cítricos, por métodos convencionales, ha sido limitado por
la falta de continuidad en programas de mejoramiento genético y por factores
biológicos, que inhiben el mejoramiento y la selección. El éxito futuro será más
promisorio si se desarrollan programas continuos, que combinen los métodos de
mejoramiento convencional con la biotecnología. Estos programas tienen potencial para
producir e identificar nuevos patrones, que exhiban la compleja combinación de
características agronómicas y patológicas necesarias para maximizar su
aprovechamiento en diversas regiones geográficas cítricolas del mundo. De manera
drástica el futuro de la citricultura dependerá del éxito o la falla de los programas de
desarrollo de nuevos portainjertos.
Se sabe que más de 20 características agronómicas y patológicas importantes son
controladas por los patrones (Castle, 1987). Algunas de ellas son: el tamaño de planta,
vigor, tolerancia a frío, tamaño de fruta, rendimiento y calidad de fruta; las
características patológicas como tolerancia a Phytophthora, virus de tristeza, blight, y
nematodos. Algunos de estos factores primarios son capaces de limitar la adaptación
de una especie a una determinada región. También son importantes la tolerancia a
factores abióticos como el frío, sequía, inundación y salinidad. A continuación se
discuten los principales objetivos de mejoramiento genético en relación a los
portainjertos.
2.12.1.1 Enfermedades inducidas por Phytophthora. La presencia del hongo
Phytophthora spp es común en todas las regiones cítricolas. P. parasitica Dast y P.
citrophthora (R.E Son and E. H. Son) Leonian, son responsables de una de las
enfermedades más serias de cítricos (Timmer y Menge, 1988). Estas enfermedades
causantes de la pudrición de raíz propiciaron la introducción y uso de patrones en la
citricultura a partir de mediados de 1800’s (Castle, 1987).
42
Las infestaciones por Phytophthora pueden rápidamente ocasionar un anillado en el
tronco y matar los árboles de vivero y también son capaces de matar árboles adultos;
sin embargo, los árboles grandes, por lo general, solo son parcialmente dañados en el
tronco lo que conduce a la declinación, defoliación, muerte regresiva y crecimiento corto
de flujos en la copa del árbol (Timmer y Menge, 1988). Las fuentes de resistencia e
inmunidad se encuentran en muchos de los parientes de Citrus (Swingle y Reece
1967). Entre los patrones con buena resistencia a Phytophthora se incluyen: Naranjo
trifoliado (Poncirus trifoliata (L). Raf)., Naranjo agrio (C. aurantium L.) y Citrumelo
swingle (híbrido C. paradisi X P. trifoliata y el Citrus macrophylla).
2.12.1.2 El virus de la tristeza de los cítricos. Tristeza (VTC), es un closterovirus
patógeno de cítricos y es el virus más importante que afecta a los cítricos (Garnsey y
Lee 1988). La declinación de los árboles sobre naranjo agrio causada por VTC tiene un
gran impacto en la producción de cítricos en todo el mundo; millones de árboles se han
muerto en España, Brasil, Argentina, Venezuela, California y Florida (Orozco-Santos,
1994; Rocha-Peña et al., 1995). La declinación es causada por una necrosis del floema
inmediatamente debajo de la unión del injerto de las variedades de naranja dulce,
toronja y mandarina sobre el portainjerto naranjo agrio. El virus que causa la tristeza es
transmitido por injerto y retransmitida rápidamente por los áfidos Toxoptera citricida,
Aphis citricola, Aphis gossypii. El VTC ha provocado una reducción del uso de naranjo
agrio, como principal patrón en todo el mundo. Todos los nuevos materiales candidatos
a usarse como patrones deben tener tolerancia ó resistencia a VTC. El limón Rugoso y
el naranjo dulce son tolerantes a VTC, los mandarinos son más resistentes y algunas
selecciones de naranjo trifoliado e híbridos son inmunes.
2.12.1.3 El Blight de los cítricos. Blight es una enfermedad de etiología
desconocida que se ha reportado en Florida, Texas, Luisiana, Hawaii, Cuba, Belice,
Colombia, Africa del Sur, Quensland. Enfermedades similares (probablemente debido al
mismo agente causal) han sido reportadas en Brasil, Argentina y Uruguay (Castle,
1987). Debido al reciente éxito con la transmisión del Blight por injerto de raíz, se cree
que esta enfermedad es causada por un patógeno sistemíco (Tucker et al., 1984,
citados por Grosser y Gmitter, 1990a). Esta enfermedad constituye el mayor problema
en las regiones citricolas húmedas de Florida y Brasil. Por lo general el Blight afecta
43
principalmente a los árboles en producción. Los síntomas iniciales consisten en un
debilitamiento del árbol, clorosis foliar por deficiencia de Zinc, retrazo en la emisión de
flujos vegetativos de primavera en un estado avanzado de la enfermedad se observa
necrosis en las raíces principales. Lo que ocurre es que se desarrollan unos tapones
amorfos en el xilema, lo cual inhibe el transporte del agua en el tejido del xilema.
También se observa la acumulación de Zinc en el floema (Timmer, 1988). La incidencia
de Blight varía grandemente, dependiendo del tipo de patrón; el naranjo Trifoliado, el
limón Rugoso y la lima Rangpur son los patrones más susceptibles y en tanto que el
naranjo dulce y naranjo agrio son los más tolerantes. Dentro del género Citrus no se
han encontrado niveles deseables de resistencia, pero podría existir en otros parientes
de los cítricos. La resistencia a Blight debe ser un objetivo primordial de programas de
investigación, que intentan desarrollar patrones para las regiones húmedas donde se
cultivan cítricos.
2.12.1.4 Resistencia a nematodos. Las altas poblaciones de nemátodos del
género Tylenchulus semipenetrans Cobb pueden causar declinación lenta del árbol, al
alimentarse de la raíz de los cítricos. Esta plaga no mata los árboles pero puede reducir
grandemente su vigor y productividad. Esta especie de nemátodos prefiere suelos
orgánicos de textura fina. Entre los portainjertos resistentes se incluyen los géneros
Poncirus, Severinia y Balsamocitrus (Kaplan, 1988). Así mismo el uso de patrones
resistentes también es importante en regiones donde se detectan los biotipos de
nemátodos de alto riesgo de daño. El nemátodo del tipo Radopholus citrophilus Huettel,
causa una más rápida declinación; este patógeno se presenta solo en áreas de Florida
en suelos profundos bien drenados (Kaplan 1988). Sin embargo, se requiere ampliar el
número de portainjertos tolerantes a la diversidad de especies de nemátodos.
2.12.1.5 Frío. Entre las regiones de cítricos con problemas de daños por heladas se
incluyen a la Florida, Texas, Japón y España. Los patrones pueden agregar a la
variedad una influencia significativa en tolerancia al frío. Las especies de cítricos
injertadas sobre naranjo trifoliado, naranjo agrio, mandarina Cleopatra y citrumelo son
menos susceptibles al daño por frío, que los patrones de limón Rugoso (C. jambhiri
Lush), lima Rangpur (C. limonia Osbeck), citrange Carrizo (un híbrido de C. sinensis por
44
P. trifoliata). Los parientes del género Citrus pueden ser una fuente de germoplasma
favorable para mejorar la tolerancia al frío (Grosser y Gmitter, 1990 a).
2.12.1.6 Salinidad. En cítricos pueden ocurrir daños por sales debido al tipo de suelos
salinos con depósitos geológicos de sales, sobre todo cuando se riega con agua salina,
si hay rocío por el viento de la costa y con la excesiva aplicación de fertilizante. Por ello,
se requiere mejorar los patrones para que sean tolerantes a sales y poder expandir la
citricultura, a regiones donde la salinidad reduce significantemente la productividad
(Grosser y Gmitter, 1990 a; Castle, 1987).
2.12.1.7 Sequía. La resistencia a sequía es importante donde la lluvia es
inadecuada ó inconsistente y el riego no es práctico como en Brasil. Se sabe que los
patrones con enraizado profundo como limón Rugoso y Rangpur toleran la sequía, pero
son altamente susceptibles al Blight; así que en áreas donde el Blight es un problema,
el mejoramiento de patrones resistentes a sequía es necesario (Grosser y Gmitter, 1990
a; Castle, 1987).
2.12.1.8 Inundación. La exposición a la inundación causada por elevados niveles del
espejo del agua ó lluvia fuertes, puede ocasionar daños a los árboles cítricos. A ésto se
le asocia la falta de oxígeno durante los períodos de altas temperaturas, por lo que los
árboles pueden ser dañados en menos de una semana por la falta de oxígeno. Para
regiones donde la citricultura experimenta estaciones lluviosas fuertes, se necesitan
patrones tolerantes a inundación (Castle 1987).
2.12.1.9 Factores agronómicos. Cualquier patrón nuevo, con posibilidad de usarse,
por haber mejorado la tolerancia a estrés biótico ó abiótico, también debe satisfacer
requerimientos de estándares agronómicos de vigor y tamaño de la planta, tamaño de
fruta, rendimiento, calidad de jugo de la variedad injertada. Los patrones, que reducen
el tamaño del árbol e inducen precocidad de la variedad, cada vez adquieren mayor
importancia para usarse en plantaciones de alta densidad, con el fin de permitir a los
productores una más rápida tasa de retorno de capital invertido (Castle, 1987). Aunque
se reconoce que el objetivo número uno en un programa de mejoramiento genético de
patrones es aumentar el rendimiento.
45
2.12.2 Objetivo del mejoramiento de variedades de C ítricos por hibridación
somática
A continuación se señalan los principales objetivos de un programa de Mejoramiento
genético para la obtención de variedades híbridas somáticas de cítricos superiores a las
actuales. En virtud de que ésta no es la principal, área de investigación en relación a
este proyecto de Investigación, se ha considerado pertinente solo presentar en forma
concreta la información recopilada por Grosser y Gmitter 1990 a, respecto a los
objetivos más importantes a seguir en un programa de Mejoramiento Genético en
Cítricos.
2.12.2.1 Tolerancia al frío. La mayoría de los cítricos en el mundo se ha establecido en
las regiones subtropicales y por ello se requieren variedades con mayor tolerancia al
frío, para evitar los daños severos causados por este factor. Entre los cítricos existe un
amplio rango de resistencia al frío donde el limón C. aurantifolia que es muy
susceptible, pero el C. ichangensis Swing que es muy tolerante. Otros materiales con
alta tolerancia a frío son los géneros Fortunella Swing, Eremocitrus Swing y Poncirus
Raf.
2.12.2.2 Resistencia a enfermedades. Es necesario incorporar resistencia genética a
enfermedades como VTC, Phytophthora sp, que debilitan árboles adultos productivos.
Mención especial merece la enfermedad denominada “Atracnosis” causada por
Colletotrichum acutatum que anualmente causa severos estragos al limón Mexicano
(Medina-Urrutia, et al., 2001). Ya que el género Poncirus es inmune a VTC, a la fecha
se hacen esfuerzos por aislar genes responsables de esta característica para luego
incorporarlo a especies del género Citrus susceptibles a esta enfermedad.
2.12.2.3 Tolerancia a plagas. La susceptibilidad de las especies de cítricos a los
daños causados por áfidos, ácaros, escamas y otras plagas repercute en la disminución
del rendimiento de los árboles; además los daños de enfermedades en el fruto reducen
el potencial de mercado de fruta fresca. Así que una prioridad en mejoramiento es
incorporar niveles elevados de tolerancia a plagas.
46
2.12.2.4 Producción estacional de fruta. Hay dos objetivos importantes: a)
seleccionar individuos con una mayor capacidad de producción que las variedades
actuales; b) obtener variedades que permitan ampliar el período de cosecha,
seleccionando las que produzca significativamente más temprano o más tarde que las
variedades actuales. La obtención de materiales tempranos y tardíos aún sacrificando
algo de calidad interna es una necesidad para el mercado en fresco de las toronjas,
mandarinas y naranjas, en varias regiones productoras de cítricos.
2.12.2.5 Variedades atractivas para el consumidor. Una preocupación contínua de
los mejoradores debe ser obtener variedades tan atractivas como las actuales, pero con
mejores características internas y externas. Los consumidores demandan frutos bien
coloreados, brillosos, sin defectos en la cáscara y que ésta sea fácil de pelar y le
permita al fruto mayor vida de anaquel. La selección de variedades de naranja,
mandarina y toronja se ha orientado a la obtención de frutos de mayor tamaño. Sin
embargo, los esfuerzos más importantes se deben centrar en seleccionar materiales
con mejor color interno y sin semillas. En cuanto a la calidad para consumo en fresco,
un incremento en el contenido de sólidos solubles en balance con una apropiada
acidez, debe ser un aspecto importante a considerar. La presencia de semillas ha
reducido la popularidad de algunas variedades de mandarina y toronja. Así que una de
las aplicaciones más importantes de la fusión de protoplastos debe ser la producción de
plantas de cítricos con frutos sin semillas.
2.13 Portainjertos y variedades de cítricos generados po r hibridación somáticas.
Por medio de la fusión de protoplastos ha sido posible generar nuevos híbridos
somáticos que tienen aplicación directa como portainjertos o variedades de cítricos y
muchos otros han constribuido a enriquecer los programas de mejoramiento genético
en diversas regiones citricolas del mundo (Grosser, 1992; 1998; Ishii et al., 1992;
Ollitrault et al., 1996 b; 2000; Tusa et al., 1992 a; 1992 b; 1992 c).
Grosser et al. (2000), reportan que a nivel mundial se han producido numerosos
híbridos somáticos en los laboratorios de diferentes regiones de cítricos. Más adelante
se proporciona un listado de los híbridos somáticos generados tanto para obtener
47
portainjertos como para variedades de cítricos. Los híbridos tienen su origen en
fusiones a partir de especies compatibles y sexualmente incompatibles.
2.13.1 Portainjertos de cítricos híbridos somáticos
Para la producción de portainjertos de cítricos mediante hibridación somática vía fusión
de protoplastos se ha optado por seguir dos alternativas: a) la producción de híbridos
alotetraploides mediante la fusión de genotipos intergenéricos ó interespecíficos
sexualmente compatibles con características complementarias; y b) la producción de
híbridos intergenéricos sexualmente incompatibles (Grosser et al., 1995, 1996 c, 1998;
Grosser y Gmitter, 1990 a).
La primer opción se basa en el principio de que al ser la hibridación somática un
proceso aditivo, sin segregación, los caractéres bajo el control de genes dominantes o
co-dominantes en uno de los progenitores, tienden a expresarse en el híbrido
anfidiploide (Grosser y Gmitter, 1990 a).
Hutchison (1975), describió que entre los caractéres que se encuentran bajo el control
de genes dominantes se incluyen: la tolerancia al frío, la poliembrionía, la resistencia a
Phytophthora parasitica, al virus de la tristeza (VTC) y al nemátodo de los cítricos T.
semipenetrans. Además los genes recesivos deletéreos que estan enmascarados en
los progenitores, no se expresarán en los híbridos somáticos.
La segunda aproximación consiste en aplicar la hibridación somática con el fin de
superar las barreras sexuales existentes entre algunas especies del género Citrus y
entre especie de otros géneros afines que no son sexualmente compatibles (Grosser y
Gmitter, 1990 a). De este modo se logra tener acceso a la variabilidad genética que
estas últimas poseen como es la adaptación a diferentes factores bióticos y abióticos
para el mejoramiento de los patrones (Swingle y Reece, 1967; Bitters et al., 1969;
Sykes, 1988).
Una forma que sirve de referencia para conocer si existe incompatibilidad sexual entre
dos géneros afines consiste en averiguar si se presenta algún tipo de incompatibiidad
somática, por ejemplo incompatibilidad por injerto (Louzada y Grosser, 1994). Se ha
48
descrito que ésta última podría determinar también el límite para la hibridación somática
entre distintas especies (Grosser y Gmitter, 1990 a).
Dentro de la subfamilia Aurantioideae, la incompatibilidad por injerto con especies del
género Citrus se ha descrito en los géneros Burkillanthus, Glycosmis, Limnocitrus,
Luvunga, Merote, Merrilla, Micromelum, Monanthocitrus, Oxanthera, Pamburus,
Paramingnya y Wenzalia y en algunas especies de los géneros Clausena, Feroniella,
Microcitrus y Murraya (FAO/IBPGR,1991). Hasta el momento no se ha conseguido
regenerar ninguna planta mediante fusión de protoplastos de especies del género Citrus
con protoplastos de especies de alguno de estos géneros incompatibles por injerto
(Motomura et al., 1997; Mourao, 1995).
En Florida y Japón se vienen desarrollando programas para la obtención de nuevos
patrones de cítricos basados en la hibridación somática desde hace varios años
(Grosser et al., 1996 c; Kobayashi et al., 1995), habiendo conseguido la regeneración
de buen número de híbridos en ambos casos.
En Francia se ha desarrollando un programa de las mismas características desde 1993,
y ya han obtenido sus primeros logros (Ollitrault et al., 1996 b; Ollitrault et al., 2000). En
todos los casos los programas de mejoramiento atienden a las necesidades específicas
de cada país, con problemáticas distintas a resolver en cada caso. Resulta evidente,
además, que la transferencia de los híbridos entre los distintos laboratorios es
complicada por problemas de posibles patentes.
2.13.1.1 Híbridos somáticos intergenéricos sexualme nte compatibles. En el Cuadro
3, se presenta una lista de 31 híbridos somáticos que resultan de las combinaciones de
algunas variedades de naranjo dulce, mandarino y limón con portainjertos del genero
Poncirus trifoliata. De un total de 31 híbridos, 26 tienen interés como portainjertos.
El interés en utilizar con mayor frecuencia a portainjertos del género Poncirus trifoliata
como progenitor derivado de protoplastos de hoja, se fundamenta en sus atributos
deseables. Los más importantes son: compatibilidad con otros géneros de Citrus,
tolerancia a tristeza, psorosis y xyloporosis, así como a nemátodos y porque desarrolla
49
árboles achaparrantes y resistentes al frío. Sin embargo, poseé la característica de ser
sensible al viroide exocortis. Debido a que los portainjertos de Poncirus trifoliata
acumulan un apreciable número de características deseables, esta especie se ha
convertido en una de las favoritas de los investigadores para utilizarse como progenitor
en fusiones con protoplastos de callo embriogénico de especies del género Citrus. A la
fecha se han obtenido portainjertos híbridos somáticos entre siete cultivares de naranja;
seis variedades de mandarino; dos de toronja y una de limón. Cada una de las cuales
se combinó con genotipos de Poncirus trifoliata (Cuadro 3).
El híbrido somático más reciente fue logrado por Guo et al., 2002 al fusionar Citrus
reticulata variedad Red Tangerine con Poncirus trifoliata para integrar en un solo
individuo, la tolerancia a exocortis del mandarino a las características del P. trifoliata.
Entre los híbridos de genotipos de mandarino con Poncirus trifoliata se han reportado
cuatro en los que se utilizó callo embriogénico de mandarino “Cleopatra”, uno del
cultivar “Changsha”, dos del “Hongjin” (Deng et al., 2000 citados por Grosser et al.,
2000) uno de Sunki (Ollitrault et al., 2000); y uno del cultivar Page (Deng et al., 2000
citados por Grosser et al., 2000).
Sin embargo, en la literatura no se encuentran reportes donde se haya utilizado al
mandarino Amblicarpa (Citrus amblycarpa) como progenitor de callo embriogénico, ni
como donador de protoplastos de hojas. El uso de mandarino como progenitor ofrece la
ventaja de incorporar características tales como la amplia adaptación a distintos tipos
de suelo.
2.13.1.2 Híbridos somáticos intergenéricos sexualme nte incompatibles. En general
se sabe que las caractéres genéticos de mayor interés que se conservan en los
portainjertos de mandarino son: tolerancia al Blight, frío, tristeza, Exocortis y
Xyloporosis. Aunque por otro lado, son susceptibles a nemátodos e intermedios en su
susceptibilidad a suelos humedos y calcáreos y tienden a producir frutos pequeños. El
naranjo dulce tiene atributos muy parecidos al mandarino excepto que es más sensible
al frío y a gomosis, a la humedad y suelos calcáreos, aunque produce mayor tamaño
de fruta que el mandarino.
50
Estas características han motivado a los investigadores a utilizar estas dos especies en
fusiones con especies de otros géneros distintos al Citrus. En el cuadro 4, se presenta
una lista de híbridos somáticos generados entre fusiones de especies de mandarino
(callo embriogénico) y nueve diferentes géneros de Citrus (mesófilo de hoja) y de
naranjo (callo embriogénico) con seis géneros de otros citricos. El mayor número de
casos de éxito obtenidos entre fusiones intergenéricas incompatibles se ha logrado
entre variedades de mandarino y de naranjo con dos especies Severinia. El género
Citropsis gilletiana (células del mesófilo), ha sido utilizado en funsiones con tangelo
“Nova”, mandarino “Cleopatra”, naranjo dulce “Hamlin” y naranjo dulce “Succari”
(células embriogénicas). Sin embargo, no existen reportes de fusiones de Citropsis
gilletiana con otras especies de Citrus.
La mayoría de los híbridos somáticos intergenéricos generados a la fecha, tienen
interés como portainjertos ó bien para ampliar la base genética de cítricos considerando
que en los otros géneros se conservan carácteres genéticos relevantes como por
ejemplo: Glycosmis es portadora de resistencia a Phyllocnistis citrella; Murraya
paniculata ha sido descrita como tolerante al greening (Huanglongbin); Severinia tolera
suelos salinos; Citropsis gilletiana es resistente a nemátodos, entre otras
características.
Guo y Deng (1998), encontraron que la combinación de tangelo Page + la naranja
Jessamine (Murraya paniculata) fue extremadamente recalcitrante para producir raíces
en el medio de cultivo, por lo que desarrolalron una técnica de microinjerto in vitro y
recuperar los híbridos somáticos que teóricamente son tolerantes a la enfermedad
Huanglonglin (greening). De Pascuale et al. (1999), describen también una técnica de
microinjerto para rescatar tejido de especies cítricas y recomiendan el uso de patrones
Cleopatra y Troyer para el desarrollo de brotes vegetativos.
En combinaciones intergenéricas de genotipos diploides de Citrus sinensis + Clausena
lansium de manera inesperada se obtuvieron híbridos somáticos hexaploides (Guo y
Deng, 1999). Deng et al. (1992 a), previamente recobraron plantas de un híbrido
intergenérico entre Citrus sinensis y Fortunella crassifolia para usarse como patrón por
su tolerancia al frío y achaparramiento.
51
2.13.1.3 Híbrido somáticos interespecíficos entre m andarino y otros Citrus. Los
híbridos somáticos interespecíficos tienen gran interés principalmente para obtención
de variedades, aunque también algunos de ellos podrán impactar favorablemente al
usarse como portainjertos. En el Cuadro 5, se observa que de los 35 híbridos somáticos
generados entre variedades de mandarino y otras especies del género Citrus,
únicamente 10 tienen interés como portainjerto.
Las variedades de mandarino “Cleopatra” en Florida y el cultivar “Honggi” en China son
las fuentes de callo embriogénico de mandarino más utilizadas para la obtención de
patrones. En cambio las variedades “Willoleaf” en Francia y Tangelos “Murcott” y “Nova”
en Florida, son de interés como donadores de callo embriogénico en cruzas con
protoplastos de hojas de naranja y limón para la obtención de nuevos híbridos de
cítricos.
En el caso de los portainjertos, los trabajos mediante fusiones se ha enfocado a obtener
híbridos somáticos entre variedades de mandarinos y otras especies como: limón
Rugoso (4 híbridos), naranjo agrio (2 híbridos), limón volkameriana (un híbrido), cidra
(un híbrido), lima Rangpur (un híbrido), lima dulce (un híbrido), limón ichangensis (un
híbrido). No existen reportes de híbridos entre Citrus amblycarpa como donador de
protoplastos de callo embriogénico y otras especies del género Citrus, para obtener
patrones, ni para desarrollar variedades.
2.13.1.4 Híbridos somáticos entre especies de limón y otros cítricos. La producción
de híbridos somáticos tomando como progenitor a los limones verdaderos y limón
mexicano, también ha sido de interés para los investigadores (Cuadro 6). El limón
mexicano Citrus aurantifolia ha sido utilizado como donador de protoplastos de callo
embriogénico en fusiones con especies del género citrus y también con otros géneros
parientes; así mismo, también se ha empleado como donador de protoplastos de hoja
en fusiones interespecíficas para la generación de híbridos somáticos. El principal
interés en usar al limón como progenitor es para desarrollar nuevas variedades debido
a sus excelente calidad de fruto y adaptación a climas cálidos. Aunque también se le
utiliza en hibridación somática para incrementar la base genética de cítricos. Sin
embargo, en el Cuadro 6, se puede observar que algunos autores reportan a Citrus
52
aurantifolia en fusiones interespecíficas con variedades de naranja e intergenéricas con
Ferionella lacida, Swingle glutinosa y el híbrido de C. sinensis X P. trifoliata con el
interés de obtener portainjertos de cítricos tetraploides con características
complementarias de ambas especies. Así mismo, resulta interesante observar en el
Cuadro 6, la generación de híbridos somáticos interespecíficos donde se utiliza a C.
limón como progenitor tanto de callo embriogénico, como de hoja. Entre los
portainjertos desarrollados en Florida se citan al limón Femminello (células del mesófilo
de la hoja) y el limón rugoso y naranjo dulce (callo embriogénico) y los híbridos entre
limón Volkameriana (células del mesófilo) y naranjo dulce y mandarino (células
embriogénicas).
