Procesamientos De Muestras Microbianas Para Su Posterior Cultivo, Tincin Y Observacin Descriptiva De Sus MorfologasE. Urdaneta; G. Avendao; L. Rivera; O. PabnUniversidad Nacional Experimental Sur del Lago Laboratorio de Microbiologa General

Resumen En el presente documento se expondr los procedimientos realizados para procesar muestras de cultivos, preparacin, fijacin y coloracin simple de frotis y descripcin morfolgica de microorganismos (bacterias y hongos), de los cuales se utilizaron Bacillus Subtilis, levaduras, hongos filamentosos (mohos), se realizaron diluciones seriadas de una muestra de queso de las cuales se extrajeron unas porciones para sembrar en cajas de Petri adems se realizaron siembras de un alimento evidentemente contaminado con mohos en cultivos de PDA y AA, para finalizar se procesaron tres muestras con distintos tipos de tincin para los cuales se utilizaron levadura, B. Subtilis y hongos filamentosos. En los cultivos encubados se lograron observar bacterias en colonias aisladas y hogos filamentosos debido a que provenan de alimentos contaminados por factores desconocidos. Palabras Claves: Agar, aislamiento, B. Subtilis, cultivos, frotis, hongos, incubacin, queso, pan, tincin, zapote. Introduccin El crecimiento microbiano es el nmero de microorganismos que crecen en un definido periodo de tiempo, y para determinado se debe hacer una suma de los ciclos celulares de los individuos que forman la poblacin. Para que este crecimiento se realice es necesaria una fuente de energa y de esta manera formar protenas. El aislamiento de microorganismos se hace mediante la utilizacin de medios de cultivos para as obtener colonias aisladas que puedan ser observables a simple vista. A partir de una sola clula se pueden obtener un gran nmero de las mismas; todo esto debe realizarse en un periodo de incubacin a temperaturas ambientales normales, en el caso de que los microorganismos crezcan en un medio liquido las clulas que se producen en cada divisin continan su vida independientemente, mientras que los que crecen en un medio solido forman rpidamente colonia, y si el nmero que se siembran por unidad de superficie es elevado provoca una unin de colonias denominado csped, por el contrario en el caso de los hongos filamentosos en lugar de colonias se producen formaciones confusas. (Martinko M. Biologa de los microorganismos-brock. 8 Edicin).

Un frotis consiste en la toma y posterior estudio de una muestra. Su funcin es la de aislar el microorganismo problema para poder visualizarlo fcilmente en el microscopio puesto a que se fija al portaobjetos, ya sea por calor pasndolo por un mechero, o con metanol, en caso de que las bacterias estn en un medio lquido. Al momento de distinguir la naturaleza de la muestra, se lleva a cabo el proceso de tincin, aplicando colorante al frotis. Esto permite discernir, observando en el microscopio ptico, si las bacterias son gram positivas o gram negativas, informacin relevante a la hora de describir y estudiar una bacteria, as como tambin su forma, teniendo presente, el tipo de microorganismo con el que se est tratando y su estructura taxonmica. (Jos A. Cortes.. Preparacin de un frotis bacteriano 2.001). Objetivos Se tomaron y procesaron muestras microbiolgicas a partir de distintos materiales, a su vez, se cultivaron y aislaron empleando diversas tcnicas con el fin de caracterizar las colonias aisladas y as obtener cultivos puros de hongos y levaduras. De igual forma se aprendi las tcnicas de preparacin y observacin de frescos a partir de medios slidos y lquidos y se conocieron los mtodos de preparacin de frotis, fijacin y coloracin y posterior observacin de microorganismos. As como tambin se identificaron las principales formas de bacterias y las principales caractersticas morfolgicas de los hongos. Materiales y Mtodos Siembra de B. Subtilis: de un cultivo solido previamente realizado en una caja de Petri se tom el inoculo con el asa de platino esterilizada con la cual se sembr en otra caja de Petri debidamente rotulada que posea un medio de cultivo compuesto de agar nutritivo utilizando el mtodo de estra simple. Adems se realiz otra siembra con la misma bacteria la cual se encontraba en un medio lquido utilizando el mtodo de siembra de estra en superficie formando tres planos distintos. Procesamiento de una Muestra de Queso: se realiz el corte y pesado de un gramo de la muestra y se procedi a triturarlo con agua peptonada, luego de que la misma se encontrase en las condiciones ideales se tomaron 2ml con los cuales 1ml se sembr en una caja de Petri con un medio de AN y el mtodo de siembra en profundidad, el ml restante (1ml) se utiliz para realizar diluciones con agua peptonada desde 10-2 hasta 10-5 y de cada una de ellas se realizaron siembras con el mtodo anteriormente nombrado. Cultivo de Hongos Filamentosos: de un pan que se encontraba en estado de descomposicin y con evidente presencia de mohos se tomaron dos trozos los cuales se colocaron en cajas de Petri una de las cuales posea un medio de AA y otra con Agar-PapaDextrosa, cabe destacar que el tiempo de incubacin de todos los microorganismos estudiados fue de 24 horas aproximadamente.