2.13.2 Híbridos somáticos para obtención de varieda des
En los cuadros 3, 4, 5 y 6 se dan a conocer los híbridos somáticos tetraploides con
potencial para el desarrollo de nuevas variedades. Los reportes indican que aquellos
tetraploides que ya han fructificado producen fruta con características poco apropiadas
para su comercialización, aún cuando los dos progenitores se caractericen por
desarrollar en lo individual una calidad de fruta aceptable. Aunque los tetraploides
tiendan a desarrollar frutos normales con semillas, comúnmente se ha observado que
desarrollan frutos grandes, cáscara rugosa, abundantes semillas, elevada acidez
(Ohgawata et al., 1994).
Sin embargo, resulta bastante alentador el hecho de que el limón Persa (C. latifolia) el
cual proviene de una cruza entre materiales diploides y tetraploides, produce frutos
grandes, de buena calidad y sin semillas. Considerando este antecedente, resulta
conveniente que en un paso subsecuente se utilicen estos híbridos somáticos
tetraploides en cruzas con material diploides de interés y de esta manera obtener
triploides sin semillas. Ohgawara et al., (1989), lograron producir plantas híbridas
somáticas entre la naranja Bahía (C. sinensis) y la toronja Marsh (C. paradisi), las
cuales previamente no había sido posible cruzarlas sexualmente debido a problemas de
poliembrionía, esterilidad masculina y ausencia de semillas.
La aplicación de la fusión de protoplastos para el mejoramiento de las variedades está
más bien dirigida hacía la producción de triploides. La hibridación somática
53
interespecífica proporciona una vía adecuada para la producción de parentales
alotetraploides heterocigoticos entre fenotipos o genotipos complementarios. De
manera que los híbridos somáticos (4X) puedan ser empleados para realizar cruzas
sexuales con genotipos 2X para generar una progenie cigótica triploide sin semillas. El
empleo de híbridos somáticos alotetraploides ha resultado benefico para este tipo de
cruzas, pues al exhibir heterocigosis se origina una mayor variabilidad en la progenie
resultante. Además, la fusión de protoplastos permite la hibridación entre especies que
no pueden cruzarse por vía sexual, bien sea por la esterilidad entre ellas o por lo
problemas asociados con la poliembrionía que manifiestan muchos cultivares de interés
(Kobayashi, et al., 1991).
Existen otros ejemplos de triploides obtenidos por el cruzamiento sexual entre
variedades diploides e híbridos somáticos alotetraploides. Se ha descrito la hibridación
sexual de un mandarino del grupo de las Clementinas con polen de un híbrido somático
intergenérico producido tras la fusión de protoplastos de naranjo dulce con protoplastos
de P. trifoliata (Ohgawara et al., 1985), y la regeneración posterior de plantas triploides
mediante el cultivo de los embriones inmaduros de las semillas abortadas (Oiyama et
al., 1991). Grosser et al. (1998), reportan 15 nuevos híbridos somáticos productores de
polen para su uso potencial como progenitor productor de polen tetraploide en cruzas
interploides para generar variedades triploides sin semilla.
El reducido número de plantas regeneradas entre combinaciones fue un indicativo de la
dificultad para producir híbridos somáticos. Así mismo, se ha descrito la obtención de un
híbrido somático entre naranjo dulce y limón rugoso (Deng et al., 1992 b), que al cabo
de tres años de su transplante a suelo floreció (Deng et al., 1995) y que posteriormente
se empleó como parental en la hibridación sexual con tres especies de Pomelo y una
de tangerina, habiéndose recuperado plantas triploides mediante el rescate de
embriones (Deng et al., 1996). En Italia se está desarrollando un programa para la
producción de variedades triploides de limón mediante la hibridación sexual entre
cultivares diploides con híbridos somáticos tetraploides (Tusa et al., 1990, 1992a,
1996).
54
Sin embargo, dado que en la hibridación somática se introducen también características
no deseables, estas se deben eliminar mediante cruzas sexuales, pero se desconoce
hasta que grado los mecanismos que inhiben la hibridación sexual entre parientes
especficos, pueden interferir con el éxito de las cruzas regresivas (Louzada y Grosser,
1994).
En España se está desarrollando un amplio programa de obtención de triploides de
cítricos, en el que una de las limitaciones más importantes es la disponibilidad de
parentales tetraploides de calidad, lo cual podría ser en parte superado mediante la
fusión de protoplastos (Olivares-Fuster, 1998).
La producción de cultivares triploides de cítricos también se ha abordado mediante la
fusión somática entre protoplastos haploides y protoplastos diploides técnica que
permitió la obtención de híbridos interespecíficos triploides en Nicotiana ó
interespecíficos en Petunia (Pirrie y Power, 1986; Power y Davey, 1990).
En cítricos, los primeros intentos dirigidos a la obtención de haploides se efectuaron
mediante el cultivo de anteras, pero sólo se consiguió la formación de callo de C. limon.
(Gmitter et al., 1992). Posteriormente se ha descrito la obtención de plantas haploides,
mediante androgénesis, en Poncirus (Hidaka et al., 1979), C. microcarpa (Chen et al.,
1980), C. madurensis (Chen, 1985), y mandarino Clementino y C. limon (Germana,
1992). Ollitrault et al., (1996 c) describieron la producción de líneas celulares
embriogénicas haploides de mandarino Clementino mediante partenogénesis inducida
por irradiación de polen (ginogénesis). Estas líneas celulares haploides embriogénicas
están siendo empleadas en fusión de protoplastos con líneas diploides a fin de obtener
mandarinos triploides sin semillas (Ollitrault et al., 1996). Hasta le momento, no se
conseguido la producción de plantas triploides mediante este procedimiento.
55
Cuadro 3. Híbridos somáticos intergenéricos sexualm ente compatibles. Especies del género Citrus como donadores
de callo.
Combinación parental (X) Objetivo Método de
Fusión Referencia
NARANJO DULCE + TRIFOLIADOS
Citrus sinensis L. Osb cv Trovita + Poncirus trifoliata L. Raf.
C. sinensis L. Osb cv Trovita + Troyer [C. sinensis L. Osb. X P. trifoliata L. Raf]
C. sinensis L. Osb cv Trovita + Poncirus trifoliata L. Raf.
C. sinensis L. Osb cv Bahia + Troyer [C. sinensis L. Osb. X P. trifoliata L. Raf]
C. sinensis L. Osb cv Valencia + [C. depressa Hay. X P. trifoliata Raf.]
C. sinensis L. Osb cv Shirayanagi + Poncirus trifoliata L. Raf.
C. sinensis L. Osb cv Hamlin+ Poncirus trifoliata cv. Flying Dragon
C. sinensis L. Osb cv Succari + P. trifoliata cv Argentina
C. sinensis L. Osb cv Valencia + Citrange carrizo
C. sinensis L. Osb cv W. Navel + P. trifoliata cv 150-7
P(1),G
V
V
P(1),G
V
P (2)
P (1,2,5,6)
P (1,2,5)
P (2)
P (2)
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
e-
PEG
PEG
PEG
PEG
Ohgawara et al., 1985
Kobayashi y Ohgawara, 1998
Kobayashi y Ohgawara, 1998
Ohgawara et al., 1991
Tusa et al., 1992 a, 1992 b
Kaneko et al., 1995
Grosser et al., 1998 a
Grosser et al., 1996
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
MANDARINOS + TRIFOLIADOS
Citrus reticulata Blanco cv. Hongju + Poncirus trifoliata L. Raf.
C. reticulata Blanco cv. Hongju + C. sinensis L. Osb x P. trifoliata L. Raf.
C. reticulata Blanco cv. Cleopatra+ P. trifoliata cv. Flying Dragon
C. reticulata Blanco cv. Cleopatra+ P. trifoliata cv Argentina
C. reticulata Blanco cv. Cleopatra + Citrumelo swingle
C. reticulata Blanco cv. Cleopatra + Citrange carrizo
C. reticulata Blanco cv. Changsha + P. trifoliata cv 50-7
C. deliciosa Ten cv Willoleaf + P. trifoliata L. Raf. Cv. Pomeroy
[C. reticulata Blancox C. paradisi Macf] cv Page + P. trifoliata L. Raf.
C. sunki Hort. ex. Tan + C. sinensis x P. trifoliata cv. Carrizo
P (2)
P (2)
P (1,2,5)
P (1,2,5)
P (1,2,5)
P (1)
P (1,2,5)
P (2)
P (2)
P (2)
e-
e-
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
e-
e-
e-
Deng et al., 2000 cita Grosser et al., 2000
Deng et al., 2000 cita Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 1996
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Ollitrault et al., 1996 (c)
Deng et al., 2000 cita Grosser et al., 2000
Ollitrault et al., 2000
Continúa Cuadro 3............................
56
Cuadro 3. Híbridos somáticos intergenéricos sexualm ente compatibles. Especies del género Citrus como donadores
de callo. (continuación)
Combinación parental (X) Objetivo Método de Fusión
Referencia
OTROS CITRUS + TRIFOLIADOS
Citrus aurantium cv. Naranjo agrio + Poncirus trifoliata cv. Flying Dragon
C. aurantium cv. Nar. Agrio + Citrange carrizo
C. aurantium cv. Nar. Agrio + P. trifoliata 50-7
C. aurantium cv. Nar. Agrio + Citrange Benton
Citrus paradisi cv. Red Marsh + P. trifoliata cv Flying Dragon
C. paradisi cv. Red Marsh + P. trifoliata cv Argentina
C. paradisi cv. Duncan + P. trifoliata 50-7
C. jambhiri cv. Milan (hibrido) + Citrumelo Swingle
C. jambhiri cv. Milan (hibrido) + Citrange carrizo
C. jambhiri Lush cv. Milam + P. trifoliata Raf. cv Flying Dragon
C. jambhiri Lush cv. Milam + [C. depressa x P. trifoliata]
P (1,2,3,5,6)
P (1,2,3,5,6)
P (1,2,3,5,6)
P (2,3,5,6)
P (1,2,5)
P (1,2,5)
P (1,2,5)
P (1,2,4,5,6)
P (1,4,6)
V
V
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
Grosser et al 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 1996
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Tusa et al., 1992 (b)
Tusa et al., 1992 (b)
e- = fusión eléctrica; PEG = Fusión con polietilenglicol; P = Portainjerto; V = producción de variedades triploides; G = Expanción de germoplasma; M = Metodología de hibridación somática. 1 = Tolerancia al frio y control del tamaño del árbol; 2= Tolerancia al Blight; 3= Resistencia a VTC; 4 = Resistencia a nemátodos; 5= Resistencia a Phytophthora; 6 = Adaptación a suelos calcáreos; (x) = Donador de callo embriogénico en primer lugar. Donador de protoplastos de hoja después del signo (+).
57
Cuadro 4. Híbridos somáticos intergenéricos sexualm ente incompatibles. Especies del género Citrus como donador de
callo embriogénico.
Combinación parental (X) Objetivo Método de
Fusión Referencia
MANDARINOS + ESPECIES DE OTROS GENEROS
C. reticulata Blanco cv Hazzara + Murraya koenigii L. Spreng.
C. reticulata Blanco cv. Ohta + Glycosmis pentaphylla (Retz.) Correa
C. unshiu Marc. cv. Saruwatari + Aegle marmelos L.
C. reticulata Blanco cv Hazzara + Swinglea glutinosa (Blanco) Merr.
C. reticulata Blanco cv. Ohta + Severinia buxifolia (Poir) Tenore
C. reticulata Blanco cv. Hazzara + Severinia buxifolia (Poir) Tenore
[C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf.] Seminole + Severinia buxifolia (Poir) Tenore
[C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf.] Seminole + Atalantia monophylla DC.
C. reticulata Blanco cv Hazzara + Microcitrus australis (Planch.) Swing.
[C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf.] Seminole + Microcitrus australis Swing.
[C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf.] Page + Murraya paniculata L. Jack.
[C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf.] Seminole + Atalantia monophylla DC.
[C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf.] Seminole + Severinia buxifolia.
Citrus deliciosa Ten. cv. Willoleaf + Fortunella japónica Swing cv. Marumi
C. reticulata Blanco cv. Ponkan + Citropsis gabunensis Swing cv Gabon
C. reticulata cv. Cleopatra + Severinia disticha XX
Tangelo “Nova” + Severinia disticha XX
C. reticulata cv. Cleopatra + Citropsis gilletiana XX
Tangelo “Nova” + Citropsis gilletiana
G,M
G,M
G,M
G,M
G,M
G,M
G,M
G,M
G,M
G,M
P (2, 3), G
G
G
V
P (2, 3), G
P(1,2,4,5)
P(1,2,4,5)
P(2,4,5)
P(2,4,5)
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
PEG
PEG
PEG
PEG
Motomura et al., 1997
Motomura et al., 1997
Motomura et al., 1997
Motomura et al., 1997
Motomura et al., 1997
Motomura et al., 1997
Motomura et al., 1997
Motomura et al., 1997
Motomura et al., 1997
Motomura et al., 1997
Guo y Deng, 1998
Motomura et al., 1995
Motomura et al., 1995
Ollitrault et al., 1996(c)
Ling e Iwamasa, 1994
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Continúa Cuadro 4............................
58
Cuadro 4. Híbridos somáticos intergenéricos sexualm ente incompatibles. Especies del género Citrus como donador de
callo embriogénico. (continuación)
Combinación parental (X) Objetivo Método de Fusión
Referencia
NARANJO DULCE + ESPECIES DE OTROS GENEROS
Citrus sinensis L. Osb. cv. Trovita + Murraya paniculata L. Jack
C. sinensis L. Osb. cv. Skagg’s Bonanza + Clausena lausium Lour, Skeels
C. sinensis cv. Hamlin + Severinia buxifolia
C. sinensis cv. Hamlin + S. buxifolia (Triploid)
C. sinensis cv. Succari + S. buxifolia
C. sinensis cv. Hamlin + S. disticha XX
C. sinensis cv. Valencia + S. disticha XX
C. sinensis cv. Succari + S. disticha XX
C. sinensis cv. Hamlin + Citropsis gilletiana
C. sinensis cv. Hamlin + Atalantia ceylanica
C. sinensis cv. Succari + A. ceylanica
C. sinensis cv. Succari + Citropsis gilletiana
C. sinensis cv. Succari + Feronia limonia
P (2)
V
P (1,2,4,5)
P (1,2,4,5)
P (1,2,4,5)
P (1,2,4,5)
P (1,2,4,5)
P (1,2,4,5)
P (2,4,5)
P (1,2,4,5)
P (1,2,4,5)
P (1,2,4,5)
P (2,4,5)
e-
e-
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
Shinozaki et al., 1992
Guo y Deng, 1999
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 1988 b
Grosser et al., 1988 b
Grosser et al., 1988 b
Grosser et al., 1988 b
Grosser et al., 1988 b
Grosser et al., 1988 b
Grosser et al., 1988 b
Grosser et al., 1988 b
Grosser et al., 1988 b
Grosser et al., 1988 b
e- = fusión eléctrica; PEG = Fusión con polietilenglicol; P = Portainjerto; V = producción de variedades triploides; G = Expanción de germoplasma; M = Metodología de hibridación somática. 1 = Tolerancia al frio y control del tamaño del árbol; 2= Tolerancia al Blight; 3= Resistencia a VTC; 4 = Resistencia a nemátodos; 5= Resistencia a Phytophthora; 6 = Adaptación a suelos calcáreos; (z) = Donador de callo embriogénico en primer lugar. Donador de protoplastos de hoja después del signo (+).
59
Cuadro 5. Híbridos somáticos interespecíficos entre mandarinos e híbridos con otras especies de Citrus .
Combinación parental (X) Objetivo Método de Fusión
Referencia
Citrus unshiu Marc. + C. jambhiri Lush Citrus unshiu Marc. + C. junus Sieb. Ex. Tan
[C. reticulata Blanco X C. paradisi Macf] Seminole + C. jambhiri Luch
[C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf] Seminole + C. Junos
C. reticulata Blanco cv. Ohta + C. jambhiri Lush
C. deliciosa Ten cv. Willoleaf + C. limon Burn f. Cv Eureka
C. deliciosa Ten cv. Willoleaf + C. aurantifolia Swingle
C. deliciosa Ten cv. Willoleaf + C. sinensis L. Osb. cv W. N
C. unshiu Marc cv. Juma + Clementino aploide
[C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf] Page + C. sinensis cv. Valencia
C. reticulata cv. Kinnow + C. reticulata cv. Bendizao
C. reticulata Blanco cv. Hongju + C. aurantium L. Cv Guotou
C. reticulata Blanco cv. Hongju + C. jambhiri Lush
C. reshni Hort. Ex Tan. cv Cleopatra + C. aurantium
C. deliciosa Ten cv. Willoleaf + C. sinensis L. Osb. cv Shamouti
C. deliciosa Ten cv. Willoleaf + C. sinensis L. Osb. cv C1
C. deliciosa Ten cv. Willoleaf + C. paradisi Macf. cv Star Ruby
C. deliciosa Ten cv. Willoleaf + C. aurantium L.
C. deliciosa Ten cv. Willoleaf + C. limon L. Burm cv LAC
C. reticulata cv. Cleopatra + C. limonia cv Rangpur
C. reticulata cv. Cleopatra + C. jambhiri cv Rugoso
C. reticulata cv. Cleopatra + C.volkameriana cv Volkamer
C. reticulata cv. Changsha + C. medica L. cv. Citron
Tangelo nova + lima dulce palestina
Tangelo nova + C. ichangensis
G, M
G, M
M
M
V, P
V
V
V
V
V
V
P
P
P
V
V
V
V
V
P (1,2), V
P (1,2), V
P (1,2), V
P (2, 6)
P (1, 2), V
P (1, 2), V
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
PEG
e-
e-
e-
e-
e-
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
Hidaka y Omura, 1992
Hidaka y Omura, 1992
Hidaka et al., 1995
Hidaka et al., 1995
Moriguchi et al., 1996
Ollitrault et al., 1996 c
Ollitrault et al., 1996 c
Ollitrault et al., 1996 c
Kobayashi et al.,,cita Grosser et al., 2000
Deng et al., 2000 cita Grosser et al., 2000
Deng et al.,2000 cita Grosser et al., 2000
Deng et al., 2000 cita Grosser et al., 2000
Deng et al., 2000 cita Grosser et al., 2000
Mouraro, cita Grosser et al., 2000
Ollitrault et al., 2000
Ollitrault et al., 2000
Ollitrault et al., 2000
Ollitrault et al., 2000
Ollitrault et al., 2000
Grosser et al., 1998 a
Grosser et al., 1996
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Continúa Cuadro 5............................
60
Cuadro 5. Híbridos somáticos interespecíficos entre mandarinos e híbridos con otras especies de Citrus .
(continuación)
Combinación parental (X) Objetivo Método de Fusión
Referencia
Tangelo nova + C. sinensis cv. Succari
Tangelo nova + C. grandis cv. Hirado Buntan
Tangor Murcott + Hibrido 1 (Fortune x Kinnow)
Tangor Murcott + Hibrido 2 (Wilking x Valencia)
Tangor Murcott + Hibrido 1 (Clementina x Minneola)
Tangor Murcott + C. sinensis cv. W. Navel
Tangor Murcott + Tangelo Osceola
Tangor Murcott + Tangor Ortanique
Tangor Murcott + Tangelo Sunburst
Tangor Murcott + Hibrido (Clementina x Satsuma)
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PEG
PÉG
PEG
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
e- = fusión eléctrica; PEG = Fusión con polietilenglicol; P = Portainjerto; V = producción de variedades triploides; G = Expanción de germoplasma; M = Metodología de hibridación somática. 1 = Tolerancia al frio y control del tamaño del árbol; 2= Tolerancia al Blight; 3= Resistencia a VTC; 4 = Resistencia a nemátodos; 5= Resistencia a Phytophthora; 6 = Adaptación a suelos calcáreos; (z) = Donador de callo embriogénico en primer lugar. Donador de protoplastos de hoja después del signo (+).
61
Cuadro 6. Híbridos y Cihibridos somáticos interespe cíficos de frutos ácidos con especies de Citrus.
Combinación parental (X) Objetivo Método de Fusión
Referencia
LIMON DONADOR DE PROTOPLASTOS DE CALLO EMBRIOGÉNICO
C. aurantifolia Swing + Ferionella lacida Swing
C. aurantifolia Swing + Swinglea glutinosa (Blanco) Merr.
C. aurantifolia Swing + C. jambhiri Lush
C. aurantifolia Swing + C. junos Sieb. Ex Tanaka
C. aurantifolia (Christm) Swing + C. sinensis L. Osb cv G1
C. aurantifolia (Christm) Swing + C. aurantium L.
C. aurantifolia (Christm) Swing + [C. sinensis L. Osb cv x P. trifoliata] cv Carrizo
P, G
P, G
M
M
V
P
P
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
Takanayagi et al., 1992
Takanayagi et al., 1992
Hidaka et al., 1995
Hidaka et al., 1995
Ollitrault et al., 2000 c
Ollitrault et al., 2000 c
Ollitrault et al., 2000 c
LIMON DONADOR DE PROTOPLASTOS DE HOJA
C. sudachi Hort. cv Shirai + C. aurantifolia Swing
C. deliciosa Ten cv. Willoleaf + C. aurantifolia Swing
C. paradisi Macf. cv. Star Ruby + C. aurantifolia Swing
C. sinensis L. Osb. cv. Salustiana + C. aurantifolia Swing
C. sinensis L. Osb. cv. Shamouti + C. aurantifolia Swing
C. deliciosa Ten cv. Willoleaf + C. aurantifolia Swing
C. paradisi Macf. cv. Star Ruby + C. aurantifolia Swing
C. sudachi Hort. cv Shirai + C. aurantifolia Swing (Cihibrido)
C. sudachi Hort. cv Shirai + C. limon L. Burn. (Cihibrido)
V
V
V
V, P
V
V
V
?
?
e-
e-
e-
PEG
e-
e-
e-
e-
e-
Saito et al., 1991
Ollitrault et al., 1966 c
Ollitrault et al., 1966 c
Olivares citado por Grosser et al., 2000
Ollitrault et al., 2000 c
Ollitrault et al., 1966 c
Ollitrault et al., 1966 c
Saito et al., 1993
Saito et al., 1993
LIMON VERDADERO Y VOLKAMERIANA (HÍBRIDOS) C. hibrido diploide tipo limon Mexicano + C. limon L. Burn cv. Eureka
C. deliciosa Ten cv Willoleaf + C. limon L. Burm cv. Eureka
C. limon L. Burm cv Kutaliken + C. limon L. Burm cv. Zaragoza Bianca
C. sinensis L. Osb cv Newball + C. limon L. Burm cv Eureka
C. limon L. Burm cv LAC + C. limon L. Burm cv Eureka
C. limon L. Burm cv LAC + C. sinensis L. Osb. cv Hamlim
C. deliciosa Ten cv Willoleaf + C. limon L. Burm cv. LAC
V
V
V
V
V
V
V
e-
e-
PEG
e-
e-
e-
e-
Saito et al., 1994
Ollitrault et al., 1966 c
Kuc et al., citados por Grosser et al., 2000
Deng et al., citados por Grosser et al., 2000
Ollitrault et al., 2000
Ollitrault et al., 1966 c
Ollitrault et al., 2000
Continúa Cuadro 6............................
62
Cuadro 6. Híbridos y Cihibridos somáticos interespe cíficos de frutos ácidos con especies de Citrus. ( continuación)
Combinación parental (X) Objetivo Método de Fusión
Referencia
C. paradisi Ten cv Star Ruby + C. limon L. Burm cv. LAC
C. jambhiri cv. Milan hibrido + C. limon Femminello
C. sinensis cv. Valencia + C. limon Femminello
C. sinensis cv. Hamlim + C. limon Femminello
C. sinensis L. Osb cv Salustiana + C. volkameriana Ten. Pasq.
C. sinensis L. Osb cv Caipira + C. volkameriana ten. Pasq.
C. reticulata Blanco cv. Celopatra + C. volkameriana
V
P (2), V
P (2), V
P (2), V
P (2)
P (2)
P (1,2), V
e-
PEG
PEG
PEG
PEG/e-
PEG
PEG
Ollitrault et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
Olivares citado por Grosser et al., 2000
Mouraro citado por Grosser et al., 2000
Grosser et al., 2000
(CIHÍBRIDOS)
C. limon L. Burm cv. LAC + C. sinensis L. Osb. Hamlim
C. deliciosa Ten cv. Willoleaf + C. limon L. Burm cv. LAC
C. paradisi Macf. cv Star Ruby + C. limon L. Burm cv. LAC
C. sinensis L. Osb. cv Shamouti + C. limon L. Burm cv LAC
V
V
V
V
e-
e-
e-
e-
Ollitrault et al., 1966 c
Ollitrault et al., 2000
Ollitrault et al., 2000
Ollitrault et al., 2000
e- = fusión eléctrica; PEG = Fusión con polietilenglicol; P = Portainjerto; V = producción de variedades triploides; G = Expanción de germoplasma; M = Metodología de hibridación somática. 1 = Tolerancia al frio y control del tamaño del árbol; 2= Tolerancia al Blight; 3= Resistencia a VTC; 4 = Resistencia a nemátodos; 5= Resistencia a Phytophthora; 6 = Adaptación a suelos calcáreos; (z) = Donador de callo embriogénico en primer lugar. Donador de protoplastos de hoja después del signo (+).