Posteriormente se realizaron varios tipos de tinciones, primero la tincin simple de levadura la cual consisti en tomar un portaobjeto y rotularlo, luego se le agrego una gota del inoculo posteriormente se aplic una gota de azul de metileno y se procedi a colocar el cubreobjetos y llevar al microscopio para su observacin, en la siguiente tincin simple se utiliz un inoculo solido (B. Subtilis) el cual se esparci en el portaobjeto con la ayuda del asa y una gota de agua destilada luego se coloc una gota de azul de metileno y para finalizar se protegi la preparacin con el cubreobjeto para llevarla al microscopio, el siguiente procedimiento realizado fue el de la tincin de gram la cual consisti en primer lugar en la preparacin de un frotis del inoculo solido del B. Subtilis para su posterior tincin siguiendo la tcnica de gram de tincin diferencial, la ltima preparacin fue la tincin simple de hongo se realiz con una fruta (zapote) infectado con un hongo filamentoso desconocido y consisti en tomar una cinta adhesiva transparente con la cual se cubri la superficie infectada por el hongo para adherir parte de la estructura del hongo a la cinta luego esta se coloc en un portaobjetos que posea una gota de azul de metileno y se continuo con su observacin. Resultados Siembra por estra simple y estra en superficie de un inoculo slido y otro liquido del B. Suptilis en medio de AN. Muestra de B. suptilis Inoculo Solido Inoculo Liquido Estra simple Estra en superficie Beige Beige Organizadas en la trayectoria Organizadas en la trayectoria de zig-zag utilizada en la de zig-zag utilizada en la siembra y posean una textura siembra y posean una textura cremosa cremosa

Descripcin macroscpica Colonia (color) Forma y textura

Apreciacin

Siembra por diluciones seriadas de una muestra de queso utilizando el mtodo de siembra a profundad. Microorganismo Desconocido Descripcin macroscpica Muestra sin diluir Muestra diluida a 10-2 Colonia (color) Blancas Blancas Forma y textura La forma apreciable era de La forma apreciable era de puntos muy pequeos puntos muy pequeos en pertenecientes a un solo tipo menor cantidad que la de bacteria y posea una anterior pertenecientes a textura cremosa un solo tipo de bacteria y posea una textura cremosa Apreciacin

Descripcin macroscpica Colonia (color) Forma y textura

Muestra diluida a 10-3 Incoloras se formaron puntos con una apariencia de gotas de agua muy pequeas y posean una textura cremosa

Muestra diluida a 10-4 Incoloras se formaron puntos con una apariencia de gotas de agua muy pequeas en menor cantidad y ms pequeas y posean una textura cremosa

Apreciacin

Descripcin macroscpica Colonia (color) Forma y textura

Muestra diluida a 10-5 Incoloras se formaron puntos con una apariencia de gotas de agua muy pequeas siendo estas las ms diminutas de la serie de dilucin y posean una textura cremosa

Apreciacin

Siembra de hogos filamentosos en medios de Agar-Agua y PDA. Muestra de hongos desconocido Descripcin Muestra en medio de AA Muestra en medio de PDA macroscpica Colonia (color) Amarillo intenso y algunos Amarillo plido y verde puntos marrones musgo Forma Forma filamentosa Forma filamentosa entrecruzadas entrecruzadas Apreciacin

Observaciones microscpicas de una levadura por tincin simple. Muestra de Levadura Descripcin microscpica Tincin simple con azul de metileno microorganismo (color) Verde Forma Ovoide Apreciacin Microscpica a 40x