63
2.14 Cihibridación de cítricos
Otra opción de mejoramiento genético mediante la fusión de protoplastos es desarrollar
plantas cihíbridas, lo cual se consigue al fusionar protoplastos de plantas de cítricos
diploides que contienen el genoma nuclear de un progenitor con protoplastos de otro
progenitor que portará el genoma de los orgánelos del citoplasma (Grosser et al., 2000).
La caracterización de los organelos del citoplasma puede contribuir a determinar la
herencia del citoplasma en los cítricos lo cual sin duda ayudará a hacer un
mejoramiento genético más selectivo (Kumar y Cocking, 1987). Los reportes orientados
a obtener cihibridos por hibridación asimétrica son escazos, en comparación con el
éxito logrado en la hibridación somática simétrica (Vardi et al., 1987; Liu y Deng, 1999).
La evolución en la cihibridación había sido lenta por lo complicado de la metodología
donador-receptor y la carencia de información relacionada con las características
citoplásmicas. Pero recientemente, este campo se ha desarrollado permitiendo la
regeneración de algunas plantas de cítricos aloplásmicas, como resultado derivado de
la aplicación de procedimientos estandarizados de hibridación somática (Galun y Aviv,
1986; Grosser et al., 2000). Estudios relacionados con la genética de los híbridos
somáticos y cihíbridos regenerados después de la fusión de protoplastos de células de
callo con las células de hoja, demostraron la eliminación específica del genoma nuclear
del progenitor de protopalstos de hoja en todos los híbridos y la no segregación del
genoma de la mitocondria (el genoma mitocondrial del progenitor de callo embriogénico
siempre permanece en los cihíbridos, así como en los híbridos somáticos completos),
mientras que el genoma de los cloroplastos puede estar en uno de los genomas tanto
de los híbridos como de los cihíbridos (Moriguchi et al., 1996; 1997; Ollitrault et al., 1996
b; Moreira et al., 2000 a; Cabasson et al., 2001).
La recombinación de genomas citoplásmicos se ha reportado con frecuencia en los
híbridos somáticos y cihíbridos de varias plantas (Yarrow, 1999; Earle, 1994), pero en
cítricos no es tán común y solo existen unos cuantos reportes sobre hibridación
asimétrica o hibridación somática estándar (Vardi et al., 1987, 1989; Liu y Deng, 1999;
Motomura et al., 1995; Moriguchi et al.,1997 y Moreira et al., 2000b; Yamamoto y
Kobayashi, 1995).
64
La presencia únicamente del genoma mitocondrial del progenitor embriogénico en todos
los híbridos somáticos y cihíbridos, sugiere que hay un papel crítico en la regeneración
de plantas por medio de la embriogenesis somática (Grosser et al., 1996 b; Ollitrault et
al., 1996 b, Moreira et al., 2000 a). Los autores han supuesto que esto último puede ser
un efecto cuantitativo dado que sólo las células cultivadas tienen las cantidades
adecuadas de mitocondria para proveer la energía necesaria para la embriogénesis
somática. Moreira et al. (2000 a), verificaron que el número de mitocondrias por cultivo
de células embriogénicas fue significativamente mayor que el de las células de hoja. De
manera que éste y otros factores ameritan más estudio, incluyendo la segregación de
condriomas, recombinación de orgánelos y los mecanismos de exclusión nuclear
(Grosser et al., 2000). Parece que en las progenies que provienen de fusiones de
protoplastos de callo con callo, se segregan tanto mitocondrias como cloroplastos. En
un grupo de 10 híbridos somáticos analizados entre mandarino variedad Willoleaf (hoja)
y toronja variedad Star Ruby (callo), en todos los tetraploides resultantes se encontró el
mismo núcleo y 3 ó 4 combinaciones citoplásmicas (Grosser et al., 2000). Así que
estudios complementarios que incluyan hibridaciones de callo con callo pueden
propiciar un entendimiento más claro de las interacciones núcleo/citoplasma que se
derivan al realizar las fusiones callo con hojas.
El valor agronómico de los cihíbridos en cítricos aún es desconocido debido a que no se
han asociado características importantes a los genomas de los organelos. Con el
desarrollo de los cíbridos la calidad de progenitores disponibles para desarrollar nuevos
híbridos somáticos podría aumentarse notablemente; y la evaluación en el campo de
los cihíbridos de cítricos puede permitir la caracterización de variables agronómicas que
codifiquen para el genoma del citoplasma (Tusa et al., 2000).
Tusa et al. (2000), examinaron la reacción al mal seco Poma tracheiphila Petri de
plantas híbridas somáticas y asimétricas obtenidos por fusión de protoplastos, y
encontraron que los híbridos somáticos y los cihíbridos mostraron un nivel intermedio
de resistencia entre los progenitores limón Femminello (susceptible) y naranjo valencia
(tolerante). La menor mortalidad observada en las plantas cihibridas, sugiere que
ciertos mecanismos específicos de resistencia a la enfermedad podrían estar activados
en estos genotipos y que los mecanismos de resistencia en la combinación limón
65
Femminello + naranjo Valencia fueron aportados por esta última especie (Tusa et al.,
2000).
La fusión de protoplastos ha hecho posible combinar características citoplásmicas en
plantas de especies superiores en las cuales los cloroplastos (cp) y mitocondrias (mt) se
heredan materialmente durante la hibridación sexual. El genoma del citoplasma controla
algunas características agronómicas valiosas. Así por ejemplo se ha encontrado que el
ADNcp juega un papel importante en la herencia de resistencia a enfermedades y el
ADNmt se realciona con la esterilidad masculina del citoplasma (Choung et al., 1988;
Cheng et al., 2003). En diferentes especies se ha confirmado que el ADN mitocondrial
es heredado por el pariente embriogénico, mientras que el ADNcp puede corresponder
a ambos progenitores (Grosser et al., 1996 b; Guo et al., 2002; Kobayashi et al., 1991;
Miranda et al.,1997; Moreira et al., 2000 a; 2000 b; Ohgawara et al., 1994; Ollitarult et
al., 2003; Saito et al., 1993). También se encontró la recombinación del genoma
mitocondrial en algunos casos y la coexistencia del ADN cp en ambos parientes en un
caso (Motomura et al., 1995). Por razones de incompatibilidad genética algunas
fusiones intergenéricas pueden no regenerar plantas, pero algunas de las que se
regeneran crecieron normalmente.
2.15 Fusión de protoplastos en diversos cultivos
Existen reportes sobre fusión de protoplastos realizadas con el fin de obtener híbridos
somáticos en diferentes especies entre las que se citan Saintpaulia ionantha Wendl
(Hoshino et al, 1995); Crisantemo, Dendranthema zawadski X D. grandiflora] (Lindsay y
Ledger 1993); Maracuyá, Passiflora edulis var flavicarpa (Carnier y Carneiro, 1993;
D’Utra et al., 1993); Caña, Beta Vulgaris L (Lindsey y Jones, 1989); Abies alba L (Lang
y Kohlenbach, 1989); Tabaco, Nicotiana tabacum (Branca et al., 1993, Desprez et al.,
1995 a, 1995 b); Menta, Menta piperira, Menta spicata, L (Krasnyanski et al., 1988);
Trigo, Hordeum vulgare L. (Golds et al., 1994); Banano, Musa spp (Panis et al., 1993);
Hyoscyamus muticus (Rahman et al., 1994); Pino, Pinus pinaster (Gomez-Maldonado et
al., 2001); Manzano, Malus domestica Borkn (Maddumage et al., 2002). En el cuadro 7
se presenta una lista de las especies en las que se ha trabajado fusión de protoplastos
indicándose el objetivo principal.
66
Cuadro 7. Trabajos reportados sobre fusión de proto plastos en otras especies
que no son cítricos.
Especie y/o Combinación Objetivo Autor
Especies incompatibles de Solanaceae Transferir características contenidas en clororplastos vía Cihibridación Medgyesy, 1994
Solanum khasianum + Solanum aculeantissimum
Producir híbridos somáticos entre especies
Statman et al., 1994
Solanum nigrum + Lycopersicon esculentum
Transferir resistencia a la atrazina de S. nigrum a L.. esculentum mediante producción de cihibridos
Jain et al., 1988
Especies de Nicotiana Transferir cloroplastos de un progenitor a otros
Medgyesy y Morton, 1986
Nicotiana glutinosa (n) + Nicotiana tabacum (2n)
Producción de triploides de tabaco Pirrie y Power, 1986
Hyoscyamus muticus +Hyoscyamus albus
Vencer la barrera de incompatibilidad sexual entre estas especies
Rahman et al., 1994
Nicotiana tabacum Segregación de orgánelos en híbridos somáticos interespecíficos
Rakosy-Tican et al., 2001
Nicotiana tabacum + Nicotiana plumbaginifolia
Híbridos somáticos a partir de protoplastos de polen y mesófilo de hojas; Transferencia de cloroplastos de hoja a protoplastos de polen
Desprez et al., 1995 a
Desprez et al., 1995 b
Nicotiana tabacum Actividad morfogénica de regulador sintético en protoplastos y microcallos
Branca et al., 1993
Nicotiana y Brassica Desarrollar Cihibridos con esterilidad masculina y resistencia a herbicidas.
Pelletier et al., 1988
Brassica y Solanacea Desarrollar metodología de fusión para desarrollar híbridos somáticos entre géneros y especies diferentes
Glimelius, 1988
Lycopersicum peruvianum + Lycopersicum esculentum
Transferir capacidad de regeneración de una especie a otra
Wijbrandi et al., 1988
Lycopersicum peruvianum + Lycopersicum esculentum
Transferir capacidad de regeneración
Wijbrandi et al., 1988
Básica napus Producción de cihibridos Yarrow, 1999
Cydonia oblonga Aislamiento de protoplastos de hojas D’onofrio et al., 1999
Lycopersicom esculetum + Solanum nigrum
Transferir resistencia a la Atrazina de Solanum a Lycopersicum
Jain et al., 1998
Brassica rapa + Brassica oleraceae Obtención de cihíbridos Earle, 1994
Pteridium quilinum y otras especies (Pterides, Polystichum, Phyllitis, Asplenium)
Protocolo de cultivo, fusión y regeneración de plantas con incompatibilidad cromosómica.
Breznovits, 1994
Pinus pinaster Análisis de expresión transgénica Gómez-Maldo-nado et al., 2001
Continúa Cuadro 7...........................
67
Cuadro 7. Trabajos reportados sobre fusión de proto plastos en otras especies
que no son cítricos. (continuación)
Especie y/o Combinación Objetivo Autor Solanum melongena + Solanum khasianum Solanum melongena + S. nigrum Solanum melogena + S. aethiopicum
Protocolo para aislamiento cultivo de protoplastos y regeneración de plantas entre especies comunes y silvestres para incorporar resistencia a enfermedades plagas y herbicidas
Sihachakr et al., 1994
Apple Transformación transitoria Maddumage et
al., 2002 Passiflora edulis flavicarpa Passiflora cincinnata Passiflora amethystina
Regeneración de brotes a partir de protplastos de cotiledones
Carrier et al., 1993
Passiflora Protocolo de aislamiento, cultivo y regeneración de protoplastos a partir de hojas
D’utra-Vaz et al.,1993
Passiflora edulis cv flavicarpa + P. incarnata P. edulis + P. amethystine P. cincinnata, P. gilberti,
Incorporar características de interés en especies silvestres a la Passiflora edulis. Se describe protocolo.
Anthony et al., 1999
Lolium Aislamiento, cultivo y regeneración de plantas de protoplastos de callo
Following y Olesen, 1999
Brassicaceae Obtener híbridos somáticos y presentar protocolo
Fahelson y Glimelius, 1999
Brassicaceae napus Transferir resistencia citoplásmica a la atrazina y a la esterilidad masculina
Chuang et al., 1988
Banana
Protocolo de aislamiento, cultivo y regeneración de protoplastos de células embriogénicas de meristemos.
Panis et al., 1993
Solanum khasianum + Solanum aculeatissimum
Fusión y regeneración de brotes de híbridos interespecíficos por electrofusión a partir de protopalstos de hoja para incrementar el contenido de solasodine (Alcaloide esteroide)
Statmann et al., 1994
Mentha piperita Protocolo regeneración de brotes a partir de protoplastos de hoja
Sato et al., 1993
Hordeum vulgare
Técnicas de alginato para aislar protoplastos de mesófilo de la hoja de tabaco. Recuperación de plantas de callo embriogénico de trigo.
Golds et al., 1994
Beta vulgaris Optimización de cultivo, selección y transformación estable de protoplastos por electrofusión
Lindsey y Jones, 1989
Continúa Cuadro 7...........................
68
Cuadro 7. Trabajos reportados sobre fusión de proto plastos en otras especies
que no son cítricos. (continuación)
Especie y/o Combinación Objetivo Autor
Abies Alba Técnica de alginato para estudiar desarrollo de un solo protoplasto
Lang y Kohlen-bach, 1989
Vitis rupestris Protocolo para la obtención de callo embriogénico a partir de protoplastos de la hoja y peciolo
Martinelli et al., 1993
Hyoscyamus muticus + Hyoscyamun albus
Obtener híbridos somáticos que incorpore las características medicinales de H. muticus con las características agronómicas de H. albus y en una sola planta.
Rahman et al., 1994
Saintpaula ionantha Aislamiento, cultivo y regeneración de plantas a partir de callo de segmentos de hoja
Hoshino et al., 1995
Lactuca sativa Teñido y análisis de proceso de fusión por microscopía fluorescente
Taniguchi et al., 1994
Oryza sativa Teñido y análisis de proceso de fusión por microscopía fluorescente
Taniguchi et al., 1994
Oryza ridleyi Factores que afectan el establecimiento de cultivos de células en suspensión y cultivo de protoplastos y comportamiento de plantas derivadas de arroz Indica.
Tang et al., 2000
Oryza sativa
Dendranthema zawadskii, Dendranthema grandifolia
Protocolo de regeneración de plántulas a partir de hojas de brotes in vitro.
Lindsey y Ledger, 1993
Rauwolfia serpentina Inducción a fusión celular por medio de estimulo eléctrico
Senda et al., 1979
Helianthus giganteus y Helianthus maximiliani (donadores) + Helianthus annus (receptors)
Aplicar agentes anti-nitóticos y citochasalin-B para lograr una transferencia parcial del genoma y regenerar Híbridos asimétricos.
Binsfeld et al., 2000
Crocus cancellatus Protocolo para la regeneración plántulas a partir de protoplastos de callo embriogénico
Shahin, 1984
Solanum tuberosum Incorporar resistencia a enfermedades de especies silvestres en especies comerciales.
Helgeson et al., 1998
Las citas en relación a la fusión de protoplastos en otras plantas anuales y frutales
diferentes de los cítricos son solo una muestra del gran potencial que tienen esta
herramienta biotecnológica en el mejoramiento genético. Con toda seguridad los países
que logran los mayores avances en este aspecto podrán desarrollar a corto y mediano
plazo un apreciable número de variedades de plantas con características superiores.
69
2.16 Conclusión
De la revisión de literatura se concluye que es necesario ampliar la base genética de
variedades y portainjertos de cítricos. En el caso de los portainjertos, no es
recomendable depender de un solo patrón para evitar la vulnerabilidad de las
plantaciones a problemas fitosanitarios de alto riesgo como el VTC, Blight, Greening
etc, entre otras. Existen numerosos reportes en los cítricos y otras especies que
muestran con claridad la ventaja de utilizar la fusión de protoplastos como alternativa de
mejoramiento genético para desarrollar nuevas variedades y portainjertos con
características deseables, superando las barreras que impiden el avance del
mejoramiento genético por hibridación sexual.
En la familia de los cítricos existen varios parientes que son incompatibles por injerto
con el género Citrus. Se sugiere que la incompatibilidad por injerto observada entre
especies de géneros más alejados puede dar una idea de la dificultad para obtener
híbridos somáticos vía fusión de protoplastos.
En sus revisiones, los líderes recomiendan enfocar la investigación al desarrollo de
nuevos híbridos somáticos de portainjertos de cítricos que en su genoma incluyan
características genéticas complementarias para resolver problemas específicos en una
determinada región citricola. No hay reportes de híbridos somáticos obtenidos a partir
de los portainjertos Amblicarpa (Citrus amblycarpa) y Macrofila (Citrus macrophylla). Se
coincide en señalar que para lograr los híbridos, es necesario contar con protocolos
eficientes de embriogénesis somática de al menos uno de los progenitores; así como de
fusión de protoplastos que incluye el aislamiento, cultivo y fusión de protoplastos y la
regeneración de plantas. Se coincide en señalar que la eficiencia de fusión y
regeneración de plantas depende de las características genéticas de los materiales
empleados como progenitores, así como de las condiciones de aislamiento, cultivo y
regeneración de protoplastos de las especies estudiadas. Por ello, en cada laboratorio
se deben desarrollar protocolos específicos de fusión y regeneración de plantas para
aumentar la eficiencia de las fusiones y así mejorar el potencial de éxito en la obtención
de híbridos somáticos.
70
III. MATERIALES Y METODOS
3.1 Localización
La parte experimental del presente trabajo se llevó a efecto durante el período
comprendido entre octubre del 2000 y septiembre del 2002 en el laboratorio de
Genética Celular y Mejoramiento de Cítricos del Citrus Research and Education Center
(CREC) perteneciente a la Universidad de Florida. Este laboratorio está ubicado en
Lake Alfred, Florida EU a cargo del Dr. Jude Grosser. El CREC está situado en el
condado Polk en la parte central de la Península del estado de Florida, donde se
cultivan más de 600 mil has de cítricos. El condado Polk es uno de los más importantes
productores de naranja en Estados Unidos. El CREC está situado a 28° 50’ latitud norte
y 30 m sobre el nivel del mar. La temperatura media anual en la región de estudio oscila
entre 18 – 23°C. Las características anteriores cla sifican a Florida como una región de
clima subtropical.
3.2 Establecimiento de experimentos
Los estudios efectuados se dividieron en tres partes. En la primera se incluyeron los
trabajos efectuados para la obtención y cultivo de callo embriogénico de los
progenitores de callo; en la segunda parte se incluyeron los experimentos que se
condujeron para mejorar la eficiencia en la técnica de fusión de protoplastos. La
justificación en lo anterior radica en que los materiales empleados en este estudio para
las fusiones, son distintos a los reportados previamente por Grosser y Gmitter 1990a y
posiblemente requieren diferente manejo durante el proceso de aislamiento y
purificación de protoplastos para un mayor éxito en las fusiones. En la tercera parte, se
incluyen los experimentos sobre hibridación somática de distintas combinaciones de
portainjertos de cítricos.
3.3 Cultivo de Callo embriogénico
Un prerrequisito para realizar fusión de protoplastos es contar con un protocolo eficiente
para producir callo embriogénico desmenuzable de los materiales portainjertos de
interés. A continuación se describen las fuentes y procedimientos seguidos para la
obtención del callo embriogénico.
71
3.3.1 Fuentes de callo embriogénico
En este trabajo interesaba mejorar los portainjertos siguientes: mandarino Amblicarpa
(Citrus amblycarpa Osche), limón Macrofila (Citrus macrophylla Wester) y limón
Volkameriana (Citrus Volkameriana Pasq). De estos tres materiales en Colima, se
hicieron trabajos previos para producir callo embriogénico de Macrofila, lo cual se
efectuó entre marzo y octubre del 2000. Los otros dos materiales se obtuvieron
directamente de la colección de callos embriogénicos disponibles en el laboratorio del
Dr. Grosser en Florida. A continuación se describe la forma como se obtuvieron los
callos embriogénicos.
3.3.1.1 Cultivo de óvulos de frutos inmaduros. Material y procedimiento de
desinfección: El callo embriogénico del portainjerto Macrofila se obtuvo a partir del
cultivo in vitro de óvulos presentes en pequeños frutos de 20-30 días de edad. Se
colectaron botones florales cerrados conteniendo el estilo y estambres de limón
Macrofila, las flores se colectaron de árboles del portainjerto Macrofila establecidos en
el INIFAP-Campo Experimental Tecomán, se llevaron al laboratorio de cultivo de tejidos,
donde se esterilizaron con etanol al 70% por cinco minutos y luego se pasaron a
hipóclorito de sodio al 2% por 15 minutos. Enseguida, se extirparon los pétalos florales
y los pequeños frutos se lavaron tres veces por cinco minutos con agua bidestilada,
estérilizada y suplementada con 2.6 µM de ácido nítrico (Carimi et al., 1998, 1999).
Disección y siembra de órganos: Los tres componentes de los pequeños frutos:
estigmas, estilos y ovarios se disectaron con un escalpelo en tres partes y cada sección
se sembró verticalmente en medio de cultivo MS con nutrientes y vitaminas y sacarosa
(Carimi et al., 1998). Previamente, el medio de cultivo MS se esterilizó en una autoclave
a 121°C y a una presión de 1.1 kg/cm² durante 15 mi nutos. El pH del medio, se ajustó a
5.7±0.1 con hidróxido de Potasio al 0.5 M. Se utilizaron cajas de petrí de plástico de 100
X 15 mm, a cada una de las cuales de les agregó 25 ml de medio y se sellaron con
película plástica. En cada caja se sembraron cuatro frutos disectados. Se sembraron un
total de 20 placas.
Manejo de explantes: Los callos y explantes se subcultivaron a intervalos de 30 días y
se mantuvieron a una temperatura de 25°C ± 1 con un fotoperíodo de 16 horas y un
72
flujo de fotones fotosintéticos de 100 µMM-2S-1 provisto por una lámpara blanca
fluorescente Osram de 18 watts. El crecimiento del callo embriogénico alrededor de los
distintos tipos de tejido que fueron sembrados en el medio de cultivo, fue muy lento e
irregular. La mejor respuesta de callo desmenuzable, se obtuvo al sembrar la parte del
fruto que contenía los ovarios. Sin embargo, para estimular y aumentar la producción de
callo desmenuzable, al medio de cultivo MS se le agregó un regulador de crecimiento a
base de citocininas con lo cual el callo aumentó su volumen de tejido apto para
utilizarse.
3.3.1.2 Cultivo de óvulos de frutos maduros. En el caso del portainjerto Amblicarpa
(Citrus amblycarpa Ochse), el callo embriogénico utilizado se obtuvo de una colección
de materiales del CREC (Citrus Research and Education Center de la Universidad de
Florida) conservada en el Laboratorio del Dr. Jude Grosser. En este caso, el callo
embriogénico se obtuvo a partir de frutos maduros de los cuales, previa desinfección
con hipoclorito de sodio 1 normal durante 20 minutos, se obtuvieron semillas abortadas,
rescatando óvulos infértiles ó no desarrollados. Los óvulos se sembraron en un medio
DOG (MT + 5 mg/l de cinetina). Fue necesario sembrar cientos de óvulos en las cajas
de petrí para producir líneas de callo embriogénico requerido, lo cual tomó más de un
año (Grosser 2003, comunicación personal). El callo embriogénico del portainjerto
Volkameriana (C. volkameriana), que se utilizó en algunos experimentos sobre
metodología de fusión de protoplastos, se obtuvo de manera similar al Amblicarpa.
3.3.1.3 Cultivos embriogénicos en suspensión. De callo embriogénico desmenuzable
color crema de ambos portainjertos Macrofila y Amblicarpa creciendo en medio de
cultivo sólido, se obtuvieron de 100 a 200 mg para iniciar los cultivos en suspensión.
Para ello, se utilizaron frascos de vidrio Earlenmeyer de 50 ml a los cuales se les
agregaron 30 ml de medio líquido EME 0.146 M (Cuadro 9) y enseguida el callo
embriogénico. Los frascos se mantuvieron en oscuridad a 25°C sobre un agitador
horizontal rotatorio a 125 rpm. Después de 1 a 2 semanas en agitación, se soltaron
numerosas células embriogénicas optándose por utilizar callo en suspensión de 4-12
días de edad, y un ciclo de subcultivo de 30 días.
73
3.4 Aislamiento y purificación de protoplastos
Dado que no se conocen reportes previos sobre la producción de protoplastos a partir
de callo embriogénico de los portainjertos Macrofila y Amblicarpa, se establecieron
varios experimentos con el fin de eficientar la producción de protoplastos en esos
materiales. Además, el interés por realizar estos estudios se fundamenta en que los
protoplastos de callo embriogénico de los portainjertos, no solo son importantes en el
proceso de fusión al combinarse con los protoplastos de hoja del otro genotipo, sino
que a la vez son los que tienen la capacidad de totipotencia requerida para regenerar
plantas a partir de las células fusionadas. Los resultados de los estudios que se
describen a continuación, contribuyeron a hacer las modificaciones necesarias al
protocolo de fusión de protoplastos previamente establecido (Grosser y Gmitter, 1990 a)
a fin de ajustarlo a las condiciones locales.
3.4.1 Intervalo de tiempo óptimo de incubación en p rotoplastos.
A partir de callo embriogénico de los portainjertos Macrofila (C. macrophylla),
Volkameriana (C. volkameriana) y Amblicarpa (C. amblycarpa) crecidos en un medio
líquido denominado EME 0.146 M, se tomaron células de estos materiales en
suspensión. El medio líquido anterior se preparó a partir de las soluciones base que
aparecen en el Cuadro 8. Los ingredientes ó soluciones del medio líquido EME 0.146 M
fueron los siguientes: macronutrientes, micronutrientes, vitaminas, fierro, calcio, maltosa
y extracto de malta ajustando a un pH de 5.8 con KOH (Cuadro 9). El callo
embriogénico se mantuvo en suspensión durante 8-10 días previos a su uso, en
matraces earlenmeyer de 100 ml colocados sobre un agitador rotatorio a 125 rpm. De
cada portainjerto se seleccionaron 2 matraces, de los cuales se extrajeron dentro de
una cámpana de flujo laminar, aproximadamente 4.0 ml del medio líquido conteniendo
las células embriogénicas en suspensión. Se pesaron dos cajitas de petrí de 60 X 15
mm por cada uno de los portainjertos y dentro de ellas se colocaron las células en
suspensión. Con una pipeta, se extrajo el líquido y una parte del callo embriogénico
hasta dejar aproximadamente un gramo de callo por caja de petrí. Enseguida, al callo
embriogénico se le adicionaron 3 ml de otro nuevo medio de cultivo líquido denominado
BH3 0.6 M, el cual se preparó a partir de las soluciones base que aparecen en el
Cuadro 10. Los ingredientes del BH3 0.6 M son los siguientes: macronutrientes,
micronutrientes, vitaminas, calcio, fierro, vitaminas A y B, Kl, azúcares-alcohol, acidos
74
orgánicos, agua de coco, extracto de malta, sacarosa, manitol, glutamina y caseina
ajustando el pH de la solución a 5.7 con KOH. Las cantidades de cada ingrediente
aparecen en el Cuadro 11.
Cuadro 8. Soluciones base para preparar medios de c ultivo EME 0.146 M.
Ingredientes Compuesto Cantidad por litro
Macronutrientes
NH4NO3
KNO3
MgSO4 x 7 H2O
KH2 PO4 (monobásico)
KH2 PO4 (dibásico)
82.5 g
95.0 g
8.5 g
7.5 g
1.0 g
Micronutrientes
H3BO3
MnSO4 x 4H2O
ZnSO4 x 7H2O
KI
Na2MoO4 x 2H2O
CuSO4 x 5H2O
CoCl2 x 6H2O
0.62 g
2.23 g
0.86 g
0.083 g
0.025 g
0.0025 g
0.0025 g
Fierro Na2EDTA
FeSO4 x 7H2O
7.45 g
5.57 g
Vitaminas
Mio – inositol
Tiamina - HCl
Piridoxina – HCl
Acido nicotínico
Glicina
10.0 g
1.0 g
1.0 g
0.5 g
0.2 g
Calcio CaCl2 x 2H2O 29.33 g
75
Cuadro 9. Ingredientes a partir de soluciones base del Cuadro 8 para preparar un
medio de cultivo EME 0.146 M (X) utilizado para el crecimiento de células
embriogénicas.
Ingredientes Cantidad por litro
Macronutrientes
Micronutrientes
Vitaminas
Calcio
Fierro
Maltosa ó lactosa
Extracto de malta
pH
20 ml
10 ml
10 ml
15 ml
5 ml
50 g
0.5 g
5.8
(x) = Para convertir EME 0.146 M a 0.6 M y 0.7 M se añaden 15.538 y 18.961 g de sacaroza por cada 100 ml, respectivamente.
Además del medio nutritivo, al callo embriogénico se le adicionaron 2.5 ml de una
solución enzimática compuesta por: manitol, celulasa (1%), macerasa (1%), pectoliasa
(0.2%), cloruro de calcio, difosfato de sodio y MES. Las cantidades de esta solución
enzimática se presentan en el Cuadro 12.
Una vez realizado lo anterior se procedió a colocar las cajas de petrí con el tejido
embriogénico, dentro de una incubadora para el aislamiento de protoplastos por un
período de tiempo de: 8, 16, 24 y 32 horas.
Después del tratamiento de incubación, el resto de la metodología aplicada fue la
recomendada por Grosser y Gmitter (1990a), hasta la obtención de protoplastos. Para
efectuar la comparación entre portainjertos, se registró el número de protoplastos por ml
contabilizando en un hematocímetro el cual fue colocado en un microscopio
estereóscopio con un lente de aumento 4X. De cada uno de los portainjertos se
obtuvieron 10 muestras de células en suspensión, las cuales se emplearon para formar
20 repeticiones que se utilizaron para el análisis de varianza en base a un diseño
bloques al azar.
76
3.4.2 Determinación de la concentración óptima de BH3.
Este trabajo es estableció con el fin de evaluar alternativas para incrementar el
rendimiento de protoplastos en Macrofila y Volkameriana, ya que en observaciones
preliminares al utilizar BH3 al 0.6 M, se apreció que el portainjerto Amblicarpa generó
mayor volumen de protoplastos que Macrofila y Volkameriana, lo que presupone un
diferente rendimiento de protoplastos entre los materiales.
De manera similar al trabajo anterior, para este estudio se seleccionaron dos matraces
conteniendo callo embriogénico en suspensión de Macrofila y Volkameriana. Con una
pipeta se extrajeron 4 ml de la suspensión y se colocaron en cajas de petri de 6.0 X 1.5
cm de diámetro y altura; por cada patrón se utilizarón ocho cajas de petri. Los
tratamientos comparados fueron las concentraciones de BH3 al 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M y
0.9 M. El BH3 al 0.6 M se preparó de acuerdo a los ingredientes y cantidades que
aparecen en el Cuadro 11.
Para obtener las concentraciones de BH3 de 0.7, 0.8 y 0.9 M se utilizaron cantidades
adicionales de sacarosa de 6.84, 13.50 y 20.34 g respectivamente por cada 200 ml de
medio de cultivo. De cada uno de estos medios de cultivo BH3 a diferentes
concentraciones, se adicionaron 3.0 ml a las cajas petrí conteniéndo un gramo de callo
embriogénico. Enseguida se agregaron 2.5 ml de la solución enzimática a base de
celulasa (1%), macerasa (1%) y pectoliasa (0.2%) mencionada anteriormente y que
aparece en el Cuadro 12.
Las cajas petrí conteniendo los diferentes tratamientos se sometieron a un período de
incubación de 24 horas en una cámara de aislamiento a 31°C. El resto de la
metodología para el aislamiento y purificación de los protoplastos fue de acuerdo a
Grosser y Gmitter (1990 a).
77
Cuadro 10. Soluciones base para la preparación de m edios de cultivo BH3 0.6 M
empleada para fusión de protoplastos. Macronutrient es, Micronutrientes, Sales,
Azúcar-alcohol y Acidos orgánicos.
Ingredientes Compuesto Cantidad por litro
Macronutrientes
MgSO4 x 7 H2O KH2 PO4 (monobásico) KH2 PO4 (dibásico) KCl
37 g 15 g 2 g 150 g
Micronutrientes
H3BO3
MnSO4 x 4H2O ZnSO4 x 7H2O KCI Na2MoO4 x 2H2O CuSO4 x 5H2O CoCl2 x 6H2O
0.62 g 2.23 g 0.86 g
0.083 g 0.025 g
0.0025 g 0.0025 g
Calcio CaCl2 x 2H2O 29.33 g
Fierro Na2EDTA FeSO4 x 7H2O
7.45 g 5.57 g
Azucar – Alcohol
Fructuosa Ribosa Xylosa Manosa Ramnosa Celobiosa Galactosa Manitol
25 g 25 g 25 g 25 g 25 g 25 g 25 g
Acidos orgánicos
Acido piruvico Acido cítrico Acido málico Acido fumárico
1.0 g 2.0 g 2.0 g 2.0 g
Vitaminas
Mio – inositol Tiamina - HCl Piridoxina – HCl Acido nicotínico Glicina
10.0 g 1.0 g 1.0 g 0.5 g 0.2 g
Multivitaminas A
Pantotenato de Calcio Acido Ascórbico Choline Chloride Acido P-aminobenzoico Riboflavina Biotina
0.5 g 1.0 g 0.5 g
0.010 g 0.10 g 0.010 g
Multivitaminas B Retinol (Vit – A) Cholecalciferol (Vit D-3) Vitamina B-12
0.010 g 0.010 g 0.020 g
78
3.4.3 Concentración óptima de sacarosa durante el a islamiento de protoplastos.
Para este trabajo se eligieron 8 cajas de petri de 60 X 15. En cada caja se colocó un
gramo de callo embriogénico en suspensión, únicamente del portainjerto Macrofila, al
cual se le adicionaron 3.0 ml de la solución BH3 0.6 M (Cuadro 11) y 2.5 ml de la
solución enzimática compuesta por macerasa, celulasa y pectoliasa (Cuadro 12).
Los callos embriogénicos se mantuvieron en incubación por 24 horas, después de lo
cual, esta solución se pasó por un filtro a tubos de cristal de 15 ml y luego se centrífugó
a 900 rpm por 10 minutos. El sobrenadante se extrajo con pipeta y luego a los
protoplastos depositados en el fondo, se les añadió nuevo BH3 al 0.6 M, con el fin de
centrifugarlos nuevamente. Enseguida a los protoplastos se les añadió sacarosa en las
concentraciones que fueron objeto de la evaluación: 8.7, 17.5, 25.0 y 35%. Usualmente
Grosser y Gmitter (1990a), han utilizado sacarosa al 25%. Una vez agregadas las
cantidades variantes de sacarosa, se procedió a agregar manitol al 13%. Luego los
protoplastos se sometieron a una segunda centrifugación después de la cual aparece
un anillo blanco de protoplastos ya purificados y colocado en la parte superior del tubo,
en medio de el manitol y la sacarosa. Para la obtención de muestras a partir del anillo
de protoplastos, así como su dilución y contéo, se siguió la misma metodología indicada
en los trabajos previos.
3.4.4. Efecto del medio de cultivo sobre el rendimi ento de protoplastos durante la
incubación
Este experimento consistió en comparar el efecto en el rendimiento de protoplastos del
medio de cultivo BH3 0.6 M (Cuadro 11), el cual se utiliza durante la incubación de
callo embriogénico, en comparación con el medio EME 0.146 M (Cuadro 9), así como la
mezcla de BH3 0.6 M más EME 0.146 M, en relación 1:1 y BH3 0.6 M más EME 0.146
M en la relación 1:2.
Para ello, se obtuvo callo embriogénico en suspensión de los portainjertos Macrofila y
Volkameriana. De cada material se colocó un gramo en cada una de dos cajas petrí de
60 X 15. Posteriormente se añadieron 3 ml del medio de cultivo a evaluar y luego 2.5 ml
de la solución enzimática compuesta por celulasa, macerasa y pectoliasa (Cuadro 12).
79
Enseguida se colocaron las cajas de petri dentro de una cámara de incubación de
protoplastos por 24 horas. Para la evaluación del rendimiento de protoplastos se obtuvo
una muestra del anillo de protoplastos y se diluyó en BH3 0.6 M. El resto de la
metodología es tal como lo refieren Grosser y Gmitter, (1990a).
Cuadro 11. Ingredientes para prepararar un medio de cultivo BH3 0.6 M (X) para
fusión de protoplastos a partir de soluciones base.
Ingredientes Cantidad por litro
Macronutrientes
Micronutrientes
Vitaminas
Calcio
Fierro
Multivitamina B
Multivitamina A
KCl
Azúcares / alcohol
Acidos orgánicos
Agua de coco
Extracto de malta
Sacarosa
Manitol
Glutamina
Caseina (enzima hidrolizada)
pH
10 ml
10 ml
10 ml
15 ml
5 ml
1 ml
2 ml
1 ml
10 ml
20 ml
20 ml
1 g
51.345 g
81.99 g
3.1 g
0.25 g
5.7
(x) = Para convertir BH3 de 0.6 M a 0.7 M se añaden 6.84 g de sacarosa por cada 200 ml, respectivamente.
80
Cuadro 12. Composición de la solución enzimática em pleada en fusión de
protoplastos (X).
Ingredientes Cantidad para 80 ml
Agua desionizada
Manitol
Celulasa (1%)
Macerasa (1%)
Pectoliasa (0.2 %)
Cloruro de sodio
Difosfato de sodio
MES
50 ml
10.24 g
0.8 g
0.8 g
0.16 g
2.0 ml
2.0 ml
2.0 ml
(X) Procedimiento: Se depositaron 50 ml de agua desionizada en un vaso de cristal de 100 ml. Se coloca sobre una plancha eléctrica y se deposita en el fondo un agitador magnético. Enseguida se pesan y se añaden uno por uno el manitol y las tres enzimas. El cloruro de calcio y difosfato de amonio y el MES son soluciones base preparadas previamente y conservadas en el refrigerador. Se afora con agua biodestilada a 80 ml. Enseguida la solución se filtra en vasos estériles mediante una bomba de vacío. Después del filtrado se ajusta el pH a 7.0 agregando HCl ó KOH a la solución dependiendo de si la solución es alcalina ó acida. 3.4.5 Efecto de la duración y velocidad de la centr ifugación
Para estos estudios únicamente se empleó al portainjerto Macrofila. Tiempo de
centrifugación: se utilizó callo embriogénico en suspensión el cual se colocó en cajas
de petrí de 60 X 15. En ellas se depositó un gramo de callo embriogénico. Enseguida
se adicionaron 3.0 ml de BH3 0.6 M (Cuadro 11) en cada caja, más 2.5 ml de la
solución enzimática mencionada previamente (Cuadro 12). Luego se sometieron a un
período de incubación de 18 hrs. Al término del aislamiento, la solución de las cuatro
primeras cajas petrí se filtró en un solo tubo de plástico estéril de 100 ml. El contenido
de las otras cuatro cajas también se depositó en otro tubo de plástico estéril.
Posteriormente en tubos cónicos de cristal de 15 ml se colocaron 10 ml de la solución
filtrada conteniéndo de la mezcla de BH3 0.6 M y los protoplastos. A partir de lo anterior
se aplicaron los siguientes tratamientos para determinar los tiempos de la primera y
segunda centrifugación: 1) primera 5 minutos y segunda 10 minutos; 2) primera 10
81
minutos y segunda 10 minutos; 3) primera 15 minutos y segunda 10 minutos; 4) primera
10 minutos y segunda 5 minutos; 5) primera 10 minutos y segunda 15 minutos. La
velocidad de la centrifugación fue de 900 rpm. Una vez obtenido el anillo de
protoplastos se tomaron muestras de todos los tratamientos y se registró el rendimiento
de protoplastos utilizando la técnica del hemacitómetro bajo un microscopio como se
señaló previamente.
La velocidad de la centrífuga: se determinó de manera similar al trabajo anterior. Los
tratamientos de centrifugación consistieron en aplicar velocidades de: 1) 500, 2) 700, 3)
900 y 4) 1100 rpm. Como testigo se usó la velocidad de 900 rpm.
3.5 Experimentos de fusión de protoplastos
Los cuatro siguientes experimentos se efectuarón para evaluar la capacidad de
diferentes materiales portainjertos de cítricos utilizados como progenitores para
fusionarse y regenerar plantas híbridas somáticas.
3.5.1 Experimento 1. Híbridos somáticos intergenéri cos entre mandarino
Amblicarpa (Citrus amblycarpa Ochse) y diferentes v ariedades del género
Poncirus trifoliata.
La justificación para realizar este trabajo se basa en que se requiere desarrollar nuevos
portainjertos de cítricos que seán achaparrantes y que además seán tolerantes a virus,
viroides y gomosis, y que tengan potencial para utilizarse en plantaciones intensivas en
diversas condiciones de suelos.
En ese sentido se sabe que Amblicarpa se adapta a diversas condiciones de suelos, es
tolerante a gomosis, exocortis y VTC, además es muy productivo con limón mexicano
(Medina-Urrutia, 1996; Medina-Urrutia, et al., 2001). Por su parte el Poncirus trifoliata y
sus híbridos presentan características complementarias al Amblicarpa, como son
tolerancia a xiloporosis y psorosis; además de que son de semivigorosos a chaparros
dependiendo la variedad (Castle, et al., 1983).
Considerando estos antecedentes las fusiones que se practicaron fueron las siguientes:
Amblicarpa (C. amblycarpa) + Citrange C – 35 (C. sinensis x P. trifoliata var C-35);
82
Amblicarpa + Citrange Carrizo (C. sinensis x P. trifoliata var carrizo); Amblicarpa +
Citrange Benton (C. sinensis x P. trifoliata var Benton); Amblicarpa + Flying Dragon (P.
trifoliata var Flying Dragon); Amblicarpa + Rubidoux (P. trifoliata var Rubidoux); y
Amblicarpa + Sofd (Citrus aurantium + P. trifoliata var Flying Dragon, tetraploide).
3.5.2 Experimento 2. Híbridos somáticos interespecí ficos entre mandarino
Amblicarpa y líneas monoembriónicas de plántulas de Pomelo (Citrus máxima
Burn).
Se pretendió desarrollar híbridos somáticos tetraploides con los atributos conocidos del
naranjo agrio (tolerante a xiloporosis, exocortis, blight y gomosis, amplia adaptación a
condiciones de suelo y altamente productivo con fruta de excelente calidad), pero
además con tolerancia al VTC. Lo anterior, basados en el hecho de que recientemente
Nicolisi et al. (2000), mediante estudios moleculares, descubrieron que el naranjo agrio
es un híbrido cuyos ancestros son el pomelo (C. máxima) y el mandarino (C. reticulata).
Posiblemente los naranjos agrios ancentrales no provienen del mejor mandarino, ni del
mejor pomelo. Sin embargo, ahora se conocen genotipos como el mandarino
Amblicarpa que es tolerante a tristeza, además de contar con otros atributos.
Entre las fusiones practicadas en este trabajo, se incluyen las siguientes
combinaciones: Amblicarpa (C. amblycarpa Ochse) + Pomelo Hirado Buntan línea 5-1-
99-1B (C. máxima); Amblicarpa + Pomelo Ling Pin Yau línea 8-1-99-4A; Amblicarpa +
Pomelo linea 8-1-99-3B, Amblicarpa + Pomelo Ling Pin Yau línea 8-1-99-5A y
Amblicarpa + Pomelo NW línea 8-2-99-3B, y Amblicarpa + Pomelo Large Pink línea 7-
2-99-5.
3.5.3 Experimento 3. Híbridos somáticos intergenéri cos entre Macrofila (Citrus
macrophylla Wester) y géneros parientes de los cítr icos.
En este caso la justificación para desarrollar fusiones entre estos materiales, se basó en
que Macrofila es un excelente portainjerto para limones, ya que reune atributos de gran
importancia como son: tolerancia a gomósis, exocortis y psorósis, precocidad de
producción, alto rendimiento y calidad de fruta. Sin embargo, es susceptible a tristeza,
xiloporosis, blight y nemátodos.
83
Así mismo es un portainjerto muy vigoroso que en pocos años adquiere un gran tamaño
(a los cinco años llega a medir de 5 a 6 m de altura), por lo que no resulta muy
apropiado para plantaciones de limón en alta densidad. Estos defectos ponen en riesgo
el uso comercial a futuro de este portainjerto en las plantaciones de limón. Por ello se
requieren nuevos portainjertos con características superiores a los que se usan
actualmente. En la mayoría de regiones importantes productoras de cítricos, han
aprendido que es necesario no depender de un solo portainjerto, por lo que han
ampliado el abanico de opciones mediante investigación .
Con el presente estudio se pretende demostrar la factibilidad de desarrollar nuevos
híbridos somáticos, utilizando como material progenitor donador de protoplastos de
callo embriogénico al portainjerto Macrofila (Citrus macrophylla Wester) y tres
variedades de cítricos pertenecientes a tres distintos géneros, como donadores de
protoplastos de hoja. Estos tres materiales son: Pomelo variedades “Ling Pin Yau”
linea 8-1-99-10 A; Citropsis gilletiana; y Citrange C –35 (Citrus sinensis x Poncirus
trifoliata). Estos tres materiales se utilizaron como parentales de hoja, caracterizándose
por se diploides.
De igual manera en este trabajo se incluye la fusión del diploide Macrofila como
donador de protoplastos de callo y el tetraploide denominado “ Sofd”,. el cual se
obtuvo previamente al fusionar Poncirus trifoliata + Citrus aurantium, y que tiene
características de ser achaparrante (Grosser et al., 2000).
3.5.4 Experimento 4. Híbridos somáticos interespecí ficos entre Amblicarpa y
especies derivadas del Cidro.
Los portainjertos Macrofila y Volkameriana en realidad son dos especies de limón que
de acuerdo con Nicolisi et al., (2000) son derivados del Cidro.
Por ello con frecuencia desarrollan árboles muy vigorosos y productivos, compatibles
con el limón mexicano. El comportamiento en cuanto a crecimiento, producción y
calidad de fruta del limón mexicano con Macrofila y Volkameriana, es muy similar
(Medina, 1996; Medina y Robles, 2003). También estos portainjertos se han significado
por ser los mejores para plantaciones de limón Persa (Medina, 1991) y el limón
84
verdadero en Arizona. Estudios realizados previamente con limón mexicano, revelan
que el Macrofila es el mas versátil para adaptarse a una mayor amplitud de condiciones
de suelo que Volkameriana (Medina, 1996). Aunque el Volkameriana le aventaja al
Macrofila por ser un patrón que tolera el virus de la tristeza. Ambos materiales ofrecen
características complementarias con el mandarino Amblicarpa . Por lo tanto la fusión y
consecuente obtención de híbridos somáticos entre el mandarino Amblicarpa y los
limones derivados del cidro, permitiría teóricamente obtener portainjertos con un gran
potencial para plantaciones no solo de limón mexicano, sino de otros tipos de limón.
Así que en este trabajo se persigue obtener portainjertos vigorosos tipo limón,
adaptados a condiciones adversas de suelos, tolerantes a la tristeza de los cítricos y
otros virus y viroides y a gomósis, entre las características mas deseables.
Para lograr lo anterior se intentaron fusionar protoplastos de callo embriogénico entre
el mandarino Amblicarpa (Citrus amblycarpa Ochse) y protoplastos de hoja de los
portainjertos de limón Macrofila (Citrus macrophylla Wester) y Volkameriana (Citrus
volkameriana Pasq.).
3.5.5 Descripción de la metodología de fusión de pr otoplastos
La metodología seguida para el estudio y obtención de las combinaciones exploradas
en los cuatro experimentos anteriores fue la empleada por Grosser y Gmitter (1990 a).
Aunque con pequeñas variantes que se incluyeron como resultado de los experimentos
explicados previamente.
3.5.5.1 Aislamiento de protoplastos. Los materiales utilizados para aislar protoplastos
de callo embriogénico fueron los siguientes: Amblicarpa y Macrofila. En los dos casos
se utilizó la misma metodología para la liberación de protoplastos del callo
embriogénico.
3.5.5.2 Protoplastos de callo embriogénico en suspe nsión. Esta parte del protocolo
de fusión se hizo de acuerdo a la técnica empleada por Grosser y Gmitter, 1990 a.
Utilizando una pipeta de 5 ml de boca ancha, se extrajeron 4 ml de una suspensión
embriogénica de un matraz conteniendo callo embriogénico, previa agitación con la
85
mano y trabajando en la campana de flujo laminar (CFL). El líquido conteniéndo las
células proembriogénicas, se colocó en cajas de petrí de 60 X 15. Enseguida con un
pipeta Pasteur, se extrajo el medio de cultivo líquido y se reemplazó por 3.0 ml de
medio de cultivo BH3 0.6 M. Previamente se preparó una solución enzimática
conteniéndo los siguientes reactivos: Mannitol 0.7 M; Cl2Ca 12.0 ηM; MES
(Acido2etano sulfonico (N-Morfolin) 6.0 ηM (buffer); PO4NaH2 1.4 ηM; y las enzimas
celulasa 1% (Onozuka); macerasa 1% y pectoliasa (Y-23) 0.2%; se ajustó la solución a
un pH de 5.8 y luego se usó un filtro estéril (Nalgene, 0.2 µm) para finalmente recibir la
solución enzimática en un frasco de vidiro color ambar, el cual se etiquetó y se
conservó en refrigeración de 8-10°C. De esta soluci ón con una pipeta estéril de 5 ml, se
estrajeron 2.5 ml y se añadieron gota a gota sobre la muestra de callo embriogénico,
con el nuevo medio de cultivo líquido fresco. Luego se sellaron las cajas de petrí con
parafilm Marca Nescofilm y se colocaron bajo incubación por 18 hr a 30-31°C en un
agitador rotatorio y dentro de una cámara de crecimiento de protoplastos.