Observaciones microscpica del B. Subtilis con tincin simple de un inoculo slido. Muestra de B. Subtilis Descripcin microscpica Tincin simple con azul de metileno Bacteria (color) Azul Forma Bacilos Apreciacin Microscpica a 100x

Observaciones microscpicas del B. Subtilis con tincin de ganm de un inoculo solido Muestra de B. Subtilis Descripcin microscpica Tincin de gram Bacteria (color) Moradas (gram positivas) Forma Bacilos Apreciacin Microscpica a 100x

Observaciones microscpicas de hogos filamentosos con tincin simple con cinta adhesiva. Muestra de hongos filamentosos Descripcin microscpica Tincin simple con azul de metileno microorganismo (color) Azules y traslucidos Forma Presentaban forma filamentosa septada y se observaron las estructuras de los esporangios Apreciacin Microscpica a 40x

Discusin Referente a la primera experiencia la cual fue el estriado simple se logr notar que estuvo bien realizada aunque se pudieron haber formado estras ms unidas, se presume que esto sucedi por no tener suficiente agilidad en la mano. En la segunda experiencia que fue la de estriado de superficie no se pudieron observar los tres planos que se realizaron sino solo uno de ellos debido a que no se us suficiente inoculo a pesar de la falta del mismo del primer estriado se corri para el segundo y tercer cuadrante ms sin embargo se pudieron observar colonias pero no tan aisladas. En las diluciones seriadas (con siembra a profundidad) se pudo observar que mientras ms concentrada esta la muestra se va a formar una mayor concentracin de bacterias cumplindose as la tendencia incluso cuando la dilucin fue de 10-3 ya se podan notar colonias aisladas que eran fciles de cuantificar adems que haba la presencia de una sola bacteria , a diferencia del grupo 3 de la maana el cual trabajo con leche se le podan notar dos tipos de bacterias las cuales eran difciles de cuantificar pero en el caso planteado si se hubiesen realizado ms diluciones no se hubiesen podido observar microorganismo.

En el caso de los hongos filamentosos sembrados A.A se observ que eran menos filamentosos que los que se sembraron en PDA y crecieron en menos proporcin debido a que este medio no brinda los nutrientes necesarios para que se realiza un crecimiento acelerado en cambio lo que se sembraron en PDA tenan mayor cantidad de filamentos y crecieron a gran escala hasta el punto que cubrieron casi todo el fondo de la caja de Petri siendo evidente que este medio contena mejores nutrientes para el crecimiento pleno de este hongo . Esto se corroboro con el resultado de otro grupo. En la observacin microscpica de la levadura se pudo constatar su forma la cual era de clulas ovoides y que gracias a la tincin con azul de metileno tenan un aspecto verdoso, as mismo la observaciones hechas al B. Subtilis con la tincin simple se apreci su morfologa, posteriormente en la observacin diferencial de gram se observ que eran gram positivas. En la ltima observacin la cual fue realizada a unos hongos filamentosos se apreciaron claramente sus estructuras con un aumento de 40x entre las cuales se identificaron las ifas septadas y esporangios en distintas fases de la reproduccin los culs presentaban una forma de sacos estos presentaban una coloracin azul ms oscuras en las etapas ms tempranas del ciclo y un tono de azul ms claro en las etapas finales de la produccin de esporas. Conclusiones En general se logr notar que en todas las muestras utilizadas se encontraban microorganismos es decir, bacterias, hongos filamentosos y levaduras; estas pudieron haber sido contaminadas en cualquiera de los procesos que se les realiza o incluso cuando se encontraban en los establecimientos donde se encontraban para la venta. En el caso del queso tal vez fue porque en el mismo lugar vendan carne y por el simple hecho de haber cortado con el cuchillo y este tuviese algn residuo de carne se pudo haber contaminado. Esto conlleva a pensar que por el simple hecho de consumir un alimento que no cumpla con las medidas sanitarias adecuadas y el consumidor lo desconozca por completo se pueden adquirir enfermedades producidas por algn microorganismo y eso que no se logr saber si eran patgenos o no, lo cual sera de gran importancia conocer. Referencias Bibliogrficas Edicin. Martinko M. 2.003 Biologa de los microorganismos-brock. 8

Jos A. Cortes. 2.001 Preparacin de un frotis bacteriano http://www.joseacortes.com/practicas/frotisbact.htm