3.5.5.3 Protoplastos de Hoja. El material utilizado para obtener los protoplastos de
hoja para realizar las fusiones por cada experimento fue el siguiente:
3.5.5.3.1 Experimento 1. Trifoliados e Híbridos: Se usaron hojas tiernas pero
expandidas de plántulas crecidas en maceta dentro del invernadero de los siguientes
materiales de cítricos diploides: Citrange Benton (C. sinensis x Poncirus trifoliata cv
Benton); Citrange C – 35 (C. sinensis x P. trifoliata cv C-35); Citrange Carrizo (C.
sinensis x P. trifoliata cv Carrizo); Flyng Dragon (P. trifoliata cv Flying Dragon),
Rubidoux (P. trifoliata cv Rubidoux).
Así mismo, también se utilizaron hojas de un tetraploide denominado Sofd el cual
proviene de un híbrido somático de naranjo agrio (Citrus aurantium) + Flying Dragon
(Poncirus trifoliata).
3.5.5.3.2. Experimento 2 . Pomelos: En este caso se utilizaron hojas tiernas
expandidas de plántulas de semilla monoembriónica derivadas de las variedades de
pomelo siguientes: Pomelo Hirado Buntan (HBP), la línea zigóticas 5-1-99-1B; Pomelo
86
Ling Pin Yau líneas cigóticas 8-1-99-4A, 8-1-99-5A, el Pomelo NW línea 8-2-99-4A y
Pomelo Large Pink línea 7-2-99-5.
3.5.5.3.3 Experimento 3. Intergenéricos: También para este caso se utilizaron
hojas nuevas, recién expandidas de los materiales siguientes: Citrange C-35; (C.
sinensis x P. trifoliata cv C-35), Citropsis gilletiana y Pomelo Ling Pin Yau línea 8-1-99-
10A , así como también eltetraploide Sofd.
3.5.5.3.4 Experimento 4. Cidro: Se usaron hojas tiernas expandidas de
plántulas de Citrus macrophylla Wester y Citrus volkameriana (Pasq). Desarolladas en
invernadero.
Desinfección de hojas: Para el aislamiento ascéptico de protoplastos de hojas se
siguió la metodología sugerida por Grosser y Chandler, (1987), y que consiste en lo
siguiente: Las hojas seleccionadas se desinfectaron por inmersión en HCl 1 N durante
15 segundos. Enseguida las hojas se pasaron por 12-15 min en un blanqueador
comercial (hipóclorito de sodio 6%). Después las hojas se enjuagaron tres veces en
agua estéril por 5 minutos. Posteriormente las hojas se seccionaron con un bisturí en
pequeñas tiras, dentro de una caja de petrí de 100 x 15.
Digestión de hojas: Enseguida las hojas se colocaron dentro de un matraz de vidrio de
100 ml, previamente esterilizado. Se agregaron 8.0 ml de solución nutritiva BH 0.7 M y
1.5 ml de la solución enzimática que se mencionó anteriormente. Posteriormente, los
matraces fueron colocados en una bomba de vacio para favorecer la penetración de las
enzimas al tejido en donde permanecieron por 25 minutos, al final de los cuales, se
llevaron a la cámara de incubación de protoplastos donde permanecieron sobre un
agitador rotatorio a 50 rpm, en la oscuridad por un intervalo de 12-16 horas a 30°C.
3.5.5.4 Purificación de protoplastos. La metodología para purificación de protoplastos
es descrita por Grosser y Gmitter (1990 a), y se indica a continuación. Después de la
incubación, se procedió a la purificación tanto de los protoplastos de hoja como los de
callo embriogénico. Para ello, se hizo pasar la solución de cada uno de los materiales
progenitores, identificados como donadores, a través de una malla tamiz de acero
87
inoxidable, seguido por un gradiente de solución BH3 0.6 M, colocando la malla sobre
un tubo de cristal de 15 cm³ previamente estéril. La solución conteniendo los
protoplastos del callo embriogénico, dió una coloración blanca, en tanto que los
protoplastos de hoja dieron un color verde. Enseguida los protoplastos se pasaron por
una centrífuga a 900 rpm durante 10 minutos, después de los cuales los protoplastos se
depositaron en el fondo del tubo. Enseguida, con mucho cuidado utilizando
micropipetas Pasteur de 1 ml, se extrajo el líquido sobrenadante, para dejar únicamente
lo que se depositó en el fondo del tubo. Posteriormente se agregaron 3 a 4 ml de
sacarosa al 25% y 1 a 2 ml de manitol y se sometieron a una segunda centrifugación,
después de la cual, se formó un anillo de protoplastos purificado y separando el resto
de residuos de callo y/o de hoja que se depositaron en el fondo. En el frasco de callo
embriogénico se formó un anillo de coloración blanca entre las soluciones de sacarosa
y manitol empleada en la última etapa de la purificación. Los protoplastos así obtenidos
de ambos donadores, quedan listos para efectuar la fusión. Es en esta última parte
donde es posible notar si el rendimiento de protoplastos es aceptable o no. Si el anillo
es delgado o imperceptible, indica una baja producción de protoplastos. Por el contrario
la formación de un anillo grueso, claramente visible, representó un buen rendimiento de
protoplastos.
3.5.5.5 Fusión de protoplastos. A partir de los protoplastos purificados previamente y
que como ya se mencionó, se caracterizaron por formar un anillo de color blanco, en el
caso de los protoplastos de callo embriogénico y un anillo color verde en los
protoplastos de hoja, se procedió a realizar las fusiones empleando la metodología
descrita previamente (Grosser y Gmitter, 1990 a; Olivares-Fuster, 1998). Para ello, se
utilizó una micropipeta, la cual se introdujo primero en el tubo conteniéndo el anillo de
callo embriogénico y con mucho cuidado para no mezclar las capas de sacarosa (abajo)
y de manitol (arriba), separadas por el anillo blanco (callo embriogénico) ó verde
(hojas), se estrajeron los protoplastos y se colocaron en un nuevo tubo conteniéndo 3
ml de medio de cultivo BH3 0.6 M. Enseguida, se hizó lo mismo con el frasco
conteniéndo el anillo verde característico de los protoplastos de hoja. Ambos anillos se
mezclaron perfectamente en la solución nutritiva y posteriormente se centrifugaron por
un minuto a 900 rpm. Después, con mucho cuidado se extrajo el sobrenadante de BH3.
88
Los protoplastos de ambos donadores, se depositaron en el fondo. Notándose a través
del vidrio que el color que predominó en la solución final fue el verde.
Posteriormente, con una pipeta se extrajeron los protoplastos y se colocaron dos gotas
por caja de petri de 60 X 15. Inmediatamente después se adicionaron dos gotas de
polietilenglicol (PEG), para llevar a cabo la fusión química. Previamente el PEG se
preparó colocando 7.0 ml de agua desionizada estéril en un vaso de 100 ml con un
agitador magnético y se añadieron 2.7 g de glucosa; una vez disuelta, se añaden 0.48 g
de cloruro de calcio dihidratado; posteriormente se agregaron 40 ml de la solución stock
del polietilenglicol, se afora a 50 ml y se ajustó el pH a 5.6.
El PEG trabajó por ocho minutos, después se añadieron 3 gotas de la solución A
(Glucosa 0.4 M, CaCl2 66 mM, Dimetil sulfóxido al 10%) y 10 gotas de la solución B
(Glicina 0.3 M). Ambas soluciones se mezclaron inmediatamente antes de usarse para
evitar su precipitación.
Después de un período de incubación en la solución A + B que duró 12 minutos, se
añadieron con cuidado 10-12 gotas de medio de cultivo fresco BH3 0.6 M en la periferia
y alrededor de los protoplastos en fusión. Luego de cinco minutos, con una micropipeta
se extrajo con cuidado, la solución PEG más la solución A+B y el BH3 0.6. Una vez que
estas sustancias se removieron, se adicionaron nuevamente 12 gotas de BH3 por cinco
minutos, después de los cuales se extrajo el BH3 y se sustituyó por otras 12 gotas por
otros cinco minutos. Al final después del tercer lavado se removió el BH3 y se
adicionaron 15 gotas de BH 0.7 al centro y en la periferia. Enseguida se sellaron las
cajitas con cinta aislante Nescofilm y se colocaron dentro de una caja de plástico
herméticamente cerrada, las cuales se mantuvieron en una cámara de crecimiento de
protoplastos en oscuridad a una temperatura de 28°C durante 4 a 6 semanas.
3.5.6 Cultivo y regeneración de protoplastos.
En general, los callos embriogénicos derivados de óvulos en un medio de cultivo líquido
proporcionaron una excelente fuente de protoplastos con totipotencia para regenerar
plantas.
89
Los cultivos de protoplastos de las diferentes combinaciones se revisaron
semanalmente, a partir de las primeras 4 – 6 semanas después de realizada la fusión.
A las 8 semanas aquellas placas o cajas petrí, donde se observaron colonias de células
en crecimiento, se les adicionaron de 10-12 gotas de medio de cultivo fresco en
proporción 1:1:1 (BH3 0.6; EME 0.6 y EME 0.15). Después de otro período de
incubación de 2-4 semanas con menor intensidad de luz, se adicionaron 10-12 gotas
más, solo que esta vez de la mezcla del medio BH3 + EME líquido (MT basal
conteniendo 50 g/l de sacarosa y 0.5 g de malta) en proporción 1:2. Después de 2 a 4
semanas, los cultivos que resultaron extremadamente vigorosos se transfirieron
mediante vaciado de su contenido sobre otro medio de cultivo EME sólido con agar
conteniendo sacarosa o maltosa en placas de 60 X 120. De esta manera, los embriones
se mantuvieron húmedos con la mezcla líquida que se mencionó anteriormente, hasta
que las colonias de callos se adaptaron al ambiente en el medio sólido y se
mantuvieron en el laboratorio bajo condiciones de iluminación a una temperatura de
28°C. A las placas que mostraron colonias con creci miento lento, se les continúo
adicionando 10 a 12 gotas únicamente de medio de cultivo EME cada 2 semanas, hasta
que las colonias de callo embriogénico alcanzaron 1-2 mm de diámetro a partir de
cuando se transfirieron también a un medio sólido conteniendo EME.
La formación de los embriones somáticos ocurrió de manera expontánea generalmente
entre 6 y 14 semanas después del plateo (siembra inicial de los protoplastos). Los
embriones somáticos grandes y bien formados germinaron en un medio de cultivo BH3
en cajas de petrí de 100 X 20 mm. Aquellos embriones somáticos grandes que
requirieron una mayor elongación del eje, se transfirieron a un medio BH3
suplementado con reguladores, para promover la germinación del embrión, crecimiento
del eje y desarrollo de raíces. En el caso de los cultivos que no exhibieron formación de
embrión expontánea, se transfirieron a un medio MT conteniéndo 2% de glicerol como
única fuente de carbono, para inducir la embriogénesis en callos. Así mismo cuando los
embriones que lograron germinar brotes, con una raíz pobre o sín raíz, se disectaron las
masas de crecimiento verde y se transfirieron a un medio de cultivo conteniendo
reguladores de crecimiento y carbón activado en un frasco con fondo hondo apropiado
para la inducción de raíz. Las plántulas que enraizaron se transfirieron a charolas
90
conteniendo peat moss y se aclimataron bajo condiciones de invernadero con un 50%
de sombra y a una temperatura de 28°C y con una alt a humedad relativa.
3.5.7 Selección y verificación de Híbridos Somático s
3.5.7.1 Selección de híbridos somáticos. Para lograr una hibridación somática
exitosa, se requirió de estrategias de selección que permitieran la identificación y
separación de las plantas híbridas somáticas del resto del material, no fusionando
(Grosser y Gmitter, 1989). En comparación con otras plantas, la estrategia de selección
en los cítricos es simple y eficiente.
Los protoplastos derivados de callo nucelar tienen la capacidad de pasar a
embriogénesis somática. Esta característica está bajo el control de genes dominantes y
por eso se puede expresar en productos de fusión, permitiendo la recuperación de toda
la planta. Los protoplastos del segundo donador aislado de tejido no embriogénico, en
este caso hojas jóvenes de plántulas, carecen de capacidad para cultivarse y
regenerarse en un medio de cultivo de protoplastos libre de reguladores. Esto impide la
recuperación de plantas a partir de un progenitor no embriogénico. Manteniendo en
mente este comportamiento, se asumió que las plántulas que logran crecer en el medio
de cultivo, se derivan del donador de callo embriogénico o bien del producto de la
fusión. De esa manera se trataron de identificar las plantas derivadas de callo
embriogénico y que mostraron mayor vigor. El vigor se expresa en la plántulas y más
especiíficamente en las hojas, las cuales cuando son híbridos somáticos tienden a ser
más grandes y de mayor grosor y de diferente morfología que las de callo
embriogénico.
3.5.7.2 Verificación de híbridos. Para confirmar las características del verdadero
híbrido somático se siguió un protocolo que consiste en: a) un análisis de la morfología
foliar, la cual se reporta que generalmente presenta una respuesta intermedia entre
ambos donadores; b) cuantificar el número de cromosomas durante la mitosis ó bien el
nivel de ploidía, el cual en los productos de fusión de dos genotipos diploides tiende a
duplicarse mostrando una característica tetraploide, c) la expresión genética de los
candidatos a híbridos, que se caracterizan por mostrar un perfil de bandeo o
polimorfismo distinto al de los donadores. En el caso de los candidatos a híbridos
91
somáticos intergenéricos, también resultó importante determinar cuales fueron los
organélos celulares que cada progenitor aporta para la integración del nuevo híbrido
somático.
Se partió de la base de que no es aceptado utilizar únicamente una sola de estas
técnicas para identificar a los híbridos somáticos por diferentes situaciones. Así por
ejemplo, se ha encontrado que la identificación de híbridos somáticos de Citrus con
parientes cercanos de otros géneros, es simple debido a que las diferencias en los
caractéres morfológicos de cada donador son muy obvias. Sin embargo, suele resultar
una morfología vegetativa intermedia en casos donde las plantas regeneradas son
originadas de productos de fusión de protoplastos, en las que ha ocurrido la eliminación
de una cierta cantidad de cromosomas antes o después de la fusión. El contéo del
número de cromosomas puede indicar que se trata de un individuo tetraploide, sin
embargo comúnmente se desarrollan tetraploides provenientes de un mismo individuo,
no fusionado que puede corresponder al donador de callo embriogénico.
Así mismo, las técnicas moleculares aunque son muy sensitivas, no distinguen si una
planta regenerada corresponde a una quimera multicelular o realmente es un híbrido
somático. Por lo tanto, para evitar dudas en este estudio se aplicaron los tres tipos de
pruebas y con esta información en su conjunto se obtuvo una conclusión definitiva.
3.5.7.3 Evaluación de la morfología de la hoja. Las plantas escogidas para
corroborrar si erán o nó híbridas somáticas se crecieron en el invernadero plantadas en
charolas de 30 cm de longitud por 11 cm de ancho. Cuando alcanzaron una altura
mínima de 35-50 cm, se seleccionaron hojas expandidas bien desarrolladas del
penúltimo brote, las cuales se utilizaron de referencia para comparar su morfología en
relación con la morfología de los dos progenitores. Las hojas de los progenitores
también se tomaron de plantas jóvenes desarrolladas en macetas de 15 litros,
seleccionando los brotes terminales maduros, como punto de muestreo. En el caso de
las plántulas que provienen de fusiones que mostraron un lento crecimiento y
regeneración, no fue posible tener hojas con las características apropiadas antes de
terminar la estancia de investigación y por lo tanto no se reportan los resultados
relacionados a esta variable.
92
Híbridos intergenéricos: Para la identificación de los híbridos somáticos intergenéricos
se buscaron principalmente las diferencias morfológicas de las hojas entre las
características de los progenitores y del híbrido somático, tales como tamaño, forma y
grosor de la hoja
Híbridos interespecíficos: En el caso de los híbridos somáticos interespecíficos,
además de las diferencias morfológicas entre las hojas, se buscaron también las
diferencias en características específicas y más sútiles, como son el tamaño de las alas,
de los pecíolos, la forma, grosor y la intensidad de coloración verde de las hojas.
3.5.7.4 Determinación del nivel de ploidía. El análisis del nivel de ploidía se realizó
con la ayuda de un citometro de flujo Ploidy Analyzer (PA) (Partec, Münster Germany),
después de que se practicó el aislamiento de núcleos y tinción del ADN con el colorante
fluorescente DAPI (4’, 6-diamino-2-fenilindol, lmax = 340 nm, lmax cm = 465 nm). El
citometro de flujo estaba equipado por una lámpara de mercurio HBO 100W y filtros
KG1 y BG38 (Partec, Münster, Germany).
Con este equipo se analizaron conjuntamente fragmentos de hoja de la planta a evaluar
como híbrido somático (candidato a ser tetraploide) y de uno de los progenitores
empleado como fuente donadora de callo embriogénico ó de protoplastos de hoja
(diploide). Con una navaja se disectaron pequeños pedacitos de hoja en presencia de
una solución para el aislamiento de núcleos (High resolution DNA Kit type P, solution A;
Partec, Münster, Germany). Después de 30 segundos de incubación, se filtró la muestra
a través de una malla de 20 µm y se añadió 1.5 a 2.0 veces el volumen que contenían
los núcleos más la solución de colorante ADN-DAPI (High resolution DNA Kit type P,
solution B; Partec, Münster, Germany). Se tomaron aproximadamente 2 ml de la
solución de núcleos teñidos y se analizaron en el citómetro de flujo.
Utilizando un programa de informática DPAC V 2.0 (Partec, Münster, Germany)
incorporado en el propio citómetro, se obtuvo un histograma que registró el número de
células por mililitro. Para cada muestra analizada este programa determinó la posición
de los picos, el coeficiente de variación del análisis y el índice de ploidía relativo a las
muestras analizadas.
93
La citometría de flujo tiene las siguientes ventajas sobre los procedimientos
convencionales de microscopio para determinar el nivel de ploidia en las células: es
excepcionalmente rápido, seguro, sensitivo y práctico. La única desventaje es que
requiere del análisis de la suspensión de células por individuo (Galbraith et al., 1983).
3.5.7.5 Marcadores genéticos
3.5.7.5.1 Extracción del ADN: Para extraer el ADN se obtuvieron muestras de
hojas tomadas de brotes jóvenes de las plantas híbridas somáticas así como también
de los progenitores donadores de protoplastos de hoja y donadores de callo
embriogénico. Para extraer el ADN de las hojas se utilizó el kit GenElute Plant Genomic
DNA por Sigma. Esta técnica consiste en cinco pasos que se mencionan a
continuación:
a) Liberación del ADN de las hojas. Se utilizaron tubos Eppendorf de 2.5 ml,
dentro de los cuales se colocó el tejido foliar de interés, posteriormente el tejido fue
congelado con Nitrógeno líquido e inmediatamente después se molió la muestra con
palillos de madera, previamente esterilizados. Se obtuvieron alrededor de 100 mg de
material vegetal en forma de polvo, posteriormente se agregaronn 350 µm de la
solución Buffer A y 50 ml de la solución buffer B para liberar el ADN. Al adicionar la
solución buffer B, se formó una precipitando color blanco. Luego la muestra se agitó
vigorosamente por un minuto para mezclar el contenido. Enseguida los tubos con la
muestra se colocaron en incubación por 10 minutos a una temperatura de 65°C con
esto el precipitado se disolvió.
b) Eliminación de residuos. Al salir de la incubadora se agregaron 130 µl de
solución de precipitación, se invirtió varias veces para homogeneizar la solución y se
incubó por cinco minutos en hielo. Posteriormente la muestra se centrifugó a 3,000 rpm
por cinco minutos, después de los cuales en el fondo se depositaron los residuos del
material vegetal junto con proteínas y polisacáridos. El sobrenadante líquido se extrajo
con una pipeta estéril y se transfirió a otro tubo Eppendorf de color azul con una
columna para filtrado especial, el cual forma parte del kit. Se centrífugó por un minuto y
se desechó el filtro especial y se conservó el líquido.
94
c) Retención del ADN en la columna. Al líquido anterior se le agregaron 700 µl de
la solución para retener el ADN, se mezcló invirtiendo varias veces el tubo. Enseguida
se extrajeron 200 µl de la mezcla y se pasaron a través de la columna de retención de
ADN, la cual no tiene color. Se centrífugó por un minuto, se descartó el líquido y se
repitió la transferencia de la solución remanente a través de la columna y se eliminó el
líquido. Luego la columna de retención se transfirió a otro nuevo tubo.
d) Lavado para eliminar contaminantes. Se agregaron 500 µl de una solución a
base de agua estéril para limpiar la columna. Se centrífugó por un minuto y se transfirió
la columna a un nuevo tubo. Se lavó por segunda ocasión con otros 500 µl de la
solución de lavado y se centrífugó por 1 minuto.
e) Purificación del ADN liberado. La columna de retención del ADN se transfirió a
un nuevo tubo y luego se añadieron 100 µl de solución buffer TE, usada para liberar el
ADN. Previamente la solución buffer se colocó en baño maria a una temperatura de
65°C. Se centrífugó por un minuto. Se repitió este paso por segunda vez y luego se
eliminó la columna-filtro y se conservó el líquido con el ADN purificado.
Una vez obtenido el ADN se guardó en el refrigerador a 4°C, hasta que se utilizó para
las pruebas moleculares. Este kit, está diseñado para que el ADN permanezca siempre
en solución, evitando problemas de resuspensión. Pero si fuera necesario concentrar el
ADN, es posible lograr su precipitación en etanol en presencia de acetato de sodio.
3.5.7.6 Pruebas de PCR. Las pruebas de PCR-RAPD fueron ejecutadas utilizando un
Termociclador de ADN Perkin modelo 480 (Perkin Elmer Corp. USA). Para la reacción
de PCR se utilizaron tubos Eppendorf de 2.0 ml en los cuales se preparó una solución
master conteniendo 23 µl compuesta de la siguiente manera: 17.4 µl de agua
desionizada estéril, 2.5 µl de dNTP, 2.5 µl de solución buffer, 0.3 µl del iniciador y 0.3 µl
de la enzima de ADN Taq polimerasa de Promega Corporation. La mezcla de dNTP
(Deoxi nucleótido) fabricado por Eppendorf, estuvo compuesta de dATP, dCTP, dGTP y
dTTP, a la concentración de 10 mM cada una y con pH de 7.0. Una vez preparada la
muestra, se colocaron los 23 µl de la solución en pequeñas mini charolas de plástico
(Falcon) y se agregaron 2 µl más de ADN de la muestra de interés, agitando con una
95
micropipeta para homogenizar la solución. Todo este procedimiento se realizó
manteniendo todas las soluciones, enzimas y reactivos sobre hielo. Finalmente la
charolita conteniendo las soluciones para la reacción, se colocaron sobre el
Termociclador y se agregaron 2 gotitas de aceite para evitar la evaporación y se ejecutó
el programa.
Programas utilizados
PCR: Para la verificación de la mayoría de los materiales se utilizó un programa de
PCR implementado por la Universidad de Florida, denominado JLKK. Este programa
considera para la ampliación del ADN el siguiente proceso: un ciclo de 2 minutos a
94°C, un minuto a 94°C, un minuto a 42°C, dos minut os a 72°C seguido de 34 ciclos de
un minuto a 94°C, 10 minutos a 72°C para la extensi ón final y remojar a 4°C. Los
iniciadores que se evaluaron, así como sus respectivas secuencias nucleotidas fueron
como sigue: C-11 (AGGTACGCCCGA), C-64 (CCAGATCCGAAT), OPAQ-01
(GGCAGGTGGA), OPAQ-02 (ACCCTCGGAC), OPAQ-03 (GAGGTGTCTG), OPAQ-06
(ACGGATCCCC) todos ellos fabricados por Operon Technologies.
PCR-ISSR (Secuencia intersimple repetida). En algunos experimentos para ciertos
híbridos somáticos interespecíficos en conflicto, fue necesario realizar esta prueba de
PCR-ISSR para lo cual se empleo el programa siguiente: Un ciclo de 3 minutos a 94°C,
un ciclo de 45 segundos a 94°C, un ciclo de 30 segu ndos a 53°C, un ciclo de 2 minutos
a 72°C, seguido de 28 ciclos de 45 segundos a 94°C, un ciclo de 6 minutos a 72°C y
remojar a 4°C por tiempo necesario, el cual fue sug erido por Scareno et al. (2000). En
este caso se utilizaron los siguientes iniciadores: AG8YT, AG8YG, HVHTCC5 y BDB-
TCC5 cuyas secuencias nucleótidas fueron como sigue: AGAGAGAGAGAGAGAGYT,
AGAGAGAGAGAGAGAGYG, HVHTCCTCCTCCTCCTCC y BDBTCCTCCTCCTCCTCC
respectivamente, de Operon Technologies Inc. USA.
En los resultados se reportan únicamente los pérfiles de bandeo con los iniciadores que
mostraron el mayor y mejor polimorfismo.
3.5.7.7 Prueba de la herencia de orgánelos. En el caso de las fusiones entre
genotipos de distinto género al Citrus, se hizo la prueba para determinar cual de los dos
96
progenitores son los responsables de la aportación en el híbrido somático de las
mitocondrias que provienen del núcleo y cual de los cloroplastos que están en el
citoplasma. Esta aportación de orgánelos frecuentemente se reporta como herencia de
orgánelos (Moreira et al., 2000 a, 2000 b; Cabasson et al., 2001; Cheng et al., 2003;
Kumar y Cocking, 1987).
Antes de realizar la digestión del ADN y corte con las enzimas de restricción
endonucleasas Taq I, para determinar de cual progenitor donador proviene el ADN
mitocondrial nuclear (ADNmt) en los híbridos somáticos, se efectúo una prueba de PCR
para determinar la presencia de ADN en las muestras utilizando los iniciadores
específicos para esta prueba. Para ello se seleccionaron tubos Eppendorf de 1.0 ml en
los cuales se preparó una mezcla de 50 µl de dNTP, 5 µl de la solución amortiguadora,
0.4 µl de Taq y 0.4 µl de cada uno de los siguientes dos iniciadores N4E2 y N4E1; y 3.0
µl de ADN de la muestra.
Se corrió un gel de electróforesis en agarosa al 1%, cargando con 10 µl de la muestra
de 50 ml preparada anteriormente. Una vez corroborada la presencia de ADN en las
muestras, se procedió a hacer la digestión enzimática. La solución para la reacción de
la digestión se preparó como sigue: Se mezclaron 0.5 µl de la enzima Taq I (New
England Biolabs INC), 2.5 µl de la solución buffer Taq I y 17.0 µl de agua y finalmente 5
µl del ADN del genotipo de interés. Posteriormente los tubos se colocaron en una
incubadora Tropicooler Bockel Scientific Modelo 260014, a una temperatura de 65°C.
Los pares de iniciadores que se utilizaron para esta prueba fueron n1eB + n1eC cuyas
secuencias nucleótidas 5’ a 3’ fueron: GCATTACGATCTGCAGCTCA y
GGAGCTCGATTAGTTTCTGC; N4E2 + N4C1 con sequencias
CAGTGGGTTGGTCTGGTATG y TCATATGGGCTACTGAGGAG y finalmente 18SrRNA +
5SrRNA cuyas secuencias son GTGTTGCTGAGACATGCGCC y
ATATGGCGCAAGACGATTCC. Todos estos iniciadores se obtuvieron de Operon
Technologies Inc. Debido a que los mejores resultados se tuvieron con estos dos
últimos, los resultados de estos estudios se reportan únicamente con los patrones de
bandeo generados en base a ellos.
97
Se siguió un procedimiento similar para conocer la herencia del ADN de los cloroplastos
del citoplasma (ADNcp). Solo que en este caso, para las combinaciones intergénericas
entre Amblycarpa y los naranjos trifoliados se intentaron cuatro pares de iniciadores
(rbeL-rbcL, rbcL-PSAI, TNR-TrnK y TrnD-TrnT) y se cortó con Taq I, aunque
únicamente con Trn-D–TrnT se observaron diferencias. Así mismo, para las
combinaciones intergenéricas entre Macrofila y materiales trifoliados se utilizan los
iniciadores rbcL-PSAI.
3.5.8 Electroforesis
En el caso de las pruebas de PCR, los productos de la reacción amplificados fueron
separados en geles de agarosa al 1% los cuales contenían solución buffer IX TAE y se
tiñeron con 0.5 µg/ml de bromuro de etidio. Los patrones de bandeo fueron observados
bajo luz ultravioleta a 70 V. En el caso de las pruebas con ISSR para los geles se utilizó
Metaphoragarosa al 2%.
98
IV. RESULTADOS
4.1 Experimentos de aislamiento y purificación de protoplastos
Los resultados de los trabajos sobre aislamientos y purificación de protoplastos
efectuados con el fin de incrementar el rendimiento de protoplastos se presentan a
continuación.
4.1.1 Experimento 1: Intervalo de tiempo óptimo de incubación
Los portainjertos tuvieron un distinto comportamiento en cuanto al rendimiento de
protoplastos de callo embriogénico. Amblicarpa, requirió únicamente de ocho horas de
incubación para soltar la mayor cantidad de protoplastos (2.1 x 106 protoplastos/ml)
(Figura 1). Por lo general, el tiempo de incubación otorgado para este material es de 16
a 24 horas, con rendimientos de protoplastos bastante aceptables. Sin embargo, la
probabilidad de éxito en la fusión podría aumentar, si se reduce el tiempo de
incubación. Contrariamente el portainjerto Macrofila requirió más de 24 horas de
incubación para lograr una máximo rendimiento de protoplastos (1.5 x 106
protoplastos/ml). Volkameriana resultó intermedio entre estos dos portainjertos y su
período óptimo de incubación se estableció en 24 horas. Considerando estos
resultados, con fines prácticos, se determinó en lo sucesivo otorgar 12 horas de
incubación para Amblicarpa y 24 horas a Macrofila. La incubación de Macrofila por más
de 24 horas permitió una aceptable producción de protoplastos, pero con un alto riesgo
de pérdida de su viabilidad ya que esta disminuye con el tiempo.
Figura 1. Rendimiento de protoplastos de callo embr iogénico de tres portainjertos
sometidos a diferentes períodos de incubación (Prot oplastos• 10 6/ml)
8 16 24 328 16 24 32
Volkameriana Amblicarpa
Macrofila
Tiempo de incubación (Horas)
1.8
1.6 1.4 1.0
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 P
roto
plas
tos
x 10
6 m
l
Pro
topl
asto
s X
10
6 ml
99
4.1.2 Experimento 2: Determinación de la óptima con centración del medio de
cultivo líquido.
En relación a la concentración del medio de cultivo BH3, los callos embriogénicos tanto
de Macrofila como de Volkameriana, produjeron mayor cantidad de protoplastos al usar
BH3 en concentración de 0.8 y 0.9 M que con 0.6 M (Figura 2). Por lo tanto, en trabajos
futuros cuando se utilice a estos portainjertos para fusión de protoplastos podrían
intentarse concentraciones más altas. Cabe hacer notar que en ensayos previos, al
utilizar BH3 al 0.6 M durante el aislamiento de protoplastos, se indujo una baja tasa de
fusiones, por lo que se esperaría aumentar el número de fusiones éxitosas al utilizar
BH3 al 0.8 ó 0.9 M en el caso específico de Macrofila.
Figura 2. Rendimiento de protoplastos de callo embr iogénico de dos portainjertos: A)
diferentes concentraciones de medio de cultivo BH 3; B) diferentes concentraciones de
sacarosa durante el aislamiento (Protoplastos • 10 6/ml).
4.1.3 Experimento 3. Efecto del medio de cultivo so bre el rendimiento de
protoplastos durante la incubación:
El uso del medio de cultivo EME al 0.146 M ó la combinación de EME 0.146 M + BH3
0.6 M, no mejoró el rendimiento de protoplastos de callo embriogénico de Macrofila en
comparación con el uso únicamente del medio BH3, 0.6 M (Cuadro 13). Así que en los
trabajos subsecuentes donde se utilizó callo de Macrofila se recurrió al uso de BH3 0.6
M como medio de cultivo.
0.6 0.7 0.8 0.9
MacrofilaVolkameriana
|
8.75 17.5 25 35
Macrofila
Concentración de BH3 M Concentración de Sacarosa (%)
1.8 1.6
1.4
1.2 0.0
1.8
1.6
1.4 1.2 0.0
A
B
Pro
topl
asto
s X
10
6 m
l
B
Macrofila
100
Cuadro 13. Rendimiento de protoplastos de callo emb riogénico de Macrofila y
Volkameriana en diferentes medios de cultivo durant e la incubación.
Medio de Cultivo Protoplastos• 106 / ml
Macrofila Volkameriana BH3 0.6 M
EME 0.6 M + BH3 0.6 M (1:1)
EME 0.6 M + BH3 0.6 M (2:1)
EME
1.40 a
1.16 b
1.20 b
1.12 b
1.25 a
--
--
0.9 b
Valores con letras distintas dentro de columna son diferentes (Tukey P = 0.05).
4.1.4 Experimento 4. Concentración de sacarosa.
La concentración más alta de protoplastos se registró al utilizarse sacarosa al 25% en
comparación con concentraciones más bajas y superiores a este valor (Figura 2).
Por ello podría considerarse que la concentración óptima de sacarosa a usar durante la
purificación de protoplastos es del 25%, lo que confirma lo reportado previamente por
Grosser y Gmitter (1990 a). Por tal motivo esta concentración es la que se utilizó en los
estudios posteriores.
4.1.5 Efecto del tiempo y velocidad de la centrifug ación durante el proceso de
purificación de protoplastos
Duración de centrifugación: En el Cuadro 14, se puede apreciar que no hubo
diferencia entre tratamientos en cuanto al rendimiento de protoplastos. En este sentido
resulta lo mismo utilizar períodos de tiempo de 5 a 15 minutos durante aplicación de la
primera y segunda centrífuga, efectuada previa a la purificación de los protoplastos.
En los siguientes trabajos se optó por aplicar períodos de centrifugación de 10 + 10
minutos para la primera y segunda centrífuga respectivamente, tal como lo realizan
Grosser y Gmitter, (1990 a).
101
Cuadro 14. Tiempo de centrifugación para la purific ación de protoplastos de callo
embriogénico de Macrofila durante la purificación.
Tratamiento T i e m p o (min) Rendimiento
(Protoplastos/ml) 1ª 2ª
1
2
3
4
5
6
5
10
15
10
10
10
+
+
+
+
+
+
10
10
10
5
10
15
1.66 X 10 6
1.62 X 10 6
1.80 X 10 6
1.78 X 10 6
1.62 X 10 6
1.45 X 10 6
Velocidad de centrifugación: En el Cuadro 15 se puede apreciar que no existe
diferencia entre las distintas velocidades de centrífuga aplicada durante la purificación
de protoplastos. Sin embargo, al comparar todos los tratamientos con el testigo se
observa con claridad que la aplicación de centrífuga disminuye fuertemente la cantidad
de protoplastos. En base a este resultado se optó en lo sucesivo, por aplicar la misma
velocidad de centrífuga (900 rpm) que se utiliza en otros laboratorios (Grosser y
Gmitter, 1990 a; Olivares-Fuster, 1998).
Cuadro 15. Velocidad de centrífugación durante el p roceso de purificación de los
protoplastos de callo embriogénico de Macrofila.
Tratamiento Velocidad (rpm) (x)
Rendimiento (protoplastos/ml)
1
2
3
4
0
500
700
900
1100
0
0.90 X 10 6 b
0.66 X 10 6 b
0.68 X 10 6 b
0.70 X 10 6 b
3.17 X 10 6 a
(x) = El tiempo de aplicación de centrífuga fue de 10 + 10 minutos.
102
4.2 Experimentos sobre fusión de protoplastos para obtención de híbridos
somáticos.
4.2.1 Experimento 1. Híbridos intergenéricos entre Amblicarpa y variedades de
Poncirus trifoliata.
4.2.1.1 Recuperación y regeneración de híbridos. Para la mayoría de las
combinaciones, las eficiencias de plateo fueron tan altas que los callos embriogénicos
cubrieron toda la superficie del plato. Después de 4-8 semanas en un medio de cultivo
sólido, se comenzaron a producir embriones somáticos globulares verdes en forma de
torpedo y corazón, los cuales se transfirieron a un medio para su crecimiento. La
formación y crecimiento de los embriones ocurrió rápidamente para las tres
combinaciones Amblicarpa + Citranges (Benton, Carrizo y C-35) y para Amblicarpa +
Flying Dragon. La recuperación y tasa de crecimiento de los embriones para las
combinaciones Amblicarpa + Sofd y Amblicarpa + Rubidoux fue menos eficiente y por
ello requirieron mayor tiempo adicional. En todas las combinaciones los embriones
anormales se cultivaron en medio DBA3, (Cuadro 16) donde produjeron múltiples
raíces. En las seis combinaciones se recuperaron numerosas plantas parentales, las
cuales se aclimatizaron sin problema siguiendo las indicaciones descritas previamente
por Grosser y Gmitter, (1990 a).
De las combinaciones intentadas entre el mandarino Amblicarpa como donador de
protoplastos de callo embriogénico y las diferentes variedades e híbridos del género
Poncirus trifoliata, las que resultaron híbridos somáticos fueron Amblicarpa (Citrus
amblicarpa) + C-35; (C. sinensis x Poncirus trifoliata variedad C-35); Amblicarpa (C.
amblycarpa) + Flying Dragon (Poncirus trifoliata variedad Flying Dragon); Amblicarpa
(C. amblycarpa) + Benton (C. sinensis x Poncirus trifoliata cv. Benton), Amblicarpa (C.
amblycarpa) + Rubioux (P. trifoliata variedad Rubidoux), Amblicarpa (C. amblycarpa) +
Carrizo (C. sinensis x Poncirus trifoliata cultivar Carrizo) y Amblicarpa (C. amblycarpa) +
Sofd (C. aurantium + P. trifoliata). De estos materiales cinco fueron tetraploides
producto de fusiones entre materiales diploides. En tanto que la combinación
Amblicarpa + Sofd fue hexaploide, el cual se obtuvo por la fusión de un diploide (C.
amblycarpa) más un tetraploide (C. aurantium + P. trifoliata).
103
Cuadro 16. Medio de cultivo DBA3 utilizado para el enraizado de embriones in
vitro.
Ingredientes Compuesto Cantidad por litro
M7acronutrientes
NO3NH4
KNO3
MgSO4 x 7 H2O
KH2 PO4 (monobásico)
KH2 PO4 (dibásico)
82.5 g
95.0 g
18.5 g
7.5 g
1.0 g
9Micronutrientes
H3BO3
MnSO4 x H2O
ZnSO4 x 7H2O
KI
Na2MoO4 x 2H2O
CuSO4 x 5H2O
CoCl2 x 6H2O
0.62 g
2.23 g
0.86 g
0.083 g
0.025 g
0.0025 g
0.0025 g
Fierro Na2EDTA
FeSO4 x 7H2O
7.45 g
5.57 g
Vitaminas
Mio – inositol
Tiamina - HCl
Piridoxina – HCl
Acido nicotínico
Glicina
10.0 g
1.0 g
1.0 g
0.5 g
0.2 g
Calcio CaCl2 x 2H2O 29.33 g
Agua de coco 20 ml
Sacarosa 25 g
Estracto de malta 1.5 g
2,4-d (x) 10 ml (usando una
solución base de 1 mg/ml).
6 bap (y) Bencil adenino purina 3.0 ml (usando una
solución base de 1 mg/ml).
Agar 8.0 g (x) = 2,4-D = 0.01 mg/l (concentración final) (y) = BAP = 3 mg/l (concentración final)
104
4.2.1.2 Morfología foliar. Todas las combinaciones mostraron la típica forma de la hoja
de los materiales trifoliados, lo cual es una característica distintiva de la gran mayoría
de variedades parientes del Poncirus trifoliata y sus híbridos (Figuras 3 y 4). Aunque
fueron pocas, en cada combinación hubo plantas que expresaron la morfología
unifoliada muy similar a las hojas del mandarino Amblicarpa, lo cual es indicativo de que
estas plantas se regeneraron a partir de células no fusionados del progenitor de callo
embriogénico. Excepto las combinaciones de Amblycarpa + Flying Dragon y Amblicarpa
+ Rubidoux que no mostraron plantas unifoliadas, las hojas de la mayoría de los
híbridos somáticos mostraron una morfología intermedia entre los dos progenitores.
4.2.1.3 Nivel de ploidia. En las Figuras 5, 6 y 7 se presentan los resultados registrados
con el citómetro de flujo en relación al nivel de ploidía mostrado por los híbridos
somáticos. Con excepción de una combinación, todas las demás mostraron dos picos
sobre el eje horizontal de la gráfica. El primero corresponde a la cantidad de núcleos
registrados por el citómetro para el material diploide utilizado como testigo en este caso
Amblicarpa y el segundo para los híbridos somáticos, los cuales muestran el doble de
núcleos equivalentes a individuos tetraploides. Unicamente la combinación Amblicarpa
+ Sofd (Figura 6), mostró tres picos que corresponden el primero al testigo diploide
(Amblicarpa), el segundo es un testigo triploide (Limón Persa) y el tercero corresponde
al híbrido somático hexaploide.
Estos análisis realizados con el citómetro de flujo confirman el nivel de ploidía que se
suponía que deben tener las plantas regeneradas a partir de las fusiones entre estos
materiales intergénericos. Los valores de coeficiente de variación en cuatro de los cinco
tetraploides fue muy bajo, inferior al 6%. En tanto que para Amblicarpa + Rubidoux y
para el hexaploide se registraron valores de coeficiente de variación de 12.1 y 10.6
respectivamente.
A las combinaciones híbridas somáticas obtenidas les correspondieron valores de 33.5
a 35.4 y de 50.2, lo que índica que por contener el doble y triple de ploidia con respecto
al testigo, estos materiales se ubican como tetraploides y hexaploides respectivamente,
y confirma que efectivamente estas plantas son diferentes a los progenitores.
105
Figura 3. Forma de las hojas de los híbridos somát icos (al centro) tetraploides obtenidos
de las combinaciones de mandarino Amblicarpa ( Citrus amblycarpa ) y dos Citranges (C-
35 y Benton) en comparación con las hojas de los ma teriales parentales donadores de
callo embriogénico (izquierda) y de protoplastos de hoja (derecha).
Amblicarpa + C - 35
Amblicarpa + Benton
Amblicarpa
C - 35
Amblicarpa
Benton
106
Figura 4. (A). Morfología de las hojas del híbrido somático Amblicarpa + Flying Dragon y
sus respectivos progenitores: Amblicarpa y Flying D ragon. (B). Morfología foliar de seis
híbridos somáticos. En la hilera de arriba de izqui erda a derecha: Rubidoux, Carrizo,
benton Sofd, Sofd (4x), C-35, Flying Dragón; Abajo: Amblicarpa + Rubidoux, Amblicarpa +
carrizo, Amblicarpa + Benton (4x), Amblicarpa + Ben ton (6x), Amblicarpa + Sofd (4x) (la
hoja más pequeña en el centro), Amblicarpa + C-35, Amblicarpa + Flying Dragon y
mandarino Amblicarpa (unifoliado).
Amblicarpa + FD
A
Amblicarpa Flying Dragon (FD)
B
107
Figura 5. Nivel de ploidía de los híbridos somáticos intergen éricos Amblicarpa +
Citrange C-35 y Amblicarpa + Citrange Benton con ci tometría de flujo. Partec, Münster,
Alemania.
Amblicarpa + C – 35
Amblicarpa + Benton
108
Figura 6. Nivel de ploidía de los híbridos somáticos intergen éricos Amblicarpa + Flying
Dragon (FD) y Amblicarpa + Sofd. Determinación con citometría de flujo. Partec, Münster,
Alemania. Sofd = Naranjo agrio + Flying Dragon.
Amblicarpa + FD
Amblicarpa + Sofd
109
Figura 7. Nivel de ploidía registrado por los difer entes híbridos somáticos Amblicarpa +
Naranjo trifoliado Rubidoux y Amblicarpa + Citrange Carrizo. Determinación con
citometría de flujo. Partec, Münster, Alemania.
Amblicarpa + Rubidoux
Amblicarpa + Carrizo
110
4.2.1.4 Análisis de PCR. Se efectuaron las pruebas de PCR con el fin de eliminar
cualquier sospecha de que los híbridos somáticos tetraploides pudieron haber resultado
de fusiones de células del mismo callo embriogénico, situación que ocurre con
frecuencia y que se reportan como autotetraploides. En las Figuras 8 y 9 se presentan
los datos de los patrones de bandeo que mostraron, tanto los híbridos somáticos como
los progenitores donadores de hoja y de callo embriogénico. Utilizando el iniciador C-
11, se encontró que la combinación Amblicarpa + C-35 (Figura 8), mostró un patrón de
bandeo en el que se observan fragmentos de ADN que no están en ninguno de los
progenitores (líneas 2 y 4), así como otros fragmentos de los híbridos que si están en
los progenitores, lo que índica que hay contribución genética de ambos progenitores
para la formación del híbrido somático y que a su vez éste mostró un polimorfismo
distinto a los dos progenitores. Similarmente la combinación Amblicarpa + Benton
(Figura 8) originó un patrón de bandeo diferente al de sus progenitores aunque varios
de los fragmentos de estos últimos compartieron posiciones similares al híbrido
somático.
Figura 8. Los patrones de bandeo en las líneas 2, 3 y 4 (iniciador C-11) y 10, 11 y 12
(iniciador C – 64) corresponden a C-35, Amblicarpa + C-35 y Amblicarpa respectivamente.
Mientras que en la línea 5, 6 y 7 (iniciador C-11) y 13, 14 y 15 (iniciador C-64) se ubican
Amblicarpa + Benton, Benton y Amblicarpa. El marcad or de referencia fue de 100 pares
de bases.
C - 11 C - 64
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
111
En la misma Figura 8, se presentan los resultados de las pruebas de PCR para estas
mismas combinaciones utilizando otro diferente iniciador el C-64 obteniéndose
resultados similares que con el iniciador C-11, en el sentido de que los híbridos
somáticos presentan distinto perfil molecular al de su progenitor, pero que comparten
con ellos algunos fragmentos.
En la Figura 9, se observa que las combinaciones Amblicarpa + Flying Dragon (línea 3)
y Amblicarpa + Sofd (línea 5) mostraron un polimorfismo que fue diferente al que
registraron los progenitores, tanto con el iniciador C-11 como con el C-64. En el caso
del híbrido Amblicarpa + Sofd al utilizar el iniciador C-11 se observó que el perfil
molecular en el carril 5 es muy similar al perfil del progenitor Sofd en el carril 6, ya que
comparten muchos fragmentos similares.
Sin embargo, aunque es algo tenue, aparece un fragmento más en el patrón de bandeo
del híbrido somático en comparación con el progenitor Sofd. Este fragmento es una
contribución del patrón Amblicarpa (Figura 9). Sin embargo, para despejar cualquier
duda, al utilizar el iniciador C-64, claramente se obtienen perfiles de bandeo muy
distintos entre el híbrido somático de Amblicarpa + Sofd y sus respectivos progenitores,
notándose la contribución de dos fragmentos de Amblicarpa (uno algo tenue) y dos del
progenitor Sofd en el nuevo híbrido y además de tres fragmentos de ADN que son
compartidos por ambos progenitores y el híbrido somático (Figura 9).
Finalmente en la Figura 10, se reportan los geles correspondientes a los patrones de
bandeo de los híbridos somáticos Amblicarpa + Carrizo y Amblicarpa + Rubidoux,
notándose que en ambos casos se observan los fragmentos de ADN aportados por
cada uno de los dos progenitores, para la integración del nuevo híbrido. También en
estos híbridos se observó que los patrones de bandeo son distintos a los que presentan
los materiales progenitores. Con estas pruebas se confirma plenamente que se tienen
cinco nuevos materiales híbridos somáticos intergénericos tetraploides entre el
mandarino Amblicarpa y variedades de Poncirus trifoliata e híbridos, los cuales no están
reportados en la literatura, un hexaploide entre Amblicarpa y Sofd. Todos estos nuevos
híbridos tienen potencial de uso como portainjertos de especies de cítricos,
especialmente para el limón Mexicano en el trópico.
112
Figura 9. Polimorfismo mostrado por los materiales Flying Dragon, Amblicarpa + Flying,
Dragón y Amblicarpa ubicados en las líneas 2, 3, 4 (C-11) y también en 12, 13 y 14 (C-64)
respectivamente; así como Amblicarpa + Sofd y Sofd en las líneas 5 y 6 (iniciador C-11) y
15 y 16 (iniciador C-64) respectivamente. El marcad or de referencia es de 100 pares de
bases (carriles 1 y 11).
Figura 10. Patrones de bandeo RAPD de dos híbridos intergenéricos y sus genotipos
parentales. Productos amplificados por los ind icadores C-11 (Gel lado izquierdo) y C
– 64 (Gel lado derecho). Marcador 1 Kb (línea 1 y 8 ); Rubidoux (líneas 2 y 9 ); Amblicarpa
+ Rubidoux (líneas 3 y 10); Amblicarpa (líneas 4, 7 , 11 y 14); Amblicarpa + Carrizo (líneas
5 y 12); Carrizo (líneas 6 y 13).
C - 11 C - 64
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
C - 11 C - 64
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
113
4.2.1.5 Herencia de organelos. Mitocondrias. El ADN de cuatro de las seis
combinaciones que fueron corroboradas como híbridos somáticos intergenéricos a
través de las pruebas previas de PCR, fue sometido a una digestión con enzimas de
restricción endonucleasas para averiguar la herencia mitocondrial de los orgánelos. En
las Figuras 11, 12 y 13 se presentan los patrones de bandeo que resultaron de las
pruebas de herencia de orgánelos entre los materiales intergenéricos C. amblycarpa y
P. trifoliata e híbridos. Unicamente en las combinaciones Amblicarpa + Rubidoux y
Amblicarpa + Carrizo no se efectuaron este tipo de pruebas. Aunque las pruebas se
efectuaron utilizando cuatro pares de iniciadores, los resultados más claros se
obtuvieron para las combinaciones Amblicarpa + Sofd, Amblicarpa + Flying Dragon,
Amblicarpa + C-35 y Amblicarpa + Benton, con los iniciadores 5SRNA y 18SrRNA.
Figura 11. Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADN mt) en los híbridos somáticos
Amblicarpa + C-35 (carril 3) y Amblicarpa + Rubidou x (carril 7). Los progenitores se
localizan en los carriles 2, 4, 6 y 8. El marcador se ubica en el carril 5.
En Figuras 11, 12 y 13 se observa que el polimorfismo de los fragmentos desplegados
en el gel de electróforesis del híbrido somático, fue similar al del progenitor de callo y
ambos diferentes al patrón de bandeo del progenitor de protoplastos de hoja. Este
resultado es una prueba clara de que el ADN de la mitocondria nuclear en el híbrido
somático proviene del progenitor donador de protoplastos de callo embriogénico.
C – 35 Amb + C-35 Amb
Rubidoux Amb + Rub Amblicarpa
1
2
3
4
5
6
7
8
114
Figura 12. Detección de ADN mitocondrial (ADN mt) en los híbridos somáticos de
Amblicarpa + Citranges (carriles 3 y 7) y sus respe ctivos progenitores colocados en los
carriles 2, 4, 6 y 8. En los carriles 1 y 5 se ubic an los marcadores.
Figura 13. Polimorfismo del ADN mitocondrial (AND m t) mostrado por el híbrido somático
tetraploide Amblicarpa + Flying Dragon y un híbrido somático hexaploide Amblicarpa +
Sofd (arriba carril 2). En los carriles 1, 3 y 6 se colocaron los progenitores y en el 4 y 5 los
marcadores 100 pb.
Benton Amb + Benton Amblicarpa C – 35 Amb + C – 35 Amblicarpa
Sofd
Amb + Sofd
Amblicarpa
FD
Amb + FD
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
115
Cloroplastos. El genoma de los cloroplastos (ADNcp) se localiza en el citoplasma
célular. En en la Figura 14, se presentan los patrones polimórficos del ADNcp de los
híbridos somáticos y sus respectivos progenitores. En las cuatro combinaciones
intergenéricas la distribución de los fragmentos de ADNcp presentada por los híbridos
somáticos es similar a la registrada por el progenitor donador de callo embriogénico.
Este resultado sugiere que el ADN de los cloroplastos del híbrido somático en este
caso, también fueron aportados por el progenitor donador de callo embriogénico.
Figura 14. Perfil de bandeo del ADN de cloroplasto s mostrado por el Mandarino
Amblicarpa y variedades del género Pocirus trifoliata así como sus híbridos somáticos.
Flying Dragón (carril 2), Amblicarpa + Flying Drago n (3); Amblicarpa (4), Benton (5);
Amblicarpa + Benton (6); Amblicarpa (7); Sofd (8); Amblicarpa + Sofd (9); Amblicarpa
(10); C-35 (11), Amblicarpa + C – 35 (12); Amblicar pa (13). Los pares de iniciadores
utilizados en esta prueba fueron: TrnD-TrnT, se cor tó con Taq I, y se utilizó un gel de
metaphoragarosa.
4.2.2 Experimento 2. Híbridos somáticos interespecí ficos entre mandarino,
Amblicarpa y líneas de Pomelo
4.2.2.1 Recuperación y regeneración de híbridos. En estas combinaciones también
se observó una alta eficiencia de plateo en la mayoría de las cajas de petrí que se
utilizaron. El callo regeneró rápidamente y cubrió la superficie entera del medio de
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Mar
cado
r
FD
Am
b +
FD
Am
b
Ben
Am
b +
Ben
Am
b
Sof
d
Am
b +
Sof
d
Am
b
C –
3 5
Am
b +
C –
35
Am
b
116
cultivo. La formación de embrioides fue esporádica y no ocurrió en todos los platos.
Cuando los embriones globulares pequeños de color verde adquirieron la forma de
corazón, se transfirieron a un nuevo medio de cultivo fresco EME, sólido con maltosa.
Sobre este medio se utilizaron pequeñas membranas circulares de acetato de celulosa
las cuales se colocaron para mejorar el crecimiento y desarrollo de los embriones. El
cultivo en suspensión de Amblicarpa confirmó su fuerte capacidad de totipotencia,
desarrollando numerosos embriones en la mayoría de fusiones. Esto propició el
descarte de un notable número de embriones, mediante la citometría de flujo, con el fin
de eliminar todos aquellos que fueron diploides y de esta manera reducir la cantidad de
trabajo innecesario en labores de cultivo de tejidos y de invernadero. La mayoría de los
embriones somáticos tetraploides se distinguieron por ser muy grandes y con frecuencia
exhibieron una forma anormal que los embriones diploides que fueron descartados. La
mayoría de los embriones producto de las fusiones produjeron múltiples brotes cuando
se cultivaron en un medio DBA3 (Cuadro 17). Los brotes de las tres combinaciones
enraizaron rápidamente al transferirse a un medio de cultivo MS conteniendo
reguladores, y su posterior aclimatización fue éxitosa cuando en el invernadero se
mantuvieron bajo condiciones de alta humedad y temperatura de 28°C.
4.2.2.2 Morfología foliar. Los materiales candidatos a híbridos somáticos mostraron
una morfología foliar intermedia en relación a los dos progenitores. Las hojas del
progenitor de callo embriogénico Amblicarpa, fueron muy pequeñas y no mostraban
alas en el peciolo. La morfología de donador de protoplastos de hoja principalmente en
la línea del Pomelo “Ling Ping You 8-1-99-4A” se caracterizó por presentar hojas muy
grandes y alas del peciolo muy desarrolladas (Figura 15). Las hojas de los híbridos
somáticos resultaron ser mucho más angostas y con alas del pecíolo más pequeñas
que el Pomelo pero de mayor longitud, que las hojas de Amblicarpa. Los demás
híbridos somáticos mostraron un comportamiento similar. De hecho los híbridos
somáticos desarrollaron hojas con una morfología un tanto similar a las hojas del
Naranjo agrio. En las figuras 15 y 16 se presentan las características foliares de cuatro
combinaciones candidatos a híbridos somáticos y sus respectivos progenitores.
117
Figura 15. Morfología de las hojas de las combinaci ones mandarino Amblicarpa ( Citrus
amblycarpa) con dos líneas de Pomelo. Las hojas del centro corr esponden a los híbridos
somáticos. La del lado izquierdo al mandarino y la derecha al Pomelo.
Amblicarpa + HBP 51991B
Amblicarpa + Ling Pin Yau 81994A
Amblicarpa
HBP 51991B
Amblicarpa
Ling Pin Yau 81994A
118
Figura 16. Proceso de fusión y regeneración de híbr idos somáticos. (A) Callo
embriogénico en suspensión de Amblicarpa. Liberació n enzimática de protoplastos de
callo embriogénico (B) y tejido foliar de Pomelo (C ). Anillo de protoplastos purificado del
progenitor de callo (D) y de hoja (E). Inicio de fu sión de protoplastos (F). Embriones
somáticos en crecimiento (G). Plantas híbridas somá ticas de Amblicarpa + Pomelo en
medio de cultivo (H). Grupo de trabajo de laborator io al centro el Prof. Jude Grosser (I).
Amb + 5-1-99-1B Amb + 8-1-99-4A
A B
C D E
F G
H I
119
4.2.2.3 Nivel de ploidía. Los resultados que arrojaron los análisis efectuados por el
citómetro de flujo indicaron que los híbridos somáticos presentan un nivel de ploidía
superior al testigo diploíde que para este caso fue el Pomelo Chandler. En las gráficas
aportadas por el citómetro de flujo para los híbridos somáticos se expresaron dos picos,
el primero correspondió al testigo diploide y el segundo al híbrido somático tetraploide,
mostrando este último el doble de núcleos registrados (Figura 17 y 18).
Figura 17. Nivel de ploidia de híbridos somáticos i nterespecíficos entre Amblicarpa y dos
líneas de Pomelo Ling Pin Yau.
Amb + Ling Pin Yau 8-1-99-4A
Amblicarpa + Ling Pin Yau 81993B
120
Figura 18. Nivel de ploidía de híbridos somáticos i nterespecíficos entre Amblicarpa y tres
variedades de Pomelo.
Amblicarpa + Pomelo NW Línea 8-2-99-3B
Amblicarpa + Pomelo Hirado Buntan 5-1-99-1B
Amblicarpa + Pomelo Large Pink 7-2-99-5
121
4.2.2.4 Pruebas de PCR. Para las pruebas de PCR con el ADN genómico total de los
candidatos a híbridos somáticos de Amblicarpa y las distintas líneas de Pomelo, que
previamente resultaron tetraploides por morfología y citometría de flujo, se utilizaron dos
diferentes metodologías: PCR y PCR-1SSR. Ambas pruebas moleculares fueron
descritas en el apartado de materiales y métodos.
Al utilizar PCR, se observó que los productos moleculares de las combinaciones
Amblicarpa + Pomelo Hirado Buntan línea 5-1-99-1B y Amblicarpa + Pomelo Ling Pin
Yau línea 8-1-99-4A y de sus materiales parentales, los cuales fueron amplificados con
los iniciadores C-11 y C-64 de Operon Thecnologies y visualizado en gel de agarosa,
mostraron un patron de bandeo diferente al de sus respectivos progenitores (Figura 19)
lo cual confirmó que son nuevos híbridos somáticos.
En la Figura 20, se presentan los resultados en base a la prueba de PCR-ISSR
utilizando el iniciador BDBTCC5. Nuevamente en esta figura se confirma que el patrón
de bandeo de la combinación Amblicarpa + Pomelo Hirado Buntan 5-1-99-1B fue
diferente al de sus progenitores y que el nuevo híbrido muestra fragmentos compartidos
con los dos progenitores. Sin embargo, con esta prueba la combinación Amblicarpa +
Ling Pin Yau línea 8-1-99-4A no resultó diferente a sus respectivos progenitores.
Por otra parte, entre las plantas que mediante la citometría de flujo se detectaron como
tetraploides, hubo algunas entre las que se incluyen; Amblicarpa + Ling Pin Yau línea 8-
1-99-5A y 8-1-99-3B, Amblicarpa + Pomelo Large Pink 7-2-99-5 y Amblicarpa + Pomelo
NW línea 8-2-99-3B, que en las distintas pruebas de PCR mostraron patrones de
bandeo que resultaron ser semejantes al progenitor de callo embriogénico Amblicarpa.
Lo anterior significa que estos materiales posiblemente son autotetraploides originados
por la fusión de dos células del mismo progenitor. No se presentan los patrones de
bandeo de Amblicarpa + Pomelo Large Pink 7-2-99-5.
122
Figura 19. Polimorfismo mostrado por las combinacio nes de Amblicarpa + Pomelo y sus
respectivos materiales parentales utilizando los in iciadores C-11 (arriba) y C-64 (Abajo).
Los marcadores están en los carriles (5, y 12); Amb licarpa (1, 4, 8, 11 y 15); Amblicarpa +
5-1-99-1B (2), Pomelo 5-1-99-1B (3); Pomelo 8-1-99- 4A (6); Amblicarpa + 8-1-99-4A (7);
Amblicarpa + 8-1-99-5A (9); Pomelo 8-1-99-5A (10); Pomelo 8-1-99-3B (13); Amblicarpa +
8-1-99-3B (14); Amblicarpa + 8-2-99-3B (16): Pomelo 8-2-99-3B (17).
Am
b A
mb
5-1-
99-1
B
5-1-
99-1
B
Am
b 8-
1-99
-4A
A
mb+
8-1-
99 4
A
Am
b A
mb
+ 8-
1-99
-5A
8-
1-99
-5A
A
mb
8-1-
99-3
B
Am
b +
8-1-
99-3
B
Am
b A
mb
+ 8-
2-99
-3B
8-
2-99
-3B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
C - 11
C - 64
123
Figura 20. Perfil de bandeo mostrado por los híbrid os somáticos (indicado con una
flecha) de Amblicarpa ( Citrus amblycarpa ) + Pomelo ( Citrus máxima ó C. grandis ) y sus
respectivos progenitores. El iniciador utilizado fu e BDBTCC5.
4.2.3 Experimento 3. Híbridos somáticos entre limón Macrofila y parientes
cercanos de los cítricos
Las combinaciones que se evaluaron fueron Macrofila (donador de protoplastos de callo
embriogénico) en los siguientes cítricos: Citropsis, Citrange C-35, Pomelo Ling Pin Yau,
línea 8-1-99-10A y el tetraploide Sofd, de los cuales se obtuvieron los protoplastos de
hoja.
4.2.3.1 Recuperación y regeneración de híbridos. A diferencia del resultado obtenido
con las combinaciones señaladas en los dos experimentos anteriores, con los híbridos
de Macrofila y las tres especies de Pomelo, se obtuvo un bajo número de cajas de petri
fusionadas, propiciado por un pobre rendimiento de protoplastos de callo para las
fusiones efectuadas.
Además en las fusiones exitosas, se notó una reducida eficiencia de plateo
desarrollando pocos embriones en el medio de cultivo. Los embriones formados
Ladd
er
5-1-
99-1
B
Am
b +
5-1-
99-1
B
Am
blic
arpa
A
mb
+ 8-
1-99
-3B
8-
1-99
-3B
--
La
dder
8-
1-99
-4A
A
mb
+ 8-
1-99
-4A
A
mbl
icar
pa
Am
b +
8-1-
99-5
A
8-1-
99-5
A
--
124
extendieron su desarrollo por mayor período de tiempo y el tejido no cubrió la superficie
entera del medio de cultivo.
Entre las combinaciones, la que mostró un mejor comportamiento in vitro, en la fase de
regeneración fue Macrofila + Citropsis. Las plantas regeneradas de estas
combinaciones quedaron listas para establecerse en vivero de 3-6 meses después que
las obtenidas en experimentos anteriores.
4.2.3.2 Morfología foliar. De las cuatro combinaciones candidatos a híbridos
somáticos, la combinación Macrofila + Citropsis mostró una forma de hoja similar al
Macrofila, progenitor de callo embriogénico, lo que podría revelar que en este caso las
características dominantes de la morfología proviene del donador de callo
embriogénico.
Este resultado difiere un tanto de la tendencia encontrada en los experimentos
previos, donde el carácter dominante de la morfología, lo aporta el genoma del donador
de protoplastos de hoja. En este caso, la morfología foliar fue semejante al Macrofila,
aunque el tamaño, color y grosor de las mismas, fue más grande que las hojas del
Macrofila (Figura 21). No se presentan figuras de las combinaciones Macrofila + C-35,
Macrofila + Pomelo Ling Ping Yau línea 8-1-99-10 A y Macrofila + Sofd porque no se
dispusó de hojas del híbrido somático con la suficiente edad para hacer las
comparaciones.
125
Figura 21. Morfología de tetraploide (centro) entre Macrofila ( C. macrophylla ) y Citropsis
gilletiana y materiales parentales.
4.2.3.3 Nivel de Ploidía. En las Figura 22 y 23 se presentan los resultados del nivel de
ploidía registrado con el citometro de flujo. Se observa que en las cuatro combinaciones
se originaron dos curvas cuyos máximos picos reflejan el nivel de ploidia. El primer pico
corresponde al portainjerto Macrofila que en este caso fue utilizado como testigo
diploide. El segundo pico corresponde al material candidato a híbrido somático.
Solamente en el caso de la combinación Macrofila + Sofd, se hicieron pruebas en las
que se incluyó también al limón Persa como testigo triploide, ante la sospecha de
obtener un hexaploide. En las cuatro gráficas mostradas en las Figura 22 y 23, se
observa que el pico máximo de la segunda curva se ubica al doble de distancia de la
primer curva. Este resultado indica que los híbridos somáticos en los cuatro casos
contienen el doble de ploidía en relación a los testigos y por lo tanto corresponden a
materiales tetraploides. Inclusive la combinación Mac + Sofd también se registró como
tetraploide despejándose de esta manera la posibilidad de que fuera haxaploide.
MACRO + CITRUS
Macrofila
Tetraploide Citropsis
126
Figura 22. Ploidía mostrada por el testigo Macrofil a (pico 1) y el candidato a híbrido
somático (pico 2) resultante de la combinación de M acrofila + Citrange C-35 (arriba).
Abajo se presenta la ploidía del testigo Macrofila (pico 1), limón Persa (pico 2) y Macrofila
+ Sofd (Pico 3) correspondiente a materiales diploi des, triploides y tetraploides,
respectivamente.
Macrofila + C - 35
Macrofila + Sofd
127
Figura 23. Ploidía de las combinaciones interespecí ficas Macrofila + Pomelo (arriba) e
intergenerica Macrofila + Citropsis gilletiana (abajo). Nótese los picos de ploidía del
testigo (pico 1) y de los híbridos (pico 2). En amb os casos el pico 2 corresponde a
materiales tetraploides.
Macrofila + Pomelo Ling Pin Yau 8-1-99-10A
Macrofila + Citropsis
128
4.2.3.4 Prueba de PCR. La Figura 24, presenta el resultado obtenido en relación a las
pruebas de PCR efectuadas para determinar los patrones de bandeo de las
combinaciones Macrofila + Pomelo, Macrofila + C-35, Macrofila + Citropsis. En el caso
de la primer combinación Macrofila + Pomelo, a pesar de que se efectuaron numerosas
pruebas de PCR variando el programa de ciclos y temperaturas, así como empleando
iniciadores de diferente número de secuencias nucleótidas, no fue posible detectar
diferencias en el polimorfismo mostrado entre el supuesto híbrido somático y su
progenitor de callo embriogénico (Figura 24). Invariablemente todos los patrones de
bandeo que aparecieron en el gel de electroforesis, se asemejaron al Macrofila.
Figura 24. Patrones de bandeo de Macrofila + Citrop sis, Macrofila + Citrange C-35 y
Macrofila + Pomelo Ling Pin Yau línea 8-1-99-10A y sus respectivos progenitores. El gel
del lado izquierdo corresponden a fragmentos amplif icados con el iniciador C-11. En los
geles del centro y lado derecho se utilizó el inici ado C-64
Este resultado permite suponer que este material en realidad es un autotetraploide
derivado de la fusión de dos células del progenitor de callo embriogénico Macrofila. En
la combinación Macrofila + C – 35, fue necesario realizar un notable número de pruebas
de PCR. Inicialmente se intento con un programa de 36 y luego de 42 ciclos y con los
iniciadores C-11, C-64, A-19, N-09, OPAQ 01, OPAQ 02, OPAQ 06. La mayoría de los
patrones de bandeo se asemejaron al progenitor donador de protoplastos de callo
embriógenico. En la figura 24, se observa que el patrón de bandeo del híbrido Macrofila
A B C
Mac
M
ac +
Citr
o a
Citr
opsi
s M
ac +
Citr
o b
Mac
M
ac +
C-3
5 C
– 3
5 M
ac
Mac
+ C
itro
a C
itrop
sis
Mac
+ C
itro
b M
ac
Mac
+ C
-35
C -
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
C - 11 C - 64
129
+ C-35 resultó similar al Macrofila tanto utilizando el iniciador C-11, como el C-64. Este
resultado permitió corroborar por via genética la obtención de un híbrido posiblemente
autotetraploide. En la Figura 24 se observa el polimorfismo en una planta candidato a
híbrido somático de la combinación Macrofila + Citropsis, y sus respectivos
progenitores. El patrón de bandeo del híbrido somático mediante PCR fué diferente al
Macrofila. Esta prueba también se corrió en otras cuatro plantas más de esta misma
combinación. En ninguna de ellas se observó diferencia entre el patrón de bandeo de
los supuestos híbridos y el patrón Macrofila.
4.2.4.5 Herencia mitocondrial y de cloroplastos. El polimorfismo mostrado por el
híbrido somático fue similar al del Macrofila. Se efectuaron pruebas de la herencia de
orgánelos para determinar la procedencia del ADN mitocondrial y del ADN de
cloroplastos en las combinaciones Macrofila + C-35 y Macrofila + Sofd. Para ello, se
hicieron pruebas de PCR utilizando enzimas de restricción endonucleosas a través de
una digestión enzimática. En la Figura 25 se presenta el polimorfismo de ambas
combinaciones el cual es similar al del donador de protoplastos callo embriogénico, lo
cual supone que el Macrofila es el donador del genoma de las mitrocondrias.
Figura 25. Perfil de distribución de ADN de mitocon drias en diferentes híbridos y sus
materiales parentales. C-35 carril (1); Macrofila + C-35 Carril (2); Macrofila (3); sofd (4);
Macrofila + Sofd (5); Macrofila (6); Marcador de 10 0 pares de bases (7); C-35 (8); Macrofila +
C-35 (9); Macrofila (10); Sofd (11); Macrofila + So fd (12); Macrofila (13). Los perfiles del 1-6
se obtuvieron utilizando el par de iniciadores sigu iente: Nad4Exon ½ y los carriles del 8-13
con 185/5ArRNA cortados con Taq I y visualizados c on un gel de metaphoragarosa al 3%.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
130
En la Figura 26 se presentan los resultados de la pruebas de PCR practicadas para
determinar la herencia del genoma de los cloroplastos en estas mismas combinaciones.
El polimorfismo similar entre los híbridos y el progenitor de callo embriogénico revela
que también los organelos del genoma de cloroplastos, provienen del Macrofila.
Figura 26. Perfil de distribución de ADN de cloropl astos en diferentes híbridos somáticos
y sus materiales parentales. 1 = C-35; 2 = Macro fila + C-35; 3 = Macrofila; 4 = Sofd; 5 =
Macrofila + Sofd; 6 = Macrofila; 7 = marcador 100 p b.
4.2.4 Experimento 4. Híbridos somáticos interespecí ficos entre Amblicarpa y
especies derivadas del cidro.
Las combinaciones evaluadas fueron Amblicarpa con fuente donadora de protoplasto
de callo embriogénico y los limones Macrofila y Volkameriana como donadores de
protoplastos de hoja.
4.2.4.1 Recuperación y regeneración de híbridos. El número de plantas regeneradas
y recuperadas a partir de estas combinaciones fue reducido, debido a que se intentaron
1 2 3 4 5 6 7
131
pocas fusiones. Sin embargo, las que se lograron mostraron un comportamiento similar
al Amblicarpa + Poncirus durante esta fase.
4.2.4.2 Morfología foliar. La morfología de las hojas correspondiente a la combinación
Amblicarpa + Volkameriana se presenta en la Figura 27. Claramente se observa que la
forma de la hoja es muy similar al progenitor donador de protoplastos de hoja , aunque
el tamaño de la misma es intermedio entre Amblicarpa y Volkameriana. Similarmente en
la combinación Amblicarpa más Macrofila, la forma de la hoja fue más parecida a
Macrofila pero de tamaño intermedio entre los dos progenitores (no se presenta figura).
En ambos casos las hojas mostraron la característica de ser de color verde mas oscuro,
mas gruesas y tamaño intermedio entre los dos progenitores. Esto revela que los genes
dominantes de esta característica fueron los aportados tanto por Macrofila como por
Volkameriana.
Figura 27. Morfología de hojas de la combinación Am blicarpa + Volkameriana (centro) y
de sus respectivos progenitores: Amblicarpa (izquie rda) y Volkameriana (derecha).
Amblicarpa Amb + Volk Volkamerian a (Amb) (Volk)
132
4.2.4.3 Nivel de Ploidia. En la Figura 28, se presentan los resultados que se obtuvieron
con el citometro de flujo para las dos combinaciones. Se observó que en cada
combinación se registraron dos picos de ploidia. El primero correspondió al testigo
Amblicarpa, que se caracterizó por ser diploide y el segundo, ubicado al doble de
distancia respecto al anterior y que correspondió al nivel de ploidia del híbrido somático,
indicando que esta combinación corresponde a un material tetraploide.
4.2.4.4 Pruebas de PCR. Para dilucidar si genéticamente esta combinaciones
corresponden a híbridos somáticos, se efectuaron varias pruebas de PCR utilizándose
un buen número de iniciadores que en estudios previos habían resultado
suficientemente capaces de ayudar a encontrar polimorfismo en Amblicarpa algunos
trifoliados y Amblicarpa + Pomelos.
Por lo tanto se decidió realizar nuevas pruebas, pero en este caso con PCR-ISSR
sugeridas por Scareno et al. (2002). De esta manera y utilizando los iniciadores
HVHTCC5 y BDBTCC5 de 5 secuencias nucleotidas repetidas. Se encontraron
diferencias en el patrón de bandeo entre los híbridos somáticos y los dos progenitores
las cuales se presentan en la Figura 29.
Estos resultados permiten corroborar que la combinación Amblicarpa + Volkameriana
corresponde a un nuevo híbrido somático potencialmente apropiado para plantaciones
de limón Mexicano, limón Persa y limón verdadero, aunque se requiere verificar
previamente su comportamiento biológico y agronómico bajo condiciones de
invernadero y de campo. En relación a la combinación Amblicarpa + Macrofila se
continúan haciendo pruebas moleculares para demostrar su naturaleza híbrida.
133
Figura 28. Ploidía del testigo Amblicarpa (pico 1) y de los híbridos somáticos (pico 2)
correspondientes a las combinaciones Amblicarpa + V olkameriana (arriba) y Amblicarpa
+ Macrofila (abajo). Nótese que la diferencia en la ubicación entre ambos picos es del
doble, lo que indica que estos corresponden a mater iales diploides y tetraploides,
respectivamente.
Amblicarpa + Volkameriana
Amblicarpa + Macrofila
134
Figura 29. Patrones de bandeo de dos híbridos somát icos y sus respectivos progenitores
iniciador HVHTCC5, lado izquierdo y con el iniciado r BDBTCC5 lado derecho.
Volkameriana (carriles 1 y 7), Amblicarpa + Volkame riana (carriles 2 y 8), Amblicarpa (3 y
9), Amblicarpa + Macrofila (4 y 10) y Macrofila (5 y 11). Marcador 100 pb (6 y 12).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
HVHTCC5 BDBTCC5
135
V. DISCUSIÓN
Aislamiento y fusión de protoplastos
Como se explicó previamente un requisito para lograr las fusiones de protoplastos
éxitosas, es que tanto la hoja como el callo embriogénico liberen una cantidad
adecuada de protoplastos (Ochatt et al., 1992; Grosser y Gmitter, 1990 a).
La obtención de protoplastos de hoja de las especies del género Citrus y del género
Poncirus no se constituyó como problema, ya que en pruebas preliminares la mayoría
de especies y variedades utilizadas como fuentes donantes de protoplastos, mostraron
hojas suculentas suaves, bien desarrolladas y de color verde, las cuales se oxidan con
menor rapidez. Lo contrario ocurrió con las especies de Glycosmis y Atalantia cuyas
hojas aún estando tiernas mostraron la rigidez de las hojas maduras, lo cual
posteriormente dificultó la liberación de protoplastos en cantidades abundantes. De
acuerdo con Ochatt et al (1992), en su revisión indican que los tejidos foliares
lignificados más difícilmente liberan protoplastos. D’onofrio et al (1999), encontraron un
mayor número y más alto porcentaje de protoplastos en hojas jóvenes de Cydonia
oblonga que en hojas maduras. Igualmente en cítricos, se ha demostrado que las hojas
más tiernas liberan mayor cantidad de protoplastos que las maduras (Vardi y Spiegel,
1982; Vardi, 1981). Se ha demostrado que las hojas tiernas desarrollan una cutícula
muy delgada por lo que ofrecen poca resistencia a la penetración de las enzimas que
degradan la pared célular (Bengochea y Dodds, 1986).
En general, la mezcla de las tres enzimas celulasa, macerasa y pectoliasa utilizadas
para degradar la pared celular de las hojas tiernas y suaves de los géneros Citrus y
Poncirus, permitieron la liberación de numerosos protoplastos, los cuales a su vez
durante el proceso de purificación después de pasar por la centrífuga, se caracterizaron
por mostrar un anillo de protoplastos más verde y de mayor diámetro que el obtenido en
Glycosmis y Atalantia. Es posible que la cantidad de protoplastos en estas especies se
pudiera aumentar, si además de determinar el tipo de tejido foliar más apropiado,
también se evaluán otras mezclas enzimáticas, tal como lo mencionan otros autores
(Ona y Tsuda, 1999). La pared celular de las plantas generalmente está compuesta por
136
celulosa, hemicelulosa, pectinas y en algunos casos por callosa (Bengochea y Dodds,
1986); y la mezcla de enzimas a utilizar debe ser capaz de digerir su composición
estructural. Li et al. (1995), citados por Bajaj, 1995 consignaron que el aislamiento de
protoplastos de tejido no embriogénico de diferentes especies de Arachis requirió
distintas combinaciones y concentraciones de enzimas, para un óptimo rendimiento.
Por otro lado, en observaciones preliminares se notó que el mandarino Amblicarpa
produjo mayor rendimiento de protoplastos de callo embriogénico que el Macrofila y
Volkameriana. De manera que se hicieron varios trabajos en un intento por lograr que
los callos embriogénicos de los tres materiales optimizaran su rendimiento de
protoplastos y al mismo tiempo encontrar respuestas a este comportamiento.
Para optimizar el rendimiento de protoplastos durante la fase de aislamiento y
purificación de protoplastos, los callos embriogénicos de los tres portainjertos
Amblicarpa, Macrofila y Volkameriana requieren un manejo diferente. Por un lado,
Amblicarpa requiere de un período de incubación más corto (8 hrs) que Volkameriana
(24 hrs) y Macrofila (32 hrs) (Figura 1). En revisiones específicas sobre el tema, se ha
consignado que las diferencias genéticas y fenotípica de los materiales influencián la
mayor ó menor respuesta de rendimiento de protoplastos entre los genotipos de cítricos
(Grosser y Gmitter, 1990; Ochatt et al., 1992). Una explicación más clara podría darse si
se conociera la composición específica de la pared celular de los tres materiales.
La mezcla en solución de las enzimas macerasa, pectoliasa y celulasa también fueron
utilizadas en este caso, trabajaron muy bien con las células de los callo embriogénicos
de los tres materiales portainjertos. Sin embargo, esto no descarta la posibilidad de
evaluar otros complejos enzimáticos que podrían ser más eficientes y liberar un elevado
número de protoplastos en el menor tiempo de incubación posible lo cual sería
recomendable para callo embriogénico de Macrofila y Volkameriana. Olivares-Fuster
(1998), al evaluar tres diferentes soluciones enzimáticas en callo embriogénico de
Citrus sinensis cv Salustiana, encontró que la mezcla de celulasa, macerasa y driselasa
propició mayores rendimientos de protoplastos que la mezcla de celulasa, macerasa y
pectoliasa. Además, no solo es importante la obtención de un alto rendimiento sino
también la viabilidad de los protoplastos. Al parecer ésta última se reduce conforme
137
transcurre el tiempo (D’Onofrio et al., 1999). Por tanto, sería ideal un tratamiento que
permita obtener un elevado número de protoplastos en el menor tiempo posible para
lograr un alto porcentaje de protoplastos con mayor viabilidad. En Amblicarpa, esto es
posible con la mezcla de celulasa, macerasa y pectoliasa dado que el rendimiento de
protoplastos con un período de incubación de 8 horas fue bastante alto y se asume que
con un alto porcentaje de viabilidad, de acuerdo a los resultados en otros cítricos (Vardi
et al., 1995).
En relación a la respuesta del callo embriogénico de Macrofila y Volkameriana a
diferentes medios de cultivo se encontró que el uso de BH3 0.6 M fue el que propició el
mayor rendimiento de protoplastos en ambos portainjertos, lo cual corrobora lo
reportado previamente por Grosser y Gmitter (1990 a,b,c).
La diferencia entre los medios de cultivo BH3 0.6 M y EME 0.146 M, es que el primero
contiene mayor concentración de nutrientes y sacarosa que el EME, además de que
éste último carece de vitaminas A y B, y de ácidos orgánicos (Grosser y Gmitter, 1990
a). Al parecer bajo estas condiciones, los protoplastos liberados se mantienen más
estables y enteros debido a una posible menor presión osmótica en el medio BH3 en
comparación con el EME (Grosser y Gmitter, 1990 a, 1990 b). Se sabe que la presión
osmótica juega un papel importante durante el proceso de aislamiento y purificación y
es uno de los principales motivos de pérdida de protoplastos (Olivares-Fuster, 1999;
Grosser y Gmitter, 1990 a). La ausencia o escazes de agentes estabilizadores
osmóticos en el medio de cultivo durante el aislamiento de protoplastos, propicia que
estos por el proceso de osmósis admitan agua y se revienten debido a la ausencia de la
pared celular (Bengochea y Dodds, 1986).
La concentración del medio de cultivo que se usa regularmente durante la fase de
incubación y purificación de células de callo embriogénico para la obtención de
protoplastos es BH3 al 0.6 M (Grosser y Gmitter, 1990 a). Sin embargo, el callo del
patrón Macrofila mostró mayor cantidad de protoplastos cuando se utilizaron
concentraciones más altas de BH3 (0.8 y 0.9 M). Esto sugiere que los protoplastos
liberados posiblemente se mantienen en mejores condiciones al incrementar la
138
concentración de sacarosa y presenten también menos riesgo de daño por presión
osmótica.
Al efectuar observaciones al microscopio para conocer las características físicas de los
protoplastos de los tres portainjertos, se observó que en el caso del Amblicarpa
predominaban los protoplastos pequeños (60%), pero la proporción de protoplastos
grandes también fue importante (40%). En ambos tamaños los protoplastos mostraban
una forma perfectamente redonda. Otra característica importante fue que los
protoplastos de este patrón mostraron una condición física “pegajosa”,
desconociéndose la causa de lo anterior.
En cambio las observaciones bajo el microscopio en el limón Macrofila, permitieron
distinguir que aunque produce un notable número de protoplastos redondos (32%) y de
tamaño pequeño (40%), inesperadamente mostró también una abundante proporción
de protoplastos grandes, de forma irregular y alargada (28%) con una notoria
proliferación de cristales de almidón dentro de las células. No existen reportes que
indiquen si la naturaleza pegajosa de los protoplastos en el caso de Amblicarpa,
favorezca el potencial de fusión. Así como tampoco se han encontrado reportes sobre
la influencia del tamaño de los protoplastos sobre la eficiencia de fusión. Pero en éste
último caso, observaciones bajo el microscopio efectuadas inmediatamente después de
la fusión, permitieron confirmar que la mayoría de las fusiones exitosas se registraron
en los protoplastos más grandes. En el caso del Macrofila, los protoplastos de forma
irregular no se distinguieron luego de las fusiones, lo que podría sugerir que estos se
eliminan durante el proceso de purificación. Bengochea y Dodds, 1986 reportan que
cuando se utilizan altas concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo, suele
ocasionarse una concentración ó plasmolisis de los protoplastos, lo que propicia que se
inhiba la regeneración de la pared célular y el retrazo ó inhibición de crecimiento
subsecuente.
Los procesos de purificación de protoplastos fueron evaluados únicamente para el
portainjerto Macrofila. Estos procesos consistieron en determinar la dosis óptima de
sacarosa, el tiempo de centrifugación y la velocidad de centrifugación utilizados para la
purificación de protoplastos. Los resultados indican que el callo embriogénico de
139
Macrofila al igual que otros cítricos, requieren una concentración de sacarosa del 25%,
diez minutos de tiempo de centrífuga y a una velocidad de 900 revoluciones por minuto.
Este resultado concuerda con lo reportado por otros autores (Grosser y Gmitter, 1990 a;
Ohgawara et al., 1985; Olivares-Fuster, 1998).
Producción de híbridos somáticos de portainjertos
En los cuatro experimentos fue posible obtener y verificar mediante pruebas de
morfología foliar, nivel de ploidía y marcadores genéticos, nuevos híbridos somáticos de
las combinaciones estudiadas, los cuales no están reportados en la literatura. Estos
resultados confirman la factibilidad de la técnica de fusión de protoplastos para generar
nuevos híbridos (Grosser et al., 2000, Grosser y Chandler, 2000; Grosser et al.,1998;
Guo et al., 2000; Oghawara et al., 1985). Este resultado contribuye con una aportación
importante para ampliar la base genética de los portainjertos para los cítricos en general
y para el limón mexicano en particular. Entre las combinaciones estudiadas hubo mayor
facilidad para producir híbridos somáticos intergenéricos entre el mandarino Amblicarpa
+ especies y variedades del genéro Poncirus trifoliata e híbridos, así como también
híbridos somáticos interespecíficos entre el mandarino Amblicarpa y variedades de
Pomelo.
Trabajos previos no publicados sobre fusión de protoplastos efectuados por el autor,
donde se utilizó a Volkameriana como donador de protoplastos de callo embriógenico y
diferentes parientes de los cítricos como son Glycosmis, Atalantia, Citropsis y el mismo
Citrus, como donadores de protoplastos de hoja, se encontró que hubo mayor éxito de
fusiones en las combinaciones de Volkameriana con Pomelo que pertenece al género
Citrus. Los pocos casos de éxito de fusión entre Volkameriana con otros géneros se
lograron con Citropsis. Sin embargo, ninguna de estas combinaciones originó híbridos
somáticos, lo cual se debió principalmente a que los embriones no se desarrollaron
adecuadamente hacía la siguiente fase por problemas de manejo y condiciones del
medio de cultivo ó por falta de capacidad del callo embriogénico para regenerar plantas
híbridas. Tang et al. (2000), previamente consignaron que los factores que influenciaron
la regeneración de plantas a partir de protoplastos de arroz fueron; el medio de cultivo,
procedimiento de cultivo de protoplastos y la fuente de obtención de protoplastos.
140
En la literatura usando marcadores moleculares se reporta que el grupo de variedades
de Poncirus trifoliata son las más alejadas del género Citrus (Herrero et al., 1996 a,
1996 b). Sin embargo, este hecho no parece afectar la factibilidad de realizar
mejoramiento genético entre ambos géneros. De hecho en reportes previos aunque con
cierta dificultad, pero ha sido posible generar híbridos sexuales y también híbridos
somáticos entre especies del género Citrus con Poncirus para utilizarse como
portainjertos (Castle et al., 1987, 1993; Grosser et al, 2000; Ollitrault et al. 1998, 2000
b). En este estudio se confirmó que fueron mínimas las limitantes para producir híbridos
somáticos intergenéricos entre Amblicarpa y Poncirus.
Así mismo, el hecho de haber obtenido un aceptable número de plantas híbridas
somáticas producto de las fusiones entre Amblicarpa + Pomelo y de Amblicarpa +
Poncirus las cuales pertenecen al mismo y diferentes géneros del Citrus
respectivamente, confirma que posiblemente las distancias genéticas no son tan
importantes, para lograr fusiones exitosas, como lo es la capacidad que tienen los
protoplastos para fusionarse y formar células capaces de regenerar plantas, al menos
para las especies y géneros que se estudiaron en este caso. En trabajos previos
(Ollitrault et al., 1996 b; Grosser et al., 2000), se ha observado que la fusión de
protoplastos derivados de callo embriogénico de especies de mandarino, con
protoplastos de hojas de especies trifoliadas, ha sido favorable por lo que al igual que
en estudios previos, en este estudio se confirma este resultado (Grosser et al., 2000;
Grosser y Gmitter, 1990 a; Guo et al., 2002; Grosser et al., 1998; Ohgawara, et al.,
1994, 1998). Por lo tanto, estas evidencias permiten argumentar que el éxito de las
fusiones no depende del grado de lejanía ó parentesco de las especies ó géneros de
cítricos, sino más bien se debe a otros factores que tienen que ver con el medio de
cultivo, la composición de la pared célular, la mezcla de enzimas para descomponer la
pared célular y los medios de cultivo apropiados para el crecimiento de los embriones y
regeneración de plantas, los cuales pueden ser específicos para cada combinación
Vardí y Galun, 1988; Tang et al., 2000; Louzada y Grosser, 1994; Kumar y Cocking,
1987.
En este trabajo se encontró que los nuevos híbridos somáticos obtenidos mostraron la
característica de hoja trifoliada intermedia en tamaño con relación a los dos materiales
141
parentales. Con ello, se confirma que esta característica está bajo el control de genes
dominantes del material que aporta los protoplastos de hoja (Ohgawara et al., 1994,
1998, Grosser et al., 2000).
En las combinaciones de Amblicarpa + Pomelo, hubo también un cierto grado de
eficiencia para la producción de híbridos somáticos. Nuevamente en estas
combinaciones se observa la alta capacidad regenerativa de los protoplastos de callo
embriogénico del mandarino para desarrollar una planta nueva a partir de la fusión.
Este resultado y el anterior se podría explicar por la alta dispobilidad de protoplastos
grandes y facilidad de estos para fusionarse con protoplastos de hoja del Pomelo que
son abundantes y pequeños y que aparentemente penetran fácilmente a través de la
membrana de los protoplastos del mandarino. Posiblemente en estos últimos se
presenta un cierto grado de flexibilidad y resistencia de la membrana para contener los
orgánelos y líquido del citoplasma una vez que han ingresado protoplastos completos
de hoja. Sin embargo este supuesto requiere ser confirmado.
En esta combinación de Amblicarpa + Pomelo las hojas del híbrido somático fueron
intermedias en tamaño en relación a los dos progenitores. Sin embargo, la forma del
nuevo híbrido tendió a ser más parecida al Pomelo que al Mandarino. Este resultado
confirma la prevalencia del gen dominante de morfología foliar aportado por el genotipo
donador de protoplastos de hoja (Grosser et al., 1992; Grosser y Chandler, 2000;
Grosser, 1993; Grosser et al., 1988; Guo et al., 2000, 2002; Guo y Deng, 2001).
Además en relación al tamaño, con frecuencia se reporta que los híbridos somáticos
presentan un tamaño de hoja intermedio entre el tamaño de hoja de los dos genotipos,
lo cual también se confirmó en este estudio (Kobayashi y Ohgawara, 1998; Tusa et al.,
1992 a, 1992 b; Ollitrault et al., 1996 c; Mutomura et al., 1997; Ling e Iwamasa, 1994;
Grosser et al., 1988 b).
Es preciso aclarar que las combinaciones entre Amblicarpa + Pomelo (así como
también entre otros mandarinos + Pomelo), tienen como propósito reconstruir nuevos
clones de naranjo agrio, dado que estos últimos provienen de la cruza de estos
genotipos (Nicolisi et al., 2000). Así que las hojas del híbrido somático entre Amblicarpa
+ pomelo resultaron semejantes a las del naranjo agrio (Figuras 15 y 16), lo cual es
142
bastante promisorio, dado que potencialmente se estarían creando nuevos naranjos
agrios que aunque son tetraploides contienen en su genoma tolerancia a VTC y otras
características superiores importantes.
Mención especial merece también el hecho de que con algunas de las combinaciones
que se intentaron entre Amblicarpa + Pomelo, no fue posible confirmar mediante PCR
su naturaleza híbrida. Sin embargo, la morfología foliar y nivel de ploidía indicaron que
estos genotipos son tetraploides. Este resultado corrobora las observaciones de
estudios previos (Grosser y Gmitter, 1990; Grosser et al., 2000; Ohgawara et al., 1994,
1998) en el sentido de que en realidad se trata de autotetraploides del mandarino
Amblicarpa.
Estos materiales también resultan de interés para estudios de portainjertos ya que se
ha indicado que los autotetraploides pueden generar plantas menos vigorosas que los
diploides (Olivares-Fuster, 1998).
El número de fusiones intentadas entre Amblicarpa como callo embriógenico y los
limones Macrofila y Volkameriana como donadores de protoplastos de hoja fue
reducido. Esto se reflejó en un bajo número de plantas regeneradas. El número de
fusiones realizadas entre Macrofila como donador de callo embriogénico y tres distintas
especies pertenecientes al género Citrus también fue reducido y obviamente el
resultado se reflejó en un bajo número de híbridos somáticos. Además, se explicó
previamente que el callo embriogénico de Macrofila, no mostró altos rendimientos de
protoplastos como el Amblicarpa. El bajo rendimiento y la calidad de los protoplastos de
Macrofila también pudo afectar la obtención de híbridos. Así mismo, lo anterior
repercutió en el reducido número de plantas regeneradas, las cuales se desarrollaron
débilmente y tardaron mucho en crecer (Bengochea y Dodds, 1986). Ya se mencionó
que la calidad y morfología de los protoplastos de Macrofila fue muy desuniforme.
Además al hacer observaciones al microscopio, fué muy notorio que después de una
semana de haberse efectuado la fusión, la mayoría de las células fusionadas se
desintegraron. La explicación de la desintegración de las células fusionadas, entre otras
causas se debió a que durante la fase de crecimiento en la incubadora, los protoplastos
especialmente del Macrofila requieren un medio de cultivo acorde a las necesidades de
143
esta especie a fin de mantener la presión osmótica a un nivel que impida la
desarticulación de la membrana. Lo cual debe ser motivo de estudio.
Las tres combinaciones Macrofila + C-35, Macrofila + Citropsis y Macrofila + 8-1-99-10A
incluyen tres distintos géneros de Cítricos, mostraron un similar y pobre
comportamiento. Este resultado lleva a considerar que bajo las mismas condiciones
experimentales en que se manejaron las fusiones, no hubo diferencia entre los tres
distintos géneros de cítricos, en términos de éxito de productos de fusión y
regeneración de plantas. El pobre comportamiento de estas combinaciones, más bien
se debió a deficiencias en la capacidad de Macrofila como donador de callo
embriogénico por las mismas causas que ya se explicaron anteriormente. Fue
característico que los escazos embriones desarrollados, mostraron un pobre
crecimiento y reducido cubrimiento del medio de cultivo y sobre todo un prolongado
tiempo de crecimiento. Por otro lado, la morfología de estas combinaciones fue
parecida al progenitor de callo embriogénico, aunque el tamaño de la hoja fue mayor
que el material parental Macrofila. Esto último contradice lo reportado anteriormente por
otros autores (Grosser et al., 1988).
Así mismo, aunque las pruebas de nivel de ploidía indicaron que Macrofila + 8-1-99-
10A, Macrofila + C-35 y Macrofila + Citropsis son tetraploides, hubo necesidad de
aplicar numerosas pruebas de PCR con distintos programas e iniciadores, para
diferenciar mediante marcadores moleculares a los híbridos somáticos de los
progenitores. Estos resultados indicaron que estas combinaciones muestran cierto
comportamiento atípico. Se sugiere nuevos trabajos, mejorando las condiciones
metodológicas para incrementar la producción de protoplastos de callo embriogénico de
Macrofila y lograr mayor número de plantas regeneradas de esta y otras
combinaciones.
En el caso de las combinaciones de Amblicarpa + Macrofila y Volkameriana también se
obtuvieron un bajo número de plantas y porque los intentos de fusión fueron pocos. El
tamaño de la hoja Amblicarpa + Volkameriana fue intermedio entre los dos parentales.
Pero la morfología de la hoja fue similar a Volkameriana, lo que confirma el efecto de
genes dominantes en ese último progenitor. Fue posible confirmar solo la naturaleza
144
híbrida en Amblicarpa + Volkameriana por medio de marcadores moleculares ISSR.
Estudios previos indican que para el caso de los limones las pruebas de PCR para
diferenciar genotipos han resultado adecuadas (Ianelli et al; Cristofani et al., 2002).
Herencia de Orgánelos
Se sabe que en el genoma de los orgánelos del núcleo y citoplasma existen numerosos
caractéres que son responsables de la respuesta de la planta en cuanto a su
comportamiento frente a problemas bióticos y abióticos. Se ha indicado que en el
citoplasma están los orgánelos que contienen genes responsables de la tolerancia a
ciertas plagas y enfermedades. En tanto que en las mitocondrias están los genes que
regulan el comportamiento productivo y calidad del fruto, entre otros caractéres (Moreira
2000 a; 2000 b; Grosser et al, 2000; Cheng et al., 2003). No existe un reporte específico
que indique en cual orgánelo está la característica de resistencia a VTC. Sin embargo,
no hay duda que pronto se llegará a conocer. La técnica de cihibridación a través de la
fusión de protoplastos abre un camino muy importante para desarrollar nuevos
materiales cihíbridos diploides que se pueden sumar a los híbridos somáticos ya
desarrollados. Este camino consiste en que conociendo en cuales orgánelos están las
características de interés, se pueden inducir la producción de variedades y/o
portainjertos diploides con mayor potencial.
Esto se puede lograr mediante técnicas de fusión de protoplastos, a través de las
cuales, se puede reprimir el desarrollo de células completas del donador de
protoplastos de hoja, favoreciéndose únicamente la incorporación de orgánelos del
citoplasma hacía las células del progenitor donador de protoplastos de callo. Se pueden
obtener cihíbridos diploides. La cuestión es que existe mucho trabajo por delante para
identificar en cuales orgánelos están las características de mayor impacto. En el caso
de portainjertos para limón por ejemplo, interesa conocer en que orgánelos están los
genes responsables de tristeza de los cítricos, tolerancia a sequía, tolerancia a
gomósis. En el caso del limón mexicano podría ser interesante conocer de otras
especies, donde están los genes de VTC, Antracnosis y tolerancia a sequía. De esta
manera se podría desarrollar mediante la fusión de protoplastos programas de
investigación en mejoramiento genético conducentes a desarrollar variedades y
portainjertos superiores.
145
VI. CONCLUSION
El rendimiento de protoplastos a partir de callo embriogénico fue más eficiente en el
portainjerto Amblicarpa que en Macrofila y Volkameriana. El Amblicarpa produjo los más
altos rendimientos de acuerdo con el protocolo de Grosser y Gmitter, 1990a; sin
embargo, los resultados de Macrofila sugieren varias modificaciones durante el
aislamiento y purificación de protoplastos para lograr un mayor rendimiento de
protoplastos, lo que indica que con este portainjerto se requiere un protocolo diferente
al del Amblicarpa.
En este trabajo se obtuvieron nueve nuevos portainjertos tetraploides y un hexaploide
los cuales mediante pruebas morfológicas, citometría de flujo y PCR se confirmó que
son híbridos somáticos. Estos resultados permitieron determinar que fue factible ampliar
la base genética de portainjertos de cítricos para limón por medio de la fusión de
protoplastos entre diferentes especies y géneros de cítricos.
La cercanía o alejamiento de los géneros Poncirus y Citropsis con relación al Citrus, no
pareció influenciar la obtención de productos de fusión y regeneración de híbridos
somáticos.
Los nuevos híbridos somáticos obtenidos entre Amblicarpa y las variedades de
Poncirus trifoliata, Amblicarpa con Pomelo, y Amblicarpa + Volkameriana reúnen
características altamente deseables como portainjertos de limón y otros cítricos, ya que
ofrecen un gran potencial a futuro para hacer frente al problema de la tristeza de los
cítricos y otros virus y viroides, tamaño del árbol, suelos calcáreos, entre otros.
146
